CN102618534A - 稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP及其方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP及其方法与应用。该分子标记Pik-FNP是由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik的等位基因序列与Pik-1及Pik-2序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik功能特异性的单碱基差异(SNP)，再通过设计，得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，对水稻DNA扩增，并经特异性酶切之后，得到Pik功能特异性分子标记Pik-FNP。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的得到应用。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pik功能性分子标记PikFNP及其方法与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定结果容易造成误差，目标基因的选择效率往往较低。随着分子标记技术的产生以及利用，其方便、直接、不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在育种方面，通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，而且还大大加快了育种步伐。
由于含有5个具有不同抗谱以及小种特异性的等位基因Pik-m、Pik、Pik-p、Pik-h以及Pik-s，位于第11染色体长臂端上的Pik位点一直是稻瘟病抗性的研究热门。其中，Pik-m(Ashikawa et al.2008.Two adjacent nucleotide-bindingsite-leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blastresistance.Genetics 180：2267-2276)、Pik(Zhai et al.2011.The isolation andcharacterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication.New Phytologist 189：321-334)以及Pik-p(Yuan et al.2011.ThePik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linkedCC-NBS-LRR genes.Theor Appl Genet 122：1017-1028)已被成功地鉴定并克隆。研究表明，这3个等位基因的稻瘟病抗性须由2个相邻的NBS-LRR类抗病基因共同介导。同时，在水稻群体中，包含这3个等位基因的基因组区域存在着基因型的分化，即当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时存在时，该基因型定义为K型；而当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时不存在时，该基因型定义为N型(基因型与感病水稻参考品种日本晴的相同)。
抗谱分析表明，Pik对来自中国的稻瘟病菌株具有高效且持久的抗性。为了加快Pik在抗病育种工作中的应用，如在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、抗性基因Pik与其他功能基因的聚合育种、转基因育种中的应用，开发出准确有效且区别于其它等位基因的Pik功能特异性分子标记显得尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP。
本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的检测方法。
本发明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种稻瘟病抗性基因Pik的功能特异性分子标记PikFNP，它由引物对SEQID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻总DNA中扩增出核苷酸序列，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pik呈特异性带型的分子标记；
所述引物对的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1(5’-3’)：TTCGAGGCCCTACCAAGACA；
SEQ ID NO.2(5’-3’)：CATGGAAGGCTATCCTTGGTA；
所述的水稻品种为Kusabue；
所述的稻瘟病抗性基因Pik包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pik-1和Pik-2；
所述的特异性酶切指的是Kpn I酶切；
所述的稻瘟病抗性基因Pik的功能特异性分子标记PikFNP的检测方法，通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik的等位基因序列与Pik-1及Pik-2序列做比对的方法，分析得到能区别于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik功能特异性的1处单碱基差异(single nucleotide polymorphism，SNP)，再通过引物设计得到SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2，对水稻DNA进行扩增得到Pik功能特异性分子标记PikFNP。
优选的，上述稻瘟病抗性基因Pik的功能特异性分子标记PikFNP的检测方法，包括以下步骤：
(1)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pik等位基因的编码区DNA序列；
(2)利用多序列比对软件工具(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)，将步骤(1)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到Pik抗性基因所特异的1处单碱基差异，其位于Pik组成基因中的Pik-1的LRR区域，最终导致功能特异性氨基酸的改变；
(3)根据步骤(2)所得到的1个SNP以及dCAPS(Derived Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequences)标记的原理，利用Primer Premier 5.0软件工具(http://www.premierbiosoft.com)设计出引物对SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2；并用这组引物分别对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证；
(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pik抗性基因的功能特异性的分子标记PikFNP。
更优选的，
步骤(1)中所述的水稻品种包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交以及Q1063。
步骤(3)中在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物SEQ ID NO.2，而在其上游100-200bp处设计功能特异性上游引物SEQ ID NO.1；
步骤(3)中所述的PCR的反应体系如下：
所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，扩增35个循环；72℃5分钟；10℃保存。
步骤(3)中所述的酶切为利用限制性内切酶Kpn I对所获得的PCR产物进行酶切，其反应体系如下：
在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为103bp，酶切后所得到的产物大小为85bp，前者(不能被酶切的)即为抗性基因Pik的功能特异性分子标记。
所述的稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的Pik功能特异性选择标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现了目标基因Pik在水稻种质资源中以及育种后代中的鉴定，且不受环境以及人为因素的影响。因此，能够得到广泛的应用，对降低劳动成本，提高育种工作效率起到积极重要的作用。
附图说明
图1是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pik的组成基因之一Pik-1与4个Pik位点等位基因及2个感病等位基因的蛋白质序列比对图；黑色星号表示由PikFNP造成的功能特异性氨基酸的改变。
图2是水稻稻瘟病抗性基因Pik的另一组成基因Pik-2与4个Pik位点等位基因及2个感病等位基因的蛋白质序列比对图。
图3是Pik功能特异性分子标记PikFNP在12个水稻品种中的验证。其中，
泳道1：抗性基因供体品种Kusabue(Pik)；泳道2：IRBLk-Ka(Pik单基因系)；泳道3：抗性品种Kando 51(Pik)；泳道4：抗性品种Kuyuku 131(Pik)；泳道5：抗性基因供体品种Tsuyuake(Pik-m)；泳道6：IRBLKm-TS(Pik-m单基因系)；泳道7：抗性品种GA20(Pik-m)；泳道8：抗性基因供体品种K60(Pik-p)；泳道9：IRBLkp-K60(Pik-p单基因系)；泳道10：抗性品种Taifenzhan(Pik-p)；泳道11：IRBLks-S(Pik-s单基因系)；泳道12：IRBLKh-K3(Pik-h单基因系)；泳道M：DNAladder。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：Pik等位基因编码区序列的比对及SNP的鉴定
通过常规的PCR扩增(Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaportheoryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NB S-LRR genes.Theor ApplGenet 122：1017-1028；Zhai et al.2011.The isolation and characterization of Pik，arice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist189：321-334)、测序(上海英骏生物技术有限公司，广州分公司)，从5个抗病水稻品种Shin 2(Pik-s供体品种；Kiyosawa.1987.With genetic view on the mechanismof resistance and virulence.Japanese Journal of Genetics 41：89-92)、Tsuyuake(Pik-m供体品种；Ashikawa et al.2008.Two adjacent nucleotide-binding site-leucine richrepeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance.Genetics180：2267-2276)、Kusabue(Pik供体品种；Zhai et al.2011.The isolation andcharacterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication.New Phytologist 189：321-334)、K3(Pik-h供体品种；Xu et al.2008.Efficient authentic fine mapping of the rice blast resistance gene Pik-h in the Pikcluster，using new Pik-h-differentiating isolates.Molecular Breeding 22：289-299)、K60(Pik-p供体品种；Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzaein rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes.Theor Appl Genet122：1017-1028)及2个感病水稻品种黑交(K型感病品种；Zhai et al.2011.Theisolation and characterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged afterrice domestication.New Phytologist 189：321-334)、Q1063(K型感病品种；Zhai etal.2011.The isolation and characterization of Pik，a rice blast resistance gene whichemerged after rice domestication.New Phytologist 189：321-334)中获得相应的Pik等位基因编码区DNA序列[Pik-p(HM035369)，Pik(HM048900)，Pik-m(AB462256)，已经公开于http://www.ncbi.nlm.nih.gov]；利用多序列比对软件工具(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)，通过对这些序列翻译后的蛋白质序列进行比对分析，鉴定到存在于Pik-1基因cDNA第2944位点的功能特异性SNP。在第2944位点处，Pik-1编码的第985位氨基酸为亮氨酸(L)，而其它等位基因在该位点则编码缬氨酸(V)，因此，该位点可以将Pik与其它等位基因区分开(图1)。
图2是水稻稻瘟病抗性基因Pik的另一组成基因Pik-2与4个Pik位点等位基因及2个感病等位基因的蛋白质序列比对图。在此，不存在Pik功能特异性的SNP。
实施例2：Pik功能特异性分子标记及其引物设计与检测
再根据dCAPS标记的原理(Neff et al.，2002.Web-based primer design for thesingle nucleotide polymorphism analysis.Trends in Genetics 18：613-615)，在上述SNP位点上游100-200bp处设计功能特异性上游引物Pik-FNP-F，如SEQ IDNO.1所示；在上述SNP位点处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物Pik-FNP-R，如SEQ ID NO.2所示。利用这该组引物对携带有Pik基因以及其他等位基因的品种DNA模板进行扩增。
Pik-FNP的PCR扩增反应体系如下：
Pik-FNP的PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。
PCR反应结束后，利用限制性内切酶Kpn I对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下：
在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为103bp，酶切后所得到的产物大小为85bp，前者(不能被酶切的)即为抗性基因Pik的功能特异性分子标记。
实施例3：抗性基因Pik功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的应用
提取含有不同的稻瘟病抗性基因的12个水稻品种[分别为：Kusabue、Kando51、Kuyuku 131、GA20、Taifenzhan(Zhai et al.2011.The isolation andcharacterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication.New Phytologist 189：321-334)、Tsuyuake(Ashikawa et al.2008.Two adjacent nucleotide-binding site-leucine rich repeat class genes are required toconfer Pikm-specific rice blast resistance.Genetics 180：2267-2276)、K60(Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair ofclosely linked CC-NBS-LRR genes.Theor Appl Genet 122：1017-1028)、IRBLk-Ka、IRBLKm-TS、IRBLkp-K60、IRBLks-S、及IRBLKh-K3(Kobayashi et al.2007.Developmentof new sets of international standard differential varieties forblastresistance in rice(Oryza sativa L.).JARQ 41：31-37]的基因组DNA，并以此为模板，利用实施例2中描述的Pik-FNP的PCR扩增反应体系和反应条件，对抗性基因Pik功能特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测。电泳结果分别如图3所示。
如附图说明的那样，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pik功能特异性分子标记可在鉴别Pik基因与其他稻瘟病抗性基因得到应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种稻瘟病抗性基因Pik的功能特异性分子标记PikFNP，其特征在于：是由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻总DNA中扩增出的核苷酸序列，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pik呈特异性带型的分子标记；
所述的引物对的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1：5’-TTCGAGGCCCTACCAAGACA-3’；
SEQ ID NO.2：5’-CATGGAAGGCTATCCTTGGTA-3’。
2.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pik的功能特异性分子标记PikFNP，其特征在于：所述的水稻为水稻品种Kusabue。
3.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pik的功能特异性分子标记PikFNP，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pik包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pik-1和Pik-2。
4.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pik的功能特异性分子标记PikFNP，其特征在于：所述的特异性酶切为Kpn I酶切。
5.权利要求1～4任一项所述的稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的检测方法，其特征在于：通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik的等位基因序列与Pik-1及Pik-2序列做比对的方法，分析得到能区别于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik功能特异性的1处单碱基差异，再通过引物设计得到SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2，对水稻DNA进行扩增得到Pik功能特异性分子标记PikFNP。
6.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pik等位基因的编码区DNA序列；
(2)利用多序列比对软件工具(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)，将步骤(1)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到Pik抗性基因所特异的1处单碱基差异，其位于Pik组成基因中的Pik-1的LRR区域，最终导致功能特异性氨基酸的改变；
(3)根据步骤(2)所得到的1个单碱基差异以及dCAPS标记的原理，利用Primer Premier 5.0软件工具设计出引物对SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2；并用这组引物分别对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证；
(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pik抗性基因的功能特异性的分子标记PikFNP。
7.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的水稻品种包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交以及Q1063。
8.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR的反应体系如下：10×PCRBuffer 2μl、2.5mM dNTP 1.6μl、10μM引物SEQ ID NO.1 0.5μl、10μM引物SEQ ID NO.2 0.5μl、5U/μl rTaq酶0.1μl、50ng/μl DNA模板1μl、双蒸水补至20μl；
所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，扩增35个循环；72℃5分钟；10℃保存。
9.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的检测方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的酶切为利用限制性内切酶Kpn I所获得的PCR产物进行酶切，其反应体系如下：10×酶切缓冲液1.2μl、PCR扩增产物5μl、Kpn I酶0.25μl，双蒸水补至12μl。
10.权利要求1～4任一项所述的稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP的应用，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pik功能特异性分子标记PikFNP应用于在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种。
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