CN104131107A - 高通量筛选玉米内参基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高通量筛选玉米内参基因的方法，该方法利用源于具有高度多样性的不同玉米自交系、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后构建的高通量转录组测序(RNA-seq)数据库，大规模分析整个转录组的表达情况，筛选在不同发育时期、不同条件下表达最恒定的基因作为内参基因，为转录组表达研究提供准确的对照。本方法利用整个转录组数据，分析全基因组所有表达的基因，系统性地筛选玉米内参基因，相对传统筛选方法更加准确、可靠。

Description

高通量筛选玉米内参基因的方法
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，尤其涉及一种高通量筛选玉米内参基因的方法。
背景技术
基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在脱氧核糖核酸(DNA)序列中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。该过程决定了细胞的分化及形态的发生。每个基因转录产生信使核糖核酸(mRNA)的量，受到时空等多种因素的调控，最终影响个体的生长发育、形态结构及生物学功能。基因调控是现代分子生物学研究的中心课题之一。为研究基因表达调控的机制就必须了解不同基因在特定条件下的表达水平。在检测基因表达量时取样、上样等实验操作会对结果产生影响。为消除实验误差，就必须使用内源性参照基因作为参照物。在理论上，内参基因在各组织和细胞中的表达恒定，在检测基因的表达水平变化时作为参照物，用于校正实验误差，保证结果的准确性。
常用的内源性参照基因多为已知持家基因，这类基因是指所有细胞中均表达的一类基因，其产物对维持细胞基本生命活动是必需的，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。早期人们认为持家基因在不同组织和不同发育时期的表达量也是一致的，但随着研究的深入，人们发现不同持家基因在不同条件下的表达量也有差异。因此，发掘表达恒定的内参基因对基因表达调控的研究至关重要。
目前，玉米内参基因的筛选主要是先选择几个或十几个候选持家基因，然后分析比较它们在不同条件下的表达变异，选择相对表达最稳定的一个作为内参基因。需要说明的是，这种方法筛选内参基因的覆盖面非常低，其是根据之前界定的部分持家基因，仅仅比较部分持家基因的表达稳定性，数据量太小，不足以筛选出真正表达稳定的内参基因。
发明内容
本发明要解决的技术问题是解决现有技术中筛选内参基因的方法覆盖面较低，数据量较小，不足以选择出真正表达稳定的内参基因的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种高通量筛选玉米内参基因的方法，选择源于具有高度多样性的不同玉米自交系、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后构建的高通量转录组测序(RNA-seq)数据库，其筛选步骤如下：
(1)利用SolexaQA软件将RNA-seq的数据进行过滤，除去比较差的数据，留下质量较高的序列；
(2)利用Bowtie软件将得到的序列锚定到参考基因组上，当一个序列能够锚定到基因组上的不同位点，则除去该序列，只选择在基因组中有单一位点的序列；
(3)使用Cufflinks软件计算各转录本的FPKM值(fragments perkilobase of transcript per million mapped reads)，去掉FPKM小于10的转录本，余下的转录本用于后续分析；
(4)利用NormFinder软件计算所有基因在不同条件下的表达稳定性系数，选取不同RNA-seq数据库中都能达到前20％稳定表达的基因，并整合分析不同品种、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后得到的所有RNA-seq数据库，筛选在不同RNA-seq数据库中都能稳定表达的基因作为候选内参基因；
(5)选取不同品种进行胁迫处理，在不同发育时期取样提取RNA，根据候选内参基因的序列设计特异引物，通过qPCR检测候选内参基因及现有内参基因的表达水平，利用NormFinder计算各内参基因在不同条件下的表达稳定性系数，比较候选内参基因与现有内参基因在不同材料及不同处理条件下的表达稳定性，选择最优内参基因。
进一步的，所述步骤(1)中比较差的数据为Phred值低于20、长度小于20bp的数据。
本发明的高通量筛选玉米内参基因的方法，其有益效果包括：
(1)使用高通量转录组测序(RNA-seq)的数据，大规模分析整个转录组的表达情况，筛选在不同发育时期、不同条件下表达最恒定的基因作为内参基因，系统性筛选地内参基因相对现有内参基因更加准确、可靠。
(2)使用高通量转录组测序(RNA-seq)的数据，能够同时筛选整个玉米基因组所有的表达基因，大大提高了选择的效率。
(3)目前已知源于不同品种、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理的RNA-seq数据库已经超过50个，属于公开资源，可直接在网站上下载使用，通过数据分析选择出候选内参基因后，再通过qPCR验证其表达稳定性，大大减少了实验工作量，降低了实验成本。
附图说明
图1为本实施例高通量筛选玉米内参基因方法的流程图；
图2为利用本实施例高通量筛选玉米内参基因方法获得的内参基因(DPP9、DUF)与现有内参基因(ACT和GAPDH)的表达稳定性示意图。
具体实施方式
下述实施例中实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
下面结合附图与具体实施方式对本发明的高通量筛选玉米内参基因的方法作进一步的详细说明。
本实施例为高通量筛选玉米内参基因的方法，选择源于具有高度多样性的不同玉米自交系、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后构建的高通量转录组测序(RNA-seq)数据库，其筛选步骤如图1所示，包括：
(1)利用SolexaQA软件将RNA-seq的数据进行过滤，除去Phred值低于20、长度小于20bp的质量比较差的数据，留下质量较高的序列；
(2)利用Bowtie软件将测序得到的序列锚定到参考基因组上，当一个序列能够锚定到基因组上的不同位点，则除去该序列，只选择在基因组中有单一位点的序列；
(3)使用Cufflinks软件计算各转录本的FPKM值(fragments perkilobase of transcript per million mapped reads)，去掉FPKM小于10的转录本，余下的转录本用于后续分析；
(4)利用NormFinder软件计算所有基因在不同条件下的表达稳定性系数，选取不同数据库中都能达到前20％稳定表达的基因，整合分析不同品种、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后得到的所有RNA-seq数据库，筛选在不同数据库中都能达到前20％稳定表达的基因作为候选内参基因；
(5)选取9个不同玉米品种(B73、Mo17、Z1144、Ky21、M37W、M162W、Mo14、Mo28以及Mo51)，种子发芽24小时后移栽至盆钵中。从三叶期开始进行氮处理，每隔两天施尿素一次，对照组只浇水。发芽20天、40天后取叶片利用TRIzol方法提取RNA，用TransScript gDNA去除及cDNA合成试剂盒反转录为cDNA。随机选择两个候选内参基因DPP9、DUF(序列号分别为：GRMZM2G174572，GRMZM2G163888)，根据候选内参基因及现有内参基因ACT和GAPDH(序列号分别为：GRMZM2G126010，GRMZM2G046804)的序列用软件Primer(3)设计引物，其引物如表1所示。
表1通过Primer3设计的内参基因的qPCR引物序列
基因名称 正向引物 反向引物
DPP9 TTGTGCGGTGTCTGGTGCTC TTGCCGTGTGCCTGAAATGC
DUF GCGGCAGTTCCCACCTCAAG AGTTGTTGTTGCTGCTGCTGTG
ACT TGGCTGGGTGGTGCGATATTG CAACCCGTGCTAGTTCAAAGGC
GAPDH GAATCAACGGCTTCGGAAGGAT CCTCAGGGTTCCTGATGCCAAA
用Bio-RadCFX96系统运行qPCR检测各内参基因的表达水平(见表2)，利用NormFinder软件计算各内参基因的表达稳定性系数。如图2所示，通过qPCR比较利用本专利技术获得的内参基因(DPP9、DUF)与现有内参基因(ACT和GAPDH)的表达稳定性，利用本实施例的高通量筛选玉米内参基因的方法获得的内参基因(DPP9、DUF)的表达稳定性明显优于现有内参基因(ACT和GAPDH)的表达稳定性(表达稳定性系数越小越稳定)。
表2用qPCR检测出的各基因的表达水平值
品种 处理 DPP9 DUF GAPDH ACT 时期
B73 低氮 28.94 28.19 22.80 30.32 20天
B73 高氮 33.07 31.00 27.77 31.67 20天
ky21 低氮 26.71 26.60 23.65 30.69 20天
ky21 高氮 29.30 29.30 28.04 31.15 20天
M162W 低氮 27.27 26.74 24.79 30.87 20天
M162W 高氮 29.44 24.48 30.34 32.12 20天
M37W 高氮 30.32 29.33 31.62 31.74 20天
M37W 低氮 34.16 31.21 34.31 31.67 20天
Mo014 低氮 25.78 24.30 30.61 28.82 40天
Mo014 高氮 27.10 26.54 28.86 30.51 40天
Mo028 低氮 25.25 24.68 25.26 29.22 40天
Mo028 高氮 34.37 31.68 31.58 36.95 40天
Mo051 高氮 24.95 24.41 24.84 29.13 40天
Mo051 低氮 25.29 24.76 25.25 29.39 40天
Mo17 高氮 31.10 29.73 32.87 31.81 20天
Mo17 低氮 34.47 31.78 30.06 30.14 20天
Z1144 高氮 31.85 32.82 33.63 33.33 20天
Z1144 低氮 38.73 34.25 36.28 33.78 20天
特别说明的是，本发明的高通量筛选玉米内参基因的方法同样适用于已建立RNA-seq数据库的所有物种，除玉米外，还适用于水稻、大豆等。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.高通量筛选玉米内参基因的方法，其特征在于：选择源于具有高度多样性的不同玉米自交系、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后构建的高通量转录组测序(RNA-seq)数据库，其筛选步骤如下：
(1)利用SolexaQA软件将RNA-seq的数据进行过滤，除去比较差的数据，留下质量较高的序列；
(2)利用Bowtie软件将得到的序列锚定到参考基因组上，当一个序列能够锚定到基因组上的不同位点，则除去该序列，只选择在基因组中有单一位点的序列；
(3)使用Cufflinks软件计算各转录本的FPKM值(fragments per kilobase oftranscript per million mapped reads)，去掉FPKM小于10的转录本，余下的转录本用于后续分析；
(4)利用NormFinder软件计算所有基因在不同条件下的表达稳定性系数，选取不同数据库中都能达到前20％稳定表达的基因，并整合分析不同品种、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后得到的所有RNA-seq数据库，筛选在不同数据库中都能稳定表达的基因作为候选内参基因；
(5)选取不同品种进行胁迫处理，在不同发育时期取样提取RNA，根据候选内参基因的序列设计特异引物，通过qPCR检测候选内参基因及现有内参基因的表达水平，利用NormFinder软件计算各内参基因在不同条件下的表达稳定性系数，比较候选内参基因与现有内参基因在不同材料及不同处理条件下的表达稳定性，选择最优内参基因。
2.按照权利要求1所述的高通量筛选玉米内参基因的方法，其特征在于：所述步骤(1)中比较差的数据为Phred值低于20、长度小于20bp的数据。
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