CN114107554B

CN114107554B - 用于检测大豆品种纯度的引物组及其应用

Info

Publication number: CN114107554B
Application number: CN202210078676.7A
Authority: CN
Inventors: 李乐; 贾佩陇; 聂超南; 田冰川; 唐宜; 唐顺学
Original assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114107554A

Abstract

本发明公开了一种用于检测大豆品种纯度的引物组及其应用，所述引物组基于20个用于检测大豆品种纯度的SNP标记进行设计和合成，可用于检测大豆品种和遗传材料的纯度，具有广泛的应用普适性，具有共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高。该引物组的使用不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性良好，而且技术简单、易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低，不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性。

Description

用于检测大豆品种纯度的引物组及其应用

技术领域

本发明涉及生物学及植物分子育种技术领域，更具体地，涉及一种用于检测大豆品种纯度的SNP标记的引物组及其应用。

背景技术

大豆是主要的油料和饲料作物，国内的需求极大。随着大豆育种技术的不断发展和大豆的大面积推广应用，品种的纯度检测成为大豆育种研发、种子生产以及种子交易必不可少的质量保证。

现在大豆品种纯度鉴定主要依赖于传统的田间小区种植鉴定方法（Grow-outTest）。田间种植鉴定把品种种植于田间测试小区，通过观察植物不同生长时期（苗期、生长、花期、成熟期以及种子）的植物学形态特征（如植物的高矮及大小、分蘖、叶色、叶形、种子大小、种皮颜色等）和生物学特性（如植物的生育期、光周期、抗病性、抗旱性、种子落粒性等）的不同来鉴定该大豆品种的纯度。此方法取决于对植物在田间的形态特征和生物学特性的视觉识别，判断标准往往很难精确量化，主观性强，检测灵敏度和分辨力低；易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需要投入大量人力、物力，成本高。

DNA分子标记法是现在作物品种纯度检测最常用的方法。DNA分子标记是直接反应DNA差异（多态性）的一种遗传标记，主要包括SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）和SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）等。SSR目前已经成为纯度和品种真实性检测的主要方法之一，在多种作物如水稻、小麦、大豆等都有SSR的国标，目前SSR大面积使用有它的优势，包括实验室操作简单、成本低、重复性较好、结果真实可靠等。比起SSR标记法，SNP标记法技术更简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低，不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性，是快速、渐变、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定品种纯度的最常用方法。但是目前基于SNP标记的大都纯度检测方法鲜见报道。

发明内容

基于现有技术中存在的上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种用于检测大豆品种纯度的引物组，所述引物组用于检测大豆DNA中的SP标记，所述SNP标记为SY01、SY02、SY03、SY04、SY05、SY06、SY07、SY08、SY09、SY10、SY11、SY12、SY13、SY14、SY15、SY16、SY17、SY18、SY19和SY20；所述引物组包括用于检测SY01的第一引物组、用于检测SY02的第二引物组、用于检测SY 03的第三引物组、用于检测SY 04的第四引物组、用于检测SY 05的第五引物组、用于检测SY 06的第六引物组、用于检测SY 07的第七引物组、用于检测SY 08的第八引物组、用于检测SY 09的第九引物组、用于检测SY 10的第十引物组、用于检测SY11的第十一引物组、用于检测SY 12的第十二引物组、用于检测SY 13的第十三引物组、用于检测SY 14的第十四引物组、用于检测SY 15的第十五引物组、用于检测SY 16的第十六引物组、用于检测SY 17的第十七引物组、用于检测SY 18的第十八引物组、用于检测SY 19的第十九引物组和用于检测SY 20的第二十引物组；每个引物组独立地包括不同的等位基因特异性引物X和Y，以及通用引物C，其中：

所述第一引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述SY01为碱基T或者G，位于大豆1号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第1011674位；

所述第二引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；所述SY02为碱基T或者G，位于大豆2号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第47533197位；

所述第三引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；所述SY03为碱基T或者C，位于大豆3号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第37129435位；

所述第四引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；所述SY04为碱基T或者C，位于大豆4号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第42280188位；

所述第五引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；所述SY05为碱基T或者C，位于大豆5号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第38950372位；

所述第六引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.17所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；所述SY06为碱基G或者A，位于大豆6号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第46905460位；

所述第七引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；所述SY07为碱基G或者A，位于大豆7号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第15654480位；

所述第八引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.22和SEQ IDNO.23所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；所述SY08为碱基T或者G，位于大豆8号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第2177033位；

所述第九引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列；所述SY09为碱基C或者A，位于大豆9号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第2729925位；

所述第十引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.28和SEQ IDNO.29所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；所述SY010为碱基C或者T，位于大豆10号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第44161160位；

所述第十一引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.31和SEQID NO.32所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列；所述SY11为碱基T或者C，位于大豆11号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第4147983位；

所述第十二引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.34和SEQID NO.35所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；所述SY12标记为碱基A或者G，位于大豆12号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第34908863位；

所述第十三引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.37和SEQID NO.38所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列；所述SY13标记为碱基C或者T，位于大豆13号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第6652918位；

所述第十四引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.40和SEQID NO.41所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；所述SY14标记为碱基A或者G，位于大豆14号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第1033407位；

所述第十五引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.43和SEQID NO.44所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列；所述SY15标记为碱基G或者A，位于大豆15号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第49700943位；

所述第十六引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.46和SEQID NO.47所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；所述SY16标记为碱基A或者G，位于大豆16号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第5925163位；

所述第十七引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.49和SEQID NO.50所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.51所示的核苷酸序列；所述SY17标记为碱基G或者A，位于大豆17号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第9609452位；

所述第十八引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.52和SEQID NO.53所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；所述SY18标记为碱基A或者G，位于大豆18号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第58367766位；

所述第十九引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.55和SEQID NO.56所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列；所述SY19标记为碱基A或者G，位于大豆19号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第45272654位；

所述第二十引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.58和SEQID NO.59所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列；所述SY20标记为碱基T或者C，位于大豆20号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第32917583位。

在一些实施方式中，每个所述引物组中的两条等位基因特异性引物中，若其中一条特异性引物连接FAM荧光序列，则另一条等位基因特异性引物连接HEX或VIC荧光序列。具体为，若等位基因特异性引物X连接FAM荧光序列，则等位基因特异性引物Y连接HEX或VIC荧光序列；反之亦然。

本发明的目的之二在于上述任一实施方式的引物组在大豆育种中的应用。

本发明的目的之三在于提供上述任一实施方式的引物组在大豆品种纯度检测中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种使用上述任一实施方式的引物组检测大豆的SNP标记的方法，该方法包括以下步骤：

S1、从待测的大豆材料中提取基因组DNA；

S2、以提取的基因组DNA为模板，利用上述任一实施方式的引物组和高通量SNP基因型分型设备对大豆材料进行基因型分型，鉴定待测大豆的基因型；

S3、比较待测大豆材料间基因型的一致性，判定待测大豆材料的遗传纯度。

本发明的目的之五在于提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述任一实施方式的引物组。

本发明的目的之六在于提供上述的试剂盒在大豆品种纯度检测中的应用。

本发明的目的之七在于提供一种基因芯片，所述基因芯片包括上述任一实施方式的引物组。

相较于现有技术，本发明的有益效果如下：

通过筛选出一套（1 SNP/染色体）共20个高质量和高多态的SNP标记，并基于该20个SNP标记进行设计和合成对应的引物组，用于来源不同的大豆品种（系）纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性。

本发明还提供了基于KASP标记的SNP检测方法，可用于大豆的纯度检测，该方法简单、快捷，检测成本低，适用于不同的检测仪器设备。

本发明提供的大豆纯度检测方法基于SNP标记法，具有SNP标记法的所有固有有点，标记为共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性号，不同检测实验室和不同数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性。

附图说明

图1为本发明实施例的SNP标记开发流程；

图2为本发明实施例的SNP标记SY01的基因型分型示意图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

如无特别说明，下述实施例中所使用的试验方法均为常规方法；所使用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

一、本发明的SNP标记的设计过程，如图1所示，通过收集6万个大豆SNP位点信息，筛选得到用于大豆品种纯度检测的SNP位点，提取位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：

1、大豆SNP位点的收集

利用大豆的SoySNP50K芯片进行位点信息的收集，通过收集现有大豆研发成果，查看有关大豆功能基因所在区域所涉及的SNP位点进行筛选，得到超过6万个SNP位点。

2、20个大豆SNP标记的筛选

对收集到的6万多个SNP位点，在大豆参考基因组Glycine_max_v2.0上进行标记库位点比对，得到1000个匹配位点良好位点，并进行KASP标记（引物组）设计。

3、进一步对1000个设计的KASP标记对大豆参考基因组（Glycine_max_v2.0）进行序列比对，得到200个特异性最好的标记位点进行合成，并选取94份大豆进行基因分型验证，得到一套大豆的功能标记连锁标记及资源原始数据。

4、通过200个SNP标记构建的核心资源数据库，选出一套标记最少并能够区分所有材料的标记组合，具体步骤如下：

①94份大豆资源材料用200个SNP标记进行检测，得到基因分型数据；

②通过比对94份资源材料的基因分型数据，做以下条件筛选：

a. 筛除单一基因分型标记；

b.每条染色体至少含有一个标记位点；

c. 基于最少SNP数进行比对筛选（大豆含20条染色体，即最少为20个SNP标记），得到的一套标记能够实现现有的94份材料里面的任意两份材料的这一套标记的基因分型结果至少有2个以上的位点差异；

d.如果c步骤初始位点数（20个SNP无法达到），则位点数加1继续进行分析，以此选择最优标记数；

③得到一套可以支持以上条件的20个标记的位点。

最终挑选出20个用于大豆品种纯度检测的SNP标记。20个SNP标记具体如下表1所示：

表1 20个用于大豆品种纯度检测的SNP位点的信息表

5、引物设计

每个KASP标记由三条引物组成，包括两条等位基因特异性引物—特异性引物X（Allele-Specific Primer X）和特异性引物Y（Allele-Specific Primer Y）以及一条通用引物C（Common Primer；Primer_C）；两条等位基因特异性引物分别连接FAM和HEX（或VIC），即：两条等位基因特异性引物中，一条等位基因特异性引物连接FAM荧光基团，则另一条连接HEX（或VIC）荧光基团。如果样品中只检测检测到FAM荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X；如果只检测的奥HEX荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y；如果同时检测到FAM和HEX荧光，则该样品的基因型为杂合（同时带有等位基因X和Y）。20个用于大豆检测的KASP标记的等位基因型和引物序列如表2所示：

表2 用于大豆品种纯度检测的KASP标记的等位基因型和引物序列

二、KASP检测

DNA提取：从大豆中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。

KASP标记检测：KASP标记的验证和检测用Douglas Scientific的Array Tape系统进行。Array Tape 基因型分型平台包括用于PRC 扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOLLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。

PCR扩增体系：用NEXAR进行PCR扩增体系的自动组装，PCR扩增体系如表3所示。

表3 KASP标记基因型分型的PCR扩增体系

PCR扩增：用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65~75℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，33个循环。

信号扫描和基因分型：PCR反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描，然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。如图2所示，在KASP标记基因型分型检测中，样品的基因型分为3簇，分别为X簇、Y簇和XY簇（杂合基因型簇）。其中，X簇表示在这个KASP标记位点含有纯合等位基因X（见图2中的左上角），Y簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合等位基因Y（见图2右下角），XY簇表示样品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因（见图2中间位置）。

三、20个用于大豆品种纯度的SNP位点验证

20个用于大豆品种纯度检测的KASP标记的基因型分型质量验证：根据上述检测方法，用94个不同遗传来源的大豆材料对20个KASP标记进行验证。经验证，每个KASP标记的二个纯合和杂合簇分型良好、紧凑，位点为单拷贝且检出率都高于97%，20个KASP标记的基因型分型质量完全能满足大豆品种纯度的精准检测。典型的KASP标记基因型分型图如图2。

综上，使用基于本发明的SNP标记集设计的KASP标记进行检测，基于DouglasArray Tape 平台进行检测，自动化程度高达90%，极大减少了实验室的人力及人为错误。检测通量高，8h可获得122880个数据点，是传统96孔板SNP基因分型方法的10倍。而且检测反应体积少（仅0.8μL/反应），与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70~90%，而且检测精度高，具有广泛的应用普适性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 华智生物技术有限公司

<120> 用于检测大豆品种纯度的引物组及其应用

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<213> 人工序列(无)

<400> 30

gccatattca tagtgtgagt tgatacagtg g 31

<210> 31

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 31

gaaggtgacc aagttcatgc tggccatggg ctagtcattc ctt 43

<210> 32

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 32

gaaggtcgga gtcaacggat tggccatggg ctagtcattc ctc 43

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 33

tttcattaat ttgtaacacc tcatcagttc g 31

<210> 34

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 34

gaaggtgacc aagttcatgc ttctgctttt gtttaaggct agtataatca agtt 54

<210> 35

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 35

gaaggtcgga gtcaacggat ttctgctttt gtttaaggct agtataatca agtc 54

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 36

gccatacaaa catgacttca ccgaga 26

<210> 37

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 37

gaaggtgacc aagttcatgc tttcaaacca aactacctta accaattctg 50

<210> 38

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 38

gaaggtcgga gtcaacggat tcatattcaa accaaactac cttaaccaat tcta 54

<210> 39

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 39

gggagagata ttgatgtgat aatgattgag g 31

<210> 40

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 40

gaaggtgacc aagttcatgc taattcccca tagtgcgtcc atattt 46

<210> 41

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 41

gaaggtcgga gtcaacggat taattcccca tagtgcgtcc atattc 46

<210> 42

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 42

cacctaaata gactgcaagg tagatagcca ct 32

<210> 43

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 43

gaaggtgacc aagttcatgc tagccaaaca tgatttctaa accaaaagac 50

<210> 44

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 44

gaaggtcgga gtcaacggat tagccaaaca tgatttctaa accaaaagat 50

<210> 45

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 45

tccgttttct gtttttctgg tattaacttt g 31

<210> 46

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 46

gaaggtgacc aagttcatgc ttttccaata tgtctcgttg caaaatgt 48

<210> 47

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 47

gaaggtcgga gtcaacggat ttccaatatg tctcgttgca aaatgc 46

<210> 48

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 48

gcatcaaatg aagttctatc aaagtctaca tca 33

<210> 49

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 49

gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtcagga aattggaata catcaaacag 50

<210> 50

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 50

gaaggtcgga gtcaacggat ttgtcaggaa attggaatac atcaaacaa 49

<210> 51

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 51

caaataagaa cacaaatacg aatgaaagtc ca 32

<210> 52

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 52

gaaggtgacc aagttcatgc tttctaagag caaatgagcg tcagaaaat 49

<210> 53

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 53

gaaggtcgga gtcaacggat ttctaagagc aaatgagcgt cagaaaac 48

<210> 54

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 54

tgaaagcaaa ttacctaaaa ggtgtagtat gga 33

<210> 55

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 55

gaaggtgacc aagttcatgc tctaagttaa cgtctggttg agtaatggaa agta 54

<210> 56

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 56

gaaggtcgga gtcaacggat tagttaacgt ctggttgagt aatggaaagt g 51

<210> 57

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 57

tggataccca taaatacaga tttcattgtc a 31

<210> 58

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 58

gaaggtgacc aagttcatgc ttgaatggaa taatcatacc ccaagagttt t 51

<210> 59

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 59

gaaggtcgga gtcaacggat tgaatggaat aatcataccc caagagtttc 50

<210> 60

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 60

gcaggttatt caaacacatg aacaacaa 28

Claims

1.用于检测大豆品种纯度的一套引物组，其特征在于，所述一套引物组用于检测大豆DNA中的SNP标记，所述SNP标记为SY01、SY02、SY03、SY04、SY05、SY06、SY07、SY08、SY09、SY10、SY11、SY12、SY13、SY14、SY15、SY16、SY17、SY18、SY19和SY20；所述引物组由如下引物组所组成：用于检测SY01的第一引物组、用于检测SY02的第二引物组、用于检测SY 03的第三引物组、用于检测SY 04的第四引物组、用于检测SY 05的第五引物组、用于检测SY 06的第六引物组、用于检测SY 07的第七引物组、用于检测SY 08的第八引物组、用于检测SY 09的第九引物组、用于检测SY 10的第十引物组、用于检测SY 11的第十一引物组、用于检测SY12的第十二引物组、用于检测SY 13的第十三引物组、用于检测SY 14的第十四引物组、用于检测SY 15的第十五引物组、用于检测SY 16的第十六引物组、用于检测SY 17的第十七引物组、用于检测SY 18的第十八引物组、用于检测SY 19的第十九引物组和用于检测SY 20的第二十引物组；每个引物组独立地包括不同的等位基因特异性引物X和Y，以及通用引物C，其中：

所述第一引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述SY01为碱基T或者G，位于大豆1号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第1011674位；

所述第二引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；所述SY02为碱基T或者G，位于大豆2号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第47533197位；

所述第三引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；所述SY03为碱基T或者C，位于大豆3号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第37129435位；

所述第十一引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.31和SEQ IDNO.32所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列；所述SY11为碱基T或者C，位于大豆11号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第4147983位；

所述第十二引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.34和SEQ IDNO.35所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；所述SY12标记为碱基A或者G，位于大豆12号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第34908863位；

所述第十三引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.37和SEQ IDNO.38所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列；所述SY13标记为碱基C或者T，位于大豆13号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第6652918位；

所述第十四引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.40和SEQ IDNO.41所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；所述SY14标记为碱基A或者G，位于大豆14号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第1033407位；

所述第十五引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.43和SEQ IDNO.44所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列；所述SY15标记为碱基G或者A，位于大豆15号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第49700943位；

所述第十六引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.46和SEQ IDNO.47所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；所述SY16标记为碱基A或者G，位于大豆16号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第5925163位；

所述第十七引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.51所示的核苷酸序列；所述SY17标记为碱基G或者A，位于大豆17号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第9609452位；

所述第十八引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.52和SEQ IDNO.53所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；所述SY18标记为碱基A或者G，位于大豆18号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第58367766位；

所述第十九引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.55和SEQ IDNO.56所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列；所述SY19标记为碱基A或者G，位于大豆19号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第45272654位；

所述第二十引物组的两条等位基因特异性引物分别包括如SEQ ID NO.58和SEQ IDNO.59所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列；所述SY20标记为碱基T或者C，位于大豆20号染色体，位置为大豆参考基因组Glycine_max_v2.0的第32917583位。

2.根据权利要求1所述的用于检测大豆品种纯度的一套引物组，其特征在于，每个所述引物组中的两条等位基因特异性引物中，若其中一条等位基因特异性引物连接FAM荧光序列，则另一条等位基因特异性引物连接HEX或VIC荧光序列。

3.权利要求1或2所述的一套引物组在大豆育种中的应用。

4.权利要求1或2所述的一套引物组在大豆品种纯度检测中的应用。

5.使用权利要求1或2所述的一套引物组检测大豆的SNP标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、从待测的大豆材料中提取基因组DNA；

S2、以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的一套引物组和高通量SNP基因型分型设备对大豆材料进行基因型分型，鉴定待测大豆的基因型；

6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的一套引物组。

7.权利要求6所述的试剂盒在大豆品种纯度检测中的应用。

8.一种基因芯片，其特征在于，包括权利要求1或2所述的一套引物组。