CN102321758A

CN102321758A - 一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量pcr内参分子的筛选方法

Info

Publication number: CN102321758A
Application number: CN201110239015A
Authority: CN
Inventors: 李小双; 张道远; 杨红兰; 裴金玲
Original assignee: Xinjiang Institute of Ecology and Geography of CAS
Current assignee: Xinjiang Institute of Ecology and Geography of CAS
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2011-08-19
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-08-19
Also published as: CN102321758B

Abstract

本发明涉及一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法利用同源克隆对准噶尔无叶豆中的8个内参基因进行了克隆，并设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物，选取受10种非生物胁迫和没有胁迫(对照)的两周大幼苗为实验材料进行荧光定量PCR实验验证，运用geNorm软件进行荧光定量数据的分析，从而筛选出准噶尔无叶豆幼苗开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合，最稳定的内参分子是EF和α-tubulin。用本发明所述方法可避免不同非生物胁迫下的准噶尔无叶豆幼苗材料在RNA质量，产量及反转录效率等上的存在的误差，能更好的对实时荧光定量检测的数据进行校正和标准化，提高了研究的准确性和可靠性。

Description

一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种适用于沙漠植物准噶尔无叶豆幼苗各种非生物胁迫下实时荧光定量PCR研究的内参分子的筛选方法

背景技术

随着全球气候变暖和温室效应加剧，干旱区农业生产受到严峻挑战。面对我国人口不断增长、耕地和水肥资源日益减少、粮食供需矛盾日益尖锐的严峻现实，如何在节约资源和改善环境的同时，快速提高作物的产量，已成为我国农业持续高效发展的重大需求。干旱区长期进化过程中积累的抗干旱基因资源是开展种质创新的源动力！

干旱区严酷的自然环境孕育了特殊的生物，其中尤以分布在流动沙丘上的极端耐旱沙生植物最具有代表性。沙生植物是一类特殊的植物类群，可在高效利用有效水分的同时，维持高效的光合作用，是宝贵的战略性植物资源。准噶尔无叶豆是沙生植物的典型代表。

准噶尔无叶豆(Eremosparton songoricum(Litv.)Vass.)系豆科无叶豆属超旱生无叶灌木，仅片断化分布于新疆古尔班通古特沙漠流动沙丘上，是典型的流沙先锋植物。该种是我国的单属种植物类群，西北荒漠植被中的标志性种，稀有种。由于长期生活在极端恶劣的流动沙丘环境中，沙漠干旱、少雨、大风、沙埋等环境塑造了准噶尔无叶豆抗旱的形态学及生理学特性，表现在该种为小半灌木，叶极端退化，以营养枝执行光合作用，故称“无叶豆”；具有超强的根吸水能力以及细胞持水能力，并保持高效的光合能力。此外，长期的环境压力使得该种具有抗旱，抗高温，抗风蚀沙埋等抵抗多种非生物胁迫的能力，其体内必定蕴含着丰富的抗逆基因资源。

要了解准噶尔无叶豆体内丰富的抗旱基因资源及其功能，很关键的一个方法就是要克隆抗旱基因并迅速、准确地定量检测抗旱基因在各种非生物胁迫下的表达。传统的印迹杂交，生物芯片技术和RT-PCR等手段在实时、定量检测抗旱基因表达量上，或存在缺陷，或价格昂贵、费时费力。随着分子生物学各项技术的发展，实时荧光定量PCR已经成为目前基因表达定量检测的主要方法，该法不仅灵敏度高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶基因表达量，定量线性宽；而且可精确检测出同一处理不同组织、或者同一组织不同发育时期微小的基因表达水平差异。但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对数据进行校正和标准化，从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录率上可能存在的差别。

以往对内参基因的研究证实，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下有范围的恒定，在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的。若盲目的使用一个内参或几个内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能得到错误甚至是相反的结论。内参基因的稳定性问题近年来越来越受争议和关注。因此，研究和筛选特定植物中最稳定的内参分子和最合适的内参数目(或者说最优的内参组合)是进行荧光定量PCR实验的先决条件。目前，文献中用来作为植物基因表达分析的内参主要有18SrRNA，Actin，GAPDH等。因所研究植物的系统学谱系关系不同、生活型不同以及植物组织部位不同其选择内参也不同。

目前为止，对植物抗逆基因不同胁迫下表达量的研究多盲目参考在其他植物类群中使用过的内参，如Actin，18SrRNA等，但对其在极端耐旱沙生植物抗旱基因研究中的恒定性及其作为内参的适用性均未进行探究，并且开发新的内参分子尚未见报道。

近年来，从准噶尔无叶豆中已克隆出一些抗逆基因，如脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子基因(NCBI登录号：HQ687367)，这些基因的特性和功能亟待研究，但关于该种的内参基因的序列资料未见报道，最合适内参分子的研究更是空白。因此，本发明就旨在探究一种在非生物胁迫条件下准噶尔无叶豆幼苗开展实时荧光定量PCR研究最稳定，最合适的内参分子的筛选方法，为以后大规模开展抗逆基因克隆及功能研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法利用实时荧光定量PCR方法研究沙生植物抗逆相关基因功能时，缺少适用的、可靠的、表达恒定的内参分子，提出了一种适用于沙生植物准噶尔无叶豆在非生物胁迫条件下开展实时荧光定量PCR研究的最稳定，最合适的内参分子的筛选方法；利用同源克隆的方法对准噶尔无叶豆中的八个内参基因进行了克隆，并以这些序列为基础设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物。选取受10种非生物胁迫和没有胁迫(对照)的两周大幼苗为实验材料进行荧光定量PCR实验验证，运用geNorm软件进行荧光定量数据的分析，从而筛选出准噶尔无叶豆幼苗开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合，最稳定的内参分子是EF和α-tubulin。以干旱胁迫下的无叶豆幼苗为例，以无叶豆中的DREB转录因子基因为目的基因，用EF和α-tubulin两个最优内参组合来探讨DREB基因在干旱胁迫下的表达规律。运用本发明所述方法克隆，筛选并证实的内参分子，可避免在多种非生物胁迫下准噶尔无叶豆样本在RNA产量，质量及反转录效率上可能存在的差别，能更好的对实时荧光定量PCR检测出的数据进行校正和标准化，提高对该种基因定量研究的准确性和可靠性。

本发明所述的一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，按下列步骤进行：

a、利用同源克隆的方法对准噶尔无叶豆幼苗中8个内参候选基因进行了克隆，并以这些序列为基础设计了9对实时荧光定量PCR的内参基因引物；

b、分别选取干旱，高盐，冷，热，脱落酸，氧化胁迫，机械损伤，重金属胁迫为硫酸铜和硫酸锌胁迫，紫外胁迫10种非生物胁迫以及无胁迫处理的的准噶尔无叶豆叶片为实验材料，进行荧光定量PCR实验；

c、将实时荧光定量PCR得到的数据导入geNorm软件进行内参稳定性和内参数目分析，筛选出内参分子和内参分子组合；

d、选取干旱胁迫下的准噶尔无叶豆叶片，以准噶尔无叶豆中的脱水响应元件结合蛋白基因为目的基因，用实时荧光定量PCR和geNorm软件筛选出来的内参分子来探讨DREB基因在干旱胁迫下的表达规律。

步骤b和步骤d中，准噶尔无叶豆叶片为准噶尔无叶豆两周大幼苗的叶片。

步骤b中非生物胁迫处理的条件为：分别用20％聚乙二醇6000，250mM氯化钠，100μM脱落酸，0.5mM硫酸铜，0.5mM硫酸锌，50mM双氧水，0.5w/m²紫外辐射来模拟干旱，高盐，脱落酸，重金属，氧化和紫外胁迫；将无叶豆幼苗分别置于温度4℃冰箱和温度40℃光照培养箱来模拟低温和高温胁迫；机械损伤胁迫是通过剪断叶片和茎来实现，所有处理均是在胁迫4h后取材，且取得的材料要立即置于液氮中，并迅速置于温度-80℃冰箱储存。

步骤b中实时荧光定量PCR模板均为1μg RNA反转得到的cDNA的5倍稀释液，且荧光定量程序为：第一步是预变性：温度95℃30秒；第二步是PCR反应阶段，温度95℃-5秒，温度58℃-30秒，40个循环，收集荧光信号；第三步是溶解曲线分析，温度65℃-95℃，温度65℃在30s逐步升至95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。

步骤d中干旱胁迫处理的时间点为：0h，2h，6h，12h，24h。

本发明所述的一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法中利用同源克隆的方法对准噶尔无叶豆幼苗中8个内参基因进行了克隆，其中8个内参基因序列为：

18S rRNA核苷酸序列：

GATTTACTATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAG

AGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGC

AAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCG

GGCTCTTCGAGTCTGGTACTTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGA

GGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTC

CAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGACTTTG

GGTTGGGCCGGCCGGTCCGCCTTTCGGTGTGCACCGGTCGTCTCGTCCCTT

CTGCCGGCGATGCGCTCCTGGTCTTAACTGGCCGGGTCGTGCCTCCGGCAC

TGTTACTTTGAAGAAATTAGAGTGCTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGGATAC

ATTAGCATGGGATAACATCATAGGATTTCGGTCCAATC

GAPDH核苷酸序列

ATTGCTCACTTGAAGGGTGGGGCTAAGAAGGTTGTGATTTCTGCCCCTAGC

AAAGATGCACCCATGTTTGTTGTAGGCGTTAACGAGAAGGAATACGAACCA

GAGCTTAACATTGTTTCCAATGCTAGCTGCACTACCAATTGCCTTGCTCCTC

TCGCCAAGGTTATCAATGACCGATTTGGAATAGTAGAGGGTCTTATGACCAC

TGTCCATGCTATCACAGCTACTCAGAAGACTGTTGATGGACCATCAAGCAA

GGATTGGAGAGGTGGAAGAGCTGCTTCCTTCAACATTATTCCCAGCAGCAC

TGGAGCTGCCAAGGCTGTAGGAAAAGTGCTTCCAGCATTGAATGGCAAATT

GACCGGAATGTCTTTCCGTGTCCCTACCGTCGATGTCTCGGTTGTTGACCTC

ACTGTTAGGATTGAGAAGAAAGCAACCTATGAACAAATTAAGGCTGCTATC

AAGGAGGAATCTGAGGGCAAATTGAAGGGAATTTTGGGTTACATTGAAGA

GGATGTTGTATCTACCGACTTTATTGGTGATAGCAGGTCTAGCATATTTGATG

CTAAGGCTGGAATTTCTTTGAATGATAACTTTGTGAAACTTGTTTCTTGGTA

CGACAACGAATGGAAT

UBQ核苷酸序列：

ATTGATTACAACATTCAGAGGGAGTCAACTCTTCATCTCGTCCTCCGTCTTC

GTGGTGGTATGCAGATCTTCGTAAAGACCCTCACCGGAAAGACCATCACCC

TCGAGGTTGAAAGCTCCGACACCATCGACAACGTGAAGTCCAAGATCCAA

GACAAAGAGGGAATACCACCGGACCAGCAGAGGTTGATCTTCGCCGGAAA

GCAGCTTGAGGATGGTCGCACCTTAGCCGACTATAACATCCAGAAGGAATC

AACTCTCCACCTTGTGTTGCGTTTAAGGGGAGGCATGCAAATCTTTGTGAA

AACCCTCACTGGTAAAACCATTACCCTTGAGGTGGAGAGTTCTGATACCAT

CGACAACGTGAAGACCAAGATTCAAGATAAGGAGGGAATTCCACCAGACC

AGCAGAGGTTGATTTTCGCAAT

ACT核苷酸序列：

GATTTATGCCAGTGGTCGTACAACTGGTATTGTGTTGGATTCTGGTGATGGT

GTCAGCCACACTGTCCCTATCTACGAGGGTTATGCCCTTCCACATGCCTTCC

TACGTCTTGATCTGGCTGGTCGTGATCTCACAGATTTTTTGATGAAAATTCT

GACCGAGCGTGGTTATTCTTTCACCACCTCAGCAGAGCGAGAAATTGTGAG

GGATGTGAAGGAAAAGCTGGCCTACATTGCCCTTGACTACGAGCAAGAGC

TGGAGACAGCCAGGACTTGCTCATCCGTGGAGAAGAGCTACGAGTTGCCT

GATGGTCAGGTAATCACCATTGGCGACGAGCGTTTCAGATGTCCAGAGGTC

CTGTTCCAACCGTCCATGATAGGTATGGAAGCAGCAGGCATTCACGAGACC

ACATACAACTCCATCATGAAGTGCGATGTCGATATCAGGAAAGACCTGTAC

GGTAACATTGTCCTTTCTGGAGGAACAACCATGTTCCCTGGCATTGCTGATA

GAATGAGCAAGGAAATTTCCGCATTAGCTCCCAGCAGCATGAAGATCAAGG

AATC

EF核苷酸序列：

GATTAGACCACCAAGTACTACTGCACAGTCATTGATGCCCCCGGACATCGT

GACTTTATCAAGAACATGATTACTGGAACCTCCCAAGCTGACTGTGCTGTT

CTCATCATCGATTCTACCACTGGTGGTTTTGAAGCTGGTATTTCCAAGGATG

GACAGACTCGTGAGCATGCTCTTCTTGCTTTTACTCTTGGAGTCAAGCAGA

TGATCTGTTGCTGTAACAAGATGGATGCCACCACACCCAAGTACTCTAAGG

CTAGGTACGATGAAATTGTGAAGGAAGTCTCTTCATATTTGAGGAAGGTTG

GTTACAACCCAGACAAAATTCCATTTGTGCCCAACTCTGGTTTTGAGGGTG

ACAACATGATTGAGAGGTCCACCAACCTTGACTGGTACAAGGGACCAACT

CTCCTTGAGGCTCTTGACCAAATCAATGAGCCCAAGAGACCTTCAGACAA

GCCTCTCAGGCTTCCATTGCAGGATGTGTACAAGATTGGTGGAATC

β-TUB1核苷酸序列：

TGTACCAATGCAAGAAAGCCTTTCTTCTGAACATAGCTGTGAATTGCTCAC

TCACCCTGCGGAACATCTCTTGAATAGATGTGGAGTTCCCTATAAACGTAGA

AGCCATTTTGAGACCAGTTGGAGGAATATCACAGACTGTAGATTTGACATT

GTTTGGGATCCACTCAACAAAGTAGGATGAATTCTTGTTCTGAACTATGAT℃

ATCTGCTCATCAACTTCCTTGGTGCTCATCTTACCACGGAACATGGCAGATG

CTGTCAAGTAGCGACCATGGCGAGGATCAGCAGCACACATCATGTTCTTGG

CATCCCACATTTGTTGGGTCAACTCGGGTACAGTTAGAGCCCTGTACTGCT

GTGACCCACGAGATGTGAGCGGGGCAAAACCCACCATGAAGAAATGCAAA

CGAGGGAAAGGAATTAGATTCACAGCAAGTTTGCGAAGATCAGAGTTGAG

TTGACCAGGAATC

β-TUB2核苷酸序列：

GATTCCTGGTCAACTCAACTCTGATCTAAGGAAACTAGCTGTGAATCTGATA

CCATTCCCTCGCCTTCACTTTTTCATGGTGGGTTTCGCCCCATTGACCTCAC

GTGGTTCTCAGCAATACCGTGCTCTGAGCGTACCAGAGCTCACACAACAAA

TGTGGGATGCAAAGAACATGATGTGTGCTGCAGATCCTCGTCATGGTCGTT

ACCTCACCGCCTCAGCTATGTTCCGAGGCAAGATGAGCACAAAAGAGGTT

GATGAACAAATGATCAATGTTCAAAACAAGAACTCTTCATACTTCGTTGAA

TGGATTCCAAACAATGTGAAATCCACTGTTTGTGATATTCCACCAACAGGTT

TGAAGATGGCTTCGACATTCATTGGAAACTCGACATCGATTCAGGAGATGT

TTAGAAGGGTTAGTGAACAGTTCACAGCTATGTTTAGGAGAAAGGCTTTCT

TGCATTGGTACACAAT

α-TUB核苷酸序列：

CCAGTCATGATCTGAGGAGAGGAAGATGGTAAGCCAAGTTTAGACTTCTTC

CCATAATCAACAGACAACCTTTCCAAAAGTAATGATCCCAAACCAGAACCA

GTACCACCACCAACAGCATTGAAAACCAAAAATCCTTGCAAACCAGTACA

ATTATCTGCTAATTTTCTGATACGATCGAGGCATAGTTCAACAACTTCTCTTC

CAACAGTGTAGTGTCCCCGAGCAAAATTATTAGCAGCGTCTTCCTTTCCAG

AAATTAATTGCTCAGGGTGAAAGAGTTGTCTATAAGGACCAGTTTTTATTTC

ATCAATAACAGTAGGTTCCAGATCAACAAATAAAGACCTCGGCACGTGTTT

GCCGGATCCCGTCTCGCTGAAGAAGGTGTTAAAAGCATCGCGTGCTACGCC

AGGTGTGGTGTCACTCGGCATCAAACCATCAGGTTGAATTCCATGTTCGAG

GAGTTAAAGCTCA

克隆该8个内参基因的引物为：

以克隆的EF等8个基因的序列设计适合荧光定量实验的PCR引物，用Primer-BLAST软件搜索引物的特异性，并用实时荧光定量PCR生成的溶解曲线和PCR产物电泳来判断引物的特异性，并做标准曲线来判断该内参基因的扩增效率等。各个内参基因荧光定量引物信息为：

本发明所述的一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法的特点为：针对天然抗旱珍稀荒漠植物准噶尔无叶豆基因定量研究中内参基因的参考序列信息缺乏和最稳定、最合适内参分子的筛选工作的空白，克隆了8个常用的经典内参分子基因，并以此序列为基础设计特异的实时荧光定量PCR的引物。用实时荧光定量PCR实验检验这8个基因在10种非生物胁迫下的表达稳定性。然后用geNorm软件分析实时荧光定量PCR数据，得出了准噶尔无叶豆中最稳定的内参基因和最优的内参基因组合是EF和α-tubulin。并以干旱胁迫下5个时间点的无叶豆材料为模板，以无叶豆中的脱水响应元件结合蛋白(DREB基因)为例，用EF和α-tubulin两个内参共同校正和标准化了DREB转录因子基因在干旱胁迫下的表达规律。运用本发明筛选的内参分子，可避免不同非生物胁迫下的准噶尔无叶豆幼苗材料在RNA质量，产量及反转录效率等上的可能存在的误差，能更好的对实时荧光定量检测的数据进行校正和标准化，提高了研究的准确性和可靠性。

附图说明

图1为本发明候选内参分子18S rRNA实时荧光定量PCR的扩增曲线图。

图2为本发明候选内参分子18S rRNA的标准曲线图。

图3为本发明候选内参分子18S rRNA的溶解曲线图。

图4为本发明的各个内参基因实时荧光定量产物的电泳图，

图5为各种非生物胁迫下不同内参基因的实时荧光定量PCR得到的Cq值图，其中●为Cq平均值，I为最大值和最小值。

图6为geNorm软件分析的最优内参分子排序图，其中←为最不稳定的内参，→为最稳定的内参。

图7为geNorm软件分析的最合适内参分子组合结果图。

图8以EF和α-TUB基因为内参得到的干旱胁迫下各时间点的DREB基因的表达规律图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规实验操作进行。如《精编分子生物学实验指南》(F.M奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G塞德曼主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

内参分子的克隆：

以NCBI数据库里的拟南芥及豆科多种植物中已发表的GAPDH、Actin、18SrRNA、UBQ、EF、α-tubulin、β-tubulin基因的序列为参考，设计各内参基因特异引物，以光照培养箱里培养的两周大无叶豆幼苗(温度25℃，时间12h/12h，)为材料，提取RNA，反转cDNA，并用设计的各内参基因的引物来扩增目的基因，回收各扩增基因的特异片段，连接克隆载体，测序并进行序列分析；

实时荧光定量内参引物的设计：

以8个内参基因序列为基础，设计9对实时荧光定量PCR的基因特异引物，用相似性分析工具BLAST搜索引物的特异性，并用实时荧光定量PCR的溶解曲线和产物电泳来进一步验证各引物的特异性；

植物胁迫处理材料的收集：

选取实验室光照培养箱下培养的两周大无叶豆幼苗为实验材料，分别用20％聚乙二醇6000，250mM氯化钠，100μM脱落酸，0.5mM硫酸铜，0.5mM硫酸锌，0.5w/m²紫外辐射，50mM双氧水，来模拟干旱，高盐，脱落酸，重金属，紫外和氧化胁迫，将无叶豆材料分别置于温度4℃冰箱和温度40℃光照培养箱来模拟低温和高温胁迫；通过剪断叶片和茎来模拟机械损伤胁迫，胁迫4h后取材，取得的材料立即放入-80℃冰箱冻存；

RNA的提取和反转录：

收集各样本的RNA提取用TAKARA的RNAiso reagent试剂，所有样本均用1μg RNA进行反转录；

实时荧光定量PCR实验：

以上述反转的各胁迫条件下的cDNA的5倍稀释液为模板，用各荧光定量特异引物进行实时荧光定量PCR反应；

geNorm软件进行候选内参分子的实时荧光定量PCR数据分析：

GeNorm软件是根据某一内参基因与其他内参基因表达水平的两两比值经对数变换后，计算出其平均标准差作为基因表达稳定性的平均值M(M值以1.5为临界点，大于1.5认为不适合做内参，M值越小越稳定)，然后对所有内参的表达稳定性进行排序，并对标准化因子进行配对差异分析(配对变异系数Vn/Vn+1)来判断所需内参基因的最适数目(V的临界点一般默认为0.15)。

经本发明筛选方法得到的筛选结果：最稳定的内参分子是EF和α-tubulin(图6)，且V2/3＝0.147＜0.15.说明所需内参基因的合适数目是2个，分别是表达相对最稳定的EF和α-tubulin(图7)。

下面通过实验方法来说明本发明的具体筛选过程：

实验操作过程：

候选内参基因的克隆

在NCBI里下载18S等八个内参基因参考序列，以这些内参基因序列为基础，挑选各内参基因序列中最保守的基因片段用Primer Premier5.0软件设计特异引物，具体各个内参基因克隆的引物信息等见表1：

表1

以两周大无叶豆幼苗为材料提取RNA，反转录成cDNA，用表1引物进行扩增；

对特异扩增片段进行切胶回收纯化；

回收基因片段连接PMD19-T载体，转化，筛选鉴定并最终送阳性克隆测序。所有内参基因的序列信息如下：所有内参基因片断长度均在500bp左右；

内参基因序列的比对分析：将测序回来的各个基因序列提交NCBI里的BLASTX进行比对分析，各内参基因序列与其它植物中的该基因的序列相似性均在87％以上，其中18SrRNA基因的序列与宝盖草中的该基因序列的一致性高达99％，比对结果证明这些内参基因均克隆正确；

实时荧光定量PCR引物设计和验证：

以克隆的EF等8个基因的序列设计适合荧光定量实验的PCR引物，用Primer-BLAST软件搜索引物的特异性，并用实时荧光定量PCR生成的溶解曲线和PCR产物电泳来判断引物的特异性，并做标准曲线来判断该内参基因的扩增效率等，标准曲线的制作均是以未受胁迫的两周大无叶豆幼苗1μg的RNA反转得到的cDNA经梯度稀释后为模板做荧光定量PCR得到的，包括10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³.10².六个模板梯度，各个内参基因荧光定量引物及序列信息参见表2，

表2

如表，各内参实时荧光定量的片段大小均在200bp左右，且Tm值都很接近，各内参基因的扩增曲线，标准曲线均很好，如18SrRNA基因的扩增效率(E)达到了98.4，相关系数(R²)等于1，斜率(slope)＝-3.360，表明18S该内参的扩增效率很高，标准曲线的线性关系很好。各内参基因的荧光定量PCR溶解曲线分析(图3)和产物电泳图(图4)所示各内参基因均无非特异条带，特异性很好。以上数据均证明了设计的内参小片段引物等均符合要求，可继续下游的荧光定量实验。

实时荧光定量PCR实验：

以10种非生物胁迫(干旱，高盐，冷，热，脱落酸，重金属(硫酸铜和硫酸锌)，紫外，氧化胁迫和机械损伤)下的无叶豆幼苗为实验材料，提RNA，RNA质检(包括琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测)和反转录，反转录采用的是TAKARA的PrimeScript反转录试剂盒。具体反应体系和程序如下：

反转录反应：

5×PrimeScript Buffer：4μl

PrimerScript反转录酶混合液：1μl

Oligo dT引物(50μM)：1μl

总RNA：1μg

去RNA酶的水：up to 20μl

反转录反应条件：

温度37℃，时间30min；温度85℃，时间5s。

用各内参基因的荧光定量引物扩增各个胁迫条件下cDNA：

荧光定量的仪器为Bio-rad CFX96.，实时荧光定量PCR采用的是TAKARA的SYBR Premix Ex Taq^TM，反应体系如下：

SYBR Premix Ex Taq II(2x)：2μl

PCR正向引物(10μM)：0.4μl

PCR反向引物(10μM)：0.4μl

cDNA溶液：2μl

水：12.2μl

总体积：20μl

反应程序为：

第一步：预变性

循环数1，温度95℃，时间30秒

第二步：PCR反应

循环数40，变性：温度95℃，时间5秒；退火：温度58℃，时间30秒

第三步：溶解曲线制作

温度65℃-95℃(30s逐步升至95℃)，每0.5℃收集一次荧光信号，实时荧光定量PCR得到的所有内参基因的Cq平均值见表3和图5：

表3

	18S	EF	ACT	GAPDH1	GAPDH2	UBQ	α-TUB	β-TUB1	β-TUB2
										对照	11.87	19.86	24.06	22.545	22.96	18.925	22.43	22.84	23.05
干旱	11.10	19.82	24.07	23.03	23.495	18.555	22.78	23.91	23.24
										盐	12.16	20.05	23.655	22.585	22.74	18.495	22.815	24.41	23.53
冷	11.52	19.22	23.455	22.85	23.13	19.055	22.57	23.295	22.455
										热	12.73	20.21	23.24	21.88	22.635	19.86	24.15	23.61	22.29
脱落酸	11.79	19.67	23.69	23.76	23.94	18.22	23.405	23.08	23.205
										硫酸铜	11.88	19.42	23.725	23.325	23.575	18.815	23.245	24.83	23.89
硫酸锌	11.71	19.66	24.2	22.855	23.005	19.6	23.715	23.75	23.32
										双氧水	11.83	19.29	23.555	23.14	23.27	18.455	22.955	23.955	24.48
紫外线	10.63	20.067	23.74	22.325	22.645	19.285	23.345	23.71	23.855
										机械损伤	11.44	20.29	23.66	20.925	21.32	19.885	23.435	23.415	21.795

如表3图5所示，在多有内参中，18S表达丰度最高(Cq值偏小)，其他内参的Cq均在20-25之间，非常符合定量研究中内参最合适的Cq值范围的要求，同时，各内参在10种非生物胁迫下的相对表达量差异较大。

geNorm软件进行候选内参分子的实时荧光定量PCR数据分析：

数据分析采用Excel 2003和geNorm程序进行。从http://medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/网址下载geNorm程序。在Excel中将不同样本中某一内参基因Ct值最小者对应样品的表达量定义为1，其他样品此内参基因的相对表达量则为2^-ΔCt(ΔCt＝各样本Ct值-最小Ct值)，将这些数据导入geNorm程序，利用geNorm程序计算基因表达稳定度M，并对内参基因的表达稳定度进行排序(M值越小，表达越稳定)最后根据内参基因标准化因子的配对差异分析(Vn/n+1)来判定内参基因的最适数目。

在本发明中，geNorm程序首先通过计算表达稳定度平均值(M)实现了9个看家基因表达稳定度的排序，结果显示最稳定的内参是EF和α-TUB，最不稳定的是β-Tubulin2基因(图6)，然后geNorm又计算出配对变异系数V，结果得到V2/3＝0.147，＜0.15(图7)，因此，对于无叶豆幼苗在非生物胁迫方面的定量研究，只需要用两个内参来共同校正和标准化就能得到准确的定量结果。这两个内参分别是EF和α-TUB。

下面以准噶尔无叶豆中的DREB转录因子为目的基因，以上述筛选出的最优内参分子组合EF和α-TUB来共同校正和分析干旱胁迫下DREB基因的表达特性。

具体操作过程：

材料的收集

用20％聚乙二醇6000模拟干旱胁迫处理两周大无叶豆幼苗，分别在0h，2h，6h，12h，24h五个时间点取材，取得的材料立即置于温度-80℃冰箱保存；

RNA提取和RT反应：

RNA提取用TAKARA的RNAiso试剂，所有样本均是用iμg RNA进行反转录，反转录体系及程序同上；

实时荧光定量PCR实验：

用无叶豆中的DREB转录因子基因特异引物和EF，α-TUB特异的荧光定量引物来扩增以上的5个时间点的干旱处理下的无叶豆cDNA，得到各个处理时间点在以上3个基因下对应的Cq值；

数据处理：

用荧光定量仪Bio-Rad CFX 96自带的软件Bio-Rad CFX管理软件(版本1.6)处理以上实时荧光定量数据。利用该软件里自带的基因表达功能项来作图，结果如图8所示：经EF和α-TUB共同校正的DREB基因在干旱胁迫下的表达规律是随着胁迫时间的增长，该基因的表达量是逐渐增加的，并在6h时达到最高，在12h后开始下降，24h时表达量继续呈下降趋势。

Claims

1.一种沙漠植物准噶尔无叶豆实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，其特征在于按下列步骤进行：

b、分别选取干旱，高盐，冷，热，脱落酸，氧化胁迫，机械损伤，重金属胁迫为硫酸铜、硫酸锌胁迫和紫外胁迫共10种非生物胁迫以及无胁迫处理的的准噶尔无叶豆叶片为实验材料，进行荧光定量PCR实验；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b和步骤d中，准噶尔无叶豆叶片为准噶尔无叶豆两周大幼苗的叶片。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中非生物胁迫处理的条件为：分别用20％聚乙二醇6000，250mM氯化钠，100μM脱落酸，0.5mM硫酸铜，0.5mM硫酸锌，50mM双氧水，0.5w/m²紫外辐射来模拟干旱，高盐，脱落酸，重金属，氧化和紫外胁迫；将无叶豆幼苗分别置于温度4℃冰箱和温度40℃光照培养箱来模拟低温和高温胁迫；机械损伤胁迫是通过剪断叶片和茎来实现，所有处理均是在胁迫4h后取材，且取得的材料要立即置于液氮中，并迅速置于温度-80℃冰箱储存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中实时荧光定量PCR模板均为1μg RNA反转得到的cDNA的5倍稀释液，且荧光定量程序为：第一步是预变性：温度95℃-30秒；第二步是PCR反应阶段，温度95℃-5秒，温度58℃-30秒，40个循环，收集荧光信号；第三步是溶解曲线分析，温度65℃-95℃，温度65℃在30秒逐步升至95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中干旱胁迫处理的时间点为：0h，2h，6h，12h，24h。