CN114622029A

CN114622029A - 用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114622029A
Application number: CN202210257249.5A
Authority: CN
Inventors: 雷雨婷; 唐顺学; 田冰川; 谢心悦
Original assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2022-06-14

Abstract

本发明公开了用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组、试剂盒及其应用，其中用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组为AHAS1‑HT2.1和AHAS1‑HT2.2中的至少一种，所述引物组包括两条特异性引物和一条通用引物，利用该引物组能够快速有效区分向日葵对咪唑啉酮类除草剂的耐受性，且特异性好，检出率高；基于所述引物组开发的试剂盒具有操作简单、快速高效、结果稳定可靠、灵敏度极高等优点，结合Douglas Array Tape平台使用，可以实现向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的高通量和低成本检测，对加快向日葵的选育具有重要意义。

Description

用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

向日葵(Helianthus annuus L)是重要的油料作物和经济作物，其中向日葵草害是严重制约向日葵生产的重要因素，因为杂草会掠夺向日葵生长资源，而且许多杂草是病虫的共同寄主，会明显加重病虫危害程度。在所有防治杂草的方法中，使用除草剂防治杂草成本低、见效快，特别是在引进咪唑啉酮类除草剂以后，由于其用量持续增加，且持续大面积使用，土壤中的除草剂残留物容易对敏感作物产生药害，在轮作的后茬作物中药害尤为明显。随着抗性作物的选育成功，该问题也得到了有效解决，但是在选育抗性品种的过程中也存在诸多问题。

相关研究中CLPlus性状是指向日葵的咪唑啉酮类除草剂耐受性状，其受部分显性等位Ahasl1-3的控制，可以通过种子突变和农药筛选获得，CLPlus性状使咪唑啉酮类除草剂对AHAS酶的抑制水平降低，使向日葵对咪唑啉酮类除草剂的耐受水平得到很大提升，这种优越的耐受性水平也为向日葵提供了更好的耐受稳定性以应对环境变化。但是在实际应用过程抗性品种在连续种植过程中可能会出现抗性丧失的现象，然而每次通过种子突变和农药筛选获得抗咪唑啉酮类除草剂品种向日葵需要花费较多的时间和成本。相关技术中，DNA分子标记法是DNA水平遗传变异的直接反应，在向日葵的遗传育种方面起到非常重要的辅助作用，主要包括AFLP，RAPD、SSR和SNP等。与SNP标记比较，RAPD和AFLP为显性标记，灵敏度、分辨力、准确性、重复性和稳定性相对较低。比较起SSR标记法，SNP标记法技术更简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低。其中SNP标记共显性，具备遗传稳定性高、高通量、易于自动化分析、检测快速的特点，已经成为向日葵分子育种研究中一个重要的工具。但是在设计SNP分子标记引物过程中，由于向日葵中耐除草剂相关基因的高同源性，常规设计引物会出现多拷贝，相关技术中关于耐除草剂的向日葵的分子标记都基于同样SNP位点的SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)或者CAPS(C1eavedAmplified Polymorphic Sequences)标记，一定程度上避免了多拷贝的干扰，但SSCP或者CAPS标记通量低，费用高、技术复杂，耗时，基本上育种家很少用SSCP或者CAPS标记筛选，基于此，亟需寻求一种快速、高通量、成本低且检测效果好的鉴定方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组、试剂盒及其应用，能够快速有效鉴定向日葵对咪唑啉酮类除草剂的抗性。

本发明还提出一种试剂盒，包括上述引物组。

本发明还提出一种检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的方法。

本发明还提出一种上述引物组和/或试剂盒的应用。

本发明还提出一种上述检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的方法在向日葵育种中的应用。

本发明还提出一种基因芯片，包括上述引物组。

本发明的第一方面，提供了一种用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组，所述引物组为AHAS1-HT1.1和/或AHAS1-HT1.2；

所述AHAS1-HT1.1包含特异性引物Primer Allele X1、特异性引物Primer AlleleY1和通用引物1，所述特异性引物Primer Allele X1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性引物Primer Allele Y1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述通用引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述AHAS1-HT1.2包含特异性引物Primer Allele X2、特异性引物Primer AlleleY2和通用引物2，所述特异性引物Primer Allele X2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性引物Primer Allele Y2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述通用引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

根据本发明的一些实施例，所述引物组是通过SNP分子标记检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂的抗性，所述SNP分子标记为AHAS1-HT1，所述AHAS1-HT1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其中SNP位点位于第188位，多态性为C或T。

根据本发明的一些实施例，所述SNP分子标记的引物组为KASP引物组。

根据本发明的一些实施例，所述特异性引物Primer Allele X1和特异性引物Primer Allele Y1的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与向日葵基因组序列不同源。

根据本发明的一些实施例，所述特异性引物Primer Allele X2和特异性引物Primer Allele Y2的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与向日葵基因组序列不同源。

根据本发明的一些实施例，所述序列标签A为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ IDNO.8)。

根据本发明的一些实施例，所述序列标签B为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ IDNO.9)。

根据本发明实施例中，至少具有如下有益效果：本发明的一种用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组，能够快速有效区分向日葵对咪唑啉酮类除草剂的耐受性，且特异性好，检出率高。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的试剂盒，包含本发明的第一方面的引物组。

在本发明的一些实施例中，所述引物组为AHAS1-HT1.1和/或AHAS1-HT1.2；

所述AHAS1-HT1.1包含特异性引物Primer Allele X1、特异性引物Primer AlleleY1和通用引物1，所述特异性引物Primer Allele X1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：所述特异性引物Primer Allele Y1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述通用引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

优选地，根据本发明的一些实施例，所述试剂盒还包含PCR预混液，所述PCR预混液包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；

所述荧光探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；

所述荧光探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团。

根据本发明的一些实施例，所述荧光基团A与荧光基团B互不相同。

根据本发明的一些实施例，所述荧光基团A、荧光基团B选自FAM和HEX；进一步根据本发明的一些实施例，所述荧光基团A为FAM，所述荧光基团B为HEX。

根据本发明的一些实施例，所述淬灭基团选自BQH。

根据本发明的一些实施例，所述PCR预混液还包含其他KASP扩增所需的试剂，比如Taq DNA聚合酶、ROX内参染料、dNTP和MgCl₂等。

根据本发明的一些实施例，一种用于检测向日葵对磺酰脲类除草剂抗性的试剂盒，所述试剂盒包含：引物组和PCR预混液；

所述引物组为AHAS1-HT1.1和/或AHAS1-HT1.2；

所述AHAS1-HT1.1包含特异性引物Primer Allele X1、特异性引物Primer AlleleY1和通用引物1，所述特异性引物Primer Allele X1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述特异性引物Primer Allele Y1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述通用引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述AHAS1-HT1.2包含特异性引物Primer Allele X2、特异性引物Primer AlleleY2和通用引物2，所述特异性引物Primer Allele X2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述特异性引物Primer Allele Y1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述通用引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述PCR预混液为KASP Master mix，购于英国LGC公司。

根据本发明实施例中，至少具有如下有益效果：采用本发明的用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的试剂盒，可以快速准确地鉴定向日葵对咪唑啉酮类除草剂的抗性，具有操作简单、快速高效、结果稳定可靠、灵敏度极高等优点。该检测试剂盒结合Douglas Array Tape平台使用，具备检测方法简单、自动化程度高、通量高、速度快，试剂用量少、检测成本低，检测结果准确、重复性和稳定性好等优点。

本发明的第三方面，提供了一种检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的方法，包括以下步骤：

S1、提取待测向日葵样品的基因组DNA；

S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用上述引物组和/或试剂盒，对所述SNP分子标记AHAS1-HT2进行检测，获得待测向日葵的基因型数据；

S3、根据步骤S2所述的基因型数据，判断向日葵对咪唑啉酮类除草剂的抗性。

根据本发明的一些实施例，若检测到AHAS1-HT1.1和AHAS1-HT1.2的基因型均为“G:G”，判定待测向日葵为不耐受咪唑啉酮类除草剂向日葵；若检测到AHAS1-HT1.1和AHAS1-HT1.2的基因型为“A:A”和/或“A:G”，判定待测向日葵为耐受咪唑啉酮类除草剂向日葵。

根据本发明的一些实施例，所述待测向日葵样品的品种包括油葵、食葵和观赏向日葵。

根据本发明的一些实施例，所述不耐受咪唑啉酮类除草剂向日葵是指不耐受咪唑啉酮类除草剂CLPlus性状向日葵。

本发明的第四方面，提供了一种上述引物组和/或试剂盒的以下任一应用：

(1)在鉴定或辅助鉴定耐咪唑啉酮类除草剂的向日葵中的应用；

(2)在制备鉴定或辅助鉴定耐咪唑啉酮类除草剂的向日葵的产品中的应用；

(3)在选育具有耐咪唑啉酮类除草剂的向日葵中的应用；

(4)在制备选育具有耐咪唑啉酮类除草剂的向日葵产品中的应用；

(5)在向日葵育种中的应用；

(6)在制备向日葵育种的产品中的应用。

本发明的第五方面，提供了一种上述检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的方法在向日葵育种中的应用。

本发明的第六方面，提供了一种基因芯片，包括上述引物组。

根据本发明实施例中，至少具有如下有益效果：采用本发明的基于耐咪唑啉酮类除草剂向日葵的SNP分子标记位点设计的特异性引物组及其试剂盒，可以快速有效地鉴定耐咪唑啉酮类除草剂的向日葵，且稳定性好、通量高，在向日葵的育种和辅助育种过程中具有重要意义。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例的KASP标记开发流程图。

图2为本发明实施例的分子标记AHAS1-HT1.1的基因分型图。

图3为本发明实施例的分子标记AHAS1-HT1.2的基因分型图。

图4为本发明对比例的分子标记AHAS1-HT1.1a的基因分型图。

图5为本发明对比例的分子标记AHAS1-HT1.1b的基因分型图。

图6为本发明对比例的分子标记AHAS1-HT1.1c的基因分型图。

图7为本发明对比例的分子标记AHAS1-HT1.1d的基因分型图。

图8为本发明对比例的分子标记AHAS1-HT1.2a的基因分型图。

图9为本发明对比例的分子标记AHAS1-HT1.2b的基因分型图。

图10为本发明对比例的分子标记AHAS1-HT1.2c的基因分型图。

图11为本发明对比例的分子标记AHAS1-HT1.2d的基因分型图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

在实施方式中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术和条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未标明生产厂商的，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1SNP分子标记位点信息的筛选

根据对向日葵基因组研究发现，AHAS1基因为两个向日葵野生种群(ANN-PUR和ANN-KAN)抗除草剂的主要候选基因，编码向日葵AHAS催化亚基的三个基因分别为AHAS1、AHAS2和AHAS3，目前在向日葵AHAS1基因中发现了约48个单核苷酸多态性(SNPs)，其中8个氨基酸Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和Gly654(以模式植物拟南芥的AHAS氨基酸位置计算)产生变异可以使向日葵获得除草剂抗性，而Ala122、Ala205、Ser653和Gly654的变异使植物具有很高的咪唑啉酮类除草剂抗性，基于此，本发明进一步地对这些多态性位点进行分析，筛选出了一个与耐咪唑啉酮类除草剂相关度较高的SNP位点，该位点的多样性是由向日葵的AHAS1基因的第122为密码子发生突变产生，即由丙氨酸(GCG)突变成酪氨酸(ACG)，以向日葵基因组HanXRQr v2.0为参考基因组，其变异位点位于向日葵Chr09，物理位置为180619670，其具体SNP分子标记位点信息如表1所示。

表1：

实施例2KASP标记的设计

基于实施例1的SNP分子标记位点，本发明利用KASP反应原理及抗感材料的单碱基差异设计了KASP引物组，即KASP标记，具体KASP标记开发流程图如图1所示，利用该KASP标记可高通量地对耐咪唑啉酮类除草剂的向日葵材料进行快速检测。

首先提取目标SNP分子标记位点前后150bp的侧翼序列，定位AHSH1、AHSH2及AHSH3的变异区域，利用Batch Primer 3软件(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对目标SNP分子标记位点进行引物设计，并同时在SNP分子标记位点的正义链及反义链上分别设计一套KASP标记，其中正义链上标记用AHAS1-HT1.1表示，反义链上标记用AHAS1-HT1.2表示。

每个KASP标记由三条引物组成，包括两条等位基因特异性引物X(Primer_X)和Y(Primer_Y)以及一条通用引物C(Primer_C)。特异性引物Primer_X和特异性引物Primer_Y的5’端分别连接LGC公司KASP反应特定的序列标签。通过KASP反应，如果样品中只检测到FAM荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X(Allele_X)；如果只检测到HEX荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y(Allele_Y)；如果同时检测到FAM和HEX荧光，则该样品的基因型为杂合，即同时带有等位基因X和Y。用于向日葵AHAS1抗性基因检测的KASP标记的等位基因型和引物序列如表2所示。

表2：

实施例3KASP标记的验证方法

1.向日葵DNA提取

采用简化CTAB法，从向日葵叶片中提取基因组DNA，具体包括以下步骤：

(1)取约30mg叶片至1.3mL 96孔板，并置于冻干机中，抽真空12h或以上；抽真空结束后，使用分珠器向每孔中加入两粒钢珠，并盖上硅胶膜，置于高通量研磨仪中研磨1min，研磨后置于深孔板离心机中瞬离，将磨碎组织离心到孔底。

(2)用移液工作站TECAN向每孔加CTAB提取液700μL，震荡混匀后置于65℃水浴锅中温浴约1h-1.5h，每20min将1.3mL 96孔板取出于漩涡振荡器上振荡数次。

(3)温浴结束后取出1.3mL 96孔板，将其置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm离心10min。

(4)用移液工作站TECAN将每孔380μL上清转移到新的1.3mL 96孔板中，并加入等体积氯仿，颠倒混匀后静置2min，置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心10min，离心后，用移液工作站TECAN抽取上清液250μL至预先加好250μL异丙醇的0.8mL 96孔板中，漩涡振荡混匀，将其置于-20℃冰箱沉淀1h或以上。

(5)取出0.8mL 96孔板置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心15min；弃掉上清，用移液工作站TECAN向每孔中加入250μL70％乙醇，漩涡振荡器上振荡数次，5000rpm，离心15min；弃掉上清，并置于65℃烘箱中30min将其烘干。

(6)每孔加200μL灭菌超纯水，置于室温过夜溶解，提取的DNA数量和质量需符合PCR扩增的要求，即DNA无降解，DNA溶液的紫外光吸光度OD₂₆₀与OD₂₈₀的比值介于1.70～2.0之间，DNA的浓度在30ng/μL以上，DNA总量至少为2μg，提取完成后将每粒种子的DNA统一稀释至30ng/μL，4℃保存备用。

2.PCR反应

KASP标记的反应测序用Douglas Scientific的Array Tape系统进行。Array Tape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。

以本实施例提取的DNA为模板，加入上述KASP标记引物混合液和PCR预混液，采用Array Tape基因型分型平台的NEXAR系统进行PCR扩增体系的自动组装，KASP标记基因型分型的PCR反应体系如下表3所示。

表3：

其中，特异性引物Primer_X和特异性引物Primer_Y的5’端分别加上序列标签A和序列标签B：

序列标签A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO.8)；

序列标签B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO.9)。

AHAS1-HT2.1标记的特异性引物Primer_X加上序列标签A后，其核苷酸序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTCGCCTACCCCGGCGGCA-3’(SEQ ID NO.10)；

AHAS1-HT2.1标记的特异性引物Primer_Y加上序列标签B后，其核苷酸序列为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTCGCCTACCCCGGCGGCG-3’(SEQ ID NO.11)。

AHAS1-HT2.2标记的特异性引物Primer_X加上序列标签A后，其核苷酸序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTGGTGGATCTCCATTGACGT-3’(SEQ ID NO.12)；

AHAS1-HT2.2标记的特异性引物Primer_Y加上序列标签B后，其核苷酸序列为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGGTGGATCTCCATTGACGC-3’(SEQ ID NO.13)。

序列标签A和序列标签B适用于英国LGC公司KASP Master mix(PCR预混液)，其中KASP Master mix包含了荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B、ROX内参染料，Klear Taq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂，其中荧光探针A带有的荧光基团FAM，荧光信号表现为蓝色，荧光探针B带有的荧光基团HEX，荧光信号表现为红色，淬灭探针带有的淬灭基团为BHQ。

采用Array Tape基因型分型平台的SOELLEX系统进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，57℃～65℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，30个循环。

3.基因分型

PCR反应完成后用Array Tape基因型分型平台的ARAYA进行反应体系荧光信号扫描，然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。根据荧光信号的颜色获得待测向日葵品种在目标SNP分子标记位点的基因型。

在SNP分子标记基因型分型检测中，样品的基因型分成3簇，分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇，其中：

X簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有纯合X等位基因，在基因分型图中标为红色，位于图形左上角；

Y簇表示样品在SNP分子标记位点含有纯合Y等位基因型，基因分型图中标为蓝色，位于图形右下角；

杂合基因型簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有X和Y杂合等位基因型，基因分型图中标为紫色，位于图形靠近中间位置。

实施例4.KASP标记AHAS1-HT1.1、AHAS1-HT1.2的验证

为验证本发明中基于SNP位点的KASP标记引物的特异性及实用性，用107个具有咪唑啉酮类除草剂CLPlus抗性和咪唑啉酮类除草剂CLPlus不抗的向日葵多样性材料对两个KASP标记AHAS1-HT1.1、AHAS1-HT1.2进行验证，其中抗性材料共计52份，不抗材料共计55份。具体材料信息见表4。

采用实施例3的方法对107个具有咪唑啉酮类除草剂CLPlus抗性和咪唑啉酮类除草剂CLPlus不抗的向日葵多样性材料进行抗性鉴定，107份咪唑啉酮类除草剂CLPlus的抗感材料检测结果如表4所示。

表4：

从表4中可以看出，采用本发明筛选得到的KASP标记对107个具有咪唑啉酮类除草剂CLPlus抗性和咪唑啉酮类除草剂CLPlus易感向日葵多样性材料进行抗性鉴定，其鉴定结果与预期一致，其中抗性材料共计52份，不抗材料共计55份，且用本发明筛选得到的KASP标记检出率高，107个待测向日葵多样性材料中的目标SNP位点均被有效检测。

进一步的，基于SNP位点的AHAS1-HT1.1标记的基因分型结果如图2所示，从图中可以看出AHAS1-HT1.1标记的基因型被分成3簇，且样本分型明显、紧凑，其中红色簇表示待测样品在这个SNP分子标记位点含有纯合X等位基因(即A:A)，位于图的左上角，共计41份；蓝色簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有纯合Y等位基因型(即G:G)，位于图的右下角，共计55份；紫色簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有X和Y杂合等位基因型(即A：G)，位于另外两簇之间，共计11份。

基于SNP位点的AHAS1-HT1.2标记的基因分型结果如图3所示，从图中可以看出AHAS1-HT1.2标记的基因型也被分成3簇，且样本分型明显、紧凑，其中红色簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有纯合X等位基因(即A:A)，位于图的左上角，共计41份；蓝色簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有纯合Y等位基因型(即G:G)，位于图的右下角，共计55份；紫色簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有X和Y杂合等位基因型(即A：G)，位于另外两簇之间，共计11份。

综上可见，基于SNP位点设计的AHAS1-HT1.1标记和AHAS1-HT1.2标记在检测AHSH1基因位点时具有高特异性，且检出率高，可准确高效的鉴别咪唑啉酮类除草剂CLPlus向日葵材料的抗性。

对比例

1.常规KASP标记的设计

首先提取目标SNP分子标记位点前后150bp的侧翼序列，定位AHSH1、AHSH2及AHSH3的变异区域，利用Batch Primer3软件(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对目标SNP分子标记位点进行引物设计，并同时在SNP分子标记位点的正义链及反义链上分别设计了4套常规的KASP标记，共计8组KASP标记，分别为AHAS1-HT1.1a、AHAS1-HT1.1b、AHAS1-HT1.1c、AHAS1-HT1.1d、AHAS1-HT1.2a、AHAS1-HT1.2b、AHAS1-HT1.2c和AHAS1-HT1.2d标记，其中AHAS1-HT1.1a、AHAS1-HT1.1b、AHAS1-HT1.1c、AHAS1-HT1.1d表示正义链上标记；AHAS1-HT1.2a、AHAS1-HT1.2b、AHAS1-HT1.2c、AHAS1-HT1.2d表示反义链上标记。用于向日葵AHAS1抗性检测的KASP标记的等位基因型(Allele_X、Allele_Y)和引物序列如表5所示。

表5：

2.8组常规KASP标记基因分型结果验证

为了证实本发明中筛选出的KASP标记的特异性及实用性，本发明采用实施例4的107个具有咪唑啉酮类除草剂CLPlus抗性和类除草剂CLPlus不抗的向日葵多样性材料对常规设计的8个KASP标记进行验证，其中抗性材料共计52份，不抗材料共计55份。具体材料信息见表4。

本实施例的具体验证方法和步骤参见本发明实施例3，其中KASP标记的引物序列如表5所示。AHAS1-HT1.1a、AHAS1-HT1.1b、AHAS1-HT1.1c、AHAS1-HT1.1d、AHAS1-HT1.2a、AHAS1-HT1.2b、AHAS1-HT1.2c和AHAS1-HT1.2d标记的基因分型图如图4-图11所示。

其中图4、图5、图6和图7分别为正义链上的KASP标记AHAS1-HT1.1a、AHAS1-HT1.1b、AHAS1-HT1.1c和AHAS1-HT1.1d的基因分型结果图，从图中可以看出，其基因分型图散乱，无明显3簇结构，无法验证咪唑啉酮类除草剂CLPlus耐药/感药材料；其中图8、图9、图10和图11分别为反义链上KASP标记AHAS1-HT1.2a、AHAS1-HT1.2b、AHAS1-HT1.2c和AHAS1-HT1.2d的基因分型结果图，从图中可以看出，其基因分型图散乱，无明显3簇结构，尤其是AHAS1-HT1.2a标记的基因分型图，其基因型散乱，几乎无法聚集成簇，可见基于常规设计的反义链上的标记是无法验证咪唑啉酮类除草剂CLPlus耐药/感药材料。

采用常规方法设计的8组KASP标记无法有效聚集成簇的主要原因是在向日葵中有3个不同AHAS基因，由于AHAS基因的多拷贝，在开发具耐除草剂拷贝特性的KASP标记法非常困难。相关技术中筛选出来的分子标记主要是基于同样SNP位点的SSCP(single strandconformation polymorphism)标记或者CAPS(C1eaved Amplified PolymorphicSequences)标记，这些标记在一定程度上避免了多拷贝的干扰，但SSCP标记或者CAPS标记通量低，费用高、技术复杂，耗时，基本上育种人员很少用SSCP标记或者CAPS标记对其抗性进行筛选，而直接用除草剂筛选。通过对比常规的基于向日葵耐咪唑啉酮类除草剂的SNP位点设计的KASP标记，本发明基于向日葵耐咪唑啉酮类除草剂的SNP位点设计KASP标记，即AHAS1-HT1.1、AHAS1-HT1.2标记在检测AHSH1基因位点时具有高特异性，可准确高效的鉴别向咪唑啉酮类除草剂CLPlus向日葵材料的抗性。

综上所述，本发明提供精准、快速、高效鉴定耐咪唑啉酮类除草剂CLPlus向日葵的特异性SNP分子标记，标记质量好、灵敏度、分辨力高及特异性高，能精准特异的鉴定向日葵AHSH1基因中的SNP变异位点，可用于检测来源不同的向日葵品种中耐咪唑啉酮类除草剂CLPlus的材料。

进一步的，本发明还提供了基于KASP标记的SNP检测方法，用于检测向日葵品种中耐咪唑啉酮类除草剂CLPlus的材料，该KASP标记检测方法简单、检测结果准确、稳定性好、检测快速，可适用于不同的检测仪器设备。其次，本发明还提供了一种基于DouglasArrayTape平台的KASP标记检测方法，该检测方法自动化程度高、检测通量高、速度快，节约成本。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 华智生物技术有限公司

<120> 用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组、试剂盒及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcaacgac cgttaccggt gcagcctttt gtctcccgtt acgcgccaga tcaaccgaga 60

aaaggcgcag acgtgttggt ggaagctctg gaacgggaag gtgtcaccga cgtcttcgcc 120

taccccggcg gcgcgtcaat ggagatccac caagctctca cgcgctcaag cactatccgc 180

aatgtgctcc cccgtcacga acagggcggc gtgttcgccg ccgaaggcta cgcgcgcgcc 240

tccggtcttc ccggcgtgtg tatcgccact tccggtcccg gagctacgaa cctagttag 299

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tcttcgccta ccccggcggc a 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tcttcgccta ccccggcggc g 41

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgccgggaag accggaggcg 20

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc tcttggtgga tctccattga cgt 43

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat tcttggtgga tctccattga cgc 43

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgagaaaagg cgcagacgtg ttg 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 10

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtgacc aagttcatgc tgaaggtgac caagttcatg ctcttcgcct accccggcgg 60

ca 62

<210> 11

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaggtcgga gtcaacggat tgaaggtcgg agtcaacgga ttcttcgcct accccggcgg 60

cg 62

<210> 12

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaggtgacc aagttcatgc tgaaggtgac caagttcatg ctcttggtgg atctccattg 60

acgt 64

<210> 13

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaggtcgga gtcaacggat tgaaggtcgg agtcaacgga ttcttggtgg atctccattg 60

acgc 64

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagaccggag gcgcgcgcgt a 21

Claims

1.用于检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的引物组，其特征在于，所述引物组为AHAS1-HT1.1和/或AHAS1-HT1.2；

所述AHAS1-HT1.1包含特异性引物Primer Allele X1、特异性引物Primer Allele Y1和通用引物1，所述特异性引物Primer Allele X1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性引物Primer Allele Y1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述通用引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述AHAS1-HT1.2包含特异性引物Primer Allele X2、特异性引物Primer Allele Y2和通用引物2，所述特异性引物Primer Allele X2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性引物Primer Allele Y2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述通用引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述特异性引物Primer Allele X1和特异性引物Primer Allele Y1的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与向日葵基因组序列不同源；

所述特异性引物Primer Allele X2和特异性引物Primer Allele Y2的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与向日葵基因组序列不同源；

优选地，所述序列标签A为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO.8)；

优选地，所述序列标签B为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO.9)。

3.一种试剂盒，包含：权利要求1或2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR预混液，所述PCR预混液包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；

所述荧光探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列一致，所述荧光探针A的5’端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列反向互补，所述淬灭探针A的3’端连接淬灭基团；

所述荧光探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列一致，所述荧光探针A的5’端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列反向互补，所述淬灭探针A的3’端连接淬灭基团；

优选地，所述荧光基团A与荧光基团B互不相同。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团A、荧光基团B选自FAM和HEX；所述淬灭基团选自BQH。

6.一种检测向日葵对咪唑啉酮类除草剂抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待测向日葵样品的基因组DNA；

S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用如权利要求1-2任一项所述引物组和/或权利要求3-5任一项所述试剂盒进行检测，并获得基因型数据；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测向日葵样品的品种包括油葵、食葵和观赏向日葵中的至少一种。

8.如权利要求1-2任一项所述引物组和/或权利要求3-5任一项所述试剂盒的以下任一项应用：

(3)在选育具有耐咪唑啉酮类除草剂的向日葵中的应用；

(5)在向日葵育种中的应用；

(6)在制备向日葵育种的产品中的应用。

9.一种向日葵育种方法，其特征在于，包括如下步骤：采用如权利要求6所述的方法对向日葵样品进行检测，选择耐受咪唑啉酮类除草剂向日葵样品进行后续育种。

10.一种基因芯片，其特征在于，包括如权利要求1-2任一项所述引物组。