CN108517368B

CN108517368B - 利用上位性解析毛白杨LncRNA Pto-CRTG及其靶基因Pto-CAD5互作关系的方法及系统

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Publication number: CN108517368B
Application number: CN201710266801.6A
Authority: CN
Inventors: 张德强; 周大凌; 杜庆章
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: CN108517368A

Abstract

本发明提出了利用上位性解析毛白杨LncRNA Pto‑CRTG及其靶基因Pto‑CAD5互作关系的方法及系统。利用根据本发明实施例的方法和系统，能够利用上位性解析毛白杨LncRNA及其靶基因的互作关系。在lncRNA Pto‑CRTG和其Cis靶基因Pto‑CAD5中发现的功能性SNP位点为这两个基因在林木分子标记育种中的应用提供了重要的参考价值。

Description

利用上位性解析毛白杨LncRNA Pto-CRTG及其靶基因Pto- CAD5互作关系的方法及系统

技术领域

本发明涉及遗传学研究领域，具体地，本发明涉及利用上位性解析毛白杨LncRNAPto-CRTG与其靶基因Pto-CAD5互作关系的方法及系统。

背景技术

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度超过200nt的长链非编码RNA分子，是RNA聚合酶II转录的副产物。根据其在基因组上的位置，可将其分为，正义lncRNA(sense lncRNA),反义lncRNA(antisense lncRNA),基因内lncRNAs(introniclncRNA),基因间lncRNAs(intergenic lncRNA)四种主要类型。据统计，哺乳动物蛋白编码基因占总RNA的1％，而长链非编码RNA占4％～9％，这些长链非编码RNA现已成为继microRNA后的研究热点。大量研究表明，LncRNA能够参与生物体各种生命活动过程，通过顺式或反式作用方式调控基因的表达，主要表现在转录水平、转录后水平、翻译水平以及表观遗传水平等方面。

随着高通量测序技术(如RNA-seq)的发展，越来越多的lncRNA得以发现与鉴定。例如，至2013年7月1日，NONCODE v3.0非编码数据库中已收录73,327条lncRNA，主要源于人类(33,831，占46.14％)和小鼠(37,047，占50.52％)。

然而，目前对于lncRNA的功能研究还处于初步阶段。尤其是，lncRNA与其靶基因之间的相互作用关系还有待深入探究。

单核苷酸多态性(SNP)作为一种群体内个体间最为丰富的遗传变异类型，其与基因表达与功能以及个体表型性状显著连锁。有研究发现，发生在lncRNAs中的SNPs能够对lncRNAs的表达和功能产生影响。例如，在水稻中，存在于LDMAR中的一个SNP能够导致该lncRNA二级结构的改变，最终导致水稻的光敏雄性不育。而且，在人类中开展的全基因组关联分析(GWAS)结果显示，发生在lncRNAs中的SNPs与多种疾病显著相关。因此，通过关联作图的方法来研究lncRNA内的功能性SNP位点将有助于进一步研究其功能。此外，最为重要的是，上位性作为一种多基因间的遗传变异的互作效应，将为研究lncRNA与其靶基因之间的互作关系提供了一种新的思路。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种利用上位性解析毛白杨LncRNA及其靶基因互作关系的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

S1,从毛白杨杂交群体中分别选取生长量最高和最低的基因型个体；

S2,分别从所述最高和最低生长量的毛白杨个体的成熟木质部样品中提取总RNA，得到分别代表毛白杨高生长量总RNA和低生长量总RNA；

S3,将提取出的高生长量总RNA等量混合后构建高生长量cDNA文库，同时，将提取出的低生长量总RNA等量混合后构建低生长量cDNA文库，并分别对高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库进行RNA-seq测序；

S4,根据测序结果及LncRNA的预测流程，获得所述高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库中的LncRNA的注释信息；

S5，基于LncRNA的表达量，筛选出高生长量与低生长量个体木质部中差异表达倍数最高的LncRNAPto-CRTG，以便获得候选LncRNAPto-CRTG；；

S6,基于所述候选LncRNAPto-CRTG预测其Cis作用方式的靶基因；

S7,依据预测结果，从已有毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离获得该候选LncRNAPto-CRTG的Cis作用方式的靶基因Pto-CAD5；

S8，选择毛白杨关联作图群体及测定表型；

S9，依据所述Pto-CRTG与Pto-CAD5基因序列，在毛白杨关联群体中进行SNP的发现与基因型分型；

S10，依据Pto-CRTG与Pto-CAD5基因在毛白杨关联群体中的各SNP位点基因型和毛白杨关联群体表型数据，进行标记与性状的上位性关联分析。

利用根据本发明实施例的上述方法，能够利用上位性解析毛白杨LncRNA及其靶基因的互作关系。在lncRNAPto-CRTG和其Cis靶基因Pto-CAD5中发现的功能性SNP位点为这两个基因在林木分子标记育种中的应用提供了重要的参考价值。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述注释信息包括选自位置、类型及数量的至少之一。

根据本发明的实施例，在步骤S1中，毛白杨杂交群体中最高和最低生长量的个体是依据群体中每个个体的树高、胸径及材积综合评估筛选得到的。

根据本发明的实施例，lncRNAPto-CRTG是依据其在样本中的表达量(FPKM)高于1.0且在最高与最低生长量的样本中差异表达倍数最高而筛选得到的。

根据本发明的实施例，lncRNAPto-CRTG的Cis靶基因Pto-CAD5是在基因组位置上距离Pto-CRTG上下游10kb范围以内的编码蛋白基因。

根据本发明的实施例，所述LncRNAPto-CRTG具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述Pto-CAD5具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

cattttgcaatcctccgtcacttttactacatgtatgtgaagaaattatggccaacccattgttgatgcagtctctgaactatctcccatcacatagatgtgccccccgaggtgttagcttagtaaatcacaccctttgactaaagtacacattcattaaatatcttgaaggattgaagccacttaaaatcaaaataggagataggacaatgacaagaccgattggatagaggaaaaatgttgttctctccaggaagggcaacacataatagcctaaaaagttgaggtaatgatagtacgaggctgccaccatgaacagcaggttcgacagcaatacaggtatgaaaccatgggcaactagaatgggtgacaggaaataatgtataacataaagcatgacaaacattgggaagaaagaattgcagtgcacatcaaacgcatatagccattcaacccgttgctcaacaacatgactatttggagcctcctcccgaaggtaagcattagttaggaaccaacaacatgtagccagaccagctccagtaattaaaaaatgaaaaagtaatacagaaataactacaaaaacagcatgtccagcactgtggtcatacgcagcacaataagccaaagctgcgactgccaaaaggaggctggagataacaacaaaagcagggtcatcacgtgcccattgattcttagtttgtttgtgaaacttcgtatgctgatagctgcatgcaaaacataataactcaattagaaacttccca(SEQ ID NO：1)。

atgtcaccagaacaagcagcaccggtattgcgcgctggattgaaagtttacagcccacttaaacactttggattgaaacagagtgagctaagagtagggattttaggacttggaggagtaggacaaatgggagtgaagatagcaaaggcaatgggacaccatgtaactgtgattagttcttctgataagaagagggaggaggctttggaacatcttggtgctgatgaacacctggtcagctcggatggggaaggcatgcataaggcagctgattcactcgactatatatcatcgatactgtgcctgtggttcatcctcttgagccttacctttcttttttgaaacttgatggcaagttgatcttgatgggtattattaatgccccattgcagtttgttacacctatggttatgcatggtgagtctctttccatttacttcaaatactagttatctgttttctacttaattttcatttaagaaaatatcaggaaaagatttgttataatccacaatccctgataaggtgctttctcttcttatgcaattttttgtgtagggagaaagtcaatcactgggagcttcatagggagcatgaaggaaacagaggagatgcttgagttctgcatggaaaagggattgaccttcatgattgaagtgatcaaaatggattatatcaacatggcattcgagaggctcgagaaaaatgatgtgagatacagatttgctgtcgatgttgcgggcagcaagcttaga(SEQ ID NO：2)。

根据本发明的实施例，在步骤S9中，在毛白杨关联群体中对该LncRNAPto-CRTG基因与其Cis靶基因Pto-CAD5进行了SNP的发现和基因型分型。根据本发明的具体示例，该方法包括：S901，毛白杨关联作图群体基因组总DNA的提取；S902，该LncRNAPto-CRTG基因及其靶基因Pto-CAD5的扩增；S803，PCR产物的克隆与测序；S804，SNP发现和基因型分型。

根据本发明的实施例，，在步骤S902中，用于扩增LncRNAPto-CRTG基因的引物具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，扩增靶基因Pto-CAD5的引物具有SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

TAATAACTCAATTAGAAACTTCCCA(SEQ ID NO：3)。

GTAAAACGTTAGGAGGCAGTGAA(SEQ ID NO：4)。

CGATGTTGCGGGCAGCAAGCTTAGA(SEQ ID NO：5)。

TACAGTGGTCTTGTTCGTCGTG(SEQ ID NO：6)。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种利用上位性解析毛白杨LncRNAPto-CRTG及靶基因Pto-CAD5互作关系的系统。根据本发明的实施例，参考图1，所述系统包括：筛选装置100,所述筛选装置100用于从毛白杨杂交群体中选取生长量最高和最低的基因型个体；提取RNA装置200，所述提取RNA装置200用于从所述最高和最低生长量的毛白杨个体的成熟木质部样品中提取总RNA，得到代表毛白杨高生长量的总RNA和低生长量的总RNA；cDNA文库构建和测序装置300,所述cDNA文库构建和测序装置300用于将提取出的高生长量总RNA等量混合后构建高生长量cDNA文库，同时，将提取出的低生长量总RNA等量混合后构建低生长量cDNA文库，并分别对高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库进行RNA-seq测序；LncRNA注释信息获取装置400,所述LncRNA注释信息获取装置400用于基于测序结果及LncRNA的预测流程，获得所述高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库中的LncRNA的注释信息；候选LncRNAPto-CRTG获取装置500，所述候选LncRNAPto-CRTG获取装置500用于基于LncRNA的表达量，筛选出高生长量与低生长量个体木质部中差异表达倍数最高的LncRNAPto-CRTG，以便获得候选LncRNA Pto-CRTG；预测装置600,所述预测装置600用于基于所述候选LncRNAPto-CRTG预测其Cis作用方式的靶基因；分离装置700，所述分离装置700用于依据所述预测装置600的预测结果，从已有毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离获得所述候选LncRNAPto-CRTG的Cis作用方式的靶基因Pto-CAD5；选择和测定装置800，所述选择和测定装置800用于选择毛白杨关联作图群体及测定表型；SNP的发现与基因型分型装置900，所述SNP的发现与基因型分型装置900用于依据所述Pto-CRTG与Pto-CAD5的基因序列，在毛白杨关联群体中进行SNP的发现与基因型分型；以及上位性关联分析装置1000，所述上位性关联分析装置1000用于依据Pto-CRTG与Pto-CAD5基因在毛白杨关联群体中的各SNP位点基因型和毛白杨关联群体表型数据，进行标记与性状的上位性关联分析。

利用根据本发明实施例的上述系统，能够利用上位性解析毛白杨LncRNA及其靶基因的互作关系。在lncRNAPto-CRTG和其Cis靶基因Pto-CAD5中发现的功能性SNP位点为这两个基因在林木分子标记育种中的应用提供了重要的参考价值。

根据本发明的具体实施例，参考图2，所述SNP的发现与基因型分型装置900包括：DNA提取单元910，所述DNA提取单元910用于毛白杨关联作图群体基因组总DNA的提取；扩增单元920，所述扩增单元920用于LncRNAPto-CRTG基因及靶基因Pto-CAD5的扩增；克隆与测序单元930，所述克隆与测序单元930用于PCR产物的克隆与测序；以及确定单元940，所述确定单元940用于SNP的发现和基因型分型。

由上述技术方案可以看出，本发明提供了一种利用上位性解析lncRNA与其靶基因之间互作关系的有效分析方法和系统。同时，在lncRNAPto-CRTG和其Cis靶基因Pto-CAD5中发现的功能性SNP位点为这两个基因在林木分子标记育种中的应用提供了重要的参考价值。

附图说明

图1是根据本发明实施例的利用上位性解析毛白杨LncRNA Pto-CRTG及靶基因Pto-CAD5互作关系的系统图；

图2是根据本发明实施例的SNP的发现与基因型分型装置的结构示意图；

图3是根据本发明实施例的lncRNAPto-CRTG基因及其Cis靶基因Pto-CAD5中存在上位性的SNP-SNP对中功能性SNP标记在基因中的位置；以及

图4是根据本发明实施例的lncRNAPto-CRTG基因中的SNP120位点和其Cis靶基因Pto-CAD5中的SNP28位点之间不同基因型组合对微纤丝角的上位性遗传效应。

具体实施方式

下面将结合本申请的具体实施方式，对本申请的技术方案进行详细地说明，但如下实施例仅是用以理解本申请，而不能限制本申请，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，本申请可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

为了探究lncRNA调控机制，本发明提供了一种利用上位性解析毛白杨LncRNAPto-CRTG及其靶基因Pto-CAD5互作关系的方法及系统。其中，该方法包括以下步骤：

S3,将提取出的高生长量总RNA等量混合后构建高生长量cDNA文库，同时，将低生长量总RNA等量混合后构建低生长量cDNA文库，并分别进行RNA-seq测序；

S4,根据测序结果及LncRNA的预测流程，获得所述高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库中的LncRNA的位置、类型及数量等注释信息；

S5，根据LncRNA的表达量，筛选出高生长量与低生长量个体木质部中差异表达倍数最高的LncRNAPto-CRTG；

S6,针对该候选LncRNAPto-CRTG预测其Cis作用方式的靶基因；

S8，毛白杨关联作图群体的选择及表型测定；

S9，依据已获得的Pto-CRTG与Pto-CAD5基因序列，在毛白杨关联群体中进行SNP的发现与基因型分型；

从以上步骤可以看出，通过LncRNAPto-CRTG基因及其Cis靶基因Pto-CAD5中SNP位点的上位性遗传效应的解析，将有助于进一步探究lncRNA Pto-CRTG和其Cis靶基因Pto-CAD5之间的互作关系。

下面将逐步解释每一个步骤的具体实施过程：

关于步骤S1，其目的是通过对从毛白杨杂交群体中每个基因型个体的树高、胸径及材积进行综合评估，从中选出能代表该群体的最高生长量和最低生长量的个体。

关于步骤S2，其目的在于提取代表该群体的最高生长量和最低生长量的个体的总RNA。具体而言，首先收集了代表该群体的最高生长量和最低生长量的个体的成熟木质部样品，然后分别按照Qiagen RNAeasy kit(Qiagen China,Shanghai,China)描述的方法进行总RNA提取，最后经过NanoDrop ND-1000和Agilent Bioanalyzer 2100进行RNA质检，检测合格后进行后续试验。

关于步骤S3，目的在于参照Illumina公司RNA-seq步骤进行cRNA文库构建及测序。具体而言，在完成总RNA的提取之后，根据提取出的最高生长量个体的木质部总RNA建立高生长量cDNA文库，根据提取出的最低生长量个体的木质部总RNA建立低生长量cDNA文库，并进行这两个文库的RNA-seq测序；该cDNA文库构建及测序方法为常规方法，具体实施方式为现有方法，在此将不再赘述。

关于S4，根据测序结果及LncRNA的预测流程，分别获得所述高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库中的LncRNA的位置、类型及数量等注释信息。具体而言，包括：

一，测序原始数据的预处理，具体包括：

1、去除总体质量偏低的reads，将质量大于20碱基所占比例小于50％的reads去除；

2、去除3’端质量Q低于10的碱基，即碱基错误率小于0.1，其中，Q＝-10log(error_ratio)；

3、去除reads中所含有的接头序列；

4、去除reads中含有的模糊的N碱基，是由于测序强度不够，机器无法识别的碱基；

5、去除长度小于20的测序片段(reads)；

6、去除ribosome RNA，采用是杨树的所有rRNA做为比对模版，比对上模版的reads即为ribosome RNAreads；

二，将预处理后的数据利用Tophat比对到基因组，利用cufflinks组装转录本，利用cuffcompare将组装的转录本比对到基因组注释文件(合并RefSeq,Ensembl and UCSC成一个gtf)，将cuffcompare结果的gtf文件，根据transcripts FPKM值去除低质量的转录本，筛选条件为FPKM>1.0。

lncRNA的鉴定，具体包括：

根据上述筛选后的gtf文件，提取{i,j,o,u,x}五类候选转录本；

2、筛选length>200且ORF<300的转录本；

3、去除比对上已知蛋白数据库Pfam的转录本；

4、筛选CPC<0，CNCI<0的不具有编码蛋白能力的转录本。

根据步骤S4，可进一步实施S5，即筛选出高生长量与低生长量个体木质部中差异表达倍数最高的LncRNAPto-CRTG。

关于S6，可依据筛选出来的LncRNAPto-CRTG的基因组位置信息，预测与其上下游10kb范围内的编码蛋白基因作为其顺式作用靶基因，即Cis靶基因。

关于S7，从已有毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离获得该候选LncRNAPto-CRTG的Cis作用方式的靶基因的基因组序列Pto-CAD5。

关于S8，对毛白杨关联作图群体的选择及表型的测定。这些表型包括：木质素含量，综纤维素含量，α-纤维素含量，纤维长，纤维宽，微纤丝角，树高，胸径和材积。具体而言，包括：利用近红外光谱测定仪测定每个基因型个体的木质素含量、纤维素含量、棕纤维素含量三个木材化学性状指标；利用X射线衍射仪测定微纤丝角，纤维长、纤维宽三个物理性状；利用生长性状测定工具测定其胸径、树高、材积等指标。

因此，根据步骤S7和S8，可实施步骤S9，即在毛白杨关联作图群体中进行这两个基因内SNP的发现与基因型分型；

关于步骤S10，进一步利用EPISNP软件对基因型分型结果及10个表型性状进行上位性关联分析。进而可获得LncRNAPto-CRTG及其Cis靶基因Pto-CAD5的基于上位性的遗传互作关系。

以下将以毛白杨中与生长量有关的LncRNAPto-CRTG与其Cis靶基因Pto-CAD5之间的上位性互作分析过程为例，进一步说明本发明所提供的分析方法。

实施例

原料的获得：最高生长量和最低生长量的毛白杨个体来自种植于山东冠县(36°23′N,115°47′E)苗圃的毛白杨杂交群体(Populus tomentosa“TB14”×Populus tomentosa“Pt-3”)；用于关联作图分析的毛白杨自然群体来源于全国毛白杨种质资源库，代表了毛白杨在全国范围内的自然分布；

聚合酶链反应(PCR)体系中所用试剂购自Promega公司；

结合Tophat和Cufflink程序包系统进行lncRNA的预测与分析；

运用EPISNP软件进行上位性关联分析。

具体操作步骤如下：

步骤S1，在由736株毛白杨个体组成的毛白杨杂交群体中，依据其树高、胸径及材积综合评估结果，分别筛选出能代表该群体最高生长量的3株个体和代表该群体最低生长量的3株个体。

步骤S2，按照Qiagen RNAeasy kit(Qiagen China,Shanghai,China)的方法提取已筛选出的毛白杨个体的成熟木质部的总RNA，并分别将最高生长量和最低生长量个体的总RNA进行等量混合。

步骤S3，参照Illumina公司RNA-seq步骤对已提取出的高、低生长量个体的成熟木质部中总RNA进行cDNA文库构建，并送至上海博豪生物技术有限公司进行SolexaRNA-seq测序。

步骤S4，针对测序结果，结合Tophat和Cufflink程序包系统进行lncRNA的预测与分析。其预测结果如表1所示：

表1：RNA-seq测序结果分布情况

<Samples>	高生长量	地生长量
			Rawreads	182,167,590	133,897,386
Quality-trimedreads	181,386,107	133,284,534
			Adapter-trimedreads	177,607,503	130,788,490
Cleanreads	173,164,040	127,749,470
			Cleanratio	0.951	0.954
rRNA-trimedreads	172,916,160	90,662,646
			Mappedreads	155,154,979	112,547,283
Mappingratio	0.896	0.881
			NumberoflncRNAs	9,028	9,732

从表1可以看出，在高生长量木质部中，通过RNA-seq测序，共获得182,167,590个原始reads，经过数据的预处理后，共得到173,164,040个clean reads，有效率达95.1％，进一步去除rRNA后，将其余reads比对到毛果杨参考基因组上，比对率达89.6％，最终共获得9,028个lncRNA；在低生长量木质部中，共获得133,897,386个原始reads,经过数据的预处理后，共得到127,749,470个clean reads，有效率达95.4％，进一步去除rRNA后，将余下reads比对到毛果杨参考基因组上，比对率达88.1％，最终共获得9,732个lncRNA。

步骤S5，应用DEGseq软件包进行样本间差异表达分析，采用Fold-change(表达差异倍数)以及Fisher-test精确检验统计学方法对差异基因差异程度进行筛选，挑选条件为FC≥2或≤0.5且P值＜0.001，从而进一步筛选出高生长量与低生长量个体木质部中差异表达倍数最高的LncRNA。通过差异表达分析，共获得270个差异表达的lncRNA，包括144个在高生长量的成熟木质部中高表达的lncRNA和126个在低生长量的成熟木质部中高表达的lncRNA。其中，差异表达倍数排名前15的lncRNA分布如表2所示：

表2:毛白杨高生长量与低生长量个体木质部中表达差异倍数排名前15的lncRNA

从表2可以看出，lncRNAPto-CRTG为差异表达倍数最高的lncRNA，因此该lncRNA被确定为本发明中的目标lncRNA，预测其与木质部的生长发育及毛白杨生长量有关。该lncRNAPto-CRTG的序列为SEQ ID NO.1，该序列长度为767bp。

实施步骤S6，进一步确定该lncRNAPto-CRTG的顺式靶基因为Ptr-CAD5，该靶基因位于lncRNAPto-CRTG的上游1.77kb处。

实施步骤S7,从已有毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离获得该候选LncRNA Pto-CRTG的Cis作用方式的靶基因Pto-CAD5的序列为SEQ ID NO.2，该序列长度为755bp。

实施步骤S8，进行毛白杨关联作图群体的选择及表型测定。本发明从全国毛白杨基因库中选取能够最大程度地反映毛白杨天然分布范围的435株个体作为关联作图群体。测定的表型共10种，包括：木质素含量、综纤维素含量、α-纤维素含量、半纤维素含量、纤维长、纤维宽、微纤丝角、树高、胸径及材积。取样时通过木钻从关联作图群体的435株个体的1.35m处取样。材料长20厘米，直径为15毫米，采集于2012年。生长性状收集于2013年。利用X射线衍射仪测定微纤丝角，纤维长、纤维宽三个物理性状；利用近红外光谱测定仪测定每个基因型个体的木质素含量、纤维素含量、棕纤维素含量三个木材化学性状指标；利用生长性状测定工具测定其胸径、树高、材积等指标。

实施步骤S9，即在毛白杨关联群体中进行LncRNA Pto-CRTG基因及其靶基因Pto-CAD5内SNP的发现与基因型分型。具体步骤如下：

步骤S901，毛白杨关联群体基因组总DNA的提取，即从毛白杨关联群体中随机选取45株个体，并提取这45株个体的总DNA；

步骤S902，该LncRNAPto-CRTG基因及其靶基因Pto-CAD5的扩增。以毛白杨成熟木质部cDNA为模板,应用25μLDNA聚合酶链反应(PCR)体系；其中，用于扩增目的基因Pto-CRTG的引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，用于扩增目的基因Pto-CAD5的引物序列为SEQID NO.5和SEQ ID NO.6(如表3所示)。

扩增体系如下所示：

PCR反应条件为：

表3：PCR体系中引物序列

步骤S903，PCR产物的克隆与测序，即将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收、纯化目的片段后连接于pGEM-T上，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行序列测定；

步骤S904，SNP的发现和基因型分型。关于SNP的发现，结合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件分析毛白杨LncRNAPto-CRTG基因及其靶基因Pto-CAD5的45个序列，分别标出并统计这两个基因内的SNP位点。最终发现毛白杨LncRNAPto-CRTG基因中共有72个SNP位点，其中40个为常见SNP(最小等位频率≥10％)，毛白杨Pto-CAD5基因中共有78个SNP位点，其中56个为常见SNP(最小等位频率≥10％)；关于SNP的基因型分型，采用锁核酸(LNA)法(Koshkin等，Tetrahedron Lett.(1998)39,4381-4384)对Pto-CRTG基因和Pto-CAD5基因内发现的普通SNP在435株个体中进行基因型分型。

实施步骤S10，利用EPISNP软件对基因型分型结果与10个毛白杨生长和木材品质性状进行标记与表型性状的上位性关联分析。其上位性关联结果如表4所示。在附图中，图3示出了lncRNAPto-CRTG基因及其Cis靶基因Pto-CAD5中存在上位性的SNP-SNP对中功能性SNP标记在基因中的位置；图4示出了来自于lncRNAPto-CRTG基因中的SNP120位点和其Cis靶基因Pto-CAD5中的SNP28位点之间不同基因型组合对微纤丝角的上位性遗传效应。

表4:Pto-CRTG和Pto-CAD5基因内SNP标记与表型性状的上位性关联结果

注：AA，加性×加性；AD，加性×显性；DA，显性×加性；DD，显性×显性

从表4可以看出，共有来自lncRNA Pto-CRTG基因及其Cis靶基因Pto-CAD5中16个SNP位点构成的11个SNP-SNP对，它们对毛白杨纤维长、纤维宽、微纤丝角、半纤维素含量、木质素含量、胸径及材积这7个性状具有上位性遗传效应，且可解释表型变异的0.02％到0.44％。其中，包括来自lncRNA Pto-CRTG基因中的7个SNP位点所构成的5个基因内SNP-SNP上位对，且每个SNP-SNP对能与1-2个性状相关联，平均可解释表型变异的0.16％；在其靶基因Pto-CAD5中，共有由9个SNP位点所构成的5个基因内SNP-SNP上位对，平均可解释表型变异的0.04％。从基因水平上分析，lncRNA Pto-CRTG和其Cis靶基因Pto-CAD5能同时与微纤丝角和半纤维素这两个性状相关联，表明lncRNAPto-CRTG和其Cis靶基因Pto-CAD5可能同时存在且调控相同的生物学通路。值得注意地是，本发明还发现来自lncRNAPto-CRTG基因中的一个位点SNP120及其Cis靶基因Pto-CAD5中的SNP28位点对于微纤丝角具有“显性×显性”的上位性遗传互作效应，从而进一步为这两个基因之间的互作关系提供了证据。

因此，从以上实验数据可以看出，本发明的lncRNAPto-CRTG中的SNP120位点和其Cis靶基因Pto-CAD5中的SNP28位点之间存在上位性遗传互作效应，从而揭示了该lncRNAPto-CRTG与其顺式靶基因Pto-CAD5之间的互作关系。同时，本发明的毛白杨Pto-CRTG和Pto-CAD5基因内与杨树表型性状关联的功能SNP标记，为后期开展毛白杨分子标记辅助育种工作具有十分重要的参考价值和广泛的应用前景。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京林业大学

<120> 利用上位性解析毛白杨LncRNA

Pto-CRTG及其靶基因Pto-CAD5互作关系的方法及系统

<130> PIDC3168757

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 767

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LncRNA Pto-CRTG的核苷酸序列

<400> 1

cattttgcaa tcctccgtca cttttactac atgtatgtga agaaattatg gccaacccat 60

tgttgatgca gtctctgaac tatctcccat cacatagatg tgccccccga ggtgttagct 120

tagtaaatca caccctttga ctaaagtaca cattcattaa atatcttgaa ggattgaagc 180

cacttaaaat caaaatagga gataggacaa tgacaagacc gattggatag aggaaaaatg 240

ttgttctctc caggaagggc aacacataat agcctaaaaa gttgaggtaa tgatagtacg 300

aggctgccac catgaacagc aggttcgaca gcaatacagg tatgaaacca tgggcaacta 360

gaatgggtga caggaaataa tgtataacat aaagcatgac aaacattggg aagaaagaat 420

tgcagtgcac atcaaacgca tatagccatt caacccgttg ctcaacaaca tgactatttg 480

gagcctcctc ccgaaggtaa gcattagtta ggaaccaaca acatgtagcc agaccagctc 540

cagtaattaa aaaatgaaaa agtaatacag aaataactac aaaaacagca tgtccagcac 600

tgtggtcata cgcagcacaa taagccaaag ctgcgactgc caaaaggagg ctggagataa 660

caacaaaagc agggtcatca cgtgcccatt gattcttagt ttgtttgtga aacttcgtat 720

gctgatagct gcatgcaaaa cataataact caattagaaa cttccca 767

<210> 2

<211> 755

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pto-CAD5的核苷酸序列

<400> 2

atgtcaccag aacaagcagc accggtattg cgcgctggat tgaaagttta cagcccactt 60

aaacactttg gattgaaaca gagtgagcta agagtaggga ttttaggact tggaggagta 120

ggacaaatgg gagtgaagat agcaaaggca atgggacacc atgtaactgt gattagttct 180

tctgataaga agagggagga ggctttggaa catcttggtg ctgatgaaca cctggtcagc 240

tcggatgggg aaggcatgca taaggcagct gattcactcg actatatatc atcgatactg 300

tgcctgtggt tcatcctctt gagccttacc tttctttttt gaaacttgat ggcaagttga 360

tcttgatggg tattattaat gccccattgc agtttgttac acctatggtt atgcatggtg 420

agtctctttc catttacttc aaatactagt tatctgtttt ctacttaatt ttcatttaag 480

aaaatatcag gaaaagattt gttataatcc acaatccctg ataaggtgct ttctcttctt 540

atgcaatttt ttgtgtaggg agaaagtcaa tcactgggag cttcataggg agcatgaagg 600

aaacagagga gatgcttgag ttctgcatgg aaaagggatt gaccttcatg attgaagtga 660

tcaaaatgga ttatatcaac atggcattcg agaggctcga gaaaaatgat gtgagataca 720

gatttgctgt cgatgttgcg ggcagcaagc ttaga 755

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 用于扩增LncRNA Pto-CRTG基因的引物

<400> 3

taataactca attagaaact tccca 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 用于扩增LncRNA Pto-CRTG基因的引物

<400> 4

gtaaaacgtt aggaggcagt gaa 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 扩增靶基因Pto-CAD5的引物

<400> 5

cgatgttgcg ggcagcaagc ttaga 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 扩增靶基因Pto-CAD5的引物

<400> 6

tacagtggtc ttgttcgtcg tg 22

Claims

1.一种利用上位性解析毛白杨LncRNA Pto-CRTG及靶基因Pto-CAD5互作关系的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1,从毛白杨杂交群体中选取生长量最高和最低的基因型个体；

S2,从所述最高和最低生长量的毛白杨个体的成熟木质部样品中提取总RNA，得到代表毛白杨高生长量的总RNA和低生长量的总RNA；

S4,基于测序结果及LncRNA的预测流程，获得所述高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库中的LncRNA的注释信息；

S5，基于LncRNA的表达量，筛选出高生长量与低生长量个体木质部中差异表达倍数最高的LncRNA Pto-CRTG，以便获得候选LncRNA Pto-CRTG；

S6,基于所述候选LncRNA Pto-CRTG预测其Cis作用方式的靶基因；

S7,依据预测结果，从已有毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离获得所述候选LncRNAPto-CRTG的Cis作用方式的靶基因Pto-CAD5；

S8，选择毛白杨关联作图群体及测定表型；

S9，依据所述Pto-CRTG与Pto-CAD5的基因序列，在毛白杨关联群体中进行SNP的发现与基因型分型；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述注释信息包括选自位置、类型及数量的至少之一。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S1中，毛白杨杂交群体中最高和最低生长量个体的选取依据下列参数的至少之一：树高、胸径和材积。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤S4中，最高生长量与最低生长量的LncRNA的预测流程中，筛选出表达量大于1.0的LncRNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Pto-CAD5是距离Pto-CRTG上下游10kb范围以内的编码蛋白基因。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LncRNA Pto-CRTG具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述Pto-CAD5具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S9中，所述SNP的发现与基因型分型包括：

S901，毛白杨关联作图群体基因组总DNA的提取；

S902，LncRNA Pto-CRTG基因及靶基因Pto-CAD5的扩增；

S903，PCR产物的克隆与测序；

S904，SNP的发现和基因型分型。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S902中，

用于扩增LncRNA Pto-CRTG基因的引物具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，

扩增靶基因Pto-CAD5的引物具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

9.一种利用上位性解析毛白杨LncRNA Pto-CRTG及靶基因Pto-CAD5互作关系的系统，其特征在于，所述系统包括：

筛选装置,所述筛选装置用于从毛白杨杂交群体中选取生长量最高和最低的基因型个体；

提取RNA装置，所述提取RNA装置用于从所述最高和最低生长量的毛白杨个体的成熟木质部样品中提取总RNA，得到代表毛白杨高生长量的总RNA和低生长量的总RNA；

cDNA文库构建和测序装置,所述cDNA文库构建和测序装置用于将提取出的高生长量总RNA等量混合后构建高生长量cDNA文库，同时，将提取出的低生长量总RNA等量混合后构建低生长量cDNA文库，并分别对高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库进行RNA-seq测序；

LncRNA注释信息获取装置,所述LncRNA注释信息获取装置用于基于测序结果及LncRNA的预测流程，获得所述高生长量cDNA文库和低生长量cDNA文库中的LncRNA的注释信息；

候选LncRNA Pto-CRTG获取装置，所述候选LncRNA Pto-CRTG获取装置用于基于LncRNA的表达量，筛选出高生长量与低生长量个体木质部中差异表达倍数最高的LncRNA Pto-CRTG，以便获得候选LncRNA Pto-CRTG；

预测装置,所述预测装置用于基于所述候选LncRNA Pto-CRTG预测其Cis作用方式的靶基因；

分离装置，所述分离装置用于依据所述预测装置的预测结果，从已有毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离获得所述候选LncRNA Pto-CRTG的Cis作用方式的靶基因Pto-CAD5；

选择和测定装置，所述选择和测定装置用于选择毛白杨关联作图群体及测定表型；

SNP的发现与基因型分型装置，所述SNP的发现与基因型分型装置用于依据所述Pto-CRTG与Pto-CAD5的基因序列，在毛白杨关联群体中进行SNP的发现与基因型分型；以及

上位性关联分析装置，所述上位性关联分析装置用于依据Pto-CRTG与Pto-CAD5基因在毛白杨关联群体中的各SNP位点基因型和毛白杨关联群体表型数据，进行标记与性状的上位性关联分析。

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述SNP的发现与基因型分型装置包括：

DNA提取单元，所述DNA提取单元用于毛白杨关联作图群体基因组总DNA的提取；

扩增单元，所述扩增单元用于LncRNA Pto-CRTG基因及靶基因Pto-CAD5的扩增；

克隆与测序单元，所述克隆与测序单元用于PCR产物的克隆与测序；以及

确定单元，所述确定单元用于SNP的发现和基因型分型。