CN112195265A

CN112195265A - 一种鉴定辣椒杂交种纯度的snp位点、引物组及应用

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Publication number: CN112195265A
Application number: CN202011133331.4A
Authority: CN
Inventors: 温常龙; 张建; 杨静静; 张晓飞; 罗江; 李向晶
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2040-10-21
Also published as: CN112195265B

Abstract

本发明公开了一种鉴定辣椒杂交种纯度的方法及其使用的SNP引物组合。本发明所提供的SNP引物组合由8个引物组组成；每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点；各个引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所示。该SNP引物组合被确认适用于82个辣椒品种的纯度鉴定，且检测效果稳定准确、检测速度快，在种子或苗期即可鉴定，适用于高通量检测设备，操作简单、省时省力，具有广阔的应用前景，同时可为辣椒品种的种子质量管理提供技术支持。

Description

一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点、引物组及应用

技术领域

本发明属于分子标记及其检测领域，具体涉及一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点、引物组、试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum)是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一，近年来种植面积已超过200万公顷，产值常年位于前列。其营养价值高、用途广泛，在鲜食市场和加工市场均占有重要份额。《非主要农作物品种登记办法》实施以来，全国已公告登记的辣椒品种已达2464个，申请数量超过4000个，是申请和登记数量最多的蔬菜作物之一。

目前我国生产上使用的辣椒品种大部分为杂交种。辣椒杂交种在制种过程中需要进行去雄处理，但在实际生产中常因隔离措施不到位、去雄不及时或不彻底以及计划外的风媒、虫媒传粉等因素导致花粉串扰，同时在收获过程中因管理不当也会导致辣椒品种的种子纯度下降。依据农作物种子质量标准(GB16715.3--2010)的规定，辣椒杂交种的纯度应不低于96％。而一般工厂化育苗用种更是要求99％以上的纯度。因此，辣椒种子在收获后需尽早进行纯度鉴定，这是种子质量控制的必然要求，同时也可使满足质量要求的种子尽早上市从而提高市场占有率。纯度鉴定结果也是种子交易的参考指标和制种费用收取的重要依据。

传统的辣椒种子纯度鉴定主要以田间植株的叶形、长势等株型指标以及幼果果型指标进行鉴定，耗时较长、投入成本高、受环境因素影响大且对鉴定人员要求较高。后来发展的使用同工酶电泳方式鉴定辅助田间鉴定，但其多态性较低、在品种间差异有限，不能完全反应品种间基因型的差异。同时，随着育成品种的增加和骨干亲本的频繁使用，亲缘关系较近的品种也越来越多，传统鉴定方式已经不能满足品种纯度检测的要求。目前的专利技术中，仍有一些基于传统鉴定方式进行纯度鉴定和筛选的技术发明，如申请号为CN200410009909.X，于2006年6月7日公开的利用子叶为紫色的辣椒品种9004紫作为父本，通过鉴定其后代子叶颜色进行纯度鉴定和筛选的方法。还有申请号为CN201911021361.3，于2020年1月3日公开的利用紫色花柱辣椒品种8214紫或J0721紫进行作为父本进行杂交，鉴定其后代花柱颜色进行纯度鉴定和筛选。这类方法属于对传统鉴定方法的优化，其优点是表型直观，可以在田间直接看到性状差异，但同样周期较长，需要育种人员进行长时间田间鉴定，且亲本使用受限。

基于DNA分子标记的检测技术，因其检测成本低、省时高效，因此自上世纪70年代以来该技术迅速发展，迄今已经有20多种分子标记技术相继问世。目前辣椒研究中以SSR标记应用最为普遍，如辣椒杂交种一代热辣3号(刘子记等，2014)、国福903和中椒106(吴明生等，2017)、豫椒101(杨双娟等，2019)、绿陇3号(卢霞等，2020)等使用SSR标记进行种子纯度的鉴定。目前的研究中，已报道的SSR标记仅被应用于少数品种的鉴定，其是否能够推广到更多品种仍有待验证。在DNA水平进行鉴定的公开的技术方法有申请号为CN201310593868.2，于2015年7月22日公告的专利，其利用EST-SSR分子标记HE4进行热辣1号杂交种纯度的鉴定。申请号为CN201510706031.3，于2018年8月28日公告的专利，其使用2对SSR标记L0143和L0622，可用于辣椒杂交种汇丰2号的纯度鉴定。申请号为CN201811285982.8，于2019年2月12日公开的方法，其使用Indel标记进行的对辣椒杂交种654的纯度进行鉴定。以上3个专利中的方法能够替代传统杂交种子纯度鉴定方法，反应DNA水平差异，结果可靠，但3个专利中的标记均仅被确认可应用于这一个品种的纯度鉴定，其他品种基因组所使用引物所在位点插入缺失或者保守序列重复情况未知，因此无法确认其实际带型，其应用价值受到限制。申请号为CN201810811212.6，于2019年5月17日公告的专利，其使用一套Indel分子标记可用于鉴定4种辣椒雄性不育三系杂交种的纯度，该方法找到了在8份差异较大的加工型辣椒DNA中具有多态性的25对核心Indel引物，但其纯度鉴定较为繁琐，需要先用25对核心Indel进行鉴定，如果没有共显性标记则需要使用在6号染色体位于辣椒育性主效基因附近位点的21对Indel进行鉴定，并且其仅在4个辣椒杂交种中进行了验证。

总之，目前已公开的技术或者研究中的标记仍主要是以SSR、Indel等为代表的传统分子标记，且仅被确认可应用于少数辣椒品种的纯度鉴定。考虑到辣椒各个品种基因组差异较大，这些标记很可能不能应用在更多的辣椒品种中。只有在前期进行繁重的大规模多品种的筛选工作，才能找到位点差异稳定、可应用于大量品种且操作简便的核心纯度鉴定引物。同时，SSR和Indel等标记的分布相对有限，且受限于扩增方法，其存在一定的误差，有些使用方法也不够简便。相比之下，第三代分子标记SNP标记在植物基因组中的分布更为广泛、密度更高且遗传稳定性好。配合基于SNP标记开发的KASP检测方法，可使辣椒种子纯度检测实现高通量和自动化，同时检测误差较小，不受环境、栽培技术和人为观测的影响，能够精准而稳定的检测多态性位点。随着CM334和遵辣1号基因组测序以及其他辣椒资源品种基因组的重测序和转录组测序，更有利于研究人员开发适于更多品种基因型检测的SNP标记。筛选可应用于更多品种的高质量辣椒SNP标记(Perfect SNP)，使其符合大规模高通量的品种纯度检测要求，是辣椒品种纯度鉴定工作的发展方向，具有极高的应用前景。鉴于此，科研和实践中均急需开发一套适合鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点、引物组以及检测方法，应用于辣椒杂交种的纯度鉴定工作。

参考文献：

刘子记,李静婷,杨衍,曹振木.辣椒杂交种SSR分子标记鉴定及表型比较分析[J].华北农学报,2014,29(01):69-72.

卢霞,邓志军,刘梦华,赵玉虎,司龙亭,李文虎,阿门.辣椒基因组SSR引物的开发及品种纯度分子鉴定[J].江苏农业科学,2020,48(07):65-68.

吴明生,赵海艳,黄铃冰.利用SSR标记快速鉴定辣椒种子纯度[J].种子世界,2017,11):13-15.

杨双娟,于文涛,原玉香,魏小春,王志勇,赵艳艳,姚秋菊,张晓伟.辣椒品种‘豫椒101’纯度鉴定的SSR标记筛选[J].分子植物育种,2019,17(22):7433-7437.

发明内容

本发明提供了一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点、引物组、以及基于该SNP位点和引物组的试剂盒、检测方法及应用。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种用于鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点，选自如下第一SNP位点到第八SNP位点中的任1到8种：第一SNP位点，所述第一SNP位点位于辣椒参考基因组第4染色体第30522616位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；第二SNP位点，所述第二SNP位点位于辣椒参考基因组第11染色体第204038344位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为T或C；第三SNP位点，所述第三SNP位点位于辣椒参考基因组第2染色体第75886898位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；第四SNP位点，所述四第SNP位点位于辣椒参考基因组第12染色体第40630040位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或T；第五SNP位点，所述第五SNP位点位于辣椒参考基因组第9染色体第159969位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；第六SNP位点，所述第六SNP位点位于辣椒参考基因组第8染色体第126315482位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；第七SNP位点，所述第七SNP位点位于辣椒参考基因组第1染色体第293847360位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或A；第八SNP位点，所述第八SNP位点位于辣椒参考基因组第6染色体第388508位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或C；其中，所述辣椒参考基因组为辣椒Zunla-1参考基因组。

在一些实施方式中，所述第一SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQID NO：25所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：25的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：26所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：26的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：27所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：27的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第四SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：28所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQID NO：28的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第五SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：29所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：29的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第六SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：30所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：30的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第七SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：31所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：31的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第八SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：32所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：32的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％。

一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP引物组，用于分别扩增所述的SNP位点，所述SNP引物组包括：第一SNP引物组，用于扩增所述第一SNP位点；第二SNP引物组，用于扩增所述第二SNP位点；第三SNP引物组，用于扩增所述第三SNP位点；第四SNP引物组，用于扩增所述第四SNP位点；第五SNP引物组，用于扩增所述第五SNP位点；第六SNP引物组，用于扩增所述第六SNP位点；第七SNP引物组，用于扩增所述第七SNP位点；第八SNP引物组，用于扩增所述第八SNP位点。

在一些实施方式中，所述第一SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第四SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第五SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第六SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第七SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：19、SEQID NO：20、SEQ ID NO：21的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第八SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；优选地，每组所述引物中的第一上游引物和第二上游引物连接有不同的荧光分子，更优选，所述荧光分子选自FAM、HEX。

一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP试剂盒，所述SNP试剂盒配制为竞争性等位基因特异性PCR反应体系；所述反应体系包括：所述SNP引物组，优选地，所述SNP引物组中，每个引物组的第一上游引物、第二上游引物、下游引物在所述体系中浓度之比为2:2:5。

一种鉴定辣椒杂交种纯度的检测方法，包括以下步骤：DNA提取步骤：提取得到一个待测辣椒品种的N株待测辣椒杂交种的基因组DNA；N为大于12的自然数，优选大于95的自然数；目的引物组筛选步骤：以所述N株待测辣椒杂交种中大于等于8株的基因组DNA为模板，分别用所述的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应，得到PCR反应产物；再对所述PCR反应产物进行检测，得到基于所述的SNP位点的基因型为杂合型的株数，得到杂合型的株数最多的引物组即为目的引物组；目的引物组PCR扩增步骤：以所述N株待测辣椒杂交种的基因组DNA为模板，分别用所述目的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应，得到目的引物组的PCR反应产物；纯度检测步骤：对所述目的引物组的PCR反应产物进行检测，根据检测结果计算获得待测辣椒杂交种的纯度；优选地，所述目的引物组筛选步骤和纯度检测步骤中，所述检测的方法选自：荧光信号检测、直接测序。

在一些实施方式中，所述目的引物组筛选步骤和纯度检测步骤中，采用荧光信号检测时，统计所述的引物组所显示指示杂合子的颜色的荧光信号的株数；显示指示杂合子的颜色的荧光株数最多的引物组即为目的引物组；采用直接测序时，统计所述的SNP位点的基因型为杂合型的株数；杂合型株数最多的引物组即为目的引物组。

在一些实施方式中，在所述纯度检测步骤中，所述待测辣椒杂交种的纯度的计算方法为：采用荧光信号检测时，统计各个所述目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数和无荧光的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测辣椒杂交种的纯度；无荧光的株数＝N-显示指示杂合子的颜色荧光的株数-显示指示第一种纯合子的颜色荧光的株数-显示指示第二种纯合子的颜色荧光的株数；纯度＝[目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数/(N-目的引物组无荧光的株数)]×100％；采用直接测序时：统计各个目的引物组基于所述SNP位点的基因型为杂合型的株数和没有获得PCR扩增产物的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测辣椒杂交种的纯度；纯度＝[目的引物组基于SNP位点的基因型为杂合型的株数/(N-目的引物组没有获得PCR扩增产物的株数)]×100％。

在一些实施方式中，所述待测辣椒杂交种为先红五号、红鸟1号、脆螺一号、衢椒1号、亨椒一号、苏椒5号、种椒八号、苏椒15号、种都椒Ⅲ、岫椒6号、先红一号、中椒107号、索菲娅、陆尊、国福403、紫星2号、美国特大牛角椒、秀美、甜杂新1号、盛丰七号、湘辣18号、SV0108HA、苏椒5号博士王、红丰特选厚肉牛角椒(404)、扬椒2号、星秀、东黄1号、春晓、凯莱、白星2号、国福909、国福302、凌锋F1、京辣2号、锦辣红椒、赤研1号、遵辣7号、辣秀七号、B173、绿光早生、脆螺二号、赛世佳美、蓝园之星、苏椒17号、种椒1号、陇椒5号、大英雄、紫燕1号、黄苏珊、玉指小米辣、黄星一号、国禧109、京辣8号、京甜1号、国福201、甜杂一号、湘辣四号、豫杂二号、富强0055、金妈妈219、强丰7318、绿箭23、辣翠、白贵人、朝天椒、37-94、国禧113、茄门田椒、国福306、皱皮辣①、国福311、盛丰三号、望天红三号、明椒7号、红星2号、京彩红妃、京甜3号、锐致、绝美、新王牌、HNX14470065和京椒3号中的任一种。

所述SNP位点，所述SNP引物组，所述SNP试剂盒，或所述检测方法，在检测待测辣椒杂交种的纯度或制备检测待测辣椒杂交种的纯度的试剂中的应用。

本发明相比现有技术具有以下有益效果：

1、本发明筛选到了一组SNP标记组合，该标记组合能够应用于种子质量控制环节，可高通量、快速准确的鉴定82个辣椒杂交种品种的纯度，使制种和质量控制环节更加高效和稳定并提高品种上市速度。

2、本发明的8个SNP位点及其引物组合被确认适用于82个辣椒杂交种品种的纯度鉴定，且检测效果稳定准确、检测速度快，在种子或苗期即可鉴定且适用于高通量检测设备，操作简单、省时省力，具有广阔的应用前景，同时可为辣椒品种的种子质量管理提供技术支持。

附图说明

图1为实施例2中8个引物组在部分供试辣椒杂交种中的SNP分型效果图。

图2为实施例2中8个引物组在部分供试辣椒杂交种中的杂合位点数分布示意图。

图3为实施例3中引物组2和引物组5在96份国福909杂交种中的SNP分型效果图。

具体实施方式

定义：

辣椒Zunla-1参考基因组：辣椒品种遵辣1号的基因组。比如，可通过如下地址下载的基因组：

ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Capsicum_annuum。

本发明的杂交种：指杂交一代种，生产上使用的杂交种可能有亲本混杂。

杂交种纯度：一个特定杂交种品种，用其双亲间的多态性分子标记(比如，SNP)对该品种的种子或单株进行检测，某分子标记杂合基因型单株占该分子标记杂合基因型单株和纯合基因型单株的总数的百分率。

品种间同源基因组片段：是指一个物种的不同种品种(或种质资源，比如，包括但不限于本发明所述82个标准品种的辣椒)中与参考基因组片段(比如，辣椒ZUNLA-1参考基因组上承载第一SNP的SEQ ID NO：25所示序列)相同染色体的相同区段的非重复的(单拷贝)同源基因组片段(比如，辣椒ZUNLA-1参考基因组以外的辣椒基因组中，与承载本发明第一SNP的SEQ ID NO：25所示序列相同或同源的基因组片段)，以及该基因组片段上游和/或下游延伸或缩短若干碱基的基因组片段。缩短要求不能改变该基因组片段在该物种(比如，辣椒)的不同种质中的序列特异性以及在基因组中位置的识别特性，当该参考基因组片段中含有分子标记(比如，SNP位点等多态性位点标记)时，缩短要求不能跨越该同源基因组片段中的分子标记，也不能缩短到影响表征该分子标记的程度，延伸要求该基因组片段两端不能超过PCR能够有效扩增的长度。非重复指在一个品种中该基因组片段只在一个基因组位置存在，对于多倍体，可以是纯合的，也可以是杂合的，一个品种的基因组其他位置没有与其高度同源的基因组片段，但在不同的品种中普遍存在高度同源的基因组片段，比如，在本发明中，SEQ ID NO：25所示序列示出了辣椒的承载第一SNP位点的品种间同源基因组片段之一。比如，SEQ ID NO：25所示序列第11-31在辣椒ZUNLA-1参考基因组上向上下游分别延伸5-100碱基所形成的基因组片段，或者它在其他辣椒种质基因组上的同源序列视为针对辣椒的品种间同源基因组片段。

品种间同源基因组片段上的相应位点：是指以一个物种中的一个品种(或种质资源，比如，包括但不限于本发明所述82个标准品种的辣椒之一)为参考品种，该参考品种上具有特定的品种间多态性基因组片段，该多态性基因组片段中分子标记(比如，SNP位点，SEQ ID NO：25所示序列第21位)在不同品种之间是高度多态的(比如，SEQ ID NO：25所示序列第21位主要是C或T，还有可能是其他碱基)，而其上下游的一段序列(比如，SEQ ID NO：25所示序列第1-20，22-41位)在不同品种之间是高度保守的(该区域可能会发生小的突变，该突变是随机的，没有扩散到群体当中，其不具有一个品种内的普遍性，而忽略了该突变后考察该SNP，则该SNP具备该品种内的普遍性)，则在该物种的不同品种的品种间同源基因组片段中，该高度保守的基因组片段中的该分子标记的位点(比如，高度多态的碱基)即品种间同源基因组片段上的相应位点。

本发明通过大量的筛选预备工作，提供了一组辣椒SNP引物组合，其被证明可应用于82个辣椒品种纯度鉴定，可为辣椒育种行业提供更好的技术支撑。

第一方面，本发明提供一种用于鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点，所述SNP位点选自如下第一SNP位点到第八SNP位点中的任1到8种：

第一SNP位点(CaSNP01)，位于辣椒参考基因组第4染色体第30522616位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第二SNP位点(CaSNP02)，位于辣椒参考基因组第11染色体第204038344位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为T或C；

第三SNP位点(CaSNP03)，位于辣椒参考基因组第2染色体第75886898位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；

第四SNP位点(CaSNP04)，位于辣椒参考基因组第12染色体第40630040位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或T；

第五SNP位点(CaSNP05)，位于辣椒参考基因组第9染色体第159969位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第六SNP位点(CaSNP06)，所述第六SNP位点位于辣椒参考基因组第8染色体第126315482位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；

第七SNP位点(CaSNP07)，位于辣椒参考基因组第1染色体第293847360位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或A；

第八SNP位点(CaSNP08)，位于辣椒参考基因组第6染色体第388508位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或C；

其中，所述辣椒参考基因组为辣椒Zunla-1参考基因组。

第二方面，本发明提供一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP引物组，包括：第一SNP引物组，用于扩增所述第一SNP位点；第二SNP引物组，用于扩增所述第二SNP位点；第三SNP引物组，用于扩增所述第三SNP位点；第四SNP引物组，用于扩增所述第四SNP位点；第五SNP引物组，用于扩增所述第五SNP位点；第六SNP引物组，用于扩增所述第六SNP位点；第七SNP引物组，用于扩增所述第七SNP位点；第八SNP引物组，用于扩增所述第八SNP位点。

在一些实施方式中，所述第一SNP引物组，包括所述第一SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第一SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第一SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二SNP引物组，包括所述第二SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第二SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第二SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三SNP引物组，包括所述第三SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第三SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第三SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第四SNP引物组，包括所述第四SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第四SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第四SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第五SNP引物组，包括所述第五SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第五SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第五SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第六SNP引物组，包括所述第六SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第六SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第六SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第七SNP引物组，包括所述第七SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第七SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第七SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第八SNP引物组，包括所述第八SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第八SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第八SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％。

在一些实施方式中，上述SNP引物组合选自引物组01-08中的一组或多组；上述引物组01-08的DNA序列信息如序列表SEQ ID：1-24所示，参见表2。

上述引物组中，上游引物的5′端可带有荧光标签序列以便荧光PCR检测，每组所述引物中的第一上游引物和第二上游引物连接有不同的荧光分子，更优选，所述荧光分子选自FAM、HEX，进一步优选地，组所述引物中的第一上游引物连接有FAM，第二上游引物连接有HEX；例如FAM荧光标签序列的荧光信号为蓝色，HEX荧光标签序列的荧光信号为红色。

上述任一引物组中，第一上游引物(名称中含有“F1”的引物)、第二上游引物(名称中含有“F2”的引物)和下游引物(名称中含有“R”的引物)的摩尔比具体可为2:2:5。

第三方面，本发明提供一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP试剂盒，SNP试剂配制为竞争性等位基因特异性PCR反应体系，该体系优选包括：

上述SNP引物组中，每个引物组的第一上游引物、第二上游引物、下游引物在上述体系中浓度之比为2:2:5；

该反应体系中的试剂、耗材和仪器均由LGC公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南KASP user guide and manual(www.lgcgenomics.com)进行，KASPar反应在384孔板(Part No.KBS-0750-001)或96孔板(Part No.KBS-0751-001)中进行，反应体系为3μl或10μl，如下表所示。

表：384孔板或96孔板的KASP反应体系

上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围，该方法包括将上述任一引物组中各条引物分别单独包装。

第四方面，本发明提供鉴定西瓜种质资源的真实性检测方法，该方法包括以下步骤：

S1、DNA提取：提取得到一个待测辣椒品种的N株待测辣椒杂交种的基因组DNA；N为大于95的自然数；N的数值越大，鉴定待测辣椒杂交种纯度的准确性越高；如果N的数值过小则纯度检测不准确。

S2、目的引物组筛选：

S2-1：以上述N株待测辣椒杂交种中大于等于8株，比如，8-12株(如8-10株、10-12株、8株、10株或12株，该数目的样品便于在PCR板中进行布置)的基因组DNA为模板，分别用上述8个引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应(KASP)，得到PCR反应产物；

S2-2：再对上述PCR反应产物进行检测，得到基于上述SNP位点的基因型为杂合型的株数，得到杂合型的株数最多的引物组即为目的引物组；

S3、目的引物组PCR扩增：以上述N株待测辣椒杂交种的基因组DNA为模板，分别用上述目的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应(KASP)，得到目的引物组的PCR反应产物；

S4、纯度检测：对上述目的引物组的PCR反应产物进行检测，根据检测结果计算获得待测辣椒杂交种的纯度；

其中，上述目的引物组筛选步骤S2和纯度检测步骤S4中，检测方法为荧光信号检测或直接测序。(1)采用荧光信号检测时，统计上述引物组(含有荧光标签序列)所显示绿色(即指示杂合子颜色)荧光信号的株数；显示绿色荧光株数最多的引物组即为目的引物组；(2)采用直接测序时，统计上述SNP位点的基因型为杂合型的株数；杂合型株数最多的的引物组即为目的引物组。

其中，在上述引物组筛选步骤S2和纯度检测步骤S4中，KASP的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

其中，在上述纯度检测步骤S4中，上述待测辣椒杂交种的纯度的计算方法为：

(1)采用荧光信号检测时：

采用荧光信号检测时，统计各个所述目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光(绿色)的株数和无荧光的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测辣椒杂交种的纯度；

无荧光的株数＝N-显示指示杂合子的颜色荧光的株数-显示指示第一种纯合子的颜色荧光的株数-显示指示第二种纯合子的颜色荧光的株数；

纯度＝[目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数/(N-目的引物组无荧光的株数)]×100％；

上述指示杂合子的颜色荧光为绿色，指示第一种纯合子的颜色荧光为红色，指示第二种纯合子颜色荧光为蓝色。

(2)采用直接测序时：

统计各个目的引物组基于上述SNP位点的基因型为杂合型的株数和没有获得PCR扩增产物的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为上述待测辣椒杂交种的纯度；

纯度＝[目的引物组基于SNP位点的基因型为杂合型的株数/(N-目的引物组没有获得PCR扩增产物的株数)]×100％。

上述待测辣椒杂交种为：先红五号、红鸟1号、脆螺一号、衢椒1号、亨椒一号、苏椒5号、种椒八号、苏椒15号、种都椒Ⅲ、岫椒6号、先红一号、中椒107号、索菲娅、陆尊、国福403、紫星2号、美国特大牛角椒、秀美、甜杂新1号、盛丰七号、湘辣18号、SV0108HA、苏椒5号博士王、红丰特选厚肉牛角椒(404)、扬椒2号、星秀、东黄1号、春晓、凯莱、白星2号、国福909、国福302、凌锋F1、京辣2号、锦辣红椒、赤研1号、遵辣7号、辣秀七号、B173、绿光早生、脆螺二号、赛世佳美、蓝园之星、苏椒17号、种椒1号、陇椒5号、大英雄、紫燕1号、黄苏珊、玉指小米辣、黄星一号、国禧109、京辣8号、京甜1号、国福201、甜杂一号、湘辣四号、豫杂二号、富强0055、金妈妈219、强丰7318、绿箭23、辣翠、白贵人、朝天椒、37-94、国禧113、茄门田椒、国福306、皱皮辣①、国福311、盛丰三号、望天红三号、明椒7号、红星2号、京彩红妃、京甜3号、锐致、绝美、新王牌、HNX14470065和京椒3号中的任一种。

第五方面，本发明提供上述SNP位点、SNP引物组、SNP试剂盒、基于该SNP位点和引物组的试剂盒和检测方法的应用：检测待测辣椒杂交种的纯度，或制备检测待测辣椒杂交种的纯度的试剂。

需要说明的是，本发明仅适用于只有亲本混杂的杂交一代种的纯度鉴定，而不适用于由于机械混杂导致的若干品种混杂的鉴定。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

用于鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点及其引物组合的获得

一、8个SNP位点的确定

基于发明人实验室30份辣椒重测序数据以及辣椒参考基因组数据，根据筛选条件：MAF>0.1、缺失率<0.1、杂合度<0.1、染色体均匀分布以及与全基因SNP遗传距离的皮尔森相关系数大于0.9、PCA聚类效果好、区分度高且两翼50bp序列保守(无InDel，无SSR，无其它SNP)，选择出高质量SNP共计32个。用此32对SNP-KASP引物获得82份辣椒杂交种品种基因型，然后筛选SNP分型效果好、且在82份杂交种中至少包含1个杂合位点的最优组合，最终确定本发明适合辣椒杂交种纯度鉴定的8个SNP位点。上述8个SNP位点的基本信息详见表1。其中SNP位点在染色体上的位置是基于辣椒Zunla-1参考基因组序列比对确定的，该辣椒Zunla-1参考基因组下载地址为：ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Capsicum_annuum。

表1：8个SNP位点的基本信息

二、用于鉴定辣椒杂交种纯度的SNP引物组合的获得

根据步骤一发现的8个SNP位点，本发明的发明人开发了具有较高多态性的用于鉴定辣椒杂交种纯度的SNP引物组合。

SNP引物组合由8个引物组组成，每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，包括第一上游引物、第二上游引物、下游引物，用于扩增一个SNP位点。8个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示，单下划线为FAM荧光标签序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，双下划线为HEX荧光标签序列

无下划线为特异性部分的序列。

表2：8个SNP位点的SNP引物核酸序列信息表

实施例2

本实施例为实施例1开发的SNP引物组合的有效性检验。82个供试辣椒杂交种均为常见的优良杂交种或国外引进杂交种。具体情况如下表3：

表3：82个供试辣椒杂交种的基本信息

1、供试辣椒杂交种的基因组DNA的获得：

用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法分别提取82个供试辣椒杂交种的叶片(每个杂交种取30粒种子长出真叶后，摘取等量叶片混合)的基因组DNA，得到供试辣椒杂交种的基因组DNA。

CTAB法的操作具体为：混合叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热至65℃的800μl CTAB的缓冲液中进行提取，65℃水浴抽提30min；加入等体积氯仿异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，混匀后在8000r/min的转速下10min；将上清液转入新的离心管，加上清液2/3体积的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀；在10000r/min的转速下离心10min；倒去上清液，用体积分数为75％的乙醇冲洗沉淀，倒掉后吸干剩余液体，室温放置3min后，用100μl ddH₂O(含0.1％RNA酶)溶解沉淀，并将得到的辣椒基因组DNA在4℃保存备用。

以上保存的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；DNA的浓度范围在10-30ng/μL。

2、PCR扩增产物获得：以82个供试辣椒杂交种的基因组DNA为模板，分别采用8个引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增。各个PCR反应体系中，第一上游引物(名称中含有“F1”)、第二上游引物(名称中含有“F2”)、下游引物(名称中含有“R”)的浓度比为2:2:5。

该反应体系中的试剂、耗材和仪器均由LGC公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南KASP user guide and manual(www.lgcgenomics.com)进行，KASPar反应在384孔板(Part No.KBS-0750-001)或96孔板(Part No.KBS-0751-001)中进行，反应体系为3μl或10μl，如下表4所示。

表4：384孔板或96孔板的KASP反应体系

*由LGC公司提供或其它具有AS-PCR检测能力的试剂盒

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。形成的扩增产物电泳前于4℃保存。

3、荧光信号检测：完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断82个供试辣椒杂交种的基于每个SNP位点的基因型。

具体的基因型判断原则如下：

如果某供试辣椒杂交种的基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试辣椒杂交种的基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点的第一上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；

如果某供试辣椒杂交种的基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试辣椒杂交种的基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点的第二上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；

如果某供试辣椒杂交种的基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试辣椒杂交种的基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点的第一上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点的第二上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。

需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min)，直至结果满意为止。

如图1所示，每个SNP位点在82个供试辣椒杂交种的PCR扩增产物的荧光信号清晰地呈现为3种形式：1)聚合在接近X轴的样本显示为蓝色，基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型；2)聚合在接近Y轴的样本显示为红色，基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型；3)X轴和Y轴的样本显示为绿色，基因型为两种等位基因的杂合型。还有很少样本无荧光信号或无法判定，显示为粉色，可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。由此可见，各个引物组在供试辣椒杂交种中可以得到很好的分型效果。

4、杂合位点数分布和效率评价

(1)根据82个供试辣椒杂交种基于8个SNP位点的基因型，统计每个供试辣椒杂交种的杂合位点数。

建立在8个引物组上的82个供试辣椒杂交种的杂合位点数分布结果见图2。结果表明，8个引物组能使每个供试辣椒杂交种都有至少一个杂合位点。

(2)杂交种纯度鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。

结果表明，8个引物组在82个供试辣椒杂交种中的杂合位点覆盖率达到100％。

由此可见，实施例1开发的SNP引物组合可以应用于辣椒杂交种纯度鉴定。

实施例3

本实施例采用实施例1开发的SNP引物组合检测待测辣椒杂交种：国福909杂交种的纯度。本实施例的检测方法包括：

1、国福909杂交种的基因组DNA的获得

(1)以常规方式种植200粒市售国福909杂交种种子，得到国福909杂交种幼苗。

(2)随机取96株国福909杂交种幼苗的叶片或根样品，按照实施例2中的步骤1的方法，将“供试辣椒杂交种”替换为“国福909”，其他步骤不变，采用CTAB法分别提取基因组DNA，依次得到96份国福909杂交种的基因组DNA。

2、目的引物组的筛选

(1)在96份国福909杂交种的基因组DNA中随机选取8份基因组DNA，分别以此8份国福909杂交种的基因组DNA为模板，按照实施例2中的步骤2的方法，将“82个供试辣椒杂交种的基因组DNA”替换为“8份国福909杂交种的基因组DNA”，其它步骤均不变，进行竞争性等位基因特异性PCR反应，得到8份国福909杂交种的PCR产物。

PCR反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。该PCR反应体系参见实施例2的表4。

(2)完成步骤(1)后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色。比较8个引物组显示绿色荧光信号的株数，显示绿色荧光株数最多的引物组即为筛选出的引物组。

结果表明，引物组2和引物组5显示绿色荧光信号的株数最多、均为8株。因此，引物组2和引物组5即为筛选出的目的引物组，进行后续实验。

3、获得国福909杂交种的纯度

(1)以96份国福909杂交种的基因组DNA为模板，分别采用引物组2和引物组5进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的第一上游引物、名称中含有“F2”的第二上游引物引物和名称中含有“R”的下游引物的浓度比为2：2：5。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。该PCR反应体系参见实施例2的表4。

(2)完成步骤(1)后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色。

SNP分型结果见图3，其中左图为引物组2，右图为引物组5。

(3)完成步骤(2)后，分别统计引物组2和引物组5显示绿色荧光的株数和无荧光的株数(无荧光的株数＝96-显示绿色荧光的株数-显示红色荧光的株数-显示蓝色荧光的株数)；按照下述公式计算国福909杂交种的纯度；进一步计算平均值，得到平均纯度。

纯度＝[引物组显示绿色荧光的株数/(96-引物组无荧光的株数)]×100％。

结果表明，引物组2显示绿色荧光的株数为90株，无荧光的株数为1株，纯度为90/(96-1)＝94.74％；引物组5显示绿色荧光的株数为85株，无荧光的株数为4株，纯度为85/(96-4)＝92.40％；国福909杂交种的平均纯度为(94.74％+92.40％)/2＝93.57％。

在同一批次种子中，另外选取200粒国福909杂交种进行催芽和育苗，随机选取100个单株移栽至大田，在花期至结果期进行表型调查，在100单株中发现7株异型株。通过计算得出其纯度为93％，证明田间调查结果和本实施例的分子鉴定结果基本一致。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点、引物组及应用

<130> C1CNCN180990

<141> 2020-10-11

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atctccactc cctccaatca gc 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

taatctccac tccctccaat cagt 24

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcagtgattg gtcgctacta ctagtt 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggaaattagt aattttttag tagtgaccca 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gaaattagta attttttagt agtgacccg 29

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

actgacactc caggagcaat ctcaa 25

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cccaacaata acatgaaaat gaattcgatt t 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ccaacaataa catgaaaatg aattcgattc 30

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aagattgttg aattatgaac ttccatagtt aaatt 35

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cattccgatg aaaattctga atcctct 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

cattccgatg aaaattctga atcctca 27

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aaggtgcttc cccaattatt gttgctta 28

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ttggacataa tagctgaatt gcctaag 27

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cttggacata atagctgaat tgcctaaa 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

cataagcagc ataatccatc agcttcaa 28

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

cgatgttgta cctgttccat tgtga 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gatgttgtac ctgttccatt gtgg 24

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

ccgcgattag ccagtattgt atcaaaaa 28

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

attttgatca ctttccctca cctaaac 27

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

cattttgatc actttccctc acctaaat 28

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggggctgaag ttctatgtta tggacat 27

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

atatttggcc taaatcacgc ttgga 25

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

atttggccta aatcacgctt ggc 23

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gctatagcct acatttttgg ggatgg 26

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<400> 25

tctccactcc ctccaatcag taagcatcaa ctagtagtag c 41

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<400> 26

acaaagttga aaagggatat cgggtcacta ctaaaaaatt a 41

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<400> 27

tgaacttcca tagttaaatt gaatcgaatt cattttcatg t 41

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<400> 28

ccccaattat tgttgcttac tgaggattca gaattttcat c 41

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<400> 29

atcagcttca acacctcaag tttaggcaat tcagctatta t 41

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<400> 30

gttgtacctg ttccattgtg gtttttgata caatactggc t 41

<210> 31

<211> 41

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<400> 31

agttctatgt tatggacata atttaggtga gggaaagtga t 41

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<400> 32

ttggcctaaa tcacgcttgg ccccccagcc catccccaaa a 41

Claims

1.一种用于鉴定辣椒杂交种纯度的SNP位点，所述SNP位点选自如下第一SNP位点到第八SNP位点中的任1到8种：

第一SNP位点，所述第一SNP位点位于辣椒参考基因组第4染色体第30522616位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第二SNP位点，所述第二SNP位点位于辣椒参考基因组第11染色体第204038344位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为T或C；

第三SNP位点，所述第三SNP位点位于辣椒参考基因组第2染色体第75886898位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；

第四SNP位点，所述四第SNP位点位于辣椒参考基因组第12染色体第40630040位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或T；

第五SNP位点，所述第五SNP位点位于辣椒参考基因组第9染色体第159969位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第六SNP位点，所述第六SNP位点位于辣椒参考基因组第8染色体第126315482位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；

第七SNP位点，所述第七SNP位点位于辣椒参考基因组第1染色体第293847360位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或A；

第八SNP位点，所述第八SNP位点位于辣椒参考基因组第6染色体第388508位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或C；

其中，所述辣椒参考基因组为辣椒Zunla-1参考基因组。

2.如权利要求1所述的SNP位点，其特征在于：

所述第一SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：25所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：25的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：26所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：26的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：27所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：27的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第四SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：28所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：28的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第五SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：29所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：29的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第六SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：30所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：30的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第七SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：31所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：31的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第八SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：32所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：32的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％。

3.一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP引物组，所述SNP引物组用于分别扩增如权利要求1或2所述的SNP位点，所述SNP引物组包括：

第一SNP引物组，用于扩增所述第一SNP位点；第二SNP引物组，用于扩增所述第二SNP位点；第三SNP引物组，用于扩增所述第三SNP位点；第四SNP引物组，用于扩增所述第四SNP位点；第五SNP引物组，用于扩增所述第五SNP位点；第六SNP引物组，用于扩增所述第六SNP位点；第七SNP引物组，用于扩增所述第七SNP位点；第八SNP引物组，用于扩增所述第八SNP位点。

4.根据权利要求3所述SNP引物组，其特征在于：

所述第一SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第四SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第五SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第六SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第七SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第八SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

优选地，每组所述引物中的第一上游引物和第二上游引物连接有不同的荧光分子，更优选，所述荧光分子选自FAM、HEX。

5.一种鉴定辣椒杂交种纯度的SNP试剂盒，其特征在于：所述SNP试剂盒配制为竞争性等位基因特异性PCR反应体系；所述反应体系包括：

权利要求3或4所述SNP引物组，

优选地，所述SNP引物组中，每个引物组的第一上游引物、第二上游引物、下游引物在所述体系中浓度之比为2:2:5。

6.一种鉴定辣椒杂交种纯度的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

DNA提取步骤：提取得到一个待测辣椒品种的N株待测辣椒杂交种的基因组DNA；N为大于12的自然数，优选大于95的自然数；

目的引物组筛选步骤：以所述N株待测辣椒杂交种中大于等于8株的基因组DNA为模板，分别用权利要求3或4所述的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应，得到PCR反应产物；再对所述PCR反应产物进行检测，得到基于权利要求1或2所述的SNP位点的基因型为杂合型的株数，得到杂合型的株数最多的引物组即为目的引物组；

目的引物组PCR扩增步骤：以所述N株待测辣椒杂交种的基因组DNA为模板，分别用所述目的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应，得到目的引物组的PCR反应产物；

纯度检测步骤：对所述目的引物组的PCR反应产物进行检测，根据检测结果计算获得待测辣椒杂交种的纯度；

优选地，所述目的引物组筛选步骤和纯度检测步骤中，所述检测的方法选自：荧光信号检测、直接测序。

7.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于：

所述目的引物组筛选步骤和纯度检测步骤中，

采用荧光信号检测时，统计如权利要求3或4所述的引物组所显示指示杂合子的颜色的荧光信号的株数；显示指示杂合子的颜色的荧光株数最多的引物组即为目的引物组；

采用直接测序时，统计如权利要求1或2所述的SNP位点的基因型为杂合型的株数；杂合型株数最多的引物组即为目的引物组。

8.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于：

在所述纯度检测步骤中，所述待测辣椒杂交种的纯度的计算方法为：

采用荧光信号检测时，统计各个所述目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数和无荧光的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测辣椒杂交种的纯度；

采用直接测序时：

统计各个目的引物组基于所述SNP位点的基因型为杂合型的株数和没有获得PCR扩增产物的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测辣椒杂交种的纯度；

9.根据权利要求6至8任一项所述检测方法，其特征在于：

所述待测辣椒杂交种为先红五号、红鸟1号、脆螺一号、衢椒1号、亨椒一号、苏椒5号、种椒八号、苏椒15号、种都椒Ⅲ、岫椒6号、先红一号、中椒107号、索菲娅、陆尊、国福403、紫星2号、美国特大牛角椒、秀美、甜杂新1号、盛丰七号、湘辣18号、SV0108HA、苏椒5号博士王、红丰特选厚肉牛角椒(404)、扬椒2号、星秀、东黄1号、春晓、凯莱、白星2号、国福909、国福302、凌锋F1、京辣2号、锦辣红椒、赤研1号、遵辣7号、辣秀七号、B173、绿光早生、脆螺二号、赛世佳美、蓝园之星、苏椒17号、种椒1号、陇椒5号、大英雄、紫燕1号、黄苏珊、玉指小米辣、黄星一号、国禧109、京辣8号、京甜1号、国福201、甜杂一号、湘辣四号、豫杂二号、富强0055、金妈妈219、强丰7318、绿箭23、辣翠、白贵人、朝天椒、37-94、国禧113、茄门田椒、国福306、皱皮辣①、国福311、盛丰三号、望天红三号、明椒7号、红星2号、京彩红妃、京甜3号、锐致、绝美、新王牌、HNX14470065和京椒3号中的任一种。

10.权利要求1或2所述SNP位点，权利要求3或4所述SNP引物组，权利要求5所述SNP试剂盒，或权利要求6至9中任一项所述检测方法，在检测待测辣椒杂交种的纯度或制备检测待测辣椒杂交种的纯度的试剂中的应用。