CN117604151B - 一种与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记及其应用。该SNP分子标记的SNP位点位于黑胫病基因BnRlm1的A07染色体上，用于黑胫病基因BnRlm1突变型的精准鉴定，这个标记分型质量高、单拷贝、高多态性，样本数据检出率>98％，可用于甘蓝型油菜的黑胫病抗性的育种改良的标记辅助育种，具有广泛的应用普适性。还公开了用于上述SNP分子标记的KASP标记引物和试剂盒以及鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的应用，方法简单、自动化程度高、检测通量高、速度快、检测结果准确、重复性和稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记、KASP标记引物、试剂盒及其应用。
背景技术
油菜各生育期均可感染黑胫病，病部形成灰白色枯斑，斑内散生黑色小点。病斑蔓延至茎基部及根系，引起须根腐朽，根颈易折断。成株期叶上病斑圆形或不规则形，稍凹陷，中部灰白色。茎、根上病斑初呈灰白色、长椭圆形，逐渐枯朽，上生黑色小点，植株易折断死亡。角果上的病斑多从角尖开始，与茎上病斑相似；种子感病后变白皱缩，失去光泽。由斑点小球腔菌(L.maculans)引起的症状常见于茎基部，而双球小球腔菌(L.biglobosa)引起的症状常局限于茎基以上茎秆。
选用抗(耐)病品种抗病品种在许多国家已经成功应用于油菜黑胫病的防治，但对于双球小球腔菌(L.biglobosa)的抗性研究甚少。此外，一些研究表明，对斑点小球腔菌(L.maculans)的抗性基因对双球小球腔菌(L.biglobosa)并没有效果。我国很多油菜品种对国外的强毒病原斑点小球腔菌(L.maculans)引起的黑胫病均表现感病，可见黑胫病始终是我国油菜生产上的威胁，培育和选用抗病品种可防患于未然，避免黑胫病对我国油菜造成毁灭性为害。
为揭示油菜控制黑胫病抗病的分子生物学机制，挖掘、开发和利用其重要农业价值和观赏价值，开发基于KASP技术的黑胫病基因BnRlm1的功能连锁SNP标记可以作为一种高效的鉴定标记，支持在油菜育种过程中高通量、低成本、高精确度的鉴定功能基因的情况，从而加速油菜的育种选择，在本技术领域具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记、KASP标记引物、试剂盒及其应用，能够快速、高通量、低成本实现黑胫病基因BnRlm1的基因突变型进行鉴定。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记，以甘蓝型油菜的Darmor-bzh基因组版本为参考，所述SNP分子标记在甘蓝型油菜A07染色体上的第19986961位碱基存在多态性，其多态性为T或C。
上述的应用，优选的，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型；鉴定所述甘蓝型油菜A07染色体上的第19986961位碱基为纯合T时，甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型为感病；鉴定所述甘蓝型油菜A07染色体上的第19986961位碱基为纯合C或T/C时，甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型为抗病。
优选的，所述鉴定甘蓝型油菜黑胫病抗性表型采用的KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
特异性引物X：GAGCGTTTCTCTGCGCACTT(如SEQ ID NO:1所示)；
特异性引物Y：AGCGTTTCTCTGCGCACTC(如SEQ ID NO:2所示)；
通用引物C：ATAGGAGAAAGAGCCTCGGAAGAA(如SEQ ID NO:3所示)。
优选的，所述应用的方法包括以下步骤：
(1)提取甘蓝型油菜待测样品的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，分别利用所述的KASP标记引物进行PCR扩增，然后进行荧光信号扫描、基因型分型；如果样品中只检测到特异性引物X的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X；如果只检测到特异性引物Y的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y；如果同时检测到特异性引物X和Y荧光，则该样品的基因型为杂合；
(3)根据基因型分型结果进行数据分析，得出甘蓝型油菜待测样品的黑胫病基因BnRlm1分型。
优选的，所述方法采用Douglas Array Tape平台进行；PCR扩增体系包括：100μM通用引物C、100μM特异性引物X、100μM特异性引物Y、2×KASP Master Mix、甘蓝型油菜待测样品的DNA、超纯水。
优选的，用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的KASP标记引物，所述KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
特异性引物X：GAGCGTTTCTCTGCGCACTT(如SEQ ID NO:1所示)；
特异性引物Y：AGCGTTTCTCTGCGCACTC(如SEQ ID NO:2所示)；
通用引物C：ATAGGAGAAAGAGCCTCGGAAGAA(如SEQ ID NO:3所示)。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的试剂盒，包含上述的KASP标记引物。
上述的试剂盒，优选的，所述特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
优选的，所述试剂盒中还包含2×KASP Master Mix和超纯水。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种所述KASP标记引物或所述试剂盒在鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明筛选出一个与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记及其KASP标记引物组和试剂盒，用于黑胫病基因BnRlm1突变型的精准鉴定，这个标记分型质量高、单拷贝、高多态性(在现有甘蓝型油菜资源中的PIC值高于>0.3)，样本数据检出率>98％，可用于甘蓝型油菜的花期育种改良的标记辅助育种，具有广泛的应用普适性。
(2)本发明还提供了上述KASP标记引物和试剂盒鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的应用方法，该检测方法简单、自动化程度高达90％；检测通量高、速度快(8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍)；检测反试剂用量少(仅0.8uL/反应)，试剂耗材成本低(与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％)；检测结果准确、重复性和稳定性好，不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；本发明提供了一种快速、高效、低成本、精准检测的普适性方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中的SNP分子标记在油菜多样性材料中的基因型分型示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
本发明开发了一种与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记。这种分子标记是通过甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的基因区间进行基因序列提取和等位型比对得到的优质位点进行开发验证得到，与黑胫病基因BnRlm1紧密连锁，可以根据基因型快速选择育种材料是否含有黑胫病基因BnRlm1。
相比现有技术育种中对甘蓝型油菜的株高表型选择需要到田间种植黑胫病以后进行高度测量才能得到表型数据，本发明开发的SNP标记可以直接进行检测和分型，极大的提高了育种的选择效率；本发明所用的SNP标记检测基于Douglas Array Tape平台的KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)检测技术，检测方法简单、自动化程度高、通量高、速度快，试剂用量少，检测成本低，可以广泛的推广使用与育种选择。具体研发过程如下：
1、甘蓝型油菜核心种质资源数据库的构建
用已经公开的油菜种质资源完根据春油菜、半冬油菜和冬油菜的分类，选择65份油菜核心种质资源重测序数据构建甘蓝型油菜种质资源数据库。
2、已克隆黑胫病基因BnRlm1的信息挖掘
通过大量文献查找，确定黑胫病基因BnRlm1被定位在甘蓝型油菜A07染色体上，基因符号为BnaA07g27460D，甘蓝型油菜的参考基因组版本为Darmor-bzh。
3、甘蓝型油菜SNP位点的提取及序列获取
用得到的65份核心种质资源的数据基于基因BnaA07g27460D的序列进行提取，并对基因序列进行SNP多态性分析，最后得到2个SNP位点(甘蓝型油菜A07染色体上的第19986961位、第19988922位碱基)，将SNP位点进行提取并获取其侧翼序列前后约100bp。
4、标记设计及合成
对以上获取得到的SNP位点，基于甘蓝型油菜的参考基因组Darmor-bzh，利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行KASP引物标记设计。有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。设计完成后，进一步对引物序列进行全基因组拷贝数分析，最终得到一个高质量的单拷贝的KASP标记位点，信息如下表1：
表1：黑胫病基因BnRlm1的KASP标记的位点信息及引物序列
5、标记的检测及验证
为了验证标记分型的质量以及标记与样品表型的基因型的一致性，搜集了2021-2023年近3年市场上推广面积前列的品种，用品种的样品进行验证，包括以下步骤：
(1)提取甘蓝型油菜待测样品的总DNA。
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，分别利用所述的KASP标记引物进行PCR扩增，PCR反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描；然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析；在KASP标记基因型分型检测中，样品的基因型分成3簇，分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇；其中X簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合X等位基因(分型图中标为红色，位于图形左上角)，Y簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合Y等位基因型(分型图中标为蓝色，位于图形右下角)，杂合基因型簇表示样品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型(分型图中标为紫色)；
KASP标记的验证和检测用Douglas Scientific的Array Tape系统进行。ArrayTape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
PCR扩增体系：用NEXAR进行PCR扩增体系的自动组装，PCR扩增体系如下表2所示。
表2：KASP标记基因型分型的PCR扩增体系
PCR扩增：PCR用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃(每个循环退火温度降低0.8℃)60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。
基于Douglas Array Tape平台的KASP标记检测优点：基于Douglas Array Tape平台的KASP标记自动化程度达90％，极大减少了实验室的人力及人为错误。检测通量高，8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍。检测反应体积低少(仅0.8uL/反应)，与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％。
(3)根据KASP标记分型结果和表型结果进行数据分析选择最优的位点用于后续应用。
根据标记检测结果(见图1)，两个KASP标记的分型较好、紧凑，检出率都高于98％，可以对甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的精准检测。
从材料的表型数据以及基因型数据的对应结果(见表3)，BN900150标记当基因型为T时，材料的表型为感病，当基因型为C或T/C时，材料表型为抗或低抗，并且高抗的为C纯合，表型与基因型对应关系高度的一致，能够准确的通过基因型鉴定材料是否含有BnRlm1基因；BN900151标记当基因型为A时，材料的表型为感病，当基因型为T或A/T时，材料表型为抗或抵抗，但相对BN900150来说，区分效果差一些，因此选择BN900150作为后续辅助标记应用。
表3品种的表型数据及基因型数据统计
Claims (7)
1.一种鉴定甘蓝型油菜黑胫病抗性表型的KASP标记引物，其特征在于，所述KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
特异性引物X：GAGCGTTTCTCTGCGCACTT；
特异性引物Y：AGCGTTTCTCTGCGCACTC；
通用引物C：ATAGGAGAAAGAGCCTCGGAAGAA。
2.一种鉴定甘蓝型油菜黑胫病抗性表型的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的KASP标记引物。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为10~12: 10~12: 25~30。
4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含2×KASP MasterMix和超纯水。
5.一种如权利要求1所述的KASP标记引物或权利要求2~4中任一项所述的试剂盒在鉴定甘蓝型油菜黑胫病抗性表型中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：
（1）提取甘蓝型油菜待测样品的总DNA；
（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，分别利用所述的KASP标记引物进行PCR扩增，然后进行荧光信号扫描、基因型分型；如果样品中只检测到特异性引物X的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X；如果只检测到特异性引物Y的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y；如果同时检测到特异性引物X和Y荧光，则该样品的基因型为杂合；
（3）根据基因型分型结果进行数据分析，得出甘蓝型油菜待测样品的黑胫病抗性表型。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述方法采用Douglas Array Tape平台进行；PCR扩增体系包括：100 μM 通用引物C、100 μM 特异性引物X、100 μM 特异性引物Y、2×KASP Master Mix、甘蓝型油菜待测样品的DNA、超纯水。
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