CN110689925A - 一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法，包括高温处理下玉米的基因差异表达，设定差异表达基因的筛选条件，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因；设定特定的筛选标准,通过BlastX比对,筛选出参与玉米高温胁迫的数个unigene，并对基因的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类。本发明以玉米内在的遗传基因作为起点，基于转录组对耐高温玉米的基因进行分析，筛选出耐高温胁迫的基因型，来培育耐高温胁迫的新玉米品种或者种质资源，达到玉米高产稳产的目的。

Description

一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法
技术领域
本发明涉及耐高温玉米基因挖掘技术领域，具体涉及一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法。
背景技术
玉米是我国重要的粮、经、饲作物，在玉米生产过程中,温度是重要的生态因子,适宜的环境温度是高产所必需的先决条件之一,温度过低或过高都会严重影响玉米的生长发育。黄淮海平原是我国重要的夏玉米产区,花期是玉米对高温胁迫最为敏感的时期,主要影响穗的发育。因此，需要选育和推广耐热性较强的玉米品种，从而减少高温热害损失来实现玉米的高产稳产以及增加经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明包括以下步骤：
步骤一：在高温环境下处理培养玉米，获得实验组和对照组组织样本；
步骤二：对实验组和对照组组织样本进行转录组测序：从玉米的相关组织中提取RNA,然后对这些组织样品单细胞所有RNA进行测序获得结果,最后整理分析转录组数据,制作包括玉米样本名称、序列的绝对路径及序列方向的样品文件，并对照参考基因组进行分析；
步骤三：转录组测序质量评价：质量评价结果可以反映本转录组测序的质量高低,若本转录组测序的质量较高，则可以进行后续的生物信息分析；
步骤四:高温处理下玉米的基因差异表达：采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选出P值小于0.05的GO和基因通路，GO注释说明基因的基本功能，KEGG说明基因所参与的代谢通路，设定差异表达基因的筛选条件，所述差异表达基因的筛选条件包括筛选指标FDR小于0.01,Log2FC大于1，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因；
步骤五:对总的差异表达基因的KEGG和GO功能分析：对差异表达基因进行注释可进一步了解基因所参与的功能或代谢通路；
步骤六：对特异上调表达的差异基因的KEGG和GO注释分析：可进一步了解特异上调表达的差异基因所参与的功能或代谢通路；
步骤七：结果分析与玉米耐高温相关基因的挖掘：以Log2FC大于2，差异表达基因长度大于600bp，覆盖度大于85％，同源度大于95％作为筛选条件通过BlastX比对,筛选出参与玉米高温胁迫的数个unigene，并对基因的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类，以这些差异表达基因的log10RP-KM作热图分析,筛选出RPKM值大于240的玉米基因判断该基因在玉米中都发挥耐高温的作用。
作为优选，所述玉米组织样本优选的组织是玉米花粉/叶片。
作为优选，所述高温环境为至少40-50度，高温处理于玉米吐丝期前约7天开始进行,通过塑料薄膜覆盖升温,大棚两侧各预留出20％缝隙,用于气体交换,吐丝8天后处理结束后对提取玉米相关组织进行测定。
作为优选，步骤三可将总的clean Reads比对到参考基因组上，若比对率Q30满足标准，样品间的GC含量误差小于1％，则说明转录本测序的质量高则进入下一步骤。
作为优选，分析结果产生后还包括对差异表达基因的qRT-PCR验证：选取几个差异表达基因进行qRT-PCR验证，若DEGs的表达模式与转录组测序结果一致，则说明此次实验测序结果正确。
本发明的有益效果在于：
本发明以玉米内在的遗传基因作为起点，基于转录组对耐高温玉米的基因进行分析，筛选出耐高温胁迫的基因型，来培育耐高温胁迫的新玉米品种或者种质资源，达到玉米高产稳产的目的。
附图说明
图1为本发明基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法的流程结构图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
如图1所示，将本发明所述的方法的一个实施例应用到对一个耐高温玉米品种良硕88花粉/叶片的耐高温基因的挖掘中。主要步骤如下：
步骤一：在高温，环境正常温度处理下培养玉米品种良硕88，吐丝8天后处理结束,拆除薄膜，每种处理设置3组重复，取玉米花粉/叶片经液氮速冻后，于超低温冰箱中-80℃冷冻保存，用于后续RNA提取；
步骤二：进行转录组测序：从玉米花粉/叶片中提取RNA,然后对这些组织样品单细胞所有RNA进行测序获得结果；
步骤三：转录组测序质量评价：将总的clean Reads比对到参考基因组上，若比对率，Q30满足标准，样品间的GC含量接近，则说明转录本测序的质量高。步骤四：高温处理下玉米的基因差异表达：通过筛选指标FDR小于0.01,Log2FC大于1作为差异基因的筛选条件，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因。
步骤五：对总的差异表达基因的KEGG和GO功能分析；
步骤六：对特异上调表达的差异基因的KEGG和GO注释分析：可进一步了解特异上调表达的差异基因所参与的功能或代谢通路；
步骤四筛选出的差异表达基因后再进行步骤五、六，根据GO和KEGG分析，筛选出P值小于0.05的GO和基因通路。GO注释主要说明基因的基本功能，KEGG主要说明基因所参与的代谢通路。
步骤七：结果分析与玉米耐高温相关基因的挖掘：以Log2FC大于2，差异表达基因长度大于600bp，覆盖度大于85％，同源度大于95％作为筛选条件，通过BlastX比对,筛选出已有文献报道参与玉米高温胁迫的数个unigene，并对基因的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类。以这些差异表达基因的log10RP-KM作热图分析,表明不同的差异基因具有不同的表达模式。根据图表发现某些特定的基因在高温处理下的样品中显著上调表达或者下调表达，而且其RPKM很大,大于240，说明这些基因在玉米中都发挥了耐高温的作用；
步骤八：差异表达基因的qRT-PCR验证：随机选取几个差异表达基因进行qRT-PCR验证，若DEGs的表达模式与转录组测序结果一致，说明此次实验测序结果是可靠的。
本发明以玉米内在的遗传基因作为起点，基于转录组对耐高温玉米的基因进行分析，筛选出耐高温胁迫的基因型，来培育耐高温胁迫的新玉米品种或者种质资源，达到玉米高产稳产的目的。国内外研究人员利用转录组测序技术进行作物耐受各种其他胁迫的基因分析，以及利用转录组对玉米响应高温胁迫的分析，但是利用转录组测序进行耐高温玉米的基因挖掘我们是首例运用。
上述说明也并不仅限于上述举例，本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述；以上实施例及附图仅用于说明本发明的技术方案并非是对本发明的限制，参照优选的实施方式对本发明进行了详细说明，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所作的任何修改、等同替换、改进等也应属于本发明的权利要求保护范围。

Claims (5)

1.一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一：在高温环境下处理培养玉米，获得实验组和对照组组织样本。
步骤二：对实验组和对照组组织样本进行转录组测序：从玉米的相关组织中提取RNA,然后对这些组织样品单细胞所有RNA进行测序获得结果,最后整理分析转录组数据,制作包括玉米样本名称、序列的绝对路径及序列方向的样品文件，并对照参考基因组进行分析。
步骤三：转录组测序质量评价：质量评价结果可以反映本转录组测序的质量高低,若本转录组测序的质量较高，则可以进行后续的生物信息分析；
步骤四:高温处理下玉米的基因差异表达：采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选出P值小于0.05的GO和基因通路，GO注释说明基因的基本功能，KEGG说明基因所参与的代谢通路，设定差异表达基因的筛选条件，所述差异表达基因的筛选条件包括筛选指标FDR小于0.01,Log2FC大于1，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因；
步骤五:对总的差异表达基因的KEGG和GO功能分析：对差异表达基因进行注释可进一步了解基因所参与的功能或代谢通路；
步骤六：对特异上调表达的差异基因的KEGG和GO注释分析：可进一步了解特异上调表达的差异基因所参与的功能或代谢通路；
步骤七：结果分析与玉米耐高温相关基因的挖掘：以Log2FC大于2，差异表达基因长度大于600bp，覆盖度大于85％，同源度大于95％作为筛选条件通过BlastX比对,筛选出参与玉米高温胁迫的数个unigene，并对基因的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类，以这些差异表达基因的log10RP-KM作热图分析,筛选出RPKM值大于240的玉米基因判断该基因在玉米中都发挥耐高温的作用。
2.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法，其特征在于：所述玉米组织样本优选的组织是玉米花粉/叶片。
3.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法，其特征在于：所述高温环境为至少40-50度，高温处理于玉米吐丝期前约7天开始进行,通过塑料薄膜覆盖升温,大棚两侧各预留出20％缝隙,用于气体交换,吐丝8天后处理结束后对提取玉米相关组织进行测定。
4.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法，其特征在于：步骤三可将总的clean Reads比对到参考基因组上，若比对率Q30满足标准，样品间的GC含量误差小于1％，则说明转录本测序的质量高则进入下一步骤。
5.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序的耐高温玉米基因挖掘的方法，其特征在于：分析结果产生后还包括对差异表达基因的qRT-PCR验证：选取几个差异表达基因进行qRT-PCR验证，若DEGs的表达模式与转录组测序结果一致，则说明此次实验测序结果正确。
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