CN113355453A

CN113355453A - 一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记及其应用

Info

Publication number: CN113355453A
Application number: CN202110905957.0A
Authority: CN
Inventors: 唐顺学; 易丽媛; 田冰川; 彭佩; 肖金华; 王同华; 郭一鸣; 李宝
Original assignee: Huazhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Huazhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-08-09
Filing date: 2021-08-09
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-08-09
Also published as: CN113355453B

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记为BN900009.K02，其中BN900009.K02的多态性为A或G，所述SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组BrassicanapusV4.1版本的A9号染色体的第5748820bp处。本发明方案利用所述分子标记，可以快速准确的检测甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo，利用分子标记辅助选择育种，简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期，亦可进行有目的的多基因聚合，提高育种效率，带来巨大的社会经济效益。

Description

一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农业分子生物学领域，具体涉及一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记及其应用。

背景技术

油菜是继大豆和油棕之后的第三大油料作物，也是主要食用油之一。杂种优势是自然界普遍存在的一种生物现象，表现为两个亲本间杂交子代的某些性状优于双亲，因此在油菜育种工作中被广泛应用。雄性不育系制种是甘蓝型油菜杂交种生产的主要途径。

Ougra CMS（萝卜细胞质不育）最早是由在萝卜(Raphanus sativus)中发现的，有学者将欧洲甘蓝型油菜与Ougra CMS不育系杂交，并连续回交转育成甘蓝型油菜胞质不育系，其不育性十分稳定，是由细胞质中线粒体嵌合基因orf138和一对隐性细胞核基因(rf/rf)共同控制。而Ougra CMS的恢复基因仅存在于萝卜中，相关技术通过种属间杂交及分子标记辅助选择等技术，将Ougra CMS的恢复系的恢复基因Rfo从萝卜导入到油菜中，相关技术运用图位克隆的手段成功克隆出了恢复基因，并对携带有Rfo恢复基因的外源DNA片段定位，推动了Ogu-Rf体系广泛地用于杂交油菜育种。

相关技术公布的分子标记大多为SSR和CAPS标记，需要进行凝胶电泳检测，检测过程使用的核酸染料等试剂对环境及人体有危害，且自动化程度低检测通量小，另外有时会出现非特异扩增的情况，导致检测结果无法准备判断，很大程度上限制了检测效率。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记。

本发明还提出用于检测上述SNP分子标记的引物组。

本发明还提出上述SNP分子标记的检测方法。

本发明还提出上述SNP分子标记的应用。

根据本发明的第一方面实施方式的SNP分子标记，所述SNP分子标记为BN900009.K02，其中BN900009.K02的多态性为A或G，所述SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组Brassica napus V4.1版本的A9号染色体的第5748820bp处。

根据本发明第二方面实施方式的用于检测上述SNP分子标记的引物组，所述引物组包括特异型性引物；所述特异性引物包括Primer Seq Allele X和Primer Seq AlleleY，所述Primer Seq Allele X的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Primer Seq AlleleY的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施方式中，所述Primer Seq Allele X的5’端连接FAM或HEX荧光序列，Primer Seq Allele Y的5’端分别连接FAM或HEX荧光序列。

在本发明的一些实施方式中，所述引物组在油菜基因型检测中的应用。

根据本发明的第三方面实施方式的一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo基因型的检测方法，所述方法包括如下步骤：

S1、从油菜中提取基因组；

S2、以步骤S1中提取的基因组为模板，利用上述引物组，对BN900009.K02分子标记进行检测；

S3、根据检测到的基因型确定所述油菜中是否为含Rfo恢复基因的恢复系。

在本发明的一些实施方式中，只检测到引物Primer Seq Allele X所对应的碱基，判定测试的油菜样本为含Rfo恢复基因的恢复系；若只检测到引物Primer Seq Allele Y所对应的碱基，判定测试的油菜样本为不含Rfo恢复基因的不育系；若同时检测到Primer SeqAllele X、Primer Seq AlleleY所对应的碱基，则判定待测的油菜样本为杂合的含Rfo恢复基因的恢复系。

在本发明的一些实施方式中，优选地，步骤S1中，油菜中提取基因组DNA采用简化CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）。

在本发明的一些实施方式中，优选地，步骤S2中，用KASP（竞争性等位基因特异性PCR）技术对SNP位点进行检测。

根据本发明的第四方面实施方式的上述SNP分子标记的应用，所述应用为SNP分子标记在油菜育种中的应用。

一种油菜育种方法，包括如下步骤：利用上述基因型的检测方法对甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo进行检测，选择携带有甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo基因型的油菜样品进行后续育种。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为提供一种检测Rfo恢复基因SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物，优选地，所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒在油菜育种中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物，优选地，所述基因芯片还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物。

根据本发明实施方式的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记，至少具有如下有益效果：通过对本发明的甘蓝型油菜中萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记，应用KASP技术对油菜材料中的Rfo基因进行检测，可以快速准确的检测甘蓝型油菜中是否含有萝卜细胞质不育恢复基因Rfo。本发明分子标记用于识别甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系中Rfo恢复基因，利用分子标记辅助选择育种，简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期，亦可进行有目的的多基因聚合，提高育种效率，带来巨大的社会经济效益，同时利用KASP技术对所开发的SNP分子标记进行基因分型，KASP技术流程中DNA抽提、PCR体系构建和荧光信号检测等基本自动化，可实现96，384，1536孔板高通量检测，适用于大规模、高通量的Rfo基因鉴定和筛选。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择和背景选择，提高背景回复率，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于Rfo-cms系统高效的应用于油菜杂交育种中。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例中的分子标记开发流程图；

图2为本发明实施例中的BN900009.K02分子标记的分型图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例为：一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记，该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已克隆目标基因Rfo确定物理位置，通过序列对比分析得到SNP位点，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：

1 引物设计

首先，利用Ougra CMS不育系亲本与Ougra CMS恢复系亲本Rfo基因区域序列的差别（chrA09:5748000-5749800；Brassica napus4.0)，发现它们的序列中有一系列的SNP位点，利用这些SNP位点开发了相应的分子标记。并利用在线引物设计网站BatchPrimer3（http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/）对其进行引物设计。针对候选SNP标记，对不育系亲本和恢复系亲本进行KASP反应验证，挑选出与恢复系亲本共分离及扩增效果好的1组SNP标记BN900009.K02，该SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组Brassica napus V4.1版本的A9号染色体的第5748820bp处。标记BN900009.K02有三条引物，如表1所示，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托Invitrogen公司合成。

利用基于KASP反应原理及材料的单碱基差异设计的标记能高通量的对油菜材料进行Rfo恢复基因检测。如果样品扩增产物只检测到引物PrimerX对应荧光信号，则检测位点为含Rfo恢复基因的恢复系；若只检测到引物PrimerY对应荧光信号，则为不含Rfo恢复基因的不育系；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为杂合，判断待测样本为杂合的含Rfo恢复基因的恢复系。

表1 BN900009.K02的标记信息

2 样品检测

DNA提取：从油菜中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。

KASP反应测试：KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。PCR 扩增反应使用的扩增体系如表2所示，以3μL计为：20ng模板DNA，烘干后加入100UM 的上下游特异引物各0.0050µL，100UM的通用引物0.0125µL，2x KASP Master Mix 1.4792μL，余量为超纯水。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

表2 KASP检测的反应体系

3标记分型数据

根据上述检测方法，用标记BN900009.K02对4份已知基因型不育系甘蓝型油菜亲本、4份已知基因型恢复系甘蓝型油菜亲本、56份来源于3个未知基因型双亲样品（纯度值非100%）及其杂交后代样本，组成1个96孔板验证标记Assay分型情况，BN900009.K02分子标记能正常分型。

实验结果如图2所示，BN900009.K02标记检测不育系样品为A:A纯合等位基因型(分型图中标为蓝色），检测Ougra CMS恢复系样品为A:C杂合等位基因型（分型图中标为红色）或A:A纯合等位基因型（分型图中标为紫色）。实验结果表明，本申请方案BN900009.K02分子标记能正常分型。

本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 华智生物技术有限公司

<120> 一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tcgaggagat gccccacagg 40

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tacgaggaga tgccccacag a 41

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctctgctt gcatartcca tcgat 25

Claims

1.一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为BN900009.K02，其中BN900009.K02的多态性为A或G，所述SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组Brassica napus V4.1版本的A9号染色体的第5748820bp处。

2.一种用于检测如权利要求1所述的SNP分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括特异型性引物；所述特异性引物包括Primer Seq Allele X和Primer Seq Allele Y；所述Primer Seq Allele X的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Primer Seq Allele Y的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括如SEQ ID NO.3所示的通用引物核苷酸序列。

4.根据权利要求2或3所述引物组在油菜基因型检测中的应用。

5.一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo基因型的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、从油菜中提取基因组；

S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用权利要求2或3所述引物组，对BN900009.K02分子标记进行检测；

6.根据权利要求1所述SNP分子标记，或权利要求2或3所述引物组在油菜育种中的应用。

7.一种油菜育种方法，其特征在于，包括如下步骤：根据权利要求5所述检测方法，选择携带有甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的油菜样品进行后续育种。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物，优选地，所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物。

9.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物，优选地，所述基因芯片还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物。