CN112626257A - 一套检测向日葵品种纯度的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套检测向日葵品种纯度的SNP分子标记及其应用。所述一套17个SNP分子标记，可用于检测来源不同的油葵和食葵品种和遗传材料的纯度，具有广泛的应用普适性，并且能追溯推测不纯样品的污染来源；具有共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好；技术简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性。
Description
技术领域
本发明属于农业分子生物学领域，具体涉及一套检测向日葵品种纯度的SNP分子标记及其应用。
背景技术
向日葵(Helianthus annuus L.)分为油葵(主要用于榨油)、食葵(休闲零食和甜点)和观赏向日葵三大类。向日葵是仅次于大豆、油菜、花生的第四大油料作物；乌克兰、俄罗斯、欧盟、阿根廷等欧美向日葵主产国主要以油葵为主，约占向日葵栽培总面积的90％以上。从上世纪90年代开始，我国向日葵育种和生产得到长足的发展，目前中国是世界上最大的食葵生产国，食葵种植面积占中国向日葵总种植面积的90％以上，占世界食葵总种植面积的50％左右。由于向日葵耐盐碱、耐干旱、耐贫瘠、适应性强，现已成为内蒙古、新疆、甘肃、宁夏等西北地区的重要区域性特色经济作物。向日葵属于异花授粉作物，世界上种植的油葵和食葵90％以上为杂交种，制种条件要求严格，随着向日葵育种技术的不断发展和杂交品种大面积的推广应用，品种和遗传材料纯度检测成为向日葵育种研发、种子生产以及种子交易必不可少的质量保证。
现在向日葵品种纯度鉴定主要依赖于传统的田间小区种植鉴定方法(Grow-outTest)。田间种植鉴定把品种种植于田间测试小区，通过观察植株不同生长时期(苗期、生长、花期、成熟期以及种子)的植物学形态特征(如植株的高矮及大小、分蘖、叶色、叶形、种子大小、种皮颜色等)和生物学特性(如植株的生育期、光周期、抗病性、抗旱性、种子落粒性等)的不同来鉴定该向日葵品种的纯度。此方法取决于对植物在田间的形态特征和生物学特性的视觉识别，判断标准往往很难精确量化，主观性强，检测灵敏度和分辨力低；易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需拖入大量人力、物力，成本高。
基于同工酶或种子贮存蛋白的生化检测也是向日葵品种纯度鉴定中常用的方法。该方法使用IEF电泳(Isoelectric focusing electrophoresis,等电聚焦电泳)、PAGE电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳)或琼脂糖电泳检测种子或植株叶片中10-20种同工酶或者种子贮存蛋白的有无或强弱。该法检测通量低；标记物数量少，标记在品种间的多态性有限，检测灵敏度和分辨力低；易受环境和实验条件影响，准确性和稳定性差；不同检测实验室的数据结果很难相互比较验证。
DNA分子标记法是现在作物品种纯度检测最常用方法。DNA分子标记是直接反应DNA差异(多态性)的一种遗传标记，主要包括AFLP(Amplified Fragment LengthPolymorphism，扩增片段长度多态性)，RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、SSR(Simple Sequence Repeat,简单重复序列)和SNP(SingleNucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)等。分子标记在作物品种纯度检测中的应用经历了从早期的RAPD和AFLP，到随后的SSR标记到现在常用的SNP标记的转变。SNP标记共显性，可供选择的标记数目多，多态性、特异性、灵敏度和分辨力高；不受环境影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确，重复性和稳定性好；技术简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；已取代SSR标记，广泛应用到水稻、玉米、大豆、油菜等主要农作物品种纯度鉴定中已成为快速、简便、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定品种纯度的最常用方法。目前用于向日葵纯度检测的主要是SSR标记法；基于SNP标记的向日葵纯度检测方法鲜见报道。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一套向日葵的SNP分子标记，能够检测向日葵品种的纯度。
本发明还提出一种上述SNP分子标记的筛选方法。
本发明还提出用于检测上述SNP分子标记的引物组。
本发明还提出上述SNP分子标记的检测方法。
本发明还提出上述SNP分子标记的应用。
根据本发明的第一方面实施方式的SNP分子标记，所述分子标记为HA001、HA002、HA003、HA004、HA005、HA006、HA007、HA008、HA009、HA0010、HA0011、HA0012、HA0013、HA0014、HA0015、HA0016和/或HA0017，其中HA001的多态性碱基为A或G，HA002的多态性碱基为T或C，HA003的多态性碱基为T或C，HA004的多态性碱基为A或C，HA005的多态性碱基为A或G，HA006的多态性碱基为T或G，HA007的多态性碱基为T或C，HA008的多态性碱基为T或C，HA009的多态性碱基为T或C，HA010的多态性碱基为A或G，HA011的多态性碱基为A或G，HA012的多态性碱基为T或C，HA013的多态性碱基为A或G，HA014的多态性碱基为T或G，HA015的多态性碱基为A或G，HA016的多态性碱基为T或C，HA017的多态性碱基为A或G。
根据本发明的一些实施方式，所述SNP分子标记的多态性位点位于向日葵参考基因组XRQ(HanXRQr2.0)的不同染色体上，其中HA001多态性位点位于HanXRQChr01染色体的1397147位碱基处，HA002多态性位点位于HanXRQChr02染色体的174484195位碱基处，HA003多态性位点位于HanXRQChr03染色体的168673961位碱基处，HA004多态性位点位于HanXRQChr04染色体的172005308位碱基处，HA005多态性位点位于HanXRQChr05染色体的134437099位碱基处，HA006多态性位点位于HanXRQChr06染色体的38051242位碱基处，HA007多态性位点位于HanXRQChr07染色体的142435280位碱基处，HA008多态性位点位于HanXRQChr08染色体的1633016位碱基处，HA009多态性位点位于HanXRQChr09染色体的188917321位碱基处，HA010多态性位点位于HanXRQChr10染色体的178681543位碱基处，HA011多态性位点位于HanXRQChr11染色体的9495869位碱基处，HA012多态性位点位于HanXRQChr12染色体的6942535位碱基处，HA013多态性位点位于HanXRQChr13染色体的165893994位碱基处，HA014多态性位点位于HanXRQChr14染色体的123009012位碱基处，HA015多态性位点位于HanXRQChr15染色体的3426781位碱基处，HA016多态性位点位于HanXRQChr16染色体的182092609位碱基处，HA017多态性位点位于HanXRQChr17染色体的2677421位碱基处。
根据本发明第二方面实施方式的上述SNP分子标记的筛选方法，所述方法包括根据SNP标记位点的物理和遗传位置信息、基因型分型质量、拷贝数、在油葵和食葵中的多态性PIC值(Polymorphic Information Content，多态性信息值)和分辨力以及基因型检出率筛选得到可用于油葵和食葵品种纯度检测的一套分子标记。
根据本发明的一些实施方式，所述SNP分子标记从20,640个SNP标记位点筛选得到。
根据本发明第三方面实施方式的用于检测上述SNP分子标记的引物组，所述引物组每个所述SNP分子标记的引物组独立地包括特异性引物和通用引物，其中，
SNP分子标记HA001的特异性引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA001的通用引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA002的特异性引物包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA002的通用引物包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA003的特异性引物包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA003的通用引物包括如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA004的特异性引物包括如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA004的通用引物包括如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA005的特异性引物包括如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA005的通用引物包括如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA006的特异性引物包括如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA006的通用引物包括如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA007的特异性引物包括如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA007的通用引物包括如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA008的特异性引物包括如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA008的通用引物包括如SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA009的特异性引物包括如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA009的通用引物包括如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0010的特异性引物包括如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0010的通用引物包括如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0011的特异性引物包括如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0011的通用引物包括如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0012的特异性引物包括如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0012的通用引物包括如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0013的特异性引物包括如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0013的通用引物包括如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0014的特异性引物包括如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0014的通用引物包括如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0015的特异性引物包括如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0015的通用引物包括如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0016的特异性引物包括如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0016的通用引物包括如SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0017的特异性引物包括如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0017的通用引物包括如SEQ ID NO.51所示的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方式，所述Primer_X的5’端连接FAM或HEX荧光序列，Primer_Y的5’端连接HEX或FAM荧光序列。
根据本发明的一些实施方式，所述引物组在向日葵育种中的应用。
根据本发明的第四方面实施方式的上述SNP分子标记的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1、从待测向日葵材料中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用SNP分子标记HA001-HA0017的KASP引物组，使用高通量分型设备对待测向日葵材料进行基因型分型，从而获得定待测向日葵材料的基因型；
S3、比较待测向日葵材料间基因型的一致性，判定待测向日葵材料的遗传纯度。
根据本发明的一些实施方式，优选地，步骤S1中，向日葵中提取基因组DNA采用简化CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)。
根据本发明的一些实施方式，优选地，步骤S2中，用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术对SNP位点进行检测。
根据本发明的第五方面实施方式的上述SNP分子标记的应用，所述应用为在向日葵分子标记育种中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为在向日葵品种及纯度鉴定中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为在向日葵全基因组关联分析中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供一种检测向日葵品种的分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒用于向日葵育种。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括上述的引物组。
根据本发明实施方式的向日葵品种纯度的检测方法，至少具有如下有益效果：通过筛选出一套(1SNP/染色体)共17个高质量和高多态性的SNP标记，可用于来源不同的油葵和食葵品种和遗传材料纯度的精准检测，具有共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好；不同检测实验室和不同的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性，并且能追溯推测不纯样品的污染来源；应用KASP技术对向日葵的纯度检测。本发明利用基于Douglas Array Tape平台的KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，技术简单，易于自动化，速度快，自动化程度达90％，极大减少了实验室的人力及人为错误；单位数据点检测成本低，检测通量高，8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍。检测反应体积低少(仅0.8uL/反应)，与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％，适用于大规模、高通量的向日葵的纯度的鉴定。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例的分子标记开发流程图；
图2为本发明实施例的SNP分子标记HA007的基因型分型示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明实施例为：用于向日葵品种纯度检测的SNP分子标记
本发明实施例的分子标记的设计过程，如图1所示，通过搜集20,640个向日葵SNP位点信息，筛选得到用于向日葵品种纯度检测的SNP位点，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：
1 17个用于向日葵品种纯度检测的SNP位点的筛选
一共20,640个SNP标记位点用于向日葵品种纯度检测的SNP标记筛选，其中10,640个SNP标记位点的序列等信息来源于University of Georgia(UGA)领导开发的Illumina芯片，其余的10,000个SNP标记位点的信息源于美国农业部领导开发的Illumina芯片。
20,640个SNP标记位点的物理和遗传位置：利用SNP标记位点的序列信息，通过BLASTN得到这20,640个SNP标记位点在向日葵参考基因组XRQ(HanXRQr2.0)上的物理位置。在这20,640个SNP标记中，部分标记已用于构建了7个不同的遗传图谱。根据部分标记的遗传图谱以及20,640个SNP标记在向日葵参考基因组XRQ的物理位置，构建了20,640个SNP标记位点的高密度通用遗传图谱(Consensus Map)并获得这20,640个SNP标记位点在通用遗传图谱上的遗传位置。
20,640个SNP标记的芯片验证：利用这20,640个SNP标记设计的Illumina芯片，对不同来源的842份油葵和195份食葵多样性材料进行基因型分型，并获得这些标记的分型质量(GenTrain Score)、拷贝数、多态性PIC值(Polymorphic Information Content，多态性信息值；PIC值最低为0表示没多态，最高为0.5)以及基因型检出率。
17个用于向日葵品种纯度检测的SNP标记的筛选：从经过芯片验证的SNP标记中，挑选17个(1个SNP标记/染色体)高质量(GenTrain Score>0.8)、单拷贝、高多态性(在842份油葵材料和195份食葵材料中的PIC值都高于>＝0.49)、数据检出率>99.6％的SNP标记，用于各种不同遗传来源的油葵和食葵品种和遗传材料纯度的精准检测。筛选得到的17个用于向日葵品种纯度检测的SNP标记的物理和遗传位置见表1。
表1.用于向日葵品种纯度检测的SNP位点的物理和遗传位置
2引物设计
KASP标记的设计：利用BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对筛选出的17个SNP位点进行KASP引物设计。每个KASP标记由三条引物组成，包括两条等位基因特异性引物X(Primer_X)和Y(Primer_Y)以及一条通用引物C(CommonPrimer；Primer_C)。两条等位基因特异性引物分别连接FAM和HEX(或VIC)荧光基团。如果样品中只检测到FAM荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X(Allele_X)；如果只检测到HEX荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y(Allele_Y)；如果同时检测到FAM和HEX荧光，则该样品的基因型为杂合(同时带有等位基因X和Y)。17个用于向日葵品种纯度检测的KASP标记的等位基因型和引物序列见表2。
表2.17个用于向日葵品种纯度检测的KASP标记的等位基因型(Allele_X、Allele_Y)和引物序列
3 KASP检测
DNA提取：从向日葵中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
KASP标记检测流程：KASP标记的验证和检测用Douglas Scientific的Array Tape系统进行。Array Tape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
PCR反应体系：用NEXAR进行PCR反应体系的自动组装，PCR反应体系如下表3所示。
PCR扩增：用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，30个循环。
信号扫描和基因型分型：PCR反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描；然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。在KASP标记基因型分型检测中，样品的基因型分成3簇，分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇(见图2)。如图2所示，从图中可以看出，图中标为红色，位于图形左上角的为X簇，表示样品在这个KASP标记位点含有纯合X等位基因，图中标为蓝色，位于图形右下角的为Y簇，表示样品在这个KASP标记位点含有纯合Y等位基因型，图中标为紫色的为杂合基因型簇，表示样品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型。
表3.KASP检测的PCR反应体系
4 17个用于向日葵品种纯度检测的SNP位点验证
17个用于向日葵品种纯度检测的KASP标记的基因型分型质量验证：根据上述检测方法，用380个含有油葵和食葵的多样性材料对17个KASP标记进行验证。经验证，每个KASP标记的二个纯合和杂合簇分型好、紧凑，位点为单拷贝且检出率都高于99.5％，17个KASP标记的基因型分型质量完全能满足向日葵品种纯度的精准检测。典型的KASP标记基因型分型图见图2。
17个KASP标记用于向日葵品种纯度检测的验证：用这套标记对二个经人为混杂的向日葵杂交品种样品(190粒种子/样品)进行了检测，一个样品混杂了10粒不同来源的种子，另一个样品混杂了2粒不同来源的种子，这套标记精准的检出二个向日葵样品中所有混杂的种子。
综上所述，本发明提供一套17个SNP分子标记，可用于来源不同的油葵和食葵品种和遗传材料纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性，并且能追溯推测不纯样品的污染来源；具有共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好；技术简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性。
本发明中使用的Douglas Array Tap基因分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS，与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 华智生物技术有限公司
<120> 一套检测向日葵品种纯度的SNP分子标记及其应用
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc taacaatgat cactgcaagg tttcaca 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tacaatgatc actgcaaggt ttcacc 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaccgaaaga caacactacc ctctt 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tacagaggtc aaaagggaaa agagata 47
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tcagaggtca aaagggaaaa gagatg 46
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgtgttcta gttgcaaggt ttaaccaa 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tatgttgtgt tatgcaagtg agagagtt 48
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tgttgtgtta tgcaagtgag agagtg 46
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccttaacg atattaaccc gatggttat 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tgccgaaatt caagacgtag agtca 45
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gaaggtcgga gtcaacggat tccgaaattc aagacgtaga gtcg 44
<210> 21
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aactgttatg gaaggcatca tgttgagta 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tgagttacat ctcgcgtaca tccatat 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tagttacatc tcgcgtacat ccatac 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctttttcgg atggatgtga aatcgaata 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tcatcttgaa gtggcccaaa atctagt 47
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tatcttgaag tggcccaaaa tctagc 46
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccttgtcttt atagttttag ttgcttaaaa 30
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaaggtgacc aagttcatgc tgctttcgtg gtggctttgc a 41
<210> 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tgctttcgtg gtggctttgc g 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caaatgtgat cgcaaaactt atgggtcta 29
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaaggtgacc aagttcatgc tcgctacaca agattacaac gttgct 46
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaaggtcgga gtcaacggat tgctacacaa gattacaacg ttgcc 45
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgcctattca cgggtcctgt cat 23
<210> 34
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaaggtgacc aagttcatgc tgaaagtgat atcgatattt tagcaaaagc t 51
<210> 35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaaggtcgga gtcaacggat taaagtgata tcgatatttt agcaaaagcc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtaacgga gaccccggct at 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tatgagagtt aagtagccaa gatcaca 47
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gaaggtcgga gtcaacggat tgagagttaa gtagccaaga tcacg 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catcttgcgt gaagcaaaca taccattta 29
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gaaggtgacc aagttcatgc tgggaagacc agtggaagaa agataat 47
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tggaagacca gtggaagaaa gataag 46
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catccatcat caacagagta ctcattcaa 29
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gaaggtgacc aagttcatgc tggaagtcaa atctctagtc actcct 46
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cacgcgaaat acgcggggaa gaa 23
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gcagcctgca ttacatgata cctcat 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gtcaacaggt tgaacccgag ctaaa 25
Claims (10)
1.一套检测向日葵品种纯度的SNP分子标记，其特征在于：所述分子标记为HA001、HA002、HA003、HA004、HA005、HA006、HA007、HA008、HA009、HA0010、HA0011、HA0012、HA0013、HA0014、HA0015、HA0016和/或HA0017，其中HA001的多态性碱基为A或G，HA002的多态性碱基为T或C，HA003的多态性碱基为T或C，HA004的多态性碱基为A或C，HA005的多态性碱基为A或G，HA006的多态性碱基为T或G，HA007的多态性碱基为T或C，HA008的多态性碱基为T或C，HA009的多态性碱基为T或C，HA010的多态性碱基为A或G，HA011的多态性碱基为A或G，HA012的多态性碱基为T或C，HA013的多态性碱基为A或G，HA014的多态性碱基为T或G，HA015的多态性碱基为A或G，HA016的多态性碱基为T或C，HA017的多态性碱基为A或G。
2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记的多态性位点位于向日葵参考基因组XRQ(HanXRQr2.0)不同染色体上，其中HA001多态性位点位于HanXRQChr01染色体的1397147位碱基处，HA002多态性位点位于HanXRQChr02染色体的174484195位碱基处，HA003多态性位点位于HanXRQChr03染色体的168673961位碱基处，HA004多态性位点位于HanXRQChr04染色体的172005308位碱基处，HA005多态性位点位于HanXRQChr05染色体的134437099位碱基处，HA006多态性位点位于HanXRQChr06染色体的38051242位碱基处，HA007多态性位点位于HanXRQChr07染色体的142435280位碱基处，HA008多态性位点位于HanXRQChr08染色体的1633016位碱基处，HA009多态性位点位于HanXRQChr09染色体的188917321位碱基处，HA010多态性位点位于HanXRQChr10染色体的178681543位碱基处，HA011多态性位点位于HanXRQChr11染色体的9495869位碱基处，HA012多态性位点位于HanXRQChr12染色体的6942535位碱基处，HA013多态性位点位于HanXRQChr13染色体的165893994位碱基处，HA014多态性位点位于HanXRQChr14染色体的123009012位碱基处，HA015多态性位点位于HanXRQChr15染色体的3426781位碱基处，HA016多态性位点位于HanXRQChr16染色体的182092609位碱基处，HA017多态性位点位于HanXRQChr17染色体的2677421位碱基处。
3.一种用于检测如权利要求1所述的SNP分子标记的引物组，其特征在于：每个所述SNP分子标记的引物组独立地包括特异性引物和通用引物，其中，
SNP分子标记HA001的特异性引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA001的通用引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA002的特异性引物包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA002的通用引物包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA003的特异性引物包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA003的通用引物包括如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA004的特异性引物包括如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA004的通用引物包括如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA005的特异性引物包括如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA005的通用引物包括如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA006的特异性引物包括如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA006的通用引物包括如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA007的特异性引物包括如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA007的通用引物包括如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA008的特异性引物包括如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA008的通用引物包括如SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA009的特异性引物包括如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA009的通用引物包括如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0010的特异性引物包括如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0010的通用引物包括如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0011的特异性引物包括如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0011的通用引物包括如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0012的特异性引物包括如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0012的通用引物包括如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0013的特异性引物包括如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0013的通用引物包括如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0014的特异性引物包括如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0014的通用引物包括如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0015的特异性引物包括如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0015的通用引物包括如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0016的特异性引物包括如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0016的通用引物包括如SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；
SNP分子标记HA0017的特异性引物包括如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列，SNP分子标记HA0017的通用引物包括如SEQ ID NO.51所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的引物组，其特征在于：所述Primer_X的5’端连接FAM或HEX荧光序列，Primer_Y的5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。
5.如权利要求3所述的引物组在向日葵育种中的应用。
6.一种如权利要求1所述的SNP分子标记的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：
S1、从待测的向日葵材料中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用权利要求3和/或4所述的KASP引物组和高通量SNP基因型分型设备对待测向日葵材料进行基因型分型，从而鉴定待测向日葵的基因型；
S3、比较待测向日葵材料间基因型的一致性，判定待测向日葵材料的遗传纯度。
7.如权利要求1或2任一所述的SNP分子标记在向日葵分子标记育种中的应用。
8.如权利要求7所述的SNP分子标记的应用，其特征在于：所述应用为在向日葵品种鉴定和纯度检测中的应用。
9.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如权利要求3所述的引物组。
10.一种基因芯片，其特征在于：所述基因芯片包括核苷酸序列如权利要求3所述的引物组。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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