CN112695114B

CN112695114B - 一种用于检测抗稻瘟病Pik基因的SNP分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112695114B
Application number: CN202011566147.9A
Authority: CN
Inventors: 彭佩; 郑秀婷; 江南; 唐顺学; 肖金华; 田冰川
Original assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112695114A

Abstract

本发明公开了一种抗稻瘟病Pik基因座的SNP分子标记及应用，所述SNP分子标记的多态性位于第11号染色体第27998933位点处碱基为T/C。该分子标记基于KASP技术开发，可高通量检测水稻基因组第11号染色体的Pik基因座。本发明应用KASP技术对SNP分子标记进行基因分型，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定等的优点，该分子标记与抗稻瘟病显著相关，可用来鉴定抗稻瘟病Pik基因、辅助育种或者培育具有抗稻瘟病能力的水稻，对水稻稻瘟病的抗性改良具有重要意义。

Description

一种用于检测抗稻瘟病Pik基因的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测抗稻瘟病Pik基因的SNP分子标记及其应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，稻瘟病在水稻的整个生长过程都可能发生，严重时导致颗粒无收，威胁着粮食安全，利用水稻自身的抗病基因是防治稻瘟病是最经济有效的方式，且对环境友好。

位于水稻第11染色体长臂近端粒处的Pik基因座是抗稻瘟病基因研究的热门位点，该位点上有Pik、Pi-1、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p和Pik-s等多种等位基因，其中Pik和Pi-1是水稻主效抗稻瘟病基因之一，对许多中国稻瘟病小种有较强的抗性。研究结果显示，Pik基因座定位在SSR标记RM1233和RM224之间，一般由抗性由2个紧密连锁、具有独立功能的NBS-LRR基因协同作用，这些复等位基因之间序列高度同源。因此，可针对Pik基因座开发通用的SNP标记及建立高效、环保的检测体系，促进Pik基因座在商业化育种中的应用。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种SNP分子标记。

本发明的第二个目的在于，提供一组引物。

本发明的第三个目的在于，提供一种试剂盒。

本发明的第四个目的在于，提供上述分子标记在辅助鉴定抗稻瘟病基因Pik和/或辅助育种中的应用。

本发明的第五个目的在于，提供上述引物在检测抗稻瘟病基因Pik和/或辅助育种中的应用。

本发明的第六个目的在于，提供上述试剂盒在检测抗稻瘟病基因Pik和/或辅助育种中的应用。

本发明的第七个目的在于，提供一种检测抗稻瘟病基因Pik基因型的方法。

本发明的第八个目的在于，提供上述分子标记或引物或试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。

本发明的第九个目的在于，提供上述分子标记或引物或试剂盒在水稻稻瘟病的抗性改良中的应用。

本发明的第十个目的在于，提供上述分子标记或引物或试剂盒在培育具有抗稻瘟病能力水稻中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种SNP分子标记，所述SNP分子标记的多态性位于第11号染色体第27998933位点处碱基为T/C。

本发明的第二个方面，提供一组引物。

根据本发明的第二个方面，所述引物用于扩增本发明第一个方面所述分子标记，所述引物的序列如下所示：

特异性引物：

Primer X：5’-GCCCACAATATTCATATCAGGT-3’(SEQ ID NO.1)；

Primer Y：5’-CCCACAATATTCATATCAGGC-3’(SEQ ID NO.2)；

通用引物：

Primer C：5’-ACCTTGATTGTAGGCAGCTT-3’(SEQ ID NO.3)。

优选地，特异性引物Primer X和Primer Y别连接不同的荧光接头序列。

本发明的第三个方面，提供一种用于检测抗稻瘟病基因Pik的试剂盒，包含本发明第二方面所述引物。

本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述分子标记在辅助鉴定抗稻瘟病基因Pik和/或辅助育种中的应用。

本发明的第五个方面，提供本发明第二个方面所述引物在检测抗稻瘟病基因Pik和/或辅助育种中的应用。

本发明的第六个方面，提供本发明第三个方面所述试剂盒在检测抗稻瘟病基因Pik和/或辅助育种中的应用。

本发明的第七个方面，提供一种检测抗稻瘟病基因Pik基因型的方法，包括如下步骤：

S1：采用本发明第二个方面所述引物组合或本发明第三个方面所述试剂盒对水稻样品基因组进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光接头序列；

S2：若只检测到引物Primer Y所连荧光接头序列对应的荧光信号，则判断水稻样品为具有抗稻瘟病的纯合Pik基因型；若只检测到引物Primer X所连荧光接头序列对应的荧光信号，则判断水稻样品为不具有抗稻瘟病的纯合pik基因型；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为具有抗稻瘟病的杂合Pik基因型。

根据本发明第七个方面，所述荧光接头序列可为本领域常规使用的荧光接头序列。

优选地，根据本发明第七个方面，所述荧光接头序列为FAM和HEX接头序列。

进一步地，根据本发明第七个方面，所述FAM和HEX接头序列分别连接在两条特异性引物的5’端。

本发明的第八个方面，提供本发明第一个方面所述分子标记或本发明第二个方面所述引物或本发明第三个方面所述试剂盒在水稻种质资源改良中的应用，采用本发明第二个方面所述引物组合或本发明第三个方面所述试剂盒对水稻样品基因组进行KASP反应检测，筛选出具有抗稻瘟病的水稻品种，有利于水稻品种资源改良。

本发明的第九个方面，提供本发明第一个方面所述分子标记或本发明第二个方面所述引物或本发明第三个方面所述试剂盒在水稻抗性改良中的应用，采用本发明第二个方面所述引物组合或本发明第三个方面所述试剂盒对水稻样品基因组进行KASP反应检测，筛选出具有抗稻瘟病的水稻品种，对水稻稻瘟病的抗性改良具有重要意义。

本发明的第十个方面，提供本发明第一个方面所述分子标记或本发明第二个方面所述引物或本发明第三个方面所述试剂盒在培育具有抗稻瘟病能力水稻中的应用。采用本发明第二个方面所述引物组合或本发明第三个方面所述试剂盒对水稻样品基因组进行KASP反应检测，筛选出具有抗稻瘟病的水稻样品进行后续育种。

进一步的，本发明还提供一种水稻辅助育种方法，包括检测本发明第一方面所述分子标记或通过本发明第二个方面所述引物或本发明第三个方面所述试剂盒进行分子标记检测的步骤。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种抗稻瘟病Pik基因座的SNP分子标记及应用，所述分子标记是与Pik基因座组连锁的SNP标记，精准检测抗稻瘟病Pik基因座，可用来鉴定抗稻瘟病Pik基因、辅助育种或者培育具有抗稻瘟病能力的水稻，对水稻稻瘟病的抗性改良具有重要意义。该标记基于KASP技术开发，可高通量检测水稻基因组第11号染色体的Pik基因座。本发明应用KASP技术对SNP分子标记进行基因分型，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定等的优点。

附图说明

图1为SNP分子标记K_110574的开发流程图。

图2为SNP分子标记K_110574群体分型图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1抗稻瘟病基因Pik的SNP分子标记的开发

根据相关文献将Pik基因位置确定在水稻11号染色体的27984697-27989134区间，利用Pik的供体材料的重测序数据和SNP数据库对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。挑选出的SNP位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3对其进行引物设计。该SNP分子标记的多态性位于第11号染色体第27998933位碱基为T/C。上述SNP分子标记开发流程图见图1。

引物委托Invitrogen公司合成。每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光接头序列。

利用基于KASP反应原理及材料的单碱基差异设计的标记能高通量的对水稻材料进行Pik基因检测，每个标记由三条引物组成，两条特异性引物5’端分别连接LGC公司KASP反应试剂特定的荧光接头序列，一条通用引物，具体信息见表1。如果样品PCR产物只检测到引物PrimerX对应荧光信号，则检测位点为碱基T，判定测试的水稻样品为不具有抗稻瘟病的纯合的pik基因；若只检测到引物PrimerY对应荧光信号，则检测位点为碱基C，判定测试的水稻样品为具有抗稻瘟病的纯合的Pik基因；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为T：C，判断待测水稻具有抗稻瘟病的杂合的Pik基因。

表1 K_110574标记信息

实施例2SNP分子标记的KASP反应的检测

1.针对本发明所述的分子标记设计引物，利用KASP反应可高通量的对水稻品种中是否含有抗稻瘟病基因Pik进行检测，采用实施例1设计的引物组合。

2.采用简化CTAB法，从水稻叶片中提取基因组DNA。

3.KASP反应测试

KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngDNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

表2 KASP检测的反应体系

	终浓度(μM)	体积(μl)
			100μM Primer C	0.42	0.0125
100μM Primer X	0.17	0.0050
			100μM Primer Y	0.17	0.0050
2x KASP Master Mix	1x	1.4792
			超纯水		1.4983
总体积		3

用标记K_110574对水稻供体品种Kusabue(Pik)、关东51号(Pik)、Tsuyuake(Pikm)、K60(Pikp)、BL6(Pi1+Pi2)、Tetep(Pikh+Pita)与其它已知不含Pik的14个感病水稻品种进行KASP初筛反应验证，结果如表3。6份水稻供体品种在K_110574测试位点检测结果均为碱基C，14份稻瘟病感病材料均在测试位点检测出碱基T。

表3标记K_110574初筛分型数据

材料名称	材料说明	检测结果
			Kusabue/草笛	Pik	C
关东51号	Pik	C
			Tsuyuake	Pikm	C
K60	Pikp	C
			BL6	Pi1+Pi2	C
Tetep	Pikh+Pita	C
			Asominori	感病材料	T
湘早籼13号	感病材料	T
			原丰早	感病材料	T
CO39	感病材料	T
			湘矮早7号	感病材料	T
Kasalath	感病材料	T
			密阳46	感病材料	T
明恢63	感病材料	T
			Ⅱ-23B	感病材料	T
中9B	感病材料	T
			Y58S	感病材料	T
黄华占	感病材料	T
			金23B	感病材料	T
日本晴	感病材料	T

实施例3抗稻瘟病基因Pik的SNP分子标记的应用

为检测实施例1中的分子标记的特异性和实用性，利用约190份材料对所挑选的抗性基因连锁SNP标记进行自然群体验证，证明检测的通用位点可用于PiK基因座的检测。分子标记在自然群体分型结果如图2所示，从图2中可以看出分钟标记在检测中分型成明显的3簇，左上角簇分型表示样品在检测位点含有纯合的抗病Pik等位基因型，右下角簇分型表示样品在检测位点含有纯合的不抗病pik等位基因型，对角线分簇表示样品在检测位点含有杂合抗病Pik等位基因型，说明实施例1中的分子标记可以清楚明确的检测Pik等位基因型。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 华智生物技术有限公司

<120> 一种用于检测抗稻瘟病Pik基因的SNP分子标记及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcccacaata ttcatatcag gt 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccacaatat tcatatcagg c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accttgattg taggcagctt 20

Claims

1.一种SNP分子标记，所述SNP分子标记的多态性位于MSU7.0基因组版本中水稻第11号染色体第27998933位点处碱基为T/C。

2.用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列如下所示：

特异性引物：

Primer X：5’-GCCCACAATATTCATATCAGGT-3’（SEQ ID NO.1）；

Primer Y：5’-CCCACAATATTCATATCAGGC-3’（SEQ ID NO.2）；

通用引物：

Primer C：5’-ACCTTGATTGTAGGCAGCTT-3’（SEQ ID NO.3）。

3.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述引物。

4.权利要求1所述分子标记在辅助鉴定抗稻瘟病Pik基因和/或辅助育种中的应用。

5.权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在检测抗稻瘟病Pik基因和/或辅助育种中的应用。

6.一种检测抗稻瘟病Pik基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：采用权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒对水稻样品基因组进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光接头序列；

7.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。

8.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在水稻稻瘟病的抗性改良中的应用。

9.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在培育具有抗稻瘟病能力水稻中的应用。