CN108359738A - 一种榧树est-ssr引物及品种指纹图谱构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子指纹图谱技术领域，公开了一种榧树EST‑SSR引物及品种指纹图谱构建方法，序列为：SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：40。筛选所得的20个多态性EST‑SSR标记，对13个榧树品种的DNA进行PCR扩增；根据扩增结果，精确读取扩增片段长度，进行统计后，最少使用三对EST‑SSR引物组合将供试的13个榧树品种区分开。本发明基于‘细榧’和‘圆榧’种子转录组数据，对获得的SSR数据进行分析，筛选出扩增条带清晰，且多态性高的SSR引物，并利用其构建榧树特色品种的分子指纹图谱，同时为榧属种质资源评价、保存和利用提供了良好的基础。

Description

一种榧树EST-SSR引物及品种指纹图谱构建方法

技术领域

本发明属于分子指纹图谱技术领域，尤其涉及一种榧树EST-SSR引物及品种指纹图谱构建方法。

背景技术

榧属(Torreya)由Arnott于1938年创立，佛罗里达榧(Torreya taxifolia Arn)为该属的模式植物。据文献记载，现存榧属植物仅有7种2变种，间断分布于东亚和北美洲。其中，佛罗里达榧(Torreya taxifolia)和加州榧(Torreya californica Torrey)产于北美，日本榧(Torreya nucifera(L.)Sieb.et Zucc.)野生分布于日本和朝鲜半岛，我国部分城市作为庭院树引种栽培。中国自然分布有巴山榧 (Torreya fargesii Franch.)、长叶榧(Torreya jackii Chun)、榧树(Torreya grandis Fort.ex Lind)、四川榧(Torreyaparvifolia Yi,L Yang et Long)、云南榧(Torreya fargesii Franch.Var.yunnanensis)和九龙山榧(Torreya grandis Fort.ex Lind.Var. jiulongshanensis)。还有一种榧属植物Torreya clarnensis已灭绝，在美国俄勒冈州中北部地区发现了它的种子化石，这批种子化石位于始新世中期的黑硅石中。榧树(Torreya grandis)通常雌雄异株，群体内变异复杂，籽形从圆到长，从大到小呈正态分布。会稽山区的榧树类型最为丰富，不同类型的民间称谓有：细榧，芝麻榧，米榧，茄榧，獠牙榧，旋纹榧，大圆榧(炭甏榧)，圆榧，小圆榧，寸金榧，羊角榧，长榧和冲杠榧等。在安徽省黄山地区有神仙榧，花生榧，和尚榧，糯米榧，转筋榧，苹果榧，牛卵子榧，圆榧，小圆榧和米榧等品种类型的称谓。2011年，‘细榧’(Torreya grandis‘Xifei’)通过国家林业局林木品种审定委员会审定，良种编号“国S-SV-TG-024-2011”。近年来，浙江省林木品种审定委员会审(认)定了‘珍珠榧’，‘大长榧’，‘象牙榧’，‘东白珠’，‘脆仁榧’，‘朱岩榧’，‘丁山榧’，‘东榧1号’，‘东榧2号’，‘东榧3号’和‘大叶种细榧’等品种。目前，香榧造林中所应用的苗木基本来自于育苗农户和部分企业，存在着苗木品种不明确，未使用审(认)定品种作为接穗育苗的情况，导致部分造林企业和农户在购买苗木种植10多年后，出现香榧树不结实或所结种实不是购买的品种。香榧在苗期基本无法通过形态学特征来区分品种，因此随着榧树新品种的不断选育和香榧产业的发展壮大，香榧品种急需通过构建DNA指纹图谱来加以鉴定，以便保护育种者及种植者的权益；榧树各居群的实生种质需要进行评价和利用；分子标记辅助选择育种也势在必行。简单序列重复(SimpleSequence Repeat,SSR)又称微卫星序列，是广泛存在于真核和原核生物基因组中的遗传标记，具有共显性、覆盖性广、信息量大、操作简单等优势，SSR标记已广泛应用于油茶、陆地棉、油棕、花生等油料植物的遗传多样性评价和品种指纹图谱构建。传统的SSR引物主要从基因组文库中获得，其步骤复杂、工作量大，开发成本高。近年来，高通量测序技术迅猛发展，EST-SSR是ESTs测序计划的副产物，开发成本较低，共显性遗传，多态性高，重复性及稳定性好，是目前最适合用于种质鉴定分析的标记之一。在榧属植物分子标记开发方面，金则新等建立了长叶榧ISSR-PCR的反应体系，梁丹等人建立了香榧AFLP实验体系并利用AFLP进行了榧树雌雄株的鉴定，刘浩凯等利用SRAP标记研究了雌性榧树4个居群的遗传多样性，戴正等用RAPD和 SCAR标记鉴定了香榧幼苗的性别，张党权等利用RAPD将榧树的几个栽培类型进行了分类。

综上所述，现有技术存在的问题是：RFLP标记所需DNA量较大，步骤较多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素，成本高。RAPD标记因使用的引物比较短，对反应条件极为敏感，稍有改变便影响扩增产物的重现，重复性较差，稳定性不好。另外，RAPD是显性标记，不能区分纯合基因型与杂合基因型，无法直接用于基因型分析。SRAP标记是对ORF进行扩增，对基因组相对较少的着丝粒附近以及端粒的扩增会较少。ISSR标记大多是显性标记，不能区分显性纯合基因和杂合基因型，PCR扩增反应的最适条件需要一定时间摸索。AFLP标记费用比较昂贵，且方法需经多步操作，统计分析困难，对DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。国际植物新品种保护联盟(UPOV)已将DNA 分子标记鉴定纳入农作物品种DUS测试内容，并在分子生物学技术(BMT)测试指南草案中，将构建DNA指纹数据库所使用的标记方法确定为SSR和SNP。其中，SSR标记因具有多态性高、重复性好、共显性优点，被UPOV生物化学和分子技术工作组验证为植物新品种保护最广泛应用的标记体系。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种榧树EST-SSR引物及品种指纹图谱构建方法。

本发明是这样实现的，一种榧树EST-SSR引物，所述榧树EST-SSR引物序列为：SEQID NO：1-SEQ ID NO：40。

本发明的另一目的在于提供一种所述榧树EST-SSR引物的制备方法，所述榧树EST-SSR引物的制备方法包括：

对‘细榧’和‘圆榧’不同发育时期的种仁进行转录组测序，以测序数据为基础，采用Primer3程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物。引物设计的主要原则：引物长度控制在20bp；退火温度58℃-62℃；上下游引物的Tm值相差不大于2℃；PCR产物长度在100-300bp之间；GC含量在40％-60％之间；每个位点产生3对候选引物。选取巴山榧，九龙山榧，长叶榧，日本榧和榧树的DNA作为模版对合成的EST-SSR引物进行筛选；

PCR扩增采用10μL体系，其中包括10×PCR Buffer(Mg²⁺)1μL，dNTP Mix 0.8μL，上下游引物各0.5μL，DNA模版0.5μL，rTaq酶0.05μL，ddH₂O 6.65μL。扩增程序为：95℃预变性5min；然后进行30次循环，每个循环包括94℃变性 45s，54-58℃(退火温度因不同引物而异)退火30s，72℃延伸1min，；最后 72℃延伸10min，4℃保存。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述榧树EST-SSR引物的构建榧树品种指纹图谱的方法，所述榧树品种指纹图谱构建方法包括以下步骤：

步骤一，据筛选所得的20个多态性EST-SSR引物(表2)，对13个榧树品种样品进行PCR扩增；

步骤二，根据扩增结果，精确读取扩增片段长度，利用扩增片段长度的不同把13个品种区分开。统计发现，最少使用3对EST-SSR引物(ZAFU-17， ZAFU-25，ZAFU-28)组合，可以将供试的13个榧树品种区分开。利用这3对引物对13个品种扩增片段的长度数值，构建了品种指纹图谱。(表3)

本发明基于‘细榧’和‘圆榧’种仁转录组数据，对获得的SSR数据进行分析，筛选出扩增条带清晰，且多态性高的SSR引物，并利用其构建榧树特色品种的分子指纹图谱，同时为后续榧树居群遗传多样性，分子标记辅助选择育种，榧属种质资源的评价、保存和利用提供了良好的基础。

本发明相比其它分子标记，SSR标记具有以下优点：

(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高。

(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高。

(3)共显性遗传，不易被自然选择和人工选择所淘汰，符合孟德尔遗传定律。

(4)易于利用PCR技术分析，对DNA质量要求低，用量少，不需使用同位素，即使是部分降解的样品也可进行分析。

(5)重复性高，稳定性好。每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。

附图说明

图1是本发明实施例提供的榧树品种指纹图谱构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的引物ZAFU-17对13个榧树品种的扩增结果示意图

图3是本发明实施例提供的引物ZAFU-25对13个榧树品种的扩增结果示意图。

图4是本发明实施例提供的引物ZAFU-28对13个榧树品种的扩增结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的榧树EST-SSR引物序列为：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO： 40。

如图1所示，本发明实施例提供的榧树品种指纹图谱构建方法包括以下步骤：

S101：基于‘细榧’和‘圆榧’不同时期种子转录组测序所得数据，筛选SSR位点，利用Primer 3程序，对含有SSR位点的Unigene序列设计引物。随机选取设计的SSR引物交生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

S102：利用合成引物对10个榧属单株DNA进行PCR扩增，筛选出扩增产物单一明亮、无明显杂带的引物；

S103：对于能够稳定扩增出单一明亮条带引物的PCR产物，利用Qsep100^TM全自动核酸分析系统进行毛细管电泳，检测PCR扩增出的产物片段大小；

S104：统计结果后利用Popgene 1.3.2软件计算每个位点的遗传参数及PIC 值，筛选出具有多态性的EST-SSR引物；

S105：结合本课题组前期研究所得的16对EST-SSR引物和本研究筛选所得的20对EST-SSR引物对13个榧树品种(无性系)进行PCR扩增；

S106：对PCR产物进行毛细管电泳分离检测，精确读取扩增片段的长度，利用PopGene软件计算遗传参数，根据遗传参数，选择引物进行榧树品种(无性系)的指纹图谱构建。根据结果，最少利用3对EST-SSR引物组合(ZAFU-17、ZAFU-25、ZAFU-28)就可以将13个榧树品种(无性系)进行区分。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料与方法

1.1转录组数据来源

转录组数据来源于本课题组2014年对‘细榧’和‘圆榧’种仁进行Illumina 高通量测序的结果。测序时采取3个发育时期的种仁：种子脂肪酸开始合成期 (授粉后第449天)、脂肪酸合成高峰期(授粉后第469天)、脂肪酸合成平缓期(授粉后第512天)，提取RNA后委托北京百迈克生物科技公司完成 RNA-Seq测序，并通过De Novo方法组装。得到142213条Unigene，作为背景数据。

1.2转录组SSR位点鉴别及SSR引物设计

转录组数据采用Trinity软件组装，获得转录本序列。组装共得到246862条Transcript。利用MISA程序对筛选得到的1kb以上的Unigene做SSR位点搜索。

用Primer3程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物。引物设计的主要原则：引物长度控制在20bp；退火温度58℃-62℃；上下游引物的Tm值相差不大于2℃；PCR产物长度在100-300bp之间；GC含量在40％-60％之间；每个位点产生3对候选引物。

1.3植物材料

本发明选取榧属5个种的10个单株进行SSR引物的可用性及多态性评价，分别是巴山榧雌株，巴山榧雄株，九龙山榧雌株，九龙山榧雄株，长叶榧雌株，长叶榧雄株，日本榧雌株，榧树雌株，榧树雄株，‘细榧’。用筛选出的EST-SSR 引物对13个榧树品种进行指纹图谱的构建，如表1。

表1供试材料

1.4DNA提取

取榧属植物新鲜叶片，置于冰盒中保存带回实验室后，采用改良CTAB法提取基因组总DNA。用NanoDrop ND1000测定DNA浓度及质量，随后稀释至 50ng/μL，于4℃冰箱保存。

具体DNA提取步骤如下：

(1)将冰箱中取出的样品剪碎放入2ml离心管中，放入钢珠。液氮冷冻后放入磨样机研磨至粉末状。

(2)取出离心管，加入1600μl TNE冰浴30min，放入高速冷冻离心机12000rpm，4℃离心10min，取出后倒出上清，重复此步骤3次。

(3)离心管中加入65℃预热的含2％β-巯基乙醇的CTAB 800μl。放入65℃恒温水浴锅水浴40-60min。放入高速冷冻离心机12000rpm，4℃离心10min。

(4)取出离心管，取上清液，约600μl，加入新的1.5ml离心管，加入等体积25：24：1(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，震荡混匀，静置5min，使其充分反应。放入高速冷冻离心机12000rpm，4℃离心10min。

(5)取出离心管，吸取上清液，约500μl，加入新的1.5ml离心管中，加入等体积24:1(氯仿：异戊醇＝24：1)，震荡混匀，静置5min，使其充分反应。放入高速冷冻离心机12000rpm，4℃离心10min。

(6)取出离心管，吸取上清液，约400μl，加入新的1.5ml离心管，加入两倍体积-20℃预冷的75％乙醇沉淀。上下颠倒混匀，放入-20℃冰箱静置40-60min。取出后放入高速冷冻离心机12000rpm，4℃离心10min。

(7)取出离心管，倒出上清液，加入500μl 75％乙醇，轻弹管壁，使底部沉淀悬浮，上下颠倒，使沉淀充分清洗。放入高速冷冻离心机，7500rpm，4℃离心5min。重复此步骤3次。

(8)取出离心管，倒出上清液，用移液枪将底部残留酒精吸出，打开管盖，置于通风橱中，风干。

(9)待离心管中DNA充分风干后，加入30μl ddH₂O溶解DNA。

(10)1.2％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取DNA质量和浓度。

(11)依据所测得的DNA浓度，加ddH₂O稀释至50ng/μl，随后将DNA 放入-20℃冰箱保存，备用。

1.5EST-SSR引物筛选

随机选取69对EST-SSR引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。选取巴山榧，九龙山榧，长叶榧，日本榧，榧树进行引物筛选。PCR扩增采用 10μL体系，其中包括10×PCR Buffer(Mg²⁺)1μL，dNTP Mix 0.8μL，上下游引物各0.5μL，DNA模版0.5μL，rTaq酶0.05μL，ddH₂O 6.65μL。扩增程序为：95℃预变性5min；然后进行30次循环，每个循环包括94℃变性45s，54-58℃ (退火温度因不同引物而异)退火30s，72℃延伸1min，；最后72℃延伸10min， 4℃保存。

PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出能够稳定扩增出单一明亮条带或两条明亮条带的引物用于后续实验。初次筛选出的PCR产物用Qsep100^TM全自动核酸分析系统进行毛细管电泳分离检测及产物片段大小测定。

1.6数据统计

根据Qsep100^TM分离检测结果，统计其扩增条带，输入EXCEL中，转换格式后，利用PopGene Ver.1.3.2对标记数据进行遗传参数分析。引物多态性采用多态信息含量(PIC)进行评价。

多态信息含量PIC的计算公式为：

[PIC＝1-∑Pij²]；

其中,Pij表示标记i的第j个等位基因在群体中的频率。

根据统计的实验结果及计算筛选所得的每个位点的各等位基因的频率，利用软件Pic-calc 6.0计算得到PIC值。

1.7指纹图谱构建

根据每个品种样品在筛选所得的EST-SSR引物中扩增出的特定片段长度作为标记，进行指纹图谱的构建。

2结果与分析

2.1EST-SSR引物有效性及多态性评价

随机选择合成的69对EST-SSR引物，以榧属不同种的10个样品进行PCR 扩增，筛选。结果显示，其中37对引物能扩增出比较理想的产物，有效扩增率为53.62％。随后利用Qsep100^TM对PCR产物进行毛细管电泳，得到其扩增片段长度，筛选出多态引物20对，多态率为28.99％。20对引物在榧属的5个种中共扩增获得80个等位基因，每个位点等位基因数从2个到9个不等，平均每个位点等位基因数为4个。ZAFU-25、ZAFU-28和ZAFU-36三个位点的等位基因分别为9个，8个和8个。平均期望杂合度为0.8377，其中最小值为0.5817，最大值为1.000。观测杂合度则全部为1.000。多态信息含量(PIC)是衡量一个群体变异的重要参数，20个位点的多态信息含量变化范围为0.3750-0.8296，引物 ZAFU-28的PIC值最大，引物ZAFU-21、ZAFU-24、ZAFU-27、ZAFU-34和 ZAFU-35的PIC值最小，平均多态信息含量为0.594，其中13个位点具有高度多态性(PIC≥0.5)。表2为20个位点的多态性扩增情况。

表220个EST-SSRs引物在10个榧属个体中的特征

2.2品种指纹图谱构建

利用20个多态性EST-SSR引物，对13个榧树品种进行鉴定。根据PCR扩增结果，精确读取扩增片段长度，统计后发现，最少使用3对EST-SSR引物组合，ZAFU-17(图2)，ZAFU-25(图3)，ZAFU-28(图4)，即可将供试的13 个榧树品种区分开(表3)。

表3 13个榧树品种指纹图谱

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种榧树EST-SSR引物，其特征在于，所述榧树EST-SSR引物序列为：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：40。

2.一种如权利要求1所述榧树EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，所述榧树EST-SSR引物的制备方法包括：

对细榧和圆榧不同发育时期的种仁进行转录组测序，以测序数据为基础，采用Primer3程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物；引物长度控制在20bp；退火温度58℃-62℃；上下游引物的Tm值相差不大于2℃；PCR产物长度100-300bp；GC含量40％-60％；每个位点产生3对候选引物；选取巴山榧，九龙山榧，长叶榧，日本榧，榧树作为模版对合成的EST-SSR进行筛选；

PCR扩增采用10μL体系，其中包括10×PCR Buffer(Mg²⁺)1μL，dNTP Mix 0.8μL，上下游引物各0.5μL，DNA模版0.5μL，rTaq酶0.05μL，ddH₂O 6.65μL。扩增程序为：95℃预变性5min；然后进行30次循环，每个循环包括94℃变性45s，54-58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。

3.一种利用权利要求1所述榧树EST-SSR引物的榧树品种指纹图谱构建方法，其特征在于，所述榧树品种指纹图谱构建方法包括以下步骤：

步骤一，据筛选所得的20个多态性EST-SSR标记，对13个榧树品种样品进行PCR扩增；

步骤二，根据扩增结果，精确读取扩增片段长度，进行统计后，最少使用三对EST-SSR引物组合将供试的13个榧树品种区分开。