CN111763668A - 测序引物组及基于pcr的全基因组测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种测序引物组，所述测序引物组包括通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物；以及一种基于PCR的全基因组测序方法，其包括利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增得到第二扩增产物；再同时进行测序的方法，上述方法通过优化引物，可以任意调节基因组大小和样品量的大小，同时对DNA质量要求不高；建库更加简洁；不需要已知SNP标记，不需要前期构建芯片；具有基因区富集效，可以满足对全基因组检测筛选。

Description

测序引物组及基于PCR的全基因组测序方法

技术领域

本发明涉及基因测序领域，尤其涉及一种测序引物组及基于PCR的全基因组测序方法。

背景技术

基因分型是一系列遗传分析，包括利用高通量测序技术进行分子标记发现和基因分型，最强大的应用之一是植物育种领域，为植物育种和植物遗传学研究开辟了新的可能性。它提供经济高效的全基因组扫描和多重测序平台。简化测序技术是高通量测序的新应用，用于挖掘物种群体中的单核苷酸多态性(SNP)并对其进行基因分型。需要生物信息学工具来分析和解析简化测序数据集。是低成本的技术和优秀的MAS工具，简化测序目前已成功应用于大规模植物分子育种策略中的全基因组关联分析研究，分子标记挖掘，遗传连锁图谱，基因组遗传选择和群体基因组多样性研究。

简化基因组测序是在第二代测序基础上发展起来的一种利用酶切技术、序列捕获芯片技术或其他实验手段降低物种基因组复杂程度，对基因组特定区域进行测序，进而反映部分基因组序列结构信息的测序技术。目前发展起来的简化基因组测序有：复杂度降低的多态序列测序，限制性酶切位点相关的DNA测序，基因分型测序等。

一个简单的，快速和低成本有效的系统，已经用于在非模式生物的测序。其中运用最为广泛的是限制性酶切位点相关DNA的测序技术，该技术利用限制性内切酶对基因组进行酶切、产生一定大小的片段、构建测序文库、对酶切后产生的限制性酶切位点标记进行高通量测序。由于限制性酶切位点标记是全基因组范围的呈现特异性酶切位点附近的小片段DNA标签，代表了整个基因组的序列特征，因此通过对限制性酶切位点标记测序能够在大多数生物中获得成千上万的单核苷酸多态性标记。

基于测序的基因分型是高通量测序方案的新应用，用于发现和基因分型用于作物改良的单核苷酸多态性。简化测序的低成本使其成为一种有吸引力的方法，可以通过高密度的单核苷酸多态性标记来完全绘制和繁殖种群。测序和碱基调用软件的不断改进将使高通量测序技术能够为每次运行提供更高的测序通量，从而实现更深的多重化，以获得每个样品的固定平均测序深度。随着每次运行产生的序列信息的数量和质量不断增加，这使得每个样本的plex更高且成本更低，简化测序已成为其他全基因组基因分型平台的成本竞争性替代品。植物育种者将能够对大型作物基因组进行测序，并从繁殖种群中建立高密度的遗传连锁图谱。简化测序未来在作物改良中的应用可能允许植物育种者在新的种质或物种上进行标记，而无需先开发任何先前的分子工具。由于基于序列的基因分型可用于整个基因组研究，简化测序将成为植物遗传学和育种的主要组成部分之一。

通过简化测序鉴定高密度单核苷酸多态性标记以构建遗传谱图对于植物育种中的众多应用具有重要价值。

基因分型芯片是利用已知的单核苷酸多态性的位点侧翼的序列设计探针。探针固定在芯片上后，待测定样本的DNA与芯片杂交并扫描杂交荧光信号，从而鉴定这些探针位点(单核苷酸多态性的位点)的基因型。最有代表性的品牌是illumina和affymetrix。

单核苷酸多态性的芯片已成为作物遗传改良的重要工具。分子育种时代已经全面到来，为了解决分子标记检测手段的不足，传统育种周期长、不可预见，全凭育种家的经验和肉眼筛选。可把大田搬到实验室，进行大规模精准筛选，排除95％以上的单株，剩下少量单株种到大田，大大减少了田间工作量。原方法一个品种平均8到10年的育种周期，该方法3到5年就可完成。

目前芯片其在育种材料的快速鉴定、基因组选择、种质资源分析、品种改良、QTL定位、遗传分析、品种的真实性鉴定等方面有非常高的实用价值，并且具有极大的成本优势。但是，目前芯片的使用存在一些困难限制了芯片在作物遗传改良的广泛引用。主要困难有：(1)目前芯片前期研发成本较高，需要有已经测序的参考基因组和已知SNP标记；仅仅能够检测已知SNP位点，得到标记数量较少；仅仅能够检测已有SNP标记，无法发现新的SNP位点；检测手段仪器依耐性较高；目前仅仅几个育种的模式物种有相应的芯片；(2)简化测序成本还不够低，因为建库繁琐其效率不够高，对于育种大样本的检测很难广泛使用；由于都需要酶切方法，所以简化测序对DNA质量要求较高，无法使用直接解列的DNA(直接PCR)；建库中出现样本之间测序量不均一特征，需要补充测序；没有基因区的富集效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测序引物组及基于PCR的全基因组测序方法，旨在解决现有芯片筛选基因组中SNP位点速度慢、要求高、操作复杂的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种测序引物组，所述测序引物组包括通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物；

所述通用上游引物的序列包括：5’-T[barcode]CAAAXXXXNNN-3’；

所述通用下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACGZZZZNNN-3’；

所述富集启动子下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACYYNCTATA-3’；

其中，所述“XXXX”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“ZZZZ”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“barcode”的长度为4～6个碱基，且碱基选自A、T、C和G的至少一种；所述“N”为碱基A、T、C和G中的任意一种，所述“Y”为碱基C或T。

以及，一种基于PCR的全基因组测序方法，其包括如下步骤：

制备待测样品的DNA；

提供上述任一项所述的测序引物组，利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增得到第二扩增产物；

将所述第一扩增产物和第二扩增产物分别进行测序分析。

本发明提供的测序引物组包括特有序列的通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物，其中，通用上游引物和通用下游引物分别包括四个碱基：“XXXX”和“ZZZZ”(碱基均选自A、T、C和G中的至少一种进行组合)，这八个碱基为通用引物的核心碱基区域，可以根据待测样品基因组的变化而变化，根据碱基的不同，使之能够扩增不同基因组上不同的序列片段，可以根据基因组的序列优化引物方案，任意调节基因组大小和样品量的大小；同时，通过模拟真核生物上游区域碱基序列，设计具有启动子(Pormoter)区域特征的引物即富集启动子下游引物，这样，通过通用上游引物和富集启动子下游引物可以有效扩增启动子附近序列。这样的引物组用于全基因组扩增测序，不仅具有很好的富集效应，而且使建库测序更加简洁、准确，降低测序成本。

同时，本发明提供的一种基于PCR的全基因组测序方法，通过利用上述测序引物组对所述待测样品的DNA进行扩增得到待测样品PCR产物，再进行测序分析。上述基于PCR的全基因组进行测序方法，兼顾“发现”和“检测”单核苷酸多态性(SNP)位点的特点，能够在发型新标记的同时，对全基因组进行检测筛查，因此不需要前期构建芯片，不需要对已知的单核苷酸多态性(SNP)位点的标记；同时，利用此方法进行全基因组测序，对样品DNA质量要求不高，建库更加简洁方便，同时覆盖度高，具有基因区富集效应，测序时间短，能够广泛应用于不同样品的基因组测序中。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的5个样品通用引物PCR产物的琼脂糖电泳分析结果。

图2是本发明实施例1提供的5个样品富集Pormoter区引物PCR产物的琼脂糖电泳分析结果。

图3是通用引物方法得到测序reads在基因组覆盖率分析图。

图4是富集Pormoter区引物方法得到测序reads在基因组覆盖率分析图。

图5是PCR产物在基因区富集情况。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实例提供一种测序引物组，所述测序引物组包括通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物；

所述通用上游引物的序列包括：5’-T[barcode]CAAAXXXXNNN-3’；

所述通用下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACGZZZZNNN-3’；

所述富集启动子下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACYYNCTATA-3’；

其中，所述“XXXX”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“ZZZZ”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“barcode”的长度为4-6个碱基，且碱基选自A、T、C和G的至少一种；所述“N”为碱基A、T、C和G中的任意一种，所述“Y”为碱基C或T。

具体的，所述“XXXX”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“ZZZZ”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种。这八个碱基为通用引物的核心碱基区域，可以根据待测样品基因组的变化而变化，因此根据碱基的不同，使其能够扩增不同基因组上不同的序列片段。具体的，在通用上游引物上设计了所述“barcode”，其长度为4-6个碱基，且为碱基A、T、C、G的任意组合。优选的，所述“barcode”优选5个碱基，基于其为碱基A、T、C、G的任意组合，共计384个“barcode”可供选择。在本发明优选实施例中，可根据不同的样品添加任意数量的“barcode”序列以进一步对样品进行区别。所添加的“barcode”均是根据待测样品的基因组的变化而变化，添加“barcode”的目的是为了一方面是为了区别每一个不同的样品，即区别每一段DNA序列；

具体的，所述富集启动子下游引物：5’-GACTGCGTACYYNCTATA-3’。设计一个富集启动子下游引物，其原理是通过模拟真核生物上游区域碱基序列，设计具有启动子区域特征的引物即富集启动子下游引物，使该引物能够有效扩增启动子区域附近的序列，进一步达到基因区富集的目的，有利于后续的试验。

优选的，上述通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物中，所述“N”为碱基A、T、C、G中的任意一种，所述“Y”为碱基C或T。通过进一步在引物上设计“N”、“Y”碱基，一方面能够提高引物的覆盖率，使引物更大程度地扩增整个基因组DNA；另一方面，采用了混合碱基的设计方法，能够进一步的提高引物与待测样品的结合能力，达到基因去富集的目的。“N”为随机碱基，通用引物末端设计几个随机碱基，可以消除PCR富集的偏向效应，用于还原真实基因组，在拷贝数等分析上极具优势；优选的，所述“N”可设计为3-8任意数量的碱基位，用于对基因组进行更大程度的简化，可用在复杂基因组或者大基因组中，也是可以自由调节降低成本(更大样本，减少SNP)。

在本发明优选实施例中，以木薯为检测对象，所述测序引物组中，所述通用上游引物的序列为：5’-T[barcode]CAAACCGGNNN-3’，所述通用下游引物的序列为：5’-GACTGCGTACGAATTNNN-3’；或者，

所述通用上游引物的序列为：5’-T[barcode]CAAACGCGNNN-3’，所述通用下游引物的序列为：5’-GACTGCGTACGTATANNN-3’。

通过分析木薯基因中出现频率较高的基因序列，进一步确定通用上游引物的引物核心碱基“XXXX”为“CCGG”或“CGCG”；确定通用下游引物的引物核心碱基“ZZZZ”为“AATT”或“ATAT”。选择木薯基因中出现频率较高的碱基作为引物核心碱基，能够进一步提高扩增的覆盖率，能够具有良好的富集效应。

在本发明另一优选实施例中，以木薯为检测对象，所述“barcode”选自CTTAT、GTAGA、CCTCG、GAACT和TTACT中的至少一种。根据木薯检测样品的不同，在通用上游引物上设计了长度为5个碱基的“barcode”，为了区别每一段DNA序列，同时保证扩增更均匀，在全基因组的覆盖率更高，更全面。

因此，与现有技术相比，本发明提供的测序引物组包括特有序列的通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物，其中，通用上游引物和通用下游引物分别包括四个碱基：“XXXX”和“ZZZZ”(碱基均选自A、T、C和G中的至少一种进行组合)，这八个碱基为通用引物的核心碱基区域，可以根据待测样品基因组的变化而变化，根据碱基的不同，使之能够扩增不同基因组上不同的序列片段，可以根据基因组的序列优化引物方案，任意调节基因组大小和样品量的大小；同时，通过模拟真核生物上游区域碱基序列，设计具有启动子区域特征的引物即富集启动子下游引物，这样，通过通用上游引物和富集启动子下游引物可以有效扩增启动子附近序列。这样的引物组用于全基因组扩增测序，不仅具有很好的富集效应，而且使建库测序更加简洁、准确，降低测序成本。

相应的，本发明实施例还提供了一种基于PCR的全基因组测序方法，其包括如下步骤：

S01.制备待测样品的DNA；

S02.提供所述的测序引物组，利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增得到第二扩增产物；

S03.将所述第一扩增产物和第二扩增产物分别进行测序分析。

具体的，在上述步骤S01中，制备待测样品的DNA。在本发明优选实施例中，所述制备待测样品的DNA的方法选自全基因组DNA提取方法、PCR试剂盒扩增法和制备裂解液裂解组织法中的任意一种。优选的，普通全基因组DNA提取方法，主要包括利用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)，这种方法主要是利用阳离子去污剂，从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖，在高离子浓度的溶液中，十六烷基三甲基溴化铵与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不会沉淀核酸。再通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀，即使核酸分离出来，得到样品全基因组DNA；或者采用SDS(十二烷基苯磺酸钠)裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，释放得到核酸。其次，也可以直接利用PCR试剂盒扩增法进行直接制备；或者制备裂解液裂解组织法提取得到全基因组DNA。由于后续试验对DNA质量要求不高，利用本发明实施例所述的直接PCR的方法可以快速富集得到样品全基因组DNA，同时对DNA要求不高，方法简单快捷，极大地缩短了文库制备时间，提高试验效率。

具体的，在上述S02步骤中，提供所述的测序引物组，利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增得到第二扩增产物；

优选的，其中所述第一PCR扩增的步骤包括：

先进行使通用上游引物和通用下游引物结合到所述待测样品的DNA上的结合扩增，然后进行富集目标区域的富集扩增。

其中，通用PCR体系(20μL体系)如下：

所述结合扩增包括94℃5分钟，5个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；35℃，1分钟；72℃，1.5分钟；和

所述富集扩增包括35个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；50～58℃，1分钟；72℃，1.5分钟。

72℃，7分钟

优选的，所述第二PCR扩增的步骤包括：

先进行使通用上游引物和富集启动子下游引物结合到所述待测样品的DNA上的结合扩增，然后进行富集目标区域的富集扩增。

其中，富集Pormoter区PCR体系(20μL体系)如下：

所述结合扩增包括94℃5分钟，5个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；35℃，1分钟；72℃，1.5分钟；和

所述富集扩增包括35个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；50～58℃，1分钟；72℃，1.5分钟。

72℃，7分钟

其中，结合扩增主要的目的是先将上述各引物与样品DNA进行结合。其中，结合扩增的PCR反应循环次数为5个，在这个循环次数下，各个引物可以结合到样品DNA链上。根据引物上所设计的“XXXX”、“ZZZZ”、“N”及“Y”等碱基，采用了退火温度为35℃，主要是通过这种预扩增的步骤，设置较低的退火温度，使引物上所设计的“XXXX”、“N”及“Y”能够准确迅速地与样品DNA结合，将引物定位于样品DNA上，有利于后续进行富集扩增。

优选的，富集扩增主要目的是使基因去进行富集，产生富集效应，方便后续进行检测。在本发明优选实施例中，所述富集扩增的PCR反应循环次数为35个，将循环次数增加为35个，主要是为了能够扩增大量的样品DNA，提高样品DNA富集的片段数量。并且，依据各引物的长度，设置退火温度为50-58℃，合适的温度能够提高DNA的扩增速率，使DNA的富集量增加。

具体的，在上述步骤S03中，将所述第一扩增产物和第二扩增产物分别进行测序分析。在本发明优选实施例中，采用琼脂糖凝胶电泳分别对第一扩增产物和第二扩增产物进行检测，确保PCR扩增能够得到产物。优选的，将所述第一扩增产物定量至浓度为180-200ng/μL，以及将所述第二扩增产物定量至浓度为180-200ng/μL，保持各PCR产品浓度一致。若PCR产物浓度太低，则得到的PCR扩增产物的量较少，后续试验检测过程中容易受杂质干扰；若浓度太高，则PCR扩增产物量过多，在后续试验中由于浓度过高，分析不清楚，测序结果不清楚。

优选的，将第一扩增产物调节至相同浓度之后混合所有样品得到第一混合物，将第二扩增产物调节至相同浓度之后混合所有样品得到第二混合物。优选的，所述混合的方法选自吸打混匀或离心混匀的任一一种。本发明具体实施例中对单样本分别进行定量后，再混合测序，可以一定程度克服简化测序普遍现象产出数据量均一性的问题。

优选的，对所述第一混合物和第二混合物分别进行二代建库测序并分析测序结果。优选的，二代建库测序分析通常需用illumina测序。在本发明优选实施例中，对得到的测序结果进行分析，可以利用所设计的不同引物的[barcode]分别区分样品进行分析，不仅进行检测同时挖掘群体变异位点。

与现有技术相比，本发明提供的一种基于PCR的全基因组测序方法，通过利用上述测序引物组对所述待测样品的DNA进行扩增得到待测样品PCR产物，再进行测序分析。上述基于PCR的全基因组进行测序方法，兼顾“发现”和“检测”单核苷酸多态性(SNP)位点的特点，能够在发型新标记的同时，对全基因组进行检测筛查，因此不需要前期构建芯片，不需要对已知的单核苷酸多态性(SNP)位点的标记；同时，利用此方法进行全基因组测序，对样品DNA质量要求不高，建库更加简洁方便，同时覆盖度高，具有基因区富集效应，测序时间短，能够广泛应用于不同样品的基因组测序中。下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

一种基于PCR的全基因组测序方法，以不同品种的木薯为例进行试验，其包括如下步骤：

步骤一：制备待测样品的DNA；

选取在同一生长条件下生长一致，同生长期、同一部位，且无病虫害的不同品种的木薯提取基因组DNA。长期保存样品需液氮或-70℃以下冰箱。采用DNeasy 96Plant Kit(QIAGEN)试剂盒提取基因组DNA。

对提取的基因组DNA质量检测及定量：琼脂糖凝胶检测以λmarker为标记，取1μLDNA，加入2μL l0×溴酚蓝上样缓冲液，混匀，点入含0.5μg/ml Goldview染料的0.8％琼脂糖凝胶中，用1×TAE缓冲液，90V电泳40m in；凝胶成像分析系统(Tanon4100)观察DNA条带。

取1-2μL DNA样品，用NANODROP 2000C对基因组DNA进行检测。根据260nm处的光吸收值计算DNA浓度，根据OD260/OD280、OD260/OD230比值判断有无多糖、蛋白质、RNA等杂质，从而确定DNA的纯度。

步骤二：提供所述的测序引物组，利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增得到第二扩增产物；

其中，设计了5个通用上游引物，分别为

SEQ ID NO.1(5’-TCTTATCAAACCGGNNN-3’)、

SEQ ID NO.2(5’-TGTAGACAAACCGGNNN-3’)、

SEQ ID NO.3(5’-TCCTCGCAAACCGGNNN-3’)、

SEQ ID NO.4(5’-TGAACTCAAACCGGNNN-3’)、

SEQ ID NO.5(5’-TTTACTCAAACCGGNNN-3’)，其中，[barcode]区域为不同的序列，通用上游引物中“XXXX”序列为“GGCC”，由于“GGCC”为木薯中出现频率较高的序列，因此选择“GGCC”。

设计了1个通用下游引物序列为：

SEQ ID NO.6(5’-GACTGCGTACGAATTNNN-3’)，其中，“ZZZZ”序列为“AATT”，由于“AATT”为木薯中出现频率较高的序列，因此选择“AATT”。

设计了1个富集启动子下游引物为：

SEQ ID NO.7(5’-GACTGCGTACYYNCTATA-3’)。

利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增，所述第一PCR扩增的步骤包括：

先进行使通用上游引物和通用下游引物结合到所述待测样品的DNA上的结合扩增，然后进行富集目标区域的富集扩增。

其中，通用PCR体系(20μL体系)如下：

所述结合扩增包括94℃5分钟，5个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；35℃，1分钟；72℃，1.5分钟；和

所述富集扩增包括35个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；50～58℃，1分钟；72℃，1.5分钟。

72℃，7分钟

利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增，所述第二PCR扩增步骤包括：

先进行使通用上游引物和富集启动子下游引物结合到所述待测样品的DNA上的结合扩增，然后进行富集目标区域的富集扩增。

富集Pormoter区PCR体系(20μL体系)如下：

所述结合扩增包括94℃5分钟，5个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；35℃，1分钟；72℃，1.5分钟；和

所述富集扩增包括35个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；50～58℃，1分钟；72℃，1.5分钟。

72℃，7分钟

步骤三：将所述第一扩增产物和第二扩增产物分别进行测序分析。

分别取8μL第一扩增产物和8μL第二扩增产物，2％琼脂糖胶进行检测。检测结果如图1、图2。图1为5个样品第一扩增产物的检测结果图，图2为5个样品第二扩增产物的检测结果图。分别对所有PCR产物进行定量，需要均一化，精确定量到100ng/μL。分别将定量后的第一扩增产物和第二扩增产物的每个样品取2ul各混合为第一混合产物和第二混合产物。纯化回收200bp-700bp大小片段。送到第三方测序公司，使用Hiseq2500测序，测序长度为双端150bp。得到原始reads总数据量5Gb。测序结果如图3、图4、图5。图3是通用引物方法得到测序reads在基因组覆盖，图4是富集Pormoter区引物方法得到测序reads在基因组覆盖，图5是在基因区富集情况，由图5可知，其中70％的PCR产物富集于非编码区(Non-generegion)，17％的PCR产物富集于内含子区(Intron)，7％的PCR产物富集于CDS区，6％的PCR产物富集于UP_2000区域。综合上述三个图，可以分析得到利用本发明的PCR的方法进行全基因组进行测序，其在基因组上的覆盖率非常高，结果具有极高的可信度。同时这个方法建库更加简洁方便，同时覆盖度高，具有基因区富集效应，测序时间短，能够广泛应用于不同样品的基因组测序中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>测序引物组及基于PCR的全基因组测序方法

<130> 2019.3.27

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

tcttatcaaa ccggnnn 17

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<213> 人工合成

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gactgcgtac gaattnnn 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

gactgcgtac yynctata 18

Claims (10)

1.一种测序引物组，其特征在于，所述测序引物组包括通用上游引物、通用下游引物及富集启动子下游引物；

所述通用上游引物的序列包括：5’-T[barcode]CAAAXXXXNNN-3’；

所述通用下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACGZZZZNNN-3’；

所述富集启动子下游引物的序列包括：5’-GACTGCGTACYYNCTATA-3’；

其中，所述“XXXX”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“ZZZZ”的长度为4个碱基，且碱基选自A、T、C和G中的至少一种；所述“barcode”的长度为4～6个碱基，且碱基选自A、T、C和G的至少一种；所述“N”为碱基A、T、C和G中的任意一种，所述“Y”为碱基C或T。

2.根据权利要求1所述的测序引物组，其特征在于，所述测序引物组中，

所述通用上游引物的序列为：5’-T[barcode]CAAACCGGNNN-3’，所述通用下游引物的序列为：5’-GACTGCGTACGAATTNNN-3’；或者，

所述通用上游引物的序列为：5’-T[barcode]CAAACGCGNNN-3’，所述通用下游引物的序列为：5’-GACTGCGTACGTATANNN-3’。

3.根据权利要求1或2所述的测序引物组，其特征在于，所述“barcode”选自CTTAT、GTAGA、CCTCG、GAACT和TTACT中的至少一种。

4.一种基于PCR的全基因组测序方法，其包括如下步骤：

制备待测样品的DNA；

提供权利要求1-3任一项所述的测序引物组，利用所述通用上游引物和通用下游引物对所述待测样品的DNA进行第一PCR扩增得到第一扩增产物，利用所述通用上游引物和所述富集启动子下游引物对所述待测样品的DNA进行第二PCR扩增得到第二扩增产物；

将所述第一扩增产物、第二扩增产物分别进行测序分析。

5.根据权利要求4所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述第一PCR扩增的步骤包括：

先进行使通用上游引物和通用下游引物结合到所述待测样品的DNA上的结合扩增，然后进行富集目标区域的富集扩增。

6.根据权利要求5所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述结合扩增包括94℃，5分钟；5个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；35℃，1分钟；72℃，1.5分钟；和/或，

所述富集扩增包括35个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；50～58℃，1分钟；72℃，1.5分钟；72℃，7分钟。

7.根据权利要求4所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述第二PCR扩增的步骤包括：

先进行使通用上游引物和富集启动子下游引物结合到所述待测样品的DNA上的结合扩增，然后进行富集目标区域的富集扩增。

8.根据权利要求7所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述结合扩增包括94℃，5分钟；5个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；35℃，1分钟；72℃，1.5分钟；和/或，

所述富集扩增包括35个循环的如下反应程序：94℃，1分钟；50～58℃，1分钟；72℃，1.5分钟；72℃，7分钟。

9.根据权利要求4-8任一项所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，所述制备待测样品的DNA的方法选自全基因组DNA提取方法、PCR试剂盒扩增法和制备裂解液裂解组织法中的任意一种。

10.根据权利要求4-8任一项所述的基于PCR的全基因组测序方法，其特征在于，将所述第一扩增产物定量至浓度为180-200ng/μL，以及将所述第二扩增产物定量至浓度为180-200ng/μL后，再分别进行测序分析。

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