CN117363791A - 一种与甘蓝型油菜芥酸基因Bn.OLEA9紧密连锁的SNP分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种与甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9紧密连锁的SNP分子标记及其应用。该SNP分子标记的SNP位点位于芥酸含量控制基因Bn.OLEA9，用于芥酸含量控制基因Bn.OLEA9突变型的精准鉴定，这个标记分型质量高、单拷贝、高多态性，样本数据检出率>98％，可用于甘蓝型油菜的芥酸的育种改良的标记辅助育种，具有广泛的应用普适性。还公开了用于上述SNP分子标记的KASP标记引物和试剂盒以及鉴定甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的应用，方法简单、自动化程度高、检测通量高、速度快、检测结果准确、重复性和稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9紧密连锁的SNP分子标记、KASP标记引物、试剂盒及其应用。
背景技术
甘蓝型油菜是十字花科芸薹属植物。株型中等或高大，枝叶繁茂，主根膨大，支根、细根发达。叶质似甘蓝，叶蓝绿色。叶片较厚，有蜡粉，叶缘具缺刻。基叶半直立或匍匐，叶柄明显。茎苔叶无叶柄，叶基半抱茎花瓣大，深黄色，角果较大，常与花轴成直角，种子黑色，较大。
常规油菜榨出的菜籽油中主要脂肪酸包括油酸、亚油酸、亚麻酸和芥酸等。其中，油酸易于被人体吸收，且能够防止胆固醇在血管璧上沉积，从而对动脉粥样硬化，和心血管疾病有预防作用。油酸和亚油酸的比例大，食用品质就好。亚麻酸虽然也是必需的脂肪酸之一，但它影响菜油的贮藏，因此不宜太高。而芥酸可能加剧心血管疾病的发生。为此，在食用油菜品种的选育中，本领域加大对“双低”品种的科研力度，使得芥酸含量低于3％，油酸含量达60％。
因此，油菜芥酸含量性状对于育种是非常重要的性状之一，开发基于KASP技术的芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的功能连锁SNP标记可以作为一种高效的鉴定标记，支持在油菜育种过程中高通量、低成本、高精确度的鉴定功能基因的情况，从而加速油菜的育种选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种与甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9紧密连锁的SNP分子标记、KASP标记引物、试剂盒及其应用，能够快速、高通量、低成本实现芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的基因突变型进行鉴定。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种与甘蓝型油菜芥酸基因Bn.OLEA9紧密连锁的SNP分子标记，以甘蓝型油菜的Darmor-bzh基因组版本为参考，所述SNP分子标记在甘蓝型油菜A09染色体上的第28059517位碱基存在多态性，其多态性为A或G。
上述的应用，优选的于，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的芥酸含量表型；鉴定所述甘蓝型油菜A09染色体上的第28059517位碱基为纯合A或A/G时，甘蓝型油菜的芥酸含量表型为高芥酸；鉴定所述甘蓝型油菜A09染色体上的第28059517位碱基为纯合G时，甘蓝型油菜的芥酸含量表型为低芥酸。
优选的，所述鉴定甘蓝型油菜芥酸含量表型采用的KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
特异性引物X：CTGGGTCCAGAGAAGCGTAT(如SEQ ID NO:1所示)；
特异性引物Y：CTGGGTCCAGAGAAGCGTAC(如SEQ ID NO:2所示)；
通用引物C：CCTTTTATGTGGTTTCCATGTCATTG(如SEQ ID NO:3所示)。
优选的，所述应用的方法包括以下步骤：
(1)提取甘蓝型油菜待测样品的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，分别利用所述的KASP标记引物进行PCR扩增，然后进行荧光信号扫描、基因型分型；如果样品中只检测到特异性引物X的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X；如果只检测到特异性引物Y的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y；如果同时检测到特异性引物X和Y荧光，则该样品的基因型为杂合；
(3)根据基因型分型结果进行数据分析，得出甘蓝型油菜待测样品的芥酸含量控制基因Bn.OLEA9分型。
优选的，所述方法采用Douglas Array Tape平台进行；PCR扩增体系包括：100μM通用引物C、100μM特异性引物X、100μM特异性引物Y、2×KASP Master Mix、甘蓝型油菜待测样品的DNA、超纯水。
优选的，用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种鉴定甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的KASP标记引物，所述KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
特异性引物X：CTGGGTCCAGAGAAGCGTAT(如SEQ ID NO:1所示)；
特异性引物Y：CTGGGTCCAGAGAAGCGTAC(如SEQ ID NO:2所示)；
通用引物C：CCTTTTATGTGGTTTCCATGTCATTG(如SEQ ID NO:3所示)。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种鉴定甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的试剂盒，包含上述的KASP标记引物。
上述的试剂盒，优选的，所述特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
优选的，所述试剂盒中还包含2×KASP Master Mix和超纯水。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种所述KASP标记引物或所述试剂盒在鉴定甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明筛选出一个与甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9紧密连锁的SNP分子标记及其KASP标记引物组和试剂盒，用于芥酸含量控制基因Bn.OLEA9突变型的精准鉴定，这个标记分型质量高、单拷贝、高多态性(现有甘蓝型油菜资源中的PIC值高于>0.3)，样本数据检出率>98％，可用于甘蓝型油菜的芥酸育种改良的标记辅助育种，具有广泛的应用普适性。
(2)本发明还提供了上述KASP标记引物和试剂盒鉴定甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的应用方法，该检测方法简单、自动化程度高达90％；检测通量高、速度快(8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍)；检测反试剂用量少(仅0.8uL/反应)，试剂耗材成本低(与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％)；检测结果准确、重复性和稳定性好，不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；本发明提供了一种快速、高效、低成本、精准检测普适性方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中的SNP分子标记在油菜多样性材料中的基因型分型示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
本发明开发了一种与甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9紧密连锁的SNP分子标记。这种分子标记是通过甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的基因区间进行基因序列提取和等位型比对得到的优质位点进行开发验证得到，与芥酸含量控制基因Bn.OLEA9紧密连锁，可以根据基因型快速选择育种材料是否含有芥酸含量控制基因Bn.OLEA9。
相比之前育种中对甘蓝型油菜的芥酸含量水平需要到田间收种以后进行品质测量检测才能得到表型数据，本发明开发的SNP标记可以直接进行检测和分型，极大的提高了育种的选择效率；本发明所用的SNP标记检测基于Douglas Array Tape平台的KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)检测技术，检测方法简单、自动化程度高、通量高、速度快，试剂用量少，检测成本低，可以广泛的推广使用与育种选择。具体研发过程如下：
1、甘蓝型油菜核心种质资源数据库的构建
用已经公开的油菜种质资源完根据春油菜、半冬油菜和冬油菜的分类，选择180份油菜核心种质资源重测序数据构建甘蓝型油菜种质资源数据库。
2、已克隆芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的信息挖掘
通过大量文献查找，确定芥酸含量控制基因Bn.OLEA9被定位在甘蓝型油菜A09染色体上，基因符号为BnaA09g39570D，甘蓝型油菜的参考基因组版本为Darmor-bzh。
3、甘蓝型油菜SNP位点的提取及序列获取
用得到的180份核心种质资源的数据基于基因BnaA09g39570D的序列进行提取，并对基因序列进行SNP多态性分析，最后得到2个SNP位点(甘蓝型油菜A09染色体上的第28059517位、第28063791位碱基)，将SNP位点进行提取并获取其侧翼序列前后约100bp。
4、标记设计及合成
对以上获取得到的SNP位点，基于甘蓝型油菜的参考基因组Darmor-bzh，利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行KASP引物标记设计。有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。设计完成后，进一步对引物序列进行全基因组拷贝数分析，最终得到一个高质量的单拷贝的KASP标记位点，信息如下表1：
表1：芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的KASP标记的位点信息及引物序列(序列由左至右依次如SEQ ID NO:1-3所示)
5、标记的检测及验证
为了验证标记分型的质量以及标记与样品表型的基因型的一致性，搜集了2021-2023年近3年市场上推广面积前列的品种，用品种的样品进行验证，包括以下步骤：
(1)提取甘蓝型油菜待测样品的总DNA。
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，分别利用所述的KASP标记引物进行PCR扩增，PCR反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描；然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析；在KASP标记基因型分型检测中，样品的基因型分成3簇，分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇；其中X簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合X等位基因(分型图中标为红色，位于图形左上角)，Y簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合Y等位基因型(分型图中标为蓝色，位于图形右下角)，杂合基因型簇表示样品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型(分型图中标为紫色)；
KASP标记的验证和检测用Douglas Scientific的Array Tape系统进行。ArrayTape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
PCR扩增体系：用NEXAR进行PCR扩增体系的自动组装，PCR扩增体系如下表2所示。
表2：KASP标记基因型分型的PCR扩增体系
PCR扩增：PCR用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃(每个循环退火温度降低0.8℃)60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。
基于Douglas Array Tape平台的KASP标记检测优点：基于Douglas Array Tape平台的KASP标记自动化程度达90％，极大减少了实验室的人力及人为错误。检测通量高，8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍。检测反应体积低少(仅0.8uL/反应)，与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％。
(3)根据KASP标记分型结果和表型结果进行数据分析选择最优的位点用于后续应用。
根据标记检测结果(见图1)，两个KASP标记的分型较好、紧凑，检出率都高于98％，可以对甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的精准检测。
从材料的表型数据以及基因型数据的对应结果(见表3)，BN900147和BN900148标记当基因型为A或A/G时，材料的表型高芥酸含量，当基因型为G时，材料表型为低芥酸含量，表型与基因型对应关系较高度的一致，都能够准确的通过基因型鉴定材料是否含有Bn.OLEA9基因，从标记分型来说，BN900147区分效果更好一些，因此选择BN900147作为后续辅助标记应用。
表3品种的表型数据及基因型数据统计
Claims (10)
1.一种与甘蓝型油菜芥酸基因Bn.OLEA9紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，以甘蓝型油菜的Darmor-bzh基因组版本为参考，所述SNP分子标记在甘蓝型油菜A09染色体上的第28059517位碱基存在多态性，其多态性为A或G。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的芥酸含量表型；鉴定所述甘蓝型油菜A09染色体上的第28059517位碱基为纯合A或A/G时，甘蓝型油菜的芥酸含量表型为高芥酸；鉴定所述甘蓝型油菜A09染色体上的第28059517位碱基为纯合G时，甘蓝型油菜的芥酸含量表型为低芥酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴定甘蓝型油菜芥酸含量表型采用的KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
特异性引物X：CTGGGTCCAGAGAAGCGTAT；
特异性引物Y：CTGGGTCCAGAGAAGCGTAC；
通用引物C：CCTTTTATGTGGTTTCCATGTCATTG。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：
(1)提取甘蓝型油菜待测样品的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，分别利用所述的KASP标记引物进行PCR扩增，然后进行荧光信号扫描、基因型分型；如果样品中只检测到特异性引物X的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X；如果只检测到特异性引物Y的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y；如果同时检测到特异性引物X和Y荧光，则该样品的基因型为杂合；
(3)根据基因型分型结果进行数据分析，得出甘蓝型油菜待测样品的芥酸含量控制基因Bn.OLEA9分型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法采用Douglas Array Tape平台进行；CR扩增体系包括：100μM通用引物C、100μM特异性引物X、100μM特异性引物Y、2×KASPMaster Mix、甘蓝型油菜待测样品的DNA、超纯水。
6.一种鉴定甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的KASP标记引物，其特征在于，所述KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
特异性引物X：CTGGGTCCAGAGAAGCGTAT；
特异性引物Y：CTGGGTCCAGAGAAGCGTAC；
通用引物C：CCTTTTATGTGGTTTCCATGTCATTG。
7.一种鉴定甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求6所述的KASP标记引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含2×KASP MasterMix和超纯水。
10.一种如权利要求6所述的KASP标记引物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒在鉴定甘蓝型油菜芥酸含量控制基因Bn.OLEA9中的应用。
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