CN112195263B - 一种鉴定西瓜杂交种纯度的snp位点、引物组及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定西瓜杂交种纯度的方法及其使用的SNP引物组合。本发明所提供的SNP引物组合由8个引物组组成；每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点；各个引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所示。该SNP引物组合可在西瓜杂交种的种子或幼苗期进行早期鉴定，保证杂交种的纯度，切实保护生产者和育种家的权益，并为西瓜品种的种子质量管理提供技术支持。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点、引物组及应用

技术领域

本发明属于分子标记及其检测领域，具体涉及一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点、引物组、试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)原产非洲地区，属于葫芦科西瓜属一年生蔓生草本植物，其果实味甜多汁、富含多种营养成分，在热带、亚热带地区广泛栽培。我国是西瓜的生产大国和消费大国，自20世纪80年代西瓜杂交一代品种在我国普及推广以来，西瓜栽培面积迅速扩大，用种量和相应品种也越来越多。目前，全国通过鉴定、认定、登记的西瓜品种达1100多个，而在市场上的销售的西瓜品种数量远超这一数字。但在售西瓜种子质量参差不齐，其中一个较为突出的问题就是种子纯度不达标，这给之后西瓜生产造成了严重损失。传统种子纯度鉴定主要通过种子形态鉴定、田间表型鉴定等，周期长且费工费时，同时受主观和环境因素影响较大，准确性难以保证。

依据农作物种子质量标准(GB16715.3--2010)的规定，西瓜三倍体杂交种二倍体杂交种和西瓜三倍体杂交种的纯度不低于95％。而国际上一流的西瓜种业公司因其严格的质量管理和纯度鉴定体系，其要求上市的种子纯度接近100％。因此，尽快开展纯度鉴定是种子上市前的必然要求，同时纯度鉴定结果也是种子生产质量控制和交易的重要依据。

常用的种子纯度鉴定方法有形态学鉴定和分子鉴定。传统的形态学鉴定易受环境、气候和人为因素的影响，且存在费时费地费力等缺点。利用分子标记技术能够从DNA水平上检测杂交种和亲本之间的差异，克服了空间的限制，极大缩短了检验所需时间。同时值得注意的是，根据《非主要农作物品种登记指南》的要求，品种特性说明和品种DUS测试报告中涉及的有关性状如有明确关联基因，可以直接提交DNA检测结果。因此，基于DNA水平的分子标记检测鉴定种子纯度是快速和可靠的，是西瓜种业检测的发展趋势所在。

目前品种纯度鉴定可用的分子标记有RAPD标记、SRAP标记、SSR标记等，尤其SSR标记在纯度鉴定方面较为常用。如利用SSR引物对京欣1号、京欣2号、京欣3号、京欣无籽1号、京秀、暑宝和航兴天秀1号进行的纯度鉴定(牛茜等，2014)；对上海农科院的5个西瓜品种：申选958、双色冰淇淋、黄晶、圣女红3号进行种子纯度的鉴定(李超汉等，2015)；对天津市静海区主要种植的8424类型西瓜品种蜜多进行的纯度鉴定(焦荻等，2019)等。国内技术专利方面，如申请号为CN201410788486.X，于2016年9月28日公告的专利，其找到了SSR引物QYXG3或QYXG7，利用此引物刻对西瓜杂交品种荃抗绿霸进行纯度鉴定。CN201510136245.1，于2017年10月31日公告的专利，其找到了一对SSR引物可用于西瓜品种红和平杂交种的纯度鉴定。申请号为CN201610616215.5，于2019年12月3日公告的专利，其利用SSR和Indel标记组合，采用双重PCR技术对小型西瓜品种琼丽的纯度进行鉴定，提高了检测准确性。其他还包括其他一系列已公开专利中使用SSR引物对博琳、安德、天福二号、黄凤凰、安然、丰华21杂交种子纯度鉴定和使用RAPD引物对苏蜜6号、苏蜜9号进行纯度鉴定的方法等。这些技术简单易行、快速准确、费用低，具有应用价值。

但目前已报道或公开的技术和相关引物，其可应用的品种仍然较少，最多的只有7个品种。这远远达不到我国当前西瓜市场销售品种的种子纯度鉴定要求。另外受限于SSR检测方式，其检测时极易导致不真实、假阳性、假阴性的结果，因此不能适应自动化、高通量、大规模的检测时对准确性和稳定性的要求。

与SSR等传统分子标记相比，SNP分子标记具有多个方面的优势：首先SNP变异丰富、可供选择的SNP位点多，易于选出高质量SNP，其次变异清晰稳定容易检测，真实性准确性高。同时，SNP标记还具有SSR等标记的检测速度快，且检测过程和结果分析、不受环境、栽培技术和人为观测影响等优点，是进行纯度鉴定的最佳选择。但目前SNP标记在西瓜品种纯度鉴定产业中应用仍然较少，更没有同时适用数十个甚至上百个西瓜品种纯度鉴定的SNP标记组合。鉴于此，目前的科研和实践中均急需开发一套适合鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点、引物组、以及检测方法，应用于鉴定西瓜杂交种的纯度。

参考文献：

焦荻,商纪鹏,高素燕,王钦,郝建全,何伟,焦定量,吕敬刚,陈则明.西瓜品种‘蜜多’种子纯度SSR标记鉴定[J].中国瓜菜,2019,32(07):19-22.

李超汉,刘莉,刘翔,朱丽华,宋荣浩,杨红娟,顾卫红.基于SSR标记的5个西瓜新品种纯度鉴定及特异性分析的研究[J].中国农学通报,2015,31(33):177-185.

牛茜,田雅栏,吴明生.SSR分子标记技术在西瓜品种纯度快速鉴定中的应用研究[J].种子科技,2014,32(07):37-38.

发明内容

本发明提供了一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点、引物组、以及基于该SNP位点和引物组的试剂盒、检测方法及应用。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种用于鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点，选自如下第一SNP位点到第八SNP位点中的任1到8种：第一SNP位点，所述第一SNP位点位于西瓜参考基因组第1染色体第21348158位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；第二SNP位点，所述第二SNP位点位于西瓜参考基因组第11染色体第4706650位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；第三SNP位点，所述第三SNP位点位于西瓜参考基因组第6染色体第26876494位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或C；第四SNP位点，所述四第SNP位点位于西瓜参考基因组第9染色体第22057215位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或T；第五SNP位点，所述第五SNP位点位于西瓜参考基因组第79染色体第22216668位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；第六SNP位点，所述第六SNP位点位于西瓜参考基因组第5染色体第13792245位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或C；第七SNP位点，所述第七SNP位点位于西瓜参考基因组第3染色体第22502999位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；第八SNP位点，所述第八SNP位点位于西瓜参考基因组第10染色体第14688845位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；其中，所述西瓜参考基因组为西瓜97130参考基因组。

在一些实施方式中，所述第一SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQIDNO：25所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ IDNO：25的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：26所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：26的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：27所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：27的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第四SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：28所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQID NO：28的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第五SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：29所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：29的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第六SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：30所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：30的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第七SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：31所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：31的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第八SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQID NO：32所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ IDNO：32的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％。

一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP引物组，所述SNP引物组用于分别扩增所述的SNP位点，所述SNP引物组包括：第一SNP引物组，用于扩增所述第一SNP位点；第二SNP引物组，用于扩增所述第二SNP位点；第三SNP引物组，用于扩增所述第三SNP位点；第四SNP引物组，用于扩增所述第四SNP位点；第五SNP引物组，用于扩增所述第五SNP位点；第六SNP引物组，用于扩增所述第六SNP位点；第七SNP引物组，用于扩增所述第七SNP位点；第八SNP引物组，用于扩增所述第八SNP位点。

在一些实施方式中，所述第一SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第四SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第五SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第六SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第七SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：19、SEQID NO：20、SEQ ID NO：21的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第八SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；优选地，每组所述引物中的第一上游引物和第二上游引物连接有不同的荧光分子，更优选，所述荧光分子选自FAM、HEX。

一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP试剂盒，所述SNP试剂盒配制为竞争性等位基因特异性PCR反应体系；所述反应体系包括：所述SNP引物组，优选地，所述SNP引物组中，每个引物组的第一上游引物、第二上游引物、下游引物在所述体系中浓度之比为2:2:5。

一种鉴定西瓜杂交种纯度的检测方法，包括以下步骤：DNA提取步骤：提取得到一个待测西瓜品种的N株待测西瓜杂交种的基因组DNA；N为大于12的自然数，优选大于95的自然数；目的引物组筛选步骤：以所述N株待测西瓜杂交种中大于等于8株的基因组DNA为模板，分别用所述的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应，得到PCR反应产物；再对所述PCR反应产物进行检测，得到基于SNP位点的基因型为杂合型的株数，得到杂合型的株数最多的引物组即为目的引物组；目的引物组PCR扩增步骤：以所述N株待测西瓜杂交种的基因组DNA为模板，分别用所述目的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应，得到目的引物组的PCR反应产物；纯度检测步骤：对所述目的引物组的PCR反应产物进行检测，根据检测结果计算获得待测西瓜杂交种的纯度；优选地，所述目的引物组筛选步骤和纯度检测步骤中，所述检测的方法选自：荧光信号检测、直接测序。

在一些实施方式中，所述目的引物组筛选步骤和纯度检测步骤中，采用荧光信号检测时，统计所述的引物组所显示指示杂合子的颜色的荧光信号的株数；显示指示杂合子的颜色的荧光株数最多的引物组即为目的引物组；采用直接测序时，统计所述的SNP位点的基因型为杂合型的株数；杂合型株数最多的引物组即为目的引物组。

在一些实施方式中，在所述纯度检测步骤中，所述待测西瓜杂交种的纯度的计算方法为：采用荧光信号检测时，统计各个所述目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数和无荧光的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测西瓜杂交种的纯度；无荧光的株数＝N-显示指示杂合子的颜色荧光的株数-显示指示第一种纯合子的颜色荧光的株数-显示指示第二种纯合子的颜色荧光的株数；纯度＝[目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数/(N-目的引物组无荧光的株数)]×100％；采用直接测序时：统计各个目的引物组基于所述SNP位点的基因型为杂合型的株数和没有获得PCR扩增产物的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测西瓜杂交种的纯度；纯度＝[目的引物组基于SNP位点的基因型为杂合型的株数/(N-目的引物组没有获得PCR扩增产物的株数)]×100％。

在一些实施方式中，所述待测西瓜杂交种为：莎蜜佳一号、冰糖麒麟、江艺1584、红优二号、美欣101、改良勿杈瓜王、羞月4号、禾山含金、京颖、女神2000、京秀、拇指西瓜、华欣2号、黑玫瑰西瓜、申蜜968、黑蜜无籽2号、中兴红1号、京抗2号、婉悦一号、京美、羞月6号、冬喜三号、众天6211、宝威200、早春翠玉、瑞美、龙盛8号、瑞蜜十一号、红小玉、瑞蜜十九号、美惠、瑞蜜七号、金玉玲珑无籽1号、红城五号、艺甜2号、瑞蜜三号、甜王三号、甜妮、甜丰1号、甜妮2号、创研龙旋风、京欣无籽1号、西农八号、京欣1号、创研早红蜜、京欣2号、创研金砂王、金帅2号、W14039、吉福2号、美都、红小玉、绿之秀、黄小玉、雪峰新二号、喜春、京美6K、好运来、京嘉2号、中选11号、京美、中选12号、龙盛佳甜、航兴三号、昂达甜王、景欣2号、甬蜜3号、景龙宝、甬蜜2号、黑美人、龙盛佳美、永丰1号、甜蜜蜜、春蕾、京欣无籽1号、京欣3号、京欣1号、京欣4号、京欣2号、庆发十二号、金帅2号、红小帅、金宝、甜宝小无籽、庆发特早红、国蜜二号、吉福2号、天泉、航兴1号、黑宝、红小玉、黄晶一号、黄小玉、世农真美、喜春、香秀、京秀、农科大3号、好运来、美秀、中选11号、京欣8号、中选12号、宝凤、航兴三号、羞月、景欣2号、红小帅2号、景龙宝、北农天骄、小兰、欣祥1号、黑美人、暑宝6号、嘉华、农科大9号、永丰1号、春秀、春蕾、航兴天秀1号、京欣3号、北农福田、京欣4号、富莱特、庆发十二号、北农世嘉、黑龄童、暑宝8号、红小帅、金兰无籽、金玉玲珑、安琪儿、天海宏丰、黑晶、甜宝小无籽、中联58、天泉、中联黑将军、黑宝、泰科翠宝2号、黄晶一号、京阑、世农真美、华欣2号、香秀、红小帅6号、农科大3号、北农锦绣、雪峰小玉7号、北农天骄2号、美秀、珍奇、圣女红2号、金宝、国凤、农科大11号、京欣8号、北农天骄4号、宝凤、华欣-8、羞月、泰科翠宝3号、红小帅2号、黑宝6号、福运来、京抗2号、帅童、暑宝(无籽)、瑞鑫、冬喜2号、北农天骄、圣女红3号、冬喜3号、冰淇淋、欣祥1号、申选958、暑宝6号、早春红玉、农科大9号、小兰、春秀、豫艺锦霞8号、航兴天秀1号、彩虹瓜之宝、航兴天秀2号、金玉玲珑无籽1号、瑞福、众天红、华欣、金玉玲珑、瑞宏、玲珑瓜之宝、北农福田、精品黑小宝、中京1号、豫艺瓜之宝九号、富莱特、雷克、超越梦想、京颖、佳美、瑞蜜九号、北农世嘉、瑞蜜一号、暑宝8号、夏橙、金兰无籽、美惠、安琪儿、佳丽二号、黑晶、大农、中联58、胜欣、中联黑将军、嘉华、农科大10号、盈克、泰科翠宝2号、早佳8424、欣锐、冠龙、超越、甜美2号、朝霞、超越、京阑、黄小宝、京颖、花蜜(无籽)、华欣2号、瑞宏、红小帅6号、北农豪杰、北农锦绣、京珑、北农天骄2号、墨玉二号、大农、豫西瓜八号、雷克、火洲三号、珍奇、黑珍珠、传祺1号、浙蜜3号、众天红、春雷、金玉玲珑无籽1号、RN-35A、金宝、蜜童、申选958、金星、北农天骄4号、春秀、华欣-8、金城王子、冬喜2号、圣女红二号、盈克、早春红玉、泰科翠宝3号、羞月、黑宝6号、橙兰、凯卓立、金玉玲珑、圣女红3号、羞月二号、黄晶、华耐0901、佳美1号、农科大6号、传祺2号、金花1号、美惠、西农八号、胜欣、绿宝518、勇凤1号、美丰、京欣5号、京欣1号、北农吉嘉、西农八号、莎蜜佳一号、丰乐秀华、黑麒麟、丰乐玉玲珑、黄小玉、丰乐五号、传祺2号、丰乐黑优美、佳美1号、丰乐黑宝公、中宝西瓜F1、丰乐无籽三号、黄玉、时代、金福小西瓜、新星、小黄人、苏蜜6号、红香秀、申抗988、新晓兰、早佳、新小玉、众天红、拖车头美玉、陇抗9号、金小凤、嘉抗蜜宝、金凤宝、旺嘉独秀、绿小帅、京欣一号、京域贡兰、早春红玉、翠金、丰甜花冠、关东美人、西农八号、新福运、秀妃、北农佳丽、新金兰、益丰小黄玉、金玉玲珑、特甜小西瓜(红瓤)、京欣1号、懒汉瓜王、旺嘉福春、非洲黑霸王、嘉新、林丰长龙、京欣一号、懒汉大霸王、双星37、臻美甜王、寿菜XG1号、南洋甜王、瑞宏、甜王2号、莎蜜佳一号、甜美1号、京欣二号、甜王50、世纪、君川锦旺、8424、SN速丽、秀色、甜美3号、硬京欣、北农吉嘉、众天5318、勇凤1号、京嘉、京欣5号、早佳、益丰火洲一号、京凤6号、世纪墨宝、黄小玉、金妈妈九号、金豹、京欣二号、华兴小西瓜、墨美、锦蜜、玉麒麟、金铃、国秀、金富贵、苏蜜8号、金玲02、小兰、美丽瓜之宝、早秀二号、脆蜜甜、秀雅、新选西农八号、格美、美国抗病黑巨冠、郑抗三号、甜王1号、羞月5号、美洲大宝、特小凤、SN蜜莎、黄凤凰、全美8K、博丽一号、吉丰之星、极品京欣、花蜜(无籽)、开抗早花红、新黑冠、新机遇、黄娇、金兰无籽、玉美人、郑抗无籽四号、新景蜜宝6号、绿凤凰、精选新世纪、绿圆095、浪潮甜王06、华雷一号、丰抗八八、花皮无籽西瓜中的任一种。

所述SNP位点，所述SNP引物组，所述SNP试剂盒，所述检测方法在检测待测西瓜杂交种的纯度或制备检测待测西瓜杂交种的纯度的试剂中的应用。

本发明相比现有技术具有以下有益效果：

1、本发明筛选到了一组SNP标记组合，该标记组合能够应用于种子质量控制环节，可高通量、快速准确的鉴定412份西瓜品种纯度，使制种和质量控制环节更加高效和稳定并提高品种上市速度。本发明筛选到的适用于412个西瓜品种纯度鉴定的SNP引物组合，弥补了国内这方面的技术空缺。

2、本发明的8个SNP位点及其引物组合被确认适用于412份西瓜杂交种品种的纯度鉴定，且检测效果稳定准确、检测速度快，在种子或苗期即可鉴定且适用于高通量检测设备，操作简单、省时省力，具有广阔的应用前景，同时可为西瓜品种的种子质量管理提供技术支持。

附图说明

图1为实施例2中8个引物组在部分供试西瓜杂交种中的SNP分型效果图。

图2为实施例2中8个引物组在部分供试西瓜杂交种中的杂合位点数分布示意图。

图3为实施例3中引物组1和引物组7在96份京欣一号杂交种中的SNP分型效果图。

具体实施方式

定义：

西瓜97103参考基因组：西瓜品种97103的基因组。可通过如下地址下载的基因组：ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/watermelon/97103/v2/。

本发明的杂交种：指杂交一代种，生产上使用的杂交种可能有亲本混杂。

杂交种纯度：一个特定杂交种品种，用其双亲间的多态性分子标记(比如，SNP)对该品种的种子或单株进行检测，某分子标记杂合基因型单株占该分子标记杂合基因型单株和纯合基因型单株的总数的百分率。

品种间同源基因组片段：是指一个物种的不同种品种(或种质资源，比如，包括但不限于本发明所述412个标准品种的西瓜)中与参考基因组片段(比如，西瓜97130参考基因组上承载第一SNP的SEQ ID NO：25所示序列)相同染色体的相同区段的非重复的(单拷贝)同源基因组片段(比如，西瓜97130参考基因组以外的西瓜基因组中，与承载本发明第一SNP的SEQ ID NO：25所示序列相同或同源的基因组片段)，以及该基因组片段上游和/或下游延伸或缩短若干碱基的基因组片段。缩短要求不能改变该基因组片段在该物种(比如，西瓜)的不同种质中的序列特异性以及在基因组中位置的识别特性，当该参考基因组片段中含有分子标记(比如，SNP位点等多态性位点标记)时，缩短要求不能跨越该同源基因组片段中的分子标记，也不能缩短到影响表征该分子标记的程度，延伸要求该基因组片段两端不能超过PCR能够有效扩增的长度。非重复指在一个品种中该基因组片段只在一个基因组位置存在，对于多倍体，可以是纯合的，也可以是杂合的，一个品种的基因组其他位置没有与其高度同源的基因组片段，但在不同的品种中普遍存在高度同源的基因组片段，比如，在本发明中，SEQID NO：25所示序列示出了西瓜的承载第一SNP位点的品种间同源基因组片段之一。比如，SEQ ID NO：25所示序列第11-31在西瓜97130参考基因组上向上下游分别延伸5-100碱基所形成的基因组片段，或者它在其他西瓜种质基因组上的同源序列视为针对西瓜的品种间同源基因组片段。

品种间同源基因组片段上的相应位点：是指以一个物种中的一个品种(或种质资源，比如，包括但不限于本发明所述412个标准品种的西瓜之一)为参考品种，该参考品种上具有特定的品种间多态性基因组片段，该多态性基因组片段中分子标记(比如，SNP位点，SEQ ID NO：25所示序列第21位)在不同品种之间是高度多态的(比如，SEQID NO：25所示序列第21位主要是A或G，还有可能是其他碱基)，而其上下游的一段序列(比如，SEQ ID NO：25所示序列第1-20，22-41位)在不同品种之间是高度保守的(该区域可能会发生小的突变，该突变是随机的，没有扩散到群体当中，其不具有一个品种内的普遍性，而忽略了该突变后考察该SNP，则该SNP具备该品种内的普遍性)，则在该物种的不同品种的品种间同源基因组片段中，该高度保守的基因组片段中的该分子标记的位点(比如，高度多态的碱基)即品种间同源基因组片段上的相应位点。

本发明通过大量的筛选预备工作，提供了一组西瓜SNP引物组合，其被证明可应用于412个西瓜品种纯度鉴定，可为西瓜育种行业提供更好的技术支撑。

第一方面，本发明提供一种用于鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点，所述SNP位点选自如下第一SNP位点到第八SNP位点中的任1到8种：

第一SNP位点(XGSNP01)，所述第一SNP位点位于西瓜参考基因组第1染色体第21348158位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；

第二SNP位点(XGSNP02)，所述第二SNP位点位于西瓜参考基因组第11染色体第4706650位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第三SNP位点(XGSNP03)，所述第三SNP位点位于西瓜参考基因组第6染色体第26876494位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或C；

第四SNP位点(XGSNP04)，所述四第SNP位点位于西瓜参考基因组第9染色体第22057215位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或T；

第五SNP位点(XGSNP05)，所述第五SNP位点位于西瓜参考基因组第79染色体第22216668位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第六SNP位点(XGSNP06)，所述第六SNP位点位于西瓜参考基因组第5染色体第13792245位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或C；

第七SNP位点(XGSNP07)，所述第七SNP位点位于西瓜参考基因组第3染色体第22502999位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第八SNP位点(XGSNP08)，所述第八SNP位点位于西瓜参考基因组第10染色体第14688845位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或G；

其中，所述西瓜参考基因组为西瓜97130参考基因组。

在一些实施方式中，所述第一SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQIDNO：25所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ IDNO：25的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：26所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：26的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：27所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：27的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第四SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：28所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQID NO：28的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第五SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：29所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：29的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第六SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：30所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：30的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第七SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQ ID NO：31所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ ID NO：31的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第八SNP位点及其上下游碱基的序列为序列表中的SEQID NO：32所述序列的片段或其品种间同源基因组片段，更优选与序列表中的SEQ IDNO：32的核苷酸序列的同源性大于等于95％、96％、97％、98％或99％。

第二方面，本发明提供一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP引物组，包括：第一SNP引物组，用于扩增所述第一SNP位点；第二SNP引物组，用于扩增所述第二SNP位点；第三SNP引物组，用于扩增所述第三SNP位点；第四SNP引物组，用于扩增所述第四SNP位点；第五SNP引物组，用于扩增所述第五SNP位点；第六SNP引物组，用于扩增所述第六SNP位点；第七SNP引物组，用于扩增所述第七SNP位点；第八SNP引物组，用于扩增所述第八SNP位点。

在一些实施方式中，所述第一SNP引物组，包括所述第一SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第一SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第一SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二SNP引物组，包括所述第二SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第二SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第二SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三SNP引物组，包括所述第三SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第三SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第三SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第四SNP引物组，包括所述第四SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第四SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第四SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第五SNP引物组，包括所述第五SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第五SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第五SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第六SNP引物组，包括所述第六SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第六SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第六SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第七SNP引物组，包括所述第七SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第七SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第七SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第八SNP引物组，包括所述第八SNP引物组的第一上游引物(F1)的特异性部分、所述第八SNP引物组的第二上游引物(F2)的特异性部分、所述第八SNP引物组的下游引物(R)，分别与序列表中的SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24的核苷酸序列的同源性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％。

在一些实施方式中，上述SNP引物组合选自引物组01-08中的一组或多组；上述引物组01-08的DNA序列信息如序列表SEQ ID：1-24所示，参见表2。

上述引物组中，上游引物的5′端可带有荧光标签序列以便荧光PCR检测，每组所述引物中的第一上游引物和第二上游引物连接有不同的荧光分子，更优选，所述荧光分子选自FAM、HEX，进一步优选地，所述引物中的第一上游引物连接有FAM，第二上游引物连接有HEX；例如FAM荧光标签序列的荧光信号为蓝色，HEX荧光标签序列的荧光信号为红色。

上述任一引物组中，第一上游引物(名称中含有“F1”的引物)、第二上游引物(名称中含有“F2”的引物)和下游引物(名称中含有“R”的引物)的摩尔比具体可为2:2:5。

第三方面，本发明提供一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP试剂盒，SNP试剂配制为竞争性等位基因特异性PCR反应体系，该体系优选包括：

上述SNP引物组中，每个引物组的第一上游引物、第二上游引物、下游引物在上述体系中浓度之比为2:2:5；

该反应体系中的试剂、耗材和仪器均由LGC公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南KASP user guide and manual(www.lgcgenomics.com)进行，KASPar反应在384孔板(Part No.KBS-0750-001)或96孔板(Part No.KBS-0751-001)中进行，反应体系为3μl或10μl，如下表所示。

表：384孔板或96孔板的KASP反应体系

上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围，该方法包括将上述任一引物组中各条引物分别单独包装。

第四方面，本发明提供鉴定西瓜品种的真实性检测方法，该方法包括以下步骤：

S1、DNA提取：提取得到一个待测西瓜品种的N株待测西瓜杂交种的基因组DNA；N为大于95的自然数；N的数值越大，鉴定待测西瓜杂交种纯度的准确性越高；如果N的数值过小则纯度检测不准确。

S2、目的引物组筛选：

S2-1：以上述N株待测西瓜杂交种中大于等于8株，比如，8-12株(如8-10株、10-12株、8株、10株或12株，该数目的样品便于在PCR板中进行布置)的基因组DNA为模板，分别用上述8个引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应(KASP)，得到PCR反应产物；

S2-2：再对上述PCR反应产物进行检测，得到基于上述SNP位点的基因型为杂合型的株数，得到杂合型的株数最多的引物组即为目的引物组；

S3、目的引物组PCR扩增：以上述N株待测西瓜杂交种的基因组DNA为模板，分别用上述目的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应(KASP)，得到目的引物组的PCR反应产物；

S4、纯度检测：对上述目的引物组的PCR反应产物进行检测，根据检测结果计算获得待测西瓜杂交种的纯度；

其中，上述目的引物组筛选步骤S2和纯度检测步骤S4中，检测方法为荧光信号检测或直接测序。(1)采用荧光信号检测时，统计上述引物组(含有荧光标签序列)所显示绿色(即指示杂合子颜色)荧光信号的株数；显示绿色荧光株数最多的引物组即为目的引物组；(2)采用直接测序时，统计上述SNP位点的基因型为杂合型的株数；杂合型株数最多的引物组即为目的引物组。

其中，在上述引物组筛选步骤S2和纯度检测步骤S4中，KASP的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

其中，在上述纯度检测步骤S4中，上述待测西瓜杂交种的纯度的计算方法为：

(1)采用荧光信号检测时：

采用荧光信号检测时，统计各个所述目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光(绿色)的株数和无荧光的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测西瓜杂交种的纯度；

无荧光的株数＝N-显示指示杂合子的颜色荧光的株数-显示指示第一种纯合子的颜色荧光的株数-显示指示第二种纯合子的颜色荧光的株数；

纯度＝[目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数/(N-目的引物组无荧光的株数)]×100％；

上述指示杂合子的颜色荧光为绿色，指示第一种纯合子的颜色荧光为红色，指示第二种纯合子颜色荧光为蓝色。

(2)采用直接测序时：

统计各个目的引物组基于上述SNP位点的基因型为杂合型的株数和没有获得PCR扩增产物的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为上述待测西瓜杂交种的纯度；

纯度＝[目的引物组基于SNP位点的基因型为杂合型的株数/(N-目的引物组没有获得PCR扩增产物的株数)]×100％。

上述待测西瓜杂交种为：

莎蜜佳一号、冰糖麒麟、江艺1584、红优二号、美欣101、改良勿杈瓜王、羞月4号、禾山含金、京颖、女神2000、京秀、拇指西瓜、华欣2号、黑玫瑰西瓜、申蜜968、黑蜜无籽2号、中兴红1号、京抗2号、婉悦一号、京美、羞月6号、冬喜三号、众天6211、宝威200、早春翠玉、瑞美、龙盛8号、瑞蜜十一号、红小玉、瑞蜜十九号、美惠、瑞蜜七号、金玉玲珑无籽1号、红城五号、艺甜2号、瑞蜜三号、甜王三号、甜妮、甜丰1号、甜妮2号、创研龙旋风、京欣无籽1号、西农八号、京欣1号、创研早红蜜、京欣2号、创研金砂王、金帅2号、W14039、吉福2号、美都、红小玉、绿之秀、黄小玉、雪峰新二号、喜春、京美6K、好运来、京嘉2号、中选11号、京美、中选12号、龙盛佳甜、航兴三号、昂达甜王、景欣2号、甬蜜3号、景龙宝、甬蜜2号、黑美人、龙盛佳美、永丰1号、甜蜜蜜、春蕾、京欣无籽1号、京欣3号、京欣1号、京欣4号、京欣2号、庆发十二号、金帅2号、红小帅、金宝、甜宝小无籽、庆发特早红、国蜜二号、吉福2号、天泉、航兴1号、黑宝、红小玉、黄晶一号、黄小玉、世农真美、喜春、香秀、京秀、农科大3号、好运来、美秀、中选11号、京欣8号、中选12号、宝凤、航兴三号、羞月、景欣2号、红小帅2号、景龙宝、北农天骄、小兰、欣祥1号、黑美人、暑宝6号、嘉华、农科大9号、永丰1号、春秀、春蕾、航兴天秀1号、京欣3号、北农福田、京欣4号、富莱特、庆发十二号、北农世嘉、黑龄童、暑宝8号、红小帅、金兰无籽、金玉玲珑、安琪儿、天海宏丰、黑晶、甜宝小无籽、中联58、天泉、中联黑将军、黑宝、泰科翠宝2号、黄晶一号、京阑、世农真美、华欣2号、香秀、红小帅6号、农科大3号、北农锦绣、雪峰小玉7号、北农天骄2号、美秀、珍奇、圣女红2号、金宝、国凤、农科大11号、京欣8号、北农天骄4号、宝凤、华欣-8、羞月、泰科翠宝3号、红小帅2号、黑宝6号、福运来、京抗2号、帅童、暑宝(无籽)、瑞鑫、冬喜2号、北农天骄、圣女红3号、冬喜3号、冰淇淋、欣祥1号、申选958、暑宝6号、早春红玉、农科大9号、小兰、春秀、豫艺锦霞8号、航兴天秀1号、彩虹瓜之宝、航兴天秀2号、金玉玲珑无籽1号、瑞福、众天红、华欣、金玉玲珑、瑞宏、玲珑瓜之宝、北农福田、精品黑小宝、中京1号、豫艺瓜之宝九号、富莱特、雷克、超越梦想、京颖、佳美、瑞蜜九号、北农世嘉、瑞蜜一号、暑宝8号、夏橙、金兰无籽、美惠、安琪儿、佳丽二号、黑晶、大农、中联58、胜欣、中联黑将军、嘉华、农科大10号、盈克、泰科翠宝2号、早佳8424、欣锐、冠龙、超越、甜美2号、朝霞、超越、京阑、黄小宝、京颖、花蜜(无籽)、华欣2号、瑞宏、红小帅6号、北农豪杰、北农锦绣、京珑、北农天骄2号、墨玉二号、大农、豫西瓜八号、雷克、火洲三号、珍奇、黑珍珠、传祺1号、浙蜜3号、众天红、春雷、金玉玲珑无籽1号、RN-35A、金宝、蜜童、申选958、金星、北农天骄4号、春秀、华欣-8、金城王子、冬喜2号、圣女红二号、盈克、早春红玉、泰科翠宝3号、羞月、黑宝6号、橙兰、凯卓立、金玉玲珑、圣女红3号、羞月二号、黄晶、华耐0901、佳美1号、农科大6号、传祺2号、金花1号、美惠、西农八号、胜欣、绿宝518、勇凤1号、美丰、京欣5号、京欣1号、北农吉嘉、西农八号、莎蜜佳一号、丰乐秀华、黑麒麟、丰乐玉玲珑、黄小玉、丰乐五号、传祺2号、丰乐黑优美、佳美1号、丰乐黑宝公、中宝西瓜F1、丰乐无籽三号、黄玉、时代、金福小西瓜、新星、小黄人、苏蜜6号、红香秀、申抗988、新晓兰、早佳、新小玉、众天红、拖车头美玉、陇抗9号、金小凤、嘉抗蜜宝、金凤宝、旺嘉独秀、绿小帅、京欣一号、京域贡兰、早春红玉、翠金、丰甜花冠、关东美人、西农八号、新福运、秀妃、北农佳丽、新金兰、益丰小黄玉、金玉玲珑、特甜小西瓜(红瓤)、京欣1号、懒汉瓜王、旺嘉福春、非洲黑霸王、嘉新、林丰长龙、京欣一号、懒汉大霸王、双星37、臻美甜王、寿菜XG1号、南洋甜王、瑞宏、甜王2号、莎蜜佳一号、甜美1号、京欣二号、甜王50、世纪、君川锦旺、8424、SN速丽、秀色、甜美3号、硬京欣、北农吉嘉、众天5318、勇凤1号、京嘉、京欣5号、早佳、益丰火洲一号、京凤6号、世纪墨宝、黄小玉、金妈妈九号、金豹、京欣二号、华兴小西瓜、墨美、锦蜜、玉麒麟、金铃、国秀、金富贵、苏蜜8号、金玲02、小兰、美丽瓜之宝、早秀二号、脆蜜甜、秀雅、新选西农八号、格美、美国抗病黑巨冠、郑抗三号、甜王1号、羞月5号、美洲大宝、特小凤、SN蜜莎、黄凤凰、全美8K、博丽一号、吉丰之星、极品京欣、花蜜(无籽)、开抗早花红、新黑冠、新机遇、黄娇、金兰无籽、玉美人、郑抗无籽四号、新景蜜宝6号、绿凤凰、精选新世纪、绿圆095、浪潮甜王06、华雷一号、丰抗八八、花皮无籽西瓜中的任一种。

第五方面，本发明提供上述SNP位点、SNP引物组、SNP试剂盒、基于该SNP位点和引物组的试剂盒和检测方法的应用：检测待测西瓜杂交种的纯度，或制备检测待测西瓜杂交种的纯度的试剂。

需要说明的是，本发明仅适用于只有亲本混杂的杂交一代种的纯度鉴定，而不适用于由于机械混杂导致的若干品种混杂的鉴定。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

用于鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点及其引物组合的获得

一、8个SNP位点的确定

基于本实验室96份西瓜重测序数据以及西瓜参考基因组数据，根据筛选条件：MAF>0.1、缺失率<0.1、杂合度<0.1、染色体均匀分布以及与全基因SNP遗传距离的皮尔森相关系数大于0.9、PCA聚类效果好、区分度高且两翼50bp序列保守(无InDel，无SSR，无其它SNP)，选择出高质量SNP共计32个。

用此32对SNP-KASP引物获得412份西瓜杂交种品种基因型，然后筛选SNP分型效果好且在412份杂交种中至少包含1个杂合位点的最优组合，最终确定本发明适合西瓜杂交种纯度鉴定的8个SNP位点。上述8个SNP位点的基本信息详见表1。其中SNP位点在染色体上的位置是基于西瓜97130参考基因组序列比对确定的，该西瓜97130参考基因组下载地址为：

ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/watermelon/97103/v2/。

表1：8个SNP位点的基本信息

二、用于鉴定西瓜杂交种纯度的SNP引物组合的获得

根据步骤一发现的8个SNP位点，本发明的发明人开发了具有较高多态性的用于鉴定西瓜杂交种纯度的SNP引物组合。

SNP引物组合由8个引物组组成，每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，包括第一上游引物、第二上游引物、下游引物，用于扩增一个SNP位点。8个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示，单下划线为FAM荧光标签序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，双下划线为HEX荧光标签序列

无下划线为特异性部分的序列。

表2：8个SNP位点的SNP引物核酸序列信息表

实施例2

本实施例为实施例1开发的SNP引物组合的有效性检验。412份供试西瓜杂交种均为常见的优良杂交种或国外引进杂交种。具体情况如下表3：

表3：412份供试西瓜杂交种的基本信息

1、供试西瓜杂交种的基因组DNA的获得：

用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法分别提取412份供试西瓜杂交种的叶片(每个杂交种取30粒种子长出真叶后，摘取等量叶片混合)的基因组DNA，得到供试西瓜杂交种的基因组DNA。

CTAB法的操作具体为：混合叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热至65℃的800μl CTAB的缓冲液中进行提取，65℃水浴抽提30min；加入等体积氯仿异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，混匀后在8000r/min的转速下10min；将上清液转入新的离心管，加上清液2/3体积的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀；在10000r/min的转速下离心10min；倒去上清液，用体积分数为75％的乙醇冲洗沉淀，倒掉后吸干剩余液体，室温放置3min后，用100μl ddH₂O(含0.1％RNA酶)溶解沉淀，并将得到的西瓜基因组DNA在4℃保存备用。

以上保存的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；DNA的浓度范围在10-30ng/μL。

2、PCR扩增产物获得：以412份供试西瓜杂交种的基因组DNA为模板，分别采用8个引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增。各个PCR反应体系中，第一上游引物(名称中含有“F1”)、第二上游引物(名称中含有“F2”)、下游引物(名称中含有“R”)的浓度比为2:2:5。

该反应体系中的试剂、耗材和仪器均由LGC公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南KASP user guide and manual(www.lgcgenomics.com)进行，KASPar反应在384孔板(Part No.KBS-0750-001)或96孔板(Part No.KBS-0751-001)中进行，反应体系为3μl或10μl，如下表4所示。

表4：384孔板或96孔板的KASP反应体系

*由LGC公司提供或其它具有AS-PCR检测能力的试剂盒

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。形成的扩增产物电泳前于4℃保存。

3、荧光信号检测：完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断412份供试西瓜杂交种的基于每个SNP位点的基因型。

具体的基因型判断原则如下：

如果某供试西瓜杂交种的基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试西瓜杂交种的基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点的第一上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；

如果某供试西瓜杂交种的基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试西瓜杂交种的基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点的第二上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；

如果某供试西瓜杂交种的基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试西瓜杂交种的基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点的第一上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点的第二上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。

需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min)，直至结果满意为止。

如图1所示，每个SNP位点在412份供试西瓜杂交种的PCR扩增产物的荧光信号清晰地呈现为3种形式：1)聚合在接近X轴的样本显示为蓝色，基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型；2)聚合在接近Y轴的样本显示为红色，基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型；3)X轴和Y轴的样本显示为绿色，基因型为两种等位基因的杂合型。还有很少样本无荧光信号或无法判定，显示为粉色，可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。由此可见，各个引物组在供试西瓜杂交种中可以得到很好的分型效果。

4、杂合位点数分布和效率评价

(1)根据412份供试西瓜杂交种基于8个SNP位点的基因型，统计每个供试西瓜杂交种的杂合位点数。

建立在8个引物组上的412份供试西瓜杂交种的杂合位点数分布结果见图2。结果表明，8个引物组能使每个供试西瓜杂交种都有至少一个杂合位点。

(2)杂交种纯度鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。

结果表明，8个引物组在412份供试西瓜杂交种中的杂合位点覆盖率达到100％。

由此可见，实施例1开发的SNP引物组合可以应用于西瓜杂交种纯度鉴定。

实施例3

本实施例采用实施例1开发的SNP引物组合检测待测西瓜杂交种：京欣一号杂交种的纯度。本实施例的检测方法包括：

1、京欣一号杂交种的基因组DNA的获得

(1)以常规方式种植200粒市售京欣一号杂交种种子，得到京欣一号杂交种幼苗。

(2)随机取96株京欣一号杂交种幼苗的叶片或根样品，按照实施例2中的步骤1的方法，将“供试西瓜杂交种”替换为“京欣一号”，其他步骤不变，采用CTAB法分别提取基因组DNA，依次得到96份京欣一号杂交种的基因组DNA。

2、目的引物组的筛选

(1)在96份京欣一号杂交种的基因组DNA中随机选取8份基因组DNA，分别以此8份京欣一号杂交种的基因组DNA为模板，按照实施例2中的步骤2的方法，将“412份供试西瓜杂交种的基因组DNA”替换为“8份京欣一号杂交种的基因组DNA”，其它步骤均不变，进行竞争性等位基因特异性PCR反应，得到8份京欣一号杂交种的PCR产物。

PCR反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。该PCR反应体系参见实施例2的表4。

(2)完成步骤(1)后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色。比较8个引物组显示绿色荧光信号的株数，显示绿色荧光株数最多的引物组即为筛选出的引物组。

结果表明，引物组1和引物组7显示绿色荧光信号的株数最多、均为8株。因此，引物组1和引物组7即为筛选出的目的引物组，进行后续实验。

3、获得京欣一号杂交种的纯度

(1)以96份京欣一号杂交种的基因组DNA为模板，分别采用引物组1和引物组7进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的第一上游引物、名称中含有“F2”的第二上游引物引物和名称中含有“R”的下游引物的浓度比为2：2：5。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。该PCR反应体系参见实施例2的表4。

(2)完成步骤(1)后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色。

SNP分型结果见图3，其中左图为引物组1，右图为引物组7。

(3)完成步骤(2)后，分别统计引物组1和引物组6显示绿色荧光的株数和无荧光的株数(无荧光的株数＝96-显示绿色荧光的株数-显示红色荧光的株数-显示蓝色荧光的株数)；按照下述公式计算京欣一号杂交种的纯度；进一步计算平均值，得到平均纯度。

纯度＝引物组显示绿色荧光的株数/(96-引物组无荧光的株数)×100％。

结果表明，引物组1显示绿色荧光的株数为94株，无荧光的株数为1株，纯度为94/(96-1)＝98.95％；引物组7显示绿色荧光的株数为93株，无荧光的株数为2株，纯度为93/94＝98.93％；京欣一号杂交种的平均纯度为(98.95％+98.93％)/2＝98.94％。在同一批次种子中，另外选取200粒京欣一号杂交种进行催芽和育苗，随机选取100个单株移栽至大田，在花期至结果期进行表型调查，在100单株中发现2株异型株。通过计算得出其纯度为98％，证明田间调查结果和本实施例的分子鉴定结果基本一致。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP位点、引物组及应用

<130> C1CNCN181002

<141> 2020-10-12

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aaactagcaa tatgaatgaa aaaaattcaa cct 33

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

actagcaata tgaatgaaaa aaattcaacc c 31

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

caatactgat ctcaatatca ttgataaaat gatta 35

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gggtaaaacg gtattttgac ccaac 25

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggggtaaaac ggtattttga cccaat 26

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aagtcaatcc ttcacaagtt gttcgtaatt a 31

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gtagtatgga gataccaatc tacattc 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gtagtatgga gataccaatc tacattg 27

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

acttggactt gggcacgtac cattt 25

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atacaaggtt atgacaaaaa atgtgtatgg 30

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

catacaaggt tatgacaaaa aatgtgtatg t 31

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ctggattatt cttaattatt ttttgaacca taacaa 36

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tattatcgtt gatttgtaga aggattttcg 30

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gttattatcg ttgatttgta gaaggatttt ca 32

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tagttaagct cgataatgga agtgctattt t 31

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

aacataatag acacattaaa tagcactgct 30

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cataatagac acattaaata gcactgcg 28

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gtgttatctt tctcagctta actcaggat 29

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ggagaaagaa aacatataga ctaactcg 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ggagaaagaa aacatataga ctaactca 28

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggattttctt gacctaacct ccttcttata 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

tagttattag attctagaca ccaattcagt 30

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gttattagat tctagacacc aattcagc 28

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gaacattgtg aatgattata caataactat tcttaa 36

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 25

tatcattgat aaaatgatta gggttgaatt tttttcattc a 41

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 26

aaaacggtat tttgacccaa ttgtaattac gaacaacttg t 41

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 27

ggcacgtacc atttcccttg caatgtagat tggtatctcc a 41

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 28

tatgacaaaa aatgtgtatg ggttgttatg gttcaaaaaa t 41

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 29

gataatggaa gtgctatttt cgaaaatcct tctacaaatc a 41

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 30

ttctcagctt aactcaggat cgcagtgcta tttaatgtgt c 41

<210> 31

<211> 41

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 31

cctaacctcc ttcttatagt tgagttagtc tatatgtttt c 41

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 32

caataactat tcttaaggag gctgaattgg tgtctagaat c 41

Claims (11)

1.一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP引物组，所述SNP引物组由第一SNP引物组，第二SNP引物组，第三SNP引物组，第四SNP引物组，第五SNP引物组，第六SNP引物组，第七SNP引物组和第八SNP引物组组成，

所述第一SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别如序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示；

所述第二SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别如序列表中的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示；

所述第三SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别如序列表中的SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示；

所述第四SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别如序列表中的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示；

所述第五SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别如序列表中的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示；

所述第六SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别如序列表中的SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示；

所述第七SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别如序列表中的SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21所示；

所述第八SNP引物组，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别如序列表中的SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24所示；

每组所述引物中的第一上游引物和第二上游引物连接有不同的荧光分子。

2.如权利要求1所述的SNP引物组，其特征在于：所述荧光分子选自FAM、HEX。

3.一种鉴定西瓜杂交种纯度的SNP试剂盒，其特征在于：所述SNP试剂盒配制为竞争性等位基因特异性PCR反应体系；所述反应体系包括：权利要求1或2所述SNP引物组。

4.如权利要求3所述的SNP试剂盒，其特征在于：所述SNP引物组中，每个引物组的第一上游引物、第二上游引物、下游引物在所述体系中浓度之比为2:2:5。

5.一种鉴定西瓜杂交种纯度的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

DNA提取步骤：提取得到一个待测西瓜品种的N株待测西瓜杂交种的基因组DNA；N为大于12的自然数；

目的引物组筛选步骤：以所述N株待测西瓜杂交种中大于等于8株的基因组DNA为模板，分别用权利要求1或2所述的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应，得到PCR反应产物；再对所述PCR反应产物进行检测，得到如下八个SNP位点的基因型为杂合型的株数，得到杂合型的株数最多的引物组即为目的引物组；

目的引物组PCR扩增步骤：以所述N株待测西瓜杂交种的基因组DNA为模板，分别用所述目的引物组进行竞争性等位基因特异性PCR扩增反应，得到目的引物组的PCR反应产物；

纯度检测步骤：对所述目的引物组的PCR反应产物进行检测，根据检测结果计算获得待测西瓜杂交种的纯度；

所述八个SNP位点为：

第一SNP位点，所述第一SNP位点位于西瓜参考基因组第1染色体第21348158位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或G；

第二SNP位点，所述第二SNP位点位于西瓜参考基因组第11染色体第4706650位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第三SNP位点，所述第三SNP位点位于西瓜参考基因组第6染色体第26876494位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或C；

第四SNP位点，所述第 四SNP位点位于西瓜参考基因组第9染色体第22057215位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或T；

第五SNP位点，所述第五SNP位点位于西瓜参考基因组第79染色体第22216668位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第六SNP位点，所述第六SNP位点位于西瓜参考基因组第5染色体第13792245位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或C；

第七SNP位点，所述第七SNP位点位于西瓜参考基因组第3染色体第22502999位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；

第八SNP位点，所述第八SNP位点位于西瓜参考基因组第10染色体第14688845位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或G；

其中，所述西瓜参考基因组为西瓜97130参考基因组。

6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于：N为大于95的自然数。

7.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于：所述目的引物组筛选步骤和纯度检测步骤中，所述检测的方法选自：荧光信号检测、直接测序。

8.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于：

所述目的引物组筛选步骤和纯度检测步骤中，

采用荧光信号检测时，统计如权利要求1或2所述的引物组所显示指示杂合子的颜色的荧光信号的株数；显示指示杂合子的颜色的荧光株数最多的引物组即为目的引物组；

采用直接测序时，统计所述八个SNP位点的基因型为杂合型的株数；杂合型株数最多的引物组即为目的引物组。

9.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于：

在所述纯度检测步骤中，所述待测西瓜杂交种的纯度的计算方法为：

采用荧光信号检测时，统计各个所述目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数和无荧光的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测西瓜杂交种的纯度；

无荧光的株数=N-显示指示杂合子的颜色荧光的株数-显示指示第一种纯合子的颜色荧光的株数-显示指示第二种纯合子的颜色荧光的株数；

纯度=[目的引物组显示指示杂合子的颜色荧光的株数/（N-目的引物组无荧光的株数）]×100%；

采用直接测序时：

统计各个目的引物组基于所述SNP位点的基因型为杂合型的株数和没有获得PCR扩增产物的株数，分别计算纯度，之后求平均值，该平均值即为所述待测西瓜杂交种的纯度；

纯度=[目的引物组基于SNP位点的基因型为杂合型的株数/（N-目的引物组没有获得PCR扩增产物的株数）]×100%。

10.根据权利要求5至9任一项所述检测方法，其特征在于：

所述待测西瓜杂交种为：莎蜜佳一号、冰糖麒麟、江艺1584、红优二号、美欣101、改良勿杈瓜王、羞月4号、禾山含金、京颖、女神2000、京秀、拇指西瓜、华欣2号、黑玫瑰西瓜、申蜜968、黑蜜无籽2号、中兴红1号、京抗2号、婉悦一号、京美、羞月6号、冬喜三号、众天6211、宝威200、早春翠玉、瑞美、龙盛8号、瑞蜜十一号、红小玉、瑞蜜十九号、美惠、瑞蜜七号、金玉玲珑无籽1号、红城五号、艺甜2号、瑞蜜三号、甜王三号、甜妮、甜丰1号、甜妮2号、创研龙旋风、京欣无籽1号、西农八号、京欣1号、创研早红蜜、京欣2号、创研金砂王、金帅2号、W14039、吉福2号、美都、红小玉、绿之秀、黄小玉、雪峰新二号、喜春、京美6K、好运来、京嘉2号、中选11号、京美、中选12号、龙盛佳甜、航兴三号、昂达甜王、景欣2号、甬蜜3号、景龙宝、甬蜜2号、黑美人、龙盛佳美、永丰1号、甜蜜蜜、春蕾、京欣无籽1号、京欣3号、京欣1号、京欣4号、京欣2号、庆发十二号、金帅2号、红小帅、金宝、甜宝小无籽、庆发特早红、国蜜二号、吉福2号、天泉、航兴1号、黑宝、红小玉、黄晶一号、黄小玉、世农真美、喜春、香秀、京秀、农科大3号、好运来、美秀、中选11号、京欣8号、中选12号、宝凤、航兴三号、羞月、景欣2号、红小帅2号、景龙宝、北农天骄、小兰、欣祥1号、黑美人、暑宝6号、嘉华、农科大9号、永丰1号、春秀、春蕾、航兴天秀1号、京欣3号、北农福田、京欣4号、富莱特、庆发十二号、北农世嘉、黑龄童、暑宝8号、红小帅、金兰无籽、金玉玲珑、安琪儿、天海宏丰、黑晶、甜宝小无籽、中联58、天泉、中联黑将军、黑宝、泰科翠宝2号、黄晶一号、京阑、世农真美、华欣2号、香秀、红小帅6号、农科大3号、北农锦绣、雪峰小玉7号、北农天骄2号、美秀、珍奇、圣女红2号、金宝、国凤、农科大11号、京欣8号、北农天骄4号、宝凤、华欣-8、羞月、泰科翠宝3号、红小帅2号、黑宝6号、福运来、京抗2号、帅童、暑宝、瑞鑫、冬喜2号、北农天骄、圣女红3号、冬喜3号、冰淇淋、欣祥1号、申选958、暑宝6号、早春红玉、农科大9号、小兰、春秀、豫艺锦霞8号、航兴天秀1号、彩虹瓜之宝、航兴天秀2号、金玉玲珑无籽1号、瑞福、众天红、华欣、金玉玲珑、瑞宏、玲珑瓜之宝、北农福田、精品黑小宝、中京1号、豫艺瓜之宝九号、富莱特、雷克、超越梦想、京颖、佳美、瑞蜜九号、北农世嘉、瑞蜜一号、暑宝8号、夏橙、金兰无籽、美惠、安琪儿、佳丽二号、黑晶、大农、中联58、胜欣、中联黑将军、嘉华、农科大10号、盈克、泰科翠宝2号、早佳8424、欣锐、冠龙、超越、甜美2号、朝霞、超越、京阑、黄小宝、京颖、花蜜、华欣2号、瑞宏、红小帅6号、北农豪杰、北农锦绣、京珑、北农天骄2号、墨玉二号、大农、豫西瓜八号、雷克、火洲三号、珍奇、黑珍珠、传祺1号、浙蜜3号、众天红、春雷、金玉玲珑无籽1号、RN-35A、金宝、蜜童、申选958、金星、北农天骄4号、春秀、华欣-8、金城王子、冬喜2号、圣女红二号、盈克、早春红玉、泰科翠宝3号、羞月、黑宝6号、橙兰、凯卓立、金玉玲珑、圣女红3号、羞月二号、黄晶、华耐0901、佳美1号、农科大6号、传祺2号、金花1号、美惠、西农八号、胜欣、绿宝518、勇凤1号、美丰、京欣5号、京欣1号、北农吉嘉、西农八号、莎蜜佳一号、丰乐秀华、黑麒麟、丰乐玉玲珑、黄小玉、丰乐五号、传祺2号、丰乐黑优美、佳美1号、丰乐黑宝公、中宝西瓜F1、丰乐无籽三号、黄玉、时代、金福小西瓜、新星、小黄人、苏蜜6号、红香秀、申抗988、新晓兰、早佳、新小玉、众天红、拖车头美玉、陇抗9号、金小凤、嘉抗蜜宝、金凤宝、旺嘉独秀、绿小帅、京欣一号、京域贡兰、早春红玉、翠金、丰甜花冠、关东美人、西农八号、新福运、秀妃、北农佳丽、新金兰、益丰小黄玉、金玉玲珑、特甜小西瓜、京欣1号、懒汉瓜王、旺嘉福春、非洲黑霸王、嘉新、林丰长龙、京欣一号、懒汉大霸王、双星37、臻美甜王、寿菜XG1号、南洋甜王、瑞宏、甜王2号、莎蜜佳一号、甜美1号、京欣二号、甜王50、世纪、君川锦旺、8424、SN速丽、秀色、甜美3号、硬京欣、北农吉嘉、众天5318、勇凤1号、京嘉、京欣5号、早佳、益丰火洲一号、京凤6号、世纪墨宝、黄小玉、金妈妈九号、金豹、京欣二号、华兴小西瓜、墨美、锦蜜、玉麒麟、金铃、国秀、金富贵、苏蜜8号、金玲02、小兰、美丽瓜之宝、早秀二号、脆蜜甜、秀雅、新选西农八号、格美、美国抗病黑巨冠、郑抗三号、甜王1号、羞月5号、美洲大宝、特小凤、SN蜜莎、黄凤凰、全美8K、博丽一号、吉丰之星、极品京欣、花蜜、开抗早花红、新黑冠、新机遇、黄娇、金兰无籽、玉美人、郑抗无籽四号、新景蜜宝6号、绿凤凰、精选新世纪、绿圆095、浪潮甜王06、华雷一号、丰抗八八、花皮无籽西瓜中的任一种。

11.权利要求1或2所述SNP引物组，权利要求3或4所述SNP试剂盒，或权利要求5至10中任一项所述检测方法在检测待测西瓜杂交种的纯度或制备检测待测西瓜杂交种的纯度的试剂中的应用。

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