CN110055306A - 一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，属于玉米耐低氮基因领域。一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，包括如下步骤：步骤一、在低氮处理下培养实验组玉米，获得实验组组织样本；在正常氮处理下培养对照组玉米，获得对照组组织样本；步骤二、对步骤一获得的实验组和对照组组织样本进行转录组测序，从组织样本中提取RNA，然后对组织样品单细胞所有的RNA进行测序，获得测序结果，最后整理分析转录组数据；本发明以玉米内在的遗传基因作为起点，来培育耐低氮胁迫的新玉米品种或种质资源，达到减少氮肥消耗，降低了玉米生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及玉米耐低氮基因技术领域，尤其涉及一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法。
背景技术
玉米是我国重要的粮、经、饲作物，用途广需要量大，但是从20世纪90年代开始，我国农作物就出现了氮肥投入过量、利用效率过低的问题，因此亟需一种提高氮素、氮肥利用效率以及投入量合理的筛选耐低氮基因方法，来实现玉米的高产稳产以及增加经济效益。
从而筛选出耐低氮基因，以玉米内在的遗传基因作为起点，来培育耐低氮胁迫的新玉米品种或种质资源，达到减少氮肥消耗，降低玉米生产成本的方法十分重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中缺乏一种筛选出耐低氮基因，以玉米内在的遗传基因作为起点，来培育耐低氮胁迫的新玉米品种或种质资源，达到减少氮肥消耗的方法问题，而提出的一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，包括如下步骤：
步骤一、在低氮处理下培养实验组玉米，获得实验组组织样本；在正常氮处理下培养对照组玉米，获得对照组组织样本；
步骤二、对步骤一获得的实验组和对照组组织样本进行转录组测序，从组织样本中提取RNA，然后对组织样品单细胞所有的RNA进行测序，获得测序结果，最后整理分析转录组数据，将实验组组织样本的转录组数据与对照组组织样本的转录数据进行分析，挖掘出玉米中新的基因；
步骤三、低氮处理下玉米中新的基因差异表达，通过筛选指标FDR小于0.01，Log2FC大于1作为差异基因的筛选条件，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因筛选实验组组织样本中的；
注：FDR指的是错误发现率，Log2FC指的是两组样品间表达量的比值；
步骤四、对总的差异表达基因的KEGG和GO功能分析；对上调表达的差异基因的KEGG和GO注释分析；
注：KEGG主要说明基因锁参与的代谢通路，GO主要说明基因的基本功能；
步骤五、根据KEGG和GO功能分析，筛选出P值小于0.05的KEGG和GO；
步骤六、对步骤五筛选的差异基因，以Log2FC大于2，差异表达基因长度大于600bp，覆盖度大于85％，同源度大于95％作为筛选条件，通过BlastX比对，筛选出玉米低氮胁迫的数个unigene，并对筛选的unigene的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类；
注：unigene是指经过去冗余之后得到的基因序列；
步骤七、以步骤六筛选的unigene差异表达基因的log10RPKM作热图分析,表明不同的差异基因具有不同的表达模式；
注：RPKM指的是代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数；
步骤八、根据步骤七中的图表unigene差异表达基因在低氮处理下的样品中显著上调表达或者下调表达的，而且其RPKM大于240的，说明这些基因在玉米中都发挥了耐低氮的作用，从而筛选出unigene差异表达基因中在玉米中发挥了耐低氮的作用的unigene差异表达基因。
优选的，所述步骤一中组织样本采用玉米组织的叶/根或叶和根。
优选的，所述步骤一中的实验组玉米和对照组玉米均为三组。
优选的，所述步骤二在提取RNA之前对组织样本经液氮速冻后，于超低温冰箱中冷冻保存。
优选的，在步骤三的低氮处理下玉米中新的基因差异表达之前进行转录测序质量评价，当转录测序质量高，则可进行步骤三。
优选的，在进行转录测序质量评价方法为，将总的clean Reads比对到参考基因组上，若比对率，碱基质量值满足标准Q30，样品间的GC含量接近，则说明转录本测序的质量高；
注：clean Reads指的是经过过滤后的测序数据，碱基质量值为Q30指的是碱基的精确度在99.9％，GC指的是鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。
优选的，对步骤八筛选的差异表达基因进行结果验证，确保筛选准确性，利用qRT-PCR验证：随机选取几个差异表达基因进行qRT-PCR验证，若DEGs的表达模式与转录组测序结果一致，则实验测序结果是可靠的。
与现有技术相比，本发明提供了一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，具备以下有益效果：
1、该基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，通过转录组测序挖掘玉米耐低氮基因，深入分析耐低氮分子机制，挖掘耐低氮关键基因，筛选耐低氮基因，同时为提高氮素利用效率提供了新的依据和思路，以玉米内在的遗传基因作为起点，来培育耐低氮胁迫的新玉米品种或种质资源，达到减少氮肥消耗，降低了玉米生产成本。
附图说明
图1为本发明提出的一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法的流程示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1，一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，包括如下步骤：
步骤一、在低氮处理下培养实验组玉米品种郑单958到苗期，获得实验组组织样本；组织样本采用玉米组织的叶/根或叶和根，在正常氮处理下培养对照组玉米品种郑单958到苗期，获得对照组组织样本；实验组玉米和对照组玉米均为三组；
步骤二、对步骤一获得的实验组和对照组组织样本进行转录组测序，在提取RNA之前对组织样本经液氮速冻后，于超低温-80℃冰箱中冷冻保存，从组织样本中提取RNA，然后对组织样品单细胞所有的RNA进行测序，获得测序结果，最后整理分析转录组数据，将实验组组织样本的转录组数据与对照组组织样本的转录数据进行分析，挖掘出玉米中新的基因；
步骤三、低氮处理下玉米中新的基因差异表达之前进行转录测序质量评价，在进行转录测序质量评价方法为，将总的clean Reads比对到参考基因组上，若比对率，碱基质量值满足标准Q30，样品间的GC含量接近，则说明转录本测序的质量高；
注：clean Reads指的是经过过滤后的测序数据，碱基质量值为Q30指的是碱基的精确度在99.9％，GC指的是鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率；
当转录测序质量高，低氮处理下玉米中新的基因差异表达，通过筛选指标FDR小于0.01，Log2FC大于1作为差异基因的筛选条件，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因筛选实验组组织样本中的；
注：FDR指的是错误发现率，Log2FC指的是两组样品间表达量的比值；
步骤四、对总的差异表达基因的KEGG和GO功能分析；对上调表达的差异基因的KEGG和GO注释分析；
注：KEGG主要说明基因锁参与的代谢通路，GO主要说明基因的基本功能；
步骤五、根据KEGG和GO功能分析，设定筛选标准：筛选出P值小于0.05的KEGG和GO；
步骤六、对步骤五筛选的差异基因，再次设定筛选标准，以Log2FC大于2，差异表达基因长度大于600bp，覆盖度大于85％，同源度大于95％作为筛选条件，通过BlastX比对，筛选出玉米低氮胁迫的数个unigene，并对筛选的unigene的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类；
注：unigene是指经过去冗余之后得到的基因序列；
步骤七、以步骤六筛选的unigene差异表达基因的log10RPKM作热图分析,表明不同的差异基因具有不同的表达模式；
注：RPKM指的是代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数；
步骤八、根据步骤七中的图表unigene差异表达基因在低氮处理下的样品中显著上调表达或者下调表达的，而且其RPKM大于240的，说明这些基因在玉米中都发挥了耐低氮的作用，从而筛选出unigene差异表达基因中在玉米中发挥了耐低氮的作用的unigene差异表达基因；在进行筛选时可结合目前已有文献报道的unigene进行综合对比筛选，对步骤八筛选的差异表达基因进行结果验证，确保筛选准确性，利用qRT-PCR验证：随机选取几个差异表达基因进行qRT-PCR验证，若DEGs的表达模式与转录组测序结果一致，则实验测序结果是可靠的；
通过转录组测序挖掘玉米耐低氮基因，深入分析耐低氮分子机制，挖掘耐低氮关键基因，筛选耐低氮基因，同时为为提高氮素利用效率提供了新的依据和思路，以玉米内在的遗传基因作为起点，来培育耐低氮胁迫的新玉米品种或种质资源，达到减少氮肥消耗，降低了玉米生产成本。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、在低氮处理下培养实验组玉米，获得实验组组织样本；在正常氮处理下培养对照组玉米，获得对照组组织样本；
步骤二、对步骤一获得的实验组和对照组组织样本进行转录组测序，从组织样本中提取RNA，然后对组织样品单细胞所有的RNA进行测序，获得测序结果，最后整理分析转录组数据，将实验组组织样本的转录组数据与对照组组织样本的转录数据进行分析，挖掘出玉米中新的基因；
步骤三、低氮处理下玉米中新的基因差异表达，通过筛选指标FDR小于0.01，Log2FC大于1作为差异基因的筛选条件，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因筛选实验组组织样本中的；
注：FDR指的是错误发现率，Log2FC指的是两组样品间表达量的比值；
步骤四、对总的差异表达基因的KEGG和GO功能分析；对上调表达的差异基因的KEGG和GO注释分析；
注：KEGG主要说明基因锁参与的代谢通路，GO主要说明基因的基本功能；
步骤五、根据KEGG和GO功能分析，筛选出P值小于0.05的KEGG和GO；
步骤六、对步骤五筛选的差异基因，以Log2FC大于2，差异表达基因长度大于600bp，覆盖度大于85％，同源度大于95％作为筛选条件，通过BlastX比对，筛选出玉米低氮胁迫的数个unigene，并对筛选的unigene的基本功能和其参与调节的信号通路进行分类；
注：unigene是指经过去冗余之后得到的基因序列；
步骤七、以步骤六筛选的unigene差异表达基因的log10RPKM作热图分析,表明不同的差异基因具有不同的表达模式；
注：RPKM指的是代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数；
步骤八、根据步骤七中的图表unigene差异表达基因在低氮处理下的样品中显著上调表达或者下调表达的，而且其RPKM大于240的，说明这些基因在玉米中都发挥了耐低氮的作用，从而筛选出unigene差异表达基因中在玉米中发挥了耐低氮的作用的unigene差异表达基因。
2.根据权利要求1所述的基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，其特征在于，所述步骤一中组织样本采用玉米组织的叶/根或叶和根。
3.根据权利要求1或2所述的基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，其特征在于，所述步骤一中的实验组玉米和对照组玉米均为三组。
4.根据权利要求2所述的基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，其特征在于，所述步骤二在提取RNA之前对组织样本经液氮速冻后，于超低温冰箱中冷冻保存。
5.根据权利要求1所述的基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，其特征在于，在步骤三的低氮处理下玉米中新的基因差异表达之前进行转录测序质量评价，当转录测序质量高，则可进行步骤三。
6.根据权利要求5所述的基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，其特征在于，在进行转录测序质量评价方法为，将总的clean Reads比对到参考基因组上，若比对率，碱基质量值满足标准Q30，样品间的GC含量接近，则说明转录本测序的质量高；
注：clean Reads指的是经过过滤后的测序数据，碱基质量值为Q30指的是碱基的精确度在99.9％，GC指的是鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。
7.根据权利要求1所述的基于转录组测序挖掘玉米耐低氮基因的方法，其特征在于，对步骤八筛选的差异表达基因进行结果验证，确保筛选准确性，利用qRT-PCR验证：随机选取几个差异表达基因进行qRT-PCR验证，若DEGs的表达模式与转录组测序结果一致，则实验测序结果是可靠的。
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