CN110484648A - 一种鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记，引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记、引物及应用。利用4份高度纯合的自交系构建两个F₂群体(CS，SY)。利用群体分离分析法(BSA)与连锁定位的方法获得与辣椒簇生花序紧密连锁的染色体区域和候选基因，并进一步根据候选基因附近紧密连锁的变异开发分子标记，利用该标记对CS，SY两个F₂群体单株进行基因型鉴定，CS中符合率达到100％，SY中符合率达到94％。本研究结果不仅有助于补充辣椒花序结构类型鉴定的方法及分子辅助育种，且为控制此种新型的辣椒簇生花序基因的图位克隆及解析簇生花序形成的分子机制提供了基础。

Description

一种鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记，引物及应用

技术领域

本发明属于辣椒育种和分子生物学领域，涉及一种鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记、引物及应用。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L.)作为重要的茄科蔬菜，原产于中美洲和南美洲。辣椒由于其特殊的味道与丰富的营养价值深受消费者喜爱，目前在世界范围内广泛种植，中国作为其中的一个主产区域，目前种植面积已经超过大白菜，跃居为种植面积与经济效益第一的蔬菜作物。根据FAO 2017年统计结果，辣椒全世界产量已经超过4000万吨，产生了巨大的经济效益。辣椒果实作为其经济产物，高产作为主要的育种目标受到非常高的重视，辣椒果实簇生的性状能够显著增加单株果实数量，从而极大的提高产量，该性状在生产应用中具有极其重要的意义。

在开花植物中，茎尖分生组织(SAMs)在叶片形状和角度，节间长度，分枝模式，花序类型以及从营养生长到生殖生长的过渡中都起到重要作用。我们发现有许多基因如LEAFY(LFY)，APETALA1(AP1)，CAULIFLOWER，AP3和PISTILLATA能够参与调控中间分生组织的特征以及调节花器官的形态，最终决定花序的类型。此外，编码MADS结构域转录因子的AGAMOUS(AG)基因能够控制花分生组织的终止，CLV1、CLV2或CLV3的突变可以导致茎细胞产生过度增殖，从而增加了植株的花与花器官数量。WUS-CLV之间能够形成一种反馈调节，在不同的情况下激活各自的表达，通过表达量的变化调控植株结构的形成，番茄中fasciatedand branched(fab)和fasciated inflorescence(fin)的突变能够增加花与果实的数量。虽然植株结构对作物生产的重要价值是众所周知的，但其生长习性变异的遗传基础却一直未得到很好的探索，而辣椒结构的调控机制至今仍未知。

在我们目前的研究中，发现了一种突变体CL74具有簇生花序，我们利用CL74与前人发现的具有簇生花序类型的材料fa杂交分析，同时与具备单生花序类型的材料L816分别杂交，F1均表现为单生花序类型(表1)；

表1.遗传分析

其次，fa簇生表型的形成是由于fa基因中一段62bp的转座子插入(下划线)造成的，我们对CL74与fa两种材料中的fa基因进行扩增比对，表明CL74中不存在转座子的插入，具体如下。

>CL74

atggcttcgaaaatgtgtgaaccccttgtgattggtagagtgattggagaagttgttgattatttctgtccaagtgttaagatgtctgttatttataactccaacaaacatgtctataatggtcacgaactctttccttcctcagttaccactaaacctagggttgaagttaatggtggtgatctcagatccttcttcacactgatcatgatagatccagatgtacctggtcctagtgatccatatctcagggaacatctacactggattgtcacggacattccaggcactacagattgctcatttggaagagaagtggttgggtatgagatgccaaggccaaatattggaatccacaggtttgtatttttgctgttccagcagaagaaaaggcaaacaatatcgaatgcagcactctccagggatcgattctgtactcgaaaattctcagaagaaaatgaacttggctctcctgtagctgctgttttcttcaattgccagagggaaaccgctgccagaagacgttga

>fa

atggcttcgaaaatgtgtgaaccccttgtgattggtagagtgattggagaagttgttgattatttctgtccaagtgttaagatgtctgttatttataactccaacaaacatgtctataatggtcacgaactctttccttcctcagttaccactaaacctagggttgaagttaatggtggtgatctcagatccttcttcacactgatcacgatagatccag atgtacctggtcctagtgatccatatctcagggaacatctacactgatcatgatagatccagatgtacctggtcctagtgatccatatctcagggaacatctacactggattgtcacggacattccaggcactacagattgctcatttggaagagaagtggttgggtatgagatgccaaggccaaatattggaatccacaggtttgtatttttgctgttccagcagaagaaaaggcaaacaatatcgaatgcagcactctccagggatcgattctgtactcgaaaattctcagaagaaaatgaacttggctctcctgtagctgctgttttcttcaattgccagagggaaaccgctgccagaagacgttga

综上结果表明CL74与前人发现的簇生花序fa类型的材料相比是由一种非等位的、隐性的突变性状。辣椒花序结构是一个重要的部分，可以改变其植物结构，然后提高其产量和观赏价值，另一方面，具有束状果实的辣椒更适合于机械收获。目前辣椒育种的手段还比较落后，分子辅助育种还未得到很好的应用，导致育种进展缓慢，选择效率低下等问题。分子标记具有检测时期早、检测方便、结果准确等特点，能够极大的缩短育种周期，减少育种工作量。本标记能够补充簇生花序类型的鉴定，同时也能够为选育新型的辣椒簇生材料、增加植株产量提供分子基础。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记。

具体是从辣椒11号染色体197763834处开始的一段43bp的插入/缺失，其序列如下：GATTTGTAGAATATTTTCTTGACTTTACTCTTCCGCAGATGCC，见SEQ ID No.1。

本发明的分子标记以新型簇生花序基因紧密连锁的插入/缺失为基础，根据该插入/缺失上下游的序列设计开发引物。能够用于辣椒单簇生花序表型的鉴定。该标记能够准确在苗期准确的区分出花序表型，能够为高效选育簇生类型的辣椒品种提供辅助，同时还能够为克隆该新的控制簇生性状的基因，解析簇生花序的形成与调控机制奠定基础。

本发明的第二个目的是提供上述的鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记的引物，是根据43bp插入/缺失片段的上下游设计的引物。

进一步的，所述的引物优选：

正向引物CaDH-F：CGGGAGGCTATGTGACATTC，见SEQ ID No.2；

反向引物CaDH-R：TCTACGTCGTCCACGTTCAA，见SEQ ID No.3。

本发明的第三个目的是提供上述的鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记和上述的引物在辣椒新型簇生花序和单生花序类型鉴定及分子辅助育种中的应用。

具体包括如下步骤：

(1)提取辣椒单株DNA作为模板；

(2)采用依据分子标记上下游设计的引物进行PCR扩增；

(3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，利用凝胶成像系统读取带型；

(4)根据步骤(3)所得带型，如果只有243bp特异条带出现时，预测为簇生花序类型单株；如果只有200bp的特异条带出现，或者同时出现243bp与200bp的特异条带，预测为单生花序类型单株。

进一步的，PCR反应体系：总体积为20μL，具体成分如下：PCR在20μL反应系统中进行，该反应系统由1μL 30ng/μL的基因组DNA，18μLPCR-T3-Mix和10μmol正向和反向引物各0.5μL组成。

进一步的，PCR反应扩增程序为：98℃下预变性3分钟后；在98℃的变性15秒，退火温度为55-60℃，持续10秒，延伸温度为72℃，持续30秒，30个循环；然后在72℃下进行最终延伸3分钟；反应终止。

本发明的第四个目的是提供上述鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记获得方法。

具体方法如下：

(1)以辣椒单生花序高代自交系L816与CJ220分别为母本，新型的簇生花序材料CL74为父本，分别构建F2群体CS与SY；

(2)将CS与SY两个F2群体单株种植于玻璃温室，进行常规栽培管理；待群体单株进入盛花期后对F2群体单株进行表型鉴定；同时选取CS群体中单生花序与簇生花序的单株各30株构建单生混池与簇生混池，单株用CTAB法分别提取DNA后再进行等量混合，将等量混合的两个混池进行建库测序，测序深度20X；

(3)DNA文库的原始数据通过去除接头，低质量和重复的Reads来过滤，然后使用Burrows-Wheeler对齐工具BWA与辣椒参考基因组Zunla-1_V2进行比对；使用GATK软件检测SNP和插入缺失InDel；根据以下标准过滤结果:settings:--filter Expression"QD<4.0||FS>60.0||MQ<40.0",-G_filter"GQ<20",--fasciculate WindowSize 4；

InDel通过不同的过滤参数过滤，如下:settings:--filter Expression"QD<4.0||FS>200.0||Read PosRankSum<-20.0||Inbreeding Coeff<-0.8"；使用ANNOVAR基于参考基因组的GFF3文件注释SNP或InDel。SNP指数SNP-index和Δ(SNP-index)值用于鉴定与束状花序相关的候选基因组区域；将两个池中的SNP/InDel指数小于0.3的点过滤掉；基于野生型和突变体库之间的SNP-index的差异确定Δ(SNP-index)；使用具有1-Mb窗口大小和10-kb增量的滑动窗口方法作为默认设置来计算位于给定基因组区间中的SNP的Δ(SNP-index)的平均值；为了确定与突变表型相关的候选区域，首先针对具有给定读取深度和99％置信区间的所有SNP位置计算Δ(SNP-index)的统计置信区间；随后检查Δ(SNP-index)，并将置信值以上的染色体区域作为候选区域；

(4)提取CS群体亲本L816与CL74进行10X重测序，利用L816与CL74之间的变异数据进行标记开发；

(5)利用亲本变异数据对BSA获得的候选染色体区域进行标记开发与基因精细定位，利用区间变异数据设计的引物在F2群体中检测共分离程度，筛选共分离程度较高的标记。

与现有技术相比，本发明具备以下优点：

(1)本发明的分子标记能够在苗期对材料的花序类型进行鉴定，快速且准确的选出纯合基因型，不受环境与其他外界因素影响；

(2)本发明的分子标记有利于高效的选育不同花序类型的品种，缩短育种周期，减少田间材料种植的工作量，节省人力物力；

(3)利用本发明的分子标记，能够为克隆辣椒簇生基因提供基础，同时为补充解析辣椒簇生性状的调控机理奠定基础。

(4)本发明是基于发现一种新的突变体CL74，具有簇生花序，通过遗传分析发现CL74与以前发现的簇生花序突变体相比是由一种非等位的突变控制的。因此，本发明是基于该新型突变为判断标准的辣椒单簇生花序鉴定方法。

附图说明

图1为单花与簇生花亲本表型；a.单花花序植株L816；b.簇生花序植株CL74；c.F1植株；d.CL74簇生花序；

图2为Δ(SNP-index)分析单花混池和簇生花混池，箭头所指为候选QTL；

图3为利用本发明标记对F2群体部分单株花序表型鉴定；

图4为候选区段内标记开发与连锁定位示意图。

具体实施方式

本发明实施例的举例不构成对本发明的任何限制。在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。

实施例1：

本实施例的一种鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记，所述标记是根据与辣椒新型簇生花序基因紧密连锁的插入/缺失的上下游序列设计而来。

上述与辣椒新型簇生花序基因紧密连锁的分子标记获得的步骤如下：

(1)群体构建：以辣椒单生花序高代自交系L816与CJ220分别为母本，簇生花序突变体CL74为父本，分别构建F2群体CS与SY(图1)。CL74，L816与CJ220均保存于湖南省蔬菜研究所辣椒种质资源库,可以对外出售；

(2)表型鉴定：将CS与SY两个F2群体单株种植于玻璃温室，进行常规栽培管理。待群体单株进入盛花期后对F2群体单株进行表型鉴定。

(3)混池测序：选取CS群体中单生花序与簇生花序的单株各30株构建单生混池与簇生混池，单株用CTAB法分别提取DNA后再进行等量混合，将等量混合的两个混池送公司进行建库测序，测序深度20X；

(4)候选区间分析：DNA文库的原始数据通过去除接头，低质量和重复的Reads来过滤，然后使用Burrows-Wheeler对齐(BWA)工具与辣椒参考基因组Zunla-1_V2进行比对。使用GATK软件检测SNP和插入缺失(InDel)。根据以下标准过滤结果:(settings:--filterExpression"QD<4.0||FS>60.0||MQ<40.0",-G_filter"GQ<20",--fasciculateWindowSize4,)。InDel通过不同的过滤参数过滤，如下:(settings:--filter Expression"QD<4.0||FS>200.0||Read PosRankSum<-20.0||Inbreeding Coeff<-0.8")。使用ANNOVAR基于参考基因组的GFF3文件注释SNP或InDel。SNP指数(SNP-index)和Δ(SNP-index)值用于鉴定与束状花序相关的候选基因组区域。将两个池中的SNP/InDel指数小于0.3的点过滤掉。基于野生型和突变体库之间的SNP-index的差异确定Δ(SNP-index)。使用具有1-Mb窗口大小和10-kb增量的滑动窗口方法作为默认设置来计算位于给定基因组区间中的SNP的Δ(SNP-index)的平均值。为了确定与突变表型相关的候选区域，首先针对具有给定读取深度和99％置信区间的所有SNP位置计算Δ(SNP-index)的统计置信区间。随后检查Δ(SNP-index)，并将置信值以上的染色体区域作为候选区域；在第11号染色体上，见图2。

(5)亲本重测序：提取CS群体亲本L816与CL74进行10X重测序，利用L816与CL74之间的变异数据进行标记开发；

(6)分子标记开发：利用亲本变异数据对BSA获得的候选染色体区域进行标记开发与基因精细定位，利用区间变异数据设计的引物在F2群体中检测共分离程度，筛选共分离程度较高的标记。从精细定位的结果可知CaDH与表型共分离程度最高，与该性状紧密连锁(图3，图4)。

(7)利用上述技术措施，最终获得了与辣椒新型簇生花序基因紧密连锁的插入缺失标记InDelCaDH，其对应的辣椒参考基因组物理图谱的位置为11号染色体的197763834处开始的43bp的序列GATTTGTAGAATATTTTCTTGACTTTACTCTTCCGCAGATGCC。根据该段序列上下游设计的正向引物CaDH-F与反向引物CaDH-R，引物序列如下：

正向引物：CaDH-F：CGGGAGGCTATGTGACATTC

反向引物：CaDH-R：TCTACGTCGTCCACGTTCAA。

实施例2：

辣椒新型簇生花序基因紧密连锁的分子标记的验证：

利用实施例1获得的分子标记对CS与SY两个F2群体中随机抽取的50个簇生隐性单株进行鉴定，步骤如下：

(1)利用CTAB法提取辣椒F2群体单株DNA作为模板，DNA浓度为30-100ng/ul，利用分子标记进行PCR扩增，正向引物序列为CaDH-F：CGGGAGGCTATGTGACATTC，反向引物序列为CaDH-R：TCTACGTCGTCCACGTTCAA，PCR反应体系：总体积为20μl，具体成分如下：PCR在20μL反应系统中进行，该反应系统由1μl基因组DNA(30ng/μl)，18μl PCR-T3-Mix(TSINGKE)和正向和反向引物(引物浓度均为10μmol)各0.5μl组成；

(2)PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的S1000型PCR仪上进行。扩增程序为：98℃下预变性3分钟后；在98℃的变性15秒，退火温度为55-60℃，持续10秒，延伸温度为72℃，持续30秒，30个循环；然后在72℃下进行最终延伸3分钟；反应终止；

(3)利用2％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，利用凝胶成像系统读取带型；

(4)根据步骤(3)所得带型，如果仅仅出现的是243bp特异条带，预测为簇生花序类型；如果仅仅出现200bp的特异条带，或者同时出现243bp与200bp的特异条带，预测为单生花序类型；

(5)鉴定结果如表2,3

CS群体随机抽样鉴定准确率达100％，而在SY群体中准确率达94％，两个群体鉴定的准确率均达到90％以上，表明其具有准确性以及通用性，可以用于该类型簇生花序的苗期表型鉴定。

表2CS群体鉴定结果

注：1：表示仅出现200bp大小的条带；2:表示仅出现243bp大小的条带；3：表示同时出现200bp与243bp大小的条带。

表3SY群体鉴定结果

注：1：表示仅出现200bp大小的条带；2:表示仅出现243bp大小的条带；3：表示同时出现200bp与243bp大小的条带。

序列表

<110> 湖南农业大学

湖南省蔬菜研究所

<120> 一种鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记，引物及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annuum L)

<400> 1

gatttgtaga atattttctt gactttactc ttccgcagat gcc 43

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggaggcta tgtgacattc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctacgtcgt ccacgttcaa 20

<210> 4

<211> 528

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annuum L)

<400> 4

atggcttcga aaatgtgtga accccttgtg attggtagag tgattggaga agttgttgat 60

tatttctgtc caagtgttaa gatgtctgtt atttataact ccaacaaaca tgtctataat 120

ggtcacgaac tctttccttc ctcagttacc actaaaccta gggttgaagt taatggtggt 180

gatctcagat ccttcttcac actgatcatg atagatccag atgtacctgg tcctagtgat 240

ccatatctca gggaacatct acactggatt gtcacggaca ttccaggcac tacagattgc 300

tcatttggaa gagaagtggt tgggtatgag atgccaaggc caaatattgg aatccacagg 360

tttgtatttt tgctgttcca gcagaagaaa aggcaaacaa tatcgaatgc agcactctcc 420

agggatcgat tctgtactcg aaaattctca gaagaaaatg aacttggctc tcctgtagct 480

gctgttttct tcaattgcca gagggaaacc gctgccagaa gacgttga 528

<210> 5

<211> 590

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annuum L)

<400> 5

atggcttcga aaatgtgtga accccttgtg attggtagag tgattggaga agttgttgat 60

tatttctgtc caagtgttaa gatgtctgtt atttataact ccaacaaaca tgtctataat 120

ggtcacgaac tctttccttc ctcagttacc actaaaccta gggttgaagt taatggtggt 180

gatctcagat ccttcttcac actgatcacg atagatccag atgtacctgg tcctagtgat 240

ccatatctca gggaacatct acactgatca tgatagatcc agatgtacct ggtcctagtg 300

atccatatct cagggaacat ctacactgga ttgtcacgga cattccaggc actacagatt 360

gctcatttgg aagagaagtg gttgggtatg agatgccaag gccaaatatt ggaatccaca 420

ggtttgtatt tttgctgttc cagcagaaga aaaggcaaac aatatcgaat gcagcactct 480

ccagggatcg attctgtact cgaaaattct cagaagaaaa tgaacttggc tctcctgtag 540

ctgctgtttt cttcaattgc cagagggaaa ccgctgccag aagacgttga 590

Claims (8)

1.一种鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记，是从辣椒11号染色体197763834处开始的一段43bp的插入/缺失，其序列如下：GATTTGTAGAATATTTTCTTGACTTTACTCTTCCGCAGATGCC。

2.一种权利要求1所述的Indel分子标记的引物，其特征在于，是根据43bp插入/缺失片段的上下游设计的引物。

3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：

正向引物CaDH-F：CGGGAGGCTATGTGACATTC

反向引物CaDH-R：TCTACGTCGTCCACGTTCAA。

4.权利要求1所述的Indel分子标记和权利要求2或3所述的引物在辣椒新型簇生花序和单生花序类型鉴定及分子辅助育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)提取辣椒单株DNA作为模板；

(2)加入权利要求2或3所述的引物进行PCR扩增；

(3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，利用凝胶成像系统读取带型；

(4)根据步骤(3)所得带型，如果只有243bp特异条带出现时，预测为簇生花序类型单株；如果只有200bp的特异条带出现，或者同时出现243bp与200bp的特异条带，预测为单生花序类型单株。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，

PCR反应体系：总体积为20μl，具体成分如下：PCR在20μL反应系统中进行，该反应系统由1μl 30ng/μl的基因组DNA，18μl PCR-T3-Mix和10μmol正向和反向引物各0.5μl组成。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于,

PCR反应扩增程序为：98℃下预变性3分钟后；在98℃的变性15秒，退火温度为55-60℃，持续10秒，延伸温度为72℃，持续30秒，30个循环；然后在72℃下进行最终延伸3分钟；反应终止。

8.权利要求1所述的鉴定辣椒新型单簇生花序的Indel分子标记的获得方法，其特征在于，方法如下：

(1)以辣椒单生花序高代自交系L816与CJ220分别为母本，新型的簇生花序材料CL74为父本，分别构建F2群体CS与SY；

(2)将CS与SY两个F2群体单株种植于玻璃温室，进行常规栽培管理；待群体单株进入盛花期后对F2群体单株进行表型鉴定；同时选取CS群体中单生花序与簇生花序的单株各30株构建单生混池与簇生混池，单株用CTAB法分别提取DNA后再进行等量混合，将等量混合的两个混池进行建库测序，测序深度20X；

(3)DNA文库的原始数据通过去除接头，低质量和重复的Reads来过滤，然后使用Burrows-Wheeler对齐工具BWA与辣椒参考基因组Zunla-1_V2进行比对；使用GATK软件检测SNP和插入缺失InDel；根据以下标准过滤结果:settings:--filter Expression"QD<4.0||FS>60.0||MQ<40.0",-G_filter"GQ<20",--fasciculate WindowSize 4；InDel通过不同的过滤参数过滤，如下:settings:--filter Expression"QD<4.0||FS>200.0||ReadPosRankSum<-20.0||Inbreeding Coeff<-0.8"；使用ANNOVAR基于参考基因组的GFF3文件注释SNP或InDel；SNP指数SNP-index和Δ(SNP-index)值用于鉴定与束状花序相关的候选基因组区域；将两个池中的SNP/InDel指数小于0.3的点过滤掉；基于野生型和突变体库之间的SNP-index的差异确定Δ(SNP-index)；使用具有1-Mb窗口大小和10-kb增量的滑动窗口方法作为默认设置来计算位于给定基因组区间中的SNP的Δ(SNP-index)的平均值；为了确定与突变表型相关的候选区域，首先针对具有给定读取深度和99％置信区间的所有SNP位置计算Δ(SNP-index)的统计置信区间；随后检查Δ(SNP-index)，并将置信值以上的染色体区域作为候选区域；

(4)提取CS群体亲本L816与CL74进行10X重测序，利用L816与CL74之间的变异数据进行标记开发；

(5)利用亲本变异数据对BSA获得的候选染色体区域进行标记开发与基因精细定位，利用区间变异数据设计的引物在F2Q群体中检测共分离程度，筛选共分离程度较高的标记。