CN109872777A - 海滨木槿实时荧光定量pcr内参基因的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。本发明利用海滨木槿转录组数据库，选取10个候选内参基因，以10个候选内参基因序列为模板，设计实时荧光定量PCR特异引物，选取海滨木槿不同组织及各种非生物胁迫和激素处理下的海滨木槿叶片为实验材料进行荧光定量PCR实验，最后运用geNorm，NormFinder和BestKeeper软件进行数据分析，本发明专利中最稳定内参基因是ACT和SKIP。本发明方法建立了海滨木槿稳定内参基因的筛选体系，为开展海滨木槿基因功能研究提供了稳定内参基因。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种适用于海滨木槿不同组织及各种非生物胁迫和激素处理下实时荧光定量PCR的内参基因的筛选方法。
背景技术
在林木遗传育种中，基因表达模式探究普遍且重要。实时荧光定量PCR是基因表达模式研究中最常用的核酸定量技术，它具有更高的灵敏度，更好的特异性和更宽的检测范围。初始样品量，RNA完整性、cDNA合成效率等可能存在的一些差异，会影响实时荧光定量PCR结果的准确性。因此，筛选合适的内参基因是实时荧光定量PCR的重要前提条件。
许多研究已经筛选出一些内参基因，如肌动蛋白（ACT），核糖体RNA（18S rRNA或28S rRNA）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。这些基因与基本细胞过程有关，如核糖体生物合成，糖酵解代谢，蛋白质折叠和细胞骨架构成等。然而，研究发现一些常用的内参基因在特定的植物物种、不同器官组织以及特定环境条件下的表达并不稳定。例如，18S rRNA在马铃薯块茎中表达不稳定，而对水稻来说却是合适的内参基因。因此，有必要为特定植物物种筛选适合的内参基因。为了筛选最合适的内参基因，已经开发出多种分析软件来评价内参基因表达的稳定性，如NormFinder，geNorm和BestKeeper。
海滨木槿（Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc）一般生长在沿海盐碱地的公共绿地，属于锦葵科（Malvaceae）木槿属（Hamabo），是一种重要的半红树植物。因其具有优良的耐盐性，海滨木槿被认为是重盐土地生态修复的良好选择。当NaCl浓度达到1.1％~1.5％时，海滨木槿仍然可以保持正常生长状态，是研究木本植物耐盐机制的良好材料。然而，关于海滨木槿内参基因的鉴定工作还未有相关报道。
本发明选择了10个候选内参基因，旨在找到一种海滨木槿开展实时荧光定量PCR研究最稳定，最合适的内参基因的筛选方法，为以后大规模开展基因特性及功能研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。
本发明所述的一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，按下列步骤进行：
（1）利用海滨木槿转录组测序数据，挑选10个海滨木槿候选内参基因，并以挑选的10个海滨木槿序列为模板设计了10对实时荧光定量PCR的内参基因引物，其中10个内参基因的核苷酸序列及设计的10对实时荧光定量PCR引物序列为：
海滨木槿（Hibiscus hamabo Sieb. et Zucc.）肌动蛋白（ACT）核苷酸序列为SEQID NO.1。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物ACT-F：GGCACCTCTCAACCCCAAGG（SEQ ID NO.2）
反向引物ACT-R：GAGAGAACGGCCTGGATGGC（SEQ ID NO.3）
扩增长度：102 bp；扩增效率（%）：94.5；线性关系：0.98
海滨木槿小核RNA U6（U6）核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物U6-F：ACCGGCGGTGGAGAAGAAGA（SEQ ID NO.5）
反向引物U6-R：ACGCACTTCAACCTGGCGAT（SEQ ID NO.6）
扩增长度：112 bp；扩增效率（%）：95.1；线性关系：0.98
海滨木槿延伸因子（EF1α）核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物EF1α-F：AACCACCCAGGCCAAATCGG（SEQ ID NO.8）
反向引物EF1α-R：ACCATGGGCTTGCTGGGAAC（SEQ ID NO.9）
扩增长度：191 bp；扩增效率（%）：94.1；线性关系：0.97
海滨木核糖体RNA（18S）核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物18S -F：GGTCGGATTTGGAACGGCGA（SEQ ID NO.11）
反向引物18S -R：CTCCACGGGCGTATCGAGG（SEQ ID NO.12）
扩增长度：106 bp；扩增效率（%）：107.9；线性关系：1.03
海滨木槿核糖体蛋白（S13）核苷酸序列为SEQ ID NO.13。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物S13 -F：GCCCATGGTCTTGCTCCTGA（SEQ ID NO.14）
反向引物S13 -R：GTAATAGCGGGCAAGGCGGT（SEQ ID NO.15）
扩增长度：159 bp；扩增效率（%）：93.7；线性关系：0.97
海滨木槿微管蛋白（TUB）核苷酸序列为SEQ ID NO.16。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物TUB -F：ATCGGTCAGGCCGGTATCCA（SEQ ID NO.17）
反向引物TUB -R：AGTCGGCTCCAGGTCCACAA（SEQ ID NO.18）
扩增长度：195 bp；扩增效率（%）：105.4；线性关系：1.02
海滨木槿泛素缀合酶E2（UBC）核苷酸序列为SEQ ID NO.19。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物UBC -F：TCCTGCGAGGAAGAGGCTGAT（SEQ ID NO.20）
反向引物UBC -R：GGGTGTCATCCGGCCCAAAT（SEQ ID NO.21）
扩增长度：131 bp；扩增效率（%）：103.6；线性关系：1.02
海滨木槿组蛋白（HIS）核苷酸序列为SEQ ID NO.22。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物HIS -F：GCTACCAAGGCTGCCCGAAA（SEQ ID NO.23）
反向引物HIS -R：AGCATGGCTCTGGAAACGCA（SEQ ID NO.24）
扩增长度：204 bp；扩增效率（%）：99.8；线性关系：0.97
海滨木槿甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）核苷酸序列为SEQ ID NO.25。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物GAPDH -F：GGAGAGGTGGTAGGGCTGCT（SEQ ID NO.26）
反向引物GAPDH -R：CGTCGACAGTGGGAACACGG（SEQ ID NO.27）
扩增长度：132 bp；扩增效率（%）：93.5；线性关系：0.97
海滨木槿Ski相关蛋白（SKIP）核苷酸序列为SEQ ID NO.28。
实时荧光定量PCR引物序列：
正向引物SKIP -F：TGAAGATGTGCCTCCACGCC（SEQ ID NO.29）
反向引物SKIP -R：AGAGGGCAACTGCGACCAAT（SEQ ID NO.30）
扩增长度：265 bp；扩增效率（%）：108.6；线性关系：1.04
（2）分别选取干旱，高盐，低温，高温，脱落酸，水杨酸，茉莉酸甲酯共7种处理后0、1、6、12、24和48 h的海滨木槿幼苗的叶片组织以及嫩根、老叶，嫩叶，花托，花瓣，雄蕊共6种器官组织为实验材料，进行实时荧光定量实验；
（3）将实时荧光定量PCR得到的数据导入三个常用的内参稳定性评价软件geNorm，NormFinder和BestKeeper进行内参稳定性和内参数目分析，筛选出最优内参基因和内参基因组合。
（4）步骤（1）中所述的内参基因为肌动蛋白（ACT），小核RNA U6（U6），延伸因子（EF1 α），18S核糖体RNA（18S），核糖体蛋白（S13），微管蛋白（TUB），泛素缀合酶E2（UBC），组蛋白（HIS），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和Ski相关蛋白（SKIP）。
（5）步骤（2）中干旱，高盐，低温，高温，脱落酸，水杨酸，茉莉酸甲酯共7种处理的材料为经各种处理后0、1、6、12、24和48 h的海滨木槿幼苗的叶片组织。6种器官组织材料为10年生海滨木槿的嫩根，老叶，嫩叶，花托，花瓣，雄蕊组织
（6）步骤（2）中非生物胁迫处理的条件为：分别用15%聚乙二醇6000，400 mM氯化钠模拟干旱和高盐胁迫；将海滨木槿幼苗分别置于温度4°C和温度42°C培养箱中，模拟低温和高温胁迫。激素处理的条件为：分别用1 mM 茉莉酸甲酯（MeJA），200 μM水杨酸甲酯（SA）和200 μM脱落酸（ABA）喷洒海滨木槿幼苗，至叶片完全湿润为止。所有处理均在取样后，立即置于液氮中，并迅速置于-80°C冰箱中保存。
（7）步骤（2）中实时荧光定量PCR模板均为1 µg RNA反转得到的cDNA的10倍稀释液，且荧光定量PCR程序为：第一步是预变性：温度95°C-10 min；第二步是PCR反应阶段，温度95°C-15 s，60°C-30 s，72°C-30 s，40个循环，收集荧光信号；第三步是溶解曲线分析，温度60°C-95°C，温度60°C在30 s逐步升至95°C。
（8）本发明所述的海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，该方法中所述10个基因的序列设计适合荧光定量PCR实验的PCR引物，用实时荧光定量PCR生成的熔解曲线来判断引物的特异性，并做标准曲线来判断该内参基因的扩增效率等。
本发明的有益效果
（1）本发明针对耐盐植物海滨木槿稳定内参基因研究空白，以转录组数据为基础，选择了10个候选内参基因，并设计特异的实时荧光定量PCR引物。
（2）本发明用3个内参分析软件分析10个候选内参基因的表达稳定性，得出本发明中多处理下最稳定的内参基因是ACT和SKIP。
（3）本发明筛选的内参基因，可提高以海滨木槿为材料，研究其抗逆分子生物学的准确性和可靠性。
附图说明
图1为本发明10个候选内参基因的溶解曲线图。
图2为本发明不同内参基因的实时定量PCR得到的Cq值图。
图3为geNorm软件分析的最优内参基因排序图，其中←为最不稳定的内参，→为最稳定的内参。
图4为geNorm软件分析的最优内参数目结果图。
图5为NormFinder软件分析的最优内参基因排序图，其中←为最不稳定的内参，→为最稳定的内参。
图6为BestKeeper软件分析的最优内参基因排序图，其中←为最不稳定的内参，→为最稳定的内参。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
下列实施例中，按常规实验操作进行；
实施例1. 内参基因的选定
本发明从已有的海滨木槿转录组数据库中挑选10个候选内参基因，设计各内参基因实时荧光定量PCR特异引物。
候选内参基因序列的比对分析：将候选基因序列提交NCBI里的BLASTX进行比对分析，海滨木槿中的各个内参基因序列与近缘物种同源基因的序列一致性均在85%以上，大部分均在90%以上。与模式植物拟南芥的序列一致性在83%以上。比对结果见表1。
表格 内参基因BLASTX比对分析
实时荧光定量PCR 引物设计和验证：以候选基因序列为模板，用金斯瑞在线引物设计软件（https：//www.genscript.com/tools/pcr-primers-designer）设计荧光定量特异引物，用实时荧光定量PCR生成的溶解曲线来判断引物的特异性，并做标准曲线来判断该内参基因的扩增效率等。以海滨木槿不同组织及各种非生物胁迫和激素处理下的海滨木槿叶片组织为实验材料，提取RNA，反转录成cDNA，以上述10个基因的序列为模板设计适合荧光定量PCR实验的特异引物进行实时荧光定量PCR实验。标准曲线的制作均是以未受处理的海滨木槿1 µg的RNA反转得到的cDNA经梯度稀释后为模板做荧光定量PCR得到的，包括101、102、103和104五个模板梯度，候选内参基因荧光定量引物及序列信息见表2：
表格2 候选内参基因荧光定量引物及序列信息
如表2所示，各候选内参基因实时荧光定量PCR的片段大小均在100-270 bp范围内，且Tm值在58~62°C范围内，各内参基因的扩增曲线，标准曲线均良好。如各内参基因的荧光定量PCR的溶解曲线分析（图1）所示各内参基因特异性良好。以上数据证明了设计的内参引物符合要求，可继续后续荧光定量PCR实验。
实施例2. 实时荧光定量PCR实验
实验材料分两组，一组是海滨木槿嫩叶，经干旱，高盐，低温，高温，脱落酸，水杨酸，茉莉酸甲酯共7种非生物胁迫处理0、1、6、12、24和48 h；另一组是组织器官，为10年生海滨木槿的嫩根，老叶，嫩叶，花托，花瓣，雄蕊。植物处理材料的收集具体如下：一组材料以海滨木槿幼苗为材料，分别用15%聚乙二醇6000，400 mM氯化钠模拟干旱和高盐胁迫；将海滨木槿幼苗分别置于温度4°C和温度42°C培养箱中，模拟低温和高温胁迫。激素处理的条件为：分别用1 mM 茉莉酸甲酯（MeJA），200 μM水杨酸甲酯（SA）和200 μM脱落酸（ABA）喷洒海滨木槿幼苗，至叶片完全湿润为止。实验用材料为经各种处理后0、1、6、12、24和48 h的海滨木槿幼苗的叶片组织。另一组材料为10年生海滨木槿的嫩根，老叶，嫩叶，花托，花瓣，雄蕊组织。所有样品均在取样后，立即置于液氮中，并迅速置于-80°C冰箱中保存
使用Qiagen 的Plant RNeasy Mini Kit试剂盒提取各样本的RNA，进行RNA质检（紫外分光光度检测），所有样本均用1 µg RNA进行反转录，反转录采用的是Takara的PrimeScript 反转录试剂盒，具体反应体系和程序如下：5 × Prime Script Buffer：4 μl；PrimerScript 反转录酶混合液：1 μl；Oligo dT和random six mers 引物（50 μM）：1 μl；总RNA：1 μg；去RNA 酶的水：up to 20 μ1。反转录反应条件温度37°C，时间30 min；温度85°C，时间5 s。以上述反转的cDNA的10倍稀释液为模板，用各荧光定量PCR特异引物进行实时荧光定量PCR反应。
利用各内参基因的荧光定量引物扩增多种条件下的cDNA：荧光定量的仪器为StepOnePlus实时荧光定量PCR仪，实时荧光定量PCR采用的是Bimake的SYBR，反应体系如下：2 × SYBR Green Master Mix：10 µl；cDNA：1 µl；上游引物（10 µM）：0.4 μl；下游引物（10 µM）：0.4 μl；ddH2O：7.2 µl。反应程序：95°C预变10 min；95°C解链15 s，60°C退火30s，72°C延伸30 s，反应40个循环；60°C-95°C温度（30 s逐步升至95°C），每0.5°C收集一次荧光信号，实时荧光定量PCR得到的所有内参基因的Cq平均值见图2。
如图2所示，10个内参基因在7种处理（干旱，高盐，低温，高温，脱落酸，水杨酸，茉莉酸甲酯）和6种器官组织（10年生海滨木槿的嫩根，老叶，嫩叶，花托，花瓣，雄蕊组织）的实验条件下，相对表达量差异较大。在所有内参基因中，18S核糖体RNA（18S）表达丰度最高（Cq值最小），组蛋白（HIS）基因表达丰度很低（Cq值最大）。微管蛋白（TUB）的Cq值在24.31到30.81之间，变化范围最宽，而小核RNA U6（U6）的表达量变化范围最窄。
实施例3. 全部样本下内参基因的geNorm，NormFinder和BestKeeper软件评价
geNorm软件
本发明中，所述geNorm软件的下载地址为https://genorm.cmgg.be/，其步骤和标准如下：
本发明中，geNorm首先通过计算表达稳定度平均值（M）实现了10个内参基因表达稳定度的排序，结果显示全部样本下，最稳定两个内参基因是肌动蛋白（ACT）和SKI相关蛋白（SKIP）（图3），最不稳定的是微管蛋白（TUB），各内参基因的稳定性排序如下：肌动蛋白（ACT）和SKI相关蛋白（SKIP）>小核RNA U6（U6）>核糖体蛋白S13（S13）>泛素结合酶E2（UBC）>甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）>18S核糖体RNA（18S）>延伸因子（EF1α）>组蛋白（HIS）>微管蛋白（TUB）。然后geNorm又计算出配对变异系数V，结果得到V7/8=0.140<0.15（图4），因此，对于海滨木槿的定量研究，全部样本下需要用七个内参基因来共同校正和标准化就能得到准确的定量。所需的内参基因分别是肌动蛋白（ACT）、SKI相关蛋白（SKIP）、小核RNA U6（U6）、核糖体蛋白S13（S13）、泛素结合酶E2（UBC）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和18S核糖体RNA（18S）。
NormFinder软件
本发明中，所述NormFinder软件的下载地址为https://moma.dk/normfinder-software，其步骤和标准如下：
NormFinder分析的内参稳定性结果见图5，与geNorm预测结果一致，经NormFinder分析后，最稳定的内参基因仍然是肌动蛋白（ACT），其次是SKI相关蛋白（SKIP），最不稳定的是组蛋白（HIS）（图5），具体的稳定性排序为：肌动蛋白（ACT）>SKI相关蛋白（SKIP）>小核RNA U6（U6）>核糖体蛋白S13（S13）>甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）>延伸因子1α（EF1α）>18S核糖体RNA（18S）>泛素结合酶E2（UBC）>微管蛋白（TUB）>组蛋白（HIS）；
BestKeeper软件
本发明中，所述BestKeeper软件的下载地址为https://www.gene-quantification.de/bestkeeper.html。其步骤和标准如下：
直接将各样品各基因的Cq值输入Excel表格中，导入BestKeeper软件中进行内参稳定性分析。根据BestKeeper综合排序后结果如下：肌动蛋白（ACT）>核糖体蛋白S13（S13）>SKI相关蛋白（SKIP）>甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）>小核RNA U6（U6）>18S核糖体RNA（18S）>延伸因子1α（EF1α）>泛素结合酶E2（UBC）>微管蛋白（TUB）>组蛋白（HIS），排序结果与GeNorm和NormFinder基本一致（图6）。
3个软件的综合分析
对三个软件的稳定性排序综合整理见表3：
表格 3 三个软件的稳定性排序
从表3结果表明：虽然三个软件的算法不同，但是得到的内参稳定性排序基本一致，说明了本实验结果的可靠性，即肌动蛋白（ACT）和SKI相关蛋白（SKIP）是最稳定的两个候选内参基因，最不稳定的内参基因是组蛋白（HIS）和微管蛋白（TUB），其它基因的稳定性居中。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1131
<212> DNA
<213> 木槿属海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
<400> 1
atggccgatg gtgatgatat tcagcccctc gtctgtgaca atgggaccgg aatggtgaag 60
gctggtttcg ctggtgatga tgctcccagg gctgtttttc ccagtattgt tggtcgtccc 120
agacacactg gtgttatggt tgggatgggt cagaaggatg cctatgtagg agatgaggca 180
caatctaaaa gaggtattct gacattgaaa tatcctattg agcatggtat tgttagcaac 240
tgggatgata tggaaaagat ctggcatcat actttctaca atgagctccg tgttgctccc 300
gaggagcacc ctgtgcttct cacagaggca cctctcaacc ccaaggccaa tagagaaaag 360
atgacccaga tcatgtttga gaccttcaat gtacctgcca tgtacgttgc catccaggcc 420
gttctctctt tgtatgctag tggtcgtaca acaggtattg tgctggattc cggtgatggt 480
gtttctcaca ctgtgccaat ctacgaaggg tatgcccttc cacatgccat cctccgtctt 540
gatcttgctg gtcgtgatct cactgatgct ttgatgaaga tccttaccga gagaggttac 600
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tacaactcta taatgaagtg tgatgttgat atcaggaaag atctctacgg taacattgtg 900
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gtctggattg gaggatctat cttggcatcg ctcagcacct tccagcagat gtggatttcc 1080
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
<400> 2
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 654
<212> DNA
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ggagaagaag atggtaaaaa agttgaaagt gaagaagaag aagaagaaga tgatgatgat 180
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tgtccttacc ttgatactgt taatcgtcag gtgctagatt ttgattttga gaggttttgt 300
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acgcacttca acctggcgat 20
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<212> DNA
<213> 木槿属海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
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<213> 人工序列(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
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ggaacgtacc gccagctctt ccaccctgag caactcatca gtggcaaaga agatgctgct 300
aacaatttcg cccgtggtca ttatacaatt ggcaaagaga ttgttgatct ctgcttagat 360
cgcatccgaa agcttgctga taactgtact ggcctccaag gcttcttggt tttcaatgct 420
gttggtggtg gtactggttc tgggcttgga tctcttctct tggagcgtct ctctgtcgac 480
tatggaaaga agtcgaagct tgggttcacc gtctatcctt cacctcaggt ttctacatct 540
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atgtcgactc ctgcgaggaa gaggctgatg agggatttta agaggttgca gcaagatcct 60
cctgctggaa ttagtggtgc tcctcaagat aacaacatta tgctctggaa tgctgttata 120
tttgggccgg atgacacccc atgggatgga ggtacgttta agctgacact tcagttcacg 180
gaggattatc caaacaagcc acctacggtt cgttttgtat ctcgaatgtt ccatccaaat 240
atttatgctg atggaagcat ctgtttggac attctacaaa atcaatggag tccaatttat 300
gatgtagctg caatactgac atctattcag tcattgcttt gtgatccaaa tccaaactcc 360
cctgcaaatt cagaagctgc tcggatgttt agtgagaaca agcgtgaata caataggaga 420
gtacgtgaga ttgtcgagca gagttggact gccgat 456
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
<400> 20
tcctgcgagg aagaggctga t 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
<400> 21
gggtgtcatc cggcccaaat 20
<210> 22
<211> 408
<212> DNA
<213> 木槿属海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
<400> 22
atggcccgta ccaagcaaac tgcccgtaag tcgactggag gaaaggcccc taggaagcaa 60
cttgctacca aggctgcccg aaaatctgcc cccaccactg gtggagtgaa gaagcctcac 120
cgataccgtc ctggaactgt tgctcttcgt gaaatccgta agtaccagaa gagcactgag 180
cttctcatca ggaaattgcc cttccagagg cttgttcgtg aaattgccca ggacttcaag 240
actgatttgc gtttccagag ccatgctgtc cttgctcttc aggaagctgc agaggcatac 300
ctggtgggtc ttttcgaaga caccaacttg tgtgctatcc acgccaagcg tgttaccatc 360
atgcccaagg acattcagtt ggctcgcagg atcaggggcg agcgtgcc 408
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
<400> 23
gctaccaagg ctgcccgaaa 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
<400> 24
agcatggctc tggaaacgca 20
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<211> 1011
<212> DNA
<213> 木槿属海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
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atggggaaga ttaagatcgg aatcaacgga tttggaagga tcggtcgttt ggttgcgaga 60
gttgctctcc aaagcgaaga tgttgaactc gttgccgtta acgatccttt catcaccact 120
gattacatga cctacatgtt caagtacgac agtgttcatg gtcaatggaa acacaatgag 180
cttaaggtga aggactcaaa gacccttctc tttggtgaaa aggctgtcac tgttttcggc 240
atcagaaacc ctgaggaaat tccctgggct gaggctggag ctgaatttgt tgttgagtct 300
actggtgttt tcaccgacaa agataaagct gctgctcact tgaagggtgg tgcaaagaag 360
gtgatcattt ctgctcccag taaggatgcc cctatgtttg ttgtcggtgt aaatgagaag 420
gagtacaagc ctgaccttaa cattgtctcc aatgctagct gcactaccaa ctgccttgct 480
ccattggcta aggttataaa tgacaaattt ggaatcattg agggtcttat gaccactgtc 540
cactcaatca ctgctaccca gaagactgtt gatggtccat caatgaagga ctggagaggt 600
ggtagggctg cttccttcaa tatcattcca agcagcactg gagctgccaa ggctgttggc 660
aaagtgttgc cggcactgaa tggcaagctg actggaatgg ctttccgtgt tcccactgtc 720
gacgtctctg tggttgacct caccgtgagg ctcgagaaga aggcttctta cgaagatatc 780
aaggctgcta tcaaggaggc atccgaaacc accatgaagg gaattctcgg ttatgtagat 840
gaagatttgg tctcaaccga ctttgttgga gacagcaggt caagcatctt tgatgccaag 900
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ggatacagtt ctcgagtggt cgacttgatc cgacacatgg cttctgccaa g 1011
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<213> 木槿属海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)
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atgtggagat ccattgacat gcacaacttt ggtgaattat gggacatgga ctatgaccta 60
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tacttt 786
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agagggcaac tgcgaccaat 20
Claims (5)
1.一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于按下列步骤进行：
（1）利用海滨木槿转录组测序数居，挑选10个海滨木槿内参候选基因，并以挑选的10个海滨木槿序列为模板设计了10对实时荧光定量PCR的内参基因引物，其中10个内参基因的核苷酸序列及设计的10对实时荧光定量PCR引物序列为SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.30.
（2）分别选取干旱、高盐、低温、高温、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯共7种处理叶片组织以及嫩根、老叶、嫩叶、花托、花瓣、雄蕊共6种器官组织为实验材料，进行实验.
（3）将实时荧光定量PCR得到的数据导入geNorm，NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和内参基因组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述的内参基因为肌动蛋白（ACT），小核RNA U6（U6），延伸因子（EF1α），18S核糖体RNA（18S），核糖体蛋白（S13），微管蛋白（TUB），泛素缀合酶E2（UBC），组蛋白（HIS），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），Ski相关蛋白（SKIP）。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中干旱，高盐，低温，高温，脱落酸，水杨酸，茉莉酸甲酯共7种处理的材料为经各种处理后0、1、6、12、24和48 h的海滨木槿幼苗的叶片组织. 6种器官组织材料为10年生海滨木槿的嫩根，老叶，嫩叶，花托，花瓣，雄蕊组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中非生物胁迫处理的条件为：分别用15%聚乙二醇6000，400 mM氯化钠模拟干旱和高盐胁迫；将海滨木槿幼苗分别置于温度4°C和温度42°C培养箱中，模拟低温和高温胁迫. 激素处理的条件为：分别用1 mM 茉莉酸甲酯 （MeJA），200 μM水杨酸甲酯（SA）和200 μM脱落酸（ABA）喷洒海滨木槿幼苗，至叶面完全湿润为止。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中实时荧光定量PCR模板均为1 µgRNA反转得到的cDNA的10倍稀释液，且荧光定量PCR程序为：95°C预变10 min；95°C解链15s，60°C退火30 s，72°C延伸30 s，反应40个循环；60°C-95°C，60°C在30s逐步升至95°C。
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