CN103333886B - 一种利用dna熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记 - Google Patents

Abstract

本发明为一种利用DNA熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记开发，属生物技术领域。本发明针对传统的水稻<i>Pik</i>基因测序的检测方法，提出一种利用DNA熔解温度分析水稻<i>Pik</i>基因的功能标记。本发明根据水稻等位基因<i>Pik</i>与<i>pik</i>在编码区第2173碱基的C/T变异（Pita为T，pita为C），设计功能标记Pik-C/T。利用该标记进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以基因组DNA为模板，利用Pik-C/T-out引物扩增；第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用Pik-C/T-in引物扩增。利用仪器检测第二轮PCR扩增产物DNA熔解温度，通过熔解温度高低区分<i>Pik</i>和<i>pik</i>序列差异，从而判别水稻材料的稻瘟病抗性。

Description

一种利用DNA熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用DNA熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记开发。

背景技术

水稻是我国重要的农作物，其产量的稳定性直接关系到国计民生。稻瘟病是水稻的毁灭性病害，对水稻的产量造成重大影响，高抗稻瘟病一直是水稻新品种培育的关键目标。提高稻瘟病抗性最有效的方法是培育携带抗病基因的品种，这就需要对抗病基因的准确高效鉴定。传统的稻瘟病抗性检测，是通过人工剪叶然后接种稻瘟病菌的方式鉴定，该方法检测结果稳定性较差、周期较长、技术条件要求高，无法满足在育种低世代大群体的鉴定要求。最有效的抗性鉴定方法，应是直接对稻瘟病抗性基因进行选择。

研究表明，稻瘟病抗性基因Pik位于11染色体长臂，对许多中国稻瘟病小种有较强的、稳定的抗性。Pik基因座位两个连续的NBS-LRR类基因（Pik-1和Pik-2）组成，两个基因对Pik介导的稻瘟病抗性均必不可少。Pik座位上已定位或克隆的抗性复等位基因包括Pik(供体Kusabue)、Pikh(供体Tetep)、Pik-H4(供体H4)、Pikp(供体K60)、Pikm(供体Tsuyuake)、Piks(供体Norin)、Pi1(供体LAC23)等。尽管Pik座位的不同抗性复等位基因之间的抗谱有所差别，但抗性都较好。Pik对应日本晴（含稻瘟病感病基因pik）基因组的两个基因分别为LOC_Os11g46200（pikm5-NP）和LOC_Os11g46210（pikm6-NP），其中Pik-2在不同等位基因之间相对较保守。以已克隆的多个抗性复等位基因的Pik-2和LOC_Os11g46210进行多重序列比对，发现在抗性复等位基因与日本晴pik在第2173位碱基处存在SNP变异，其中抗性基因为T，而感病基因为C。针对该位点，目前并未报道合适的分子标记，只能利用基因测序的手段分析基因型。基因测序技术环节复杂、成本高，很显然并不适合大规模育种群体的筛选。

成本低、简便实用、重复性好的共显性标记，是有效开展分子辅助选择育种的重要基础。DNA序列的差异会导致DNA熔解温度的不同，如Pik和pik两种等位基因在第2173位的T/C变异，将导致该DNA区段Pik比pik的熔解温度低1℃。如果能利用DNA熔解温度检测基因型，将可避免基因测序的缺陷，实现对大规模育种群体的基因型检测。利用DNA熔解温度判别基因型在人类疾病的研究中已有报道，但是，该技术涉及环节较多、需详尽的前期优化工作，目前在水稻上系统开展此技术研究的报道较少，这在一定程度上限制了其在水稻育种中的广泛应用。

发明内容

为了解决背景技术的技术问题，本发明提供一种稻瘟病抗性基因功能标记Pik-C/T，所述的Pik-C/T由两对引物Pik-C/T-out、Pik-C/T-in构成，引物序列如下：

Pik-C/T-out：正向引物序列（5’-3’）为SEQIDNO:1CAATGCCAGCACTCGAAATCAT；反向引物序列（5’-3’）为SEQIDNO:2CAGTGACGATGCCATCAACAAA，

Pik-C/T-in：正向引物序列（5’-3’）为SEQIDNO:3TGAAAATCTCCGTGAGGTGCAT；反向引物序列（5’-3’）为SEQIDNO:4TTGGTTATTGCTTCTGCCCCAT。

根据需求提供该区别稻瘟病抗性基因功能标记Pik-C/T的应用，所述的应用为区分稻瘟病抗性基因与稻瘟病感病基因。

并根据实际的需要，提供一种区分稻瘟病抗性基因Pik与稻瘟病感病基因pik的方法，包括以下步骤：

S1.以待测基因组DNA为模版，利用根据权利要求1所述的Pik-C/T-out扩增；

S2.将步骤S1扩增所得的基因组稀释，并以之为模版，利用根据权利要求1所述的Pik-C/T-in扩增；

S3.利用仪器检测步骤S2扩增所获的DNA的熔解温度，如果待测DNA的熔解温度在78.5~79.1℃之间，待测水稻为抗稻瘟病水稻，如果待测DNA的熔解温度在79.5~80.1℃之间，待测水稻为感稻瘟病水稻。

本发明通过研究发现稻瘟病抗性基因Pik的熔解温度为78.8，正常的等位基因pik的熔解温度为79.8，稻瘟病抗性基因Pik的熔解温度比正常的等位基因pik的熔解温度低了1℃，所以，通过熔解温度就可以区分Pik和pik序列差异，从而判别水稻材料的基因型（抗病或感病）。如果待测水稻的DNA的熔解温度在78.5~79.1℃之间，可判断待测水稻为抗稻瘟病水稻，如果待测DNA的熔解温度在79.5~80.1℃之间，可判断待测水稻为感稻瘟病水稻。

不同品种的抗稻瘟病水稻的Pik基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是含有Pik基因的水稻品种，通过Pik-C/T标记扩增的DNA序列的熔解温度都会在78.8左右范围，这个范围前后不会超过0.3℃。

步骤S2所述的稀释为稀释15-25倍。

步骤S3所述的仪器为LightScanner96分析系统。

步骤S3所述的溶解温度曲线为60℃-95℃的熔解曲线。

步骤S3所述的对比，溶解温度曲线为75℃-82℃的熔解曲线。

本发明的优点如下：

1.提供的检测方法简单，比原来的通过基因测序或凝胶电泳的方法来确定基因型更加的简便，快捷。

2.本发明提供的功能标记的结构简短，易于合成。

3.本发明所提供的方法，检测准确率高，可用于大规模的筛选目标基因。

附图说明

图1为功能标记Pik-C/T的引物所在基因组位置及扩增片段。Pik和pik基因的变异位点分别以星号（*）标识。

图2为利用Pik-C/T鉴定Pik、pik及其杂合型的DNA扩增片段熔解温度。

具体实施方式

实施例1：一种利用DNA熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记开发。

1.水稻品种H4、日本晴基因组DNA的提取。

具体方法：1）取少量水稻插秧后一月幼叶置于液氮冷冻的2.0mL灭菌离心管中搅拌至粉末状，加1000μL2×CTAB-DNA提取液（质量分数W/V2%的CTAB，pH8.0；质量分数W/V1%的PVP；100mmol/LTris-HCl，pH8.0；1.4mol/LNaCl；20mmol/LEDTA，pH8.0；体积分数V/V0.2%的巯基乙醇）；2）置于65℃恒温水浴锅中每隔10min摇动一次，30~45min后取出；3）冷却2min后加1000μL氯仿-异戊醇（体积比24：1），上下剧烈充分摇动，使两者混合均匀；4）10000rpm离心10min，轻取上清至1.5ml灭菌新离心管中，加入600μL预冷异丙醇上下轻摇均匀；5）-20℃放置30min使DNA沉淀；6）10000rpm离心6min，立即倒掉上清倒立离心管于纸巾上；7）1min后直立离心管，加入800μL70%乙醇和3MNaAc(体积比9：1)，轻摇使DNA悬浮放置30min；8）10000rpm离心6min，立即倒掉上清加入800μL70%乙醇将DNA再次漂洗30min；9）10000rpm离心3min，通风橱内烘干；10）加入100-200μL1×TBBuffer(10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0)溶解，4℃保存备用。

2.水稻品种H4、日本晴稻瘟病鉴定方法。

具体方法：1）将水稻品系干种子催芽后，按顺序穴播于秧盘中（30×20×8cm3），每盘播28穴，每个品系播一次（8~10粒种子/穴）。稻苗采取旱育栽培，长至一叶一心期采用硫酸铵进行施肥，每盘施0.5g，接菌前共施肥3次，待苗长至3.5~4片叶时，分别采用GD00193和T13两个菌分别接种。2）采用广东省农科院植物保护研究所的方法进行稻瘟病菌的单孢分离和孢子培养。用无菌蒸馏水洗下孢子悬浮液，接菌液浓度为5×104个每毫升。采用高压喷雾接菌法。每个育秧盘内接30~40ml孢子悬浮液。接菌后于25℃暗室中保湿培育24h，然后移至遮蔽阴网室，环境温度保持在22~30℃，定期喷雾保湿，使相对湿度保持在90%以上，促进发病。接菌后7天进行病情鉴定。病级划分按全国统一的0~9级标准进行，将病级0~3级定为抗病，4~9级定为感病。

3.稻瘟病抗性基因功能标记Pik-C/T开发及扩增。

1）比较H4、日本晴Pita基因两者在编码区第2173碱基的C/T变异，设计涵盖差异位点的功能标记Pik-C/T（图1）。相比日本晴该区段，H4在该位点为T，导致该区段DNA熔解温度比日本晴低1℃。所述的Pik-C/T由两对引物Pik-C/T-out、Pik-C/T-in构成，引物序列如下：

Pik-C/T-out：正向引物序列（5’-3’）为SEQIDNO:1CAATGCCAGCACTCGAAATCAT；反向引物序列（5’-3’）为SEQIDNO:2CAGTGACGATGCCATCAACAAA。

Pik-C/T-in：正向引物序列（5’-3’）为SEQIDNO:3TGAAAATCTCCGTGAGGTGCAT；反向引物序列（5’-3’）为SEQIDNO:4TTGGTTATTGCTTCTGCCCCAT。

2）利用功能标记Pik-C/T进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以基因组DNA为模板，利用Pik-C/T-out引物扩增；第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用Pik-C/T-in引物扩增。

第一轮PCR：反应体系依次加入2×PowerTaqPCRMasterMix母液（百泰克，北京）5μL、外部引物F/R（10μmol/L）各0.3μL以及0.5μL基因组DNA，最后以双蒸水补足10μL。在GeneAmp9700型PCR仪(AppliedBiosystems,USA)上进行PCR扩增，扩增程序为95℃,5min;25×(95℃,20s;57℃,20s;72℃,10s);72℃,5min。反应完成后，向PCR管加入200μL双蒸水，以稀释第一轮PCR产物（约20倍）。

第二轮PCR：反应体系依次加入2×PowerTaqPCRMasterMix母液（百泰克，北京）4μL、外部引物F/R（10μmol/L）各0.3μL、0.5μL20×EvaGreen染料(Biotium,USA)、以及0.5μL稀释过的第一轮PCR产物，最后以双蒸水补足10μL。PCR扩增程序为95℃,2min;25×(95℃,20s;59℃,20s;72℃,10s);72℃,5min;95℃,2min；25℃,2min。

4.功能标记Pik-C/T扩增产物DNA熔解温度检测方法。

第二轮扩增产物分别全部转移至带裙边、白底不透明的96孔板，加入20μL矿物油(SIGMA，USA)，离心(1000rpm，1min)以消除气泡。将待测的检测板放入LightScanner96(IdahoTechnology，USA)分析系统，读取60℃-95℃的熔解曲线。所采集的原始数据用LightScannerCallIT软件(IdahoTechnology，USA)进行分析，选用SmallAmplicon模式进行自动化分析。

5.功能标记Pik-C/T扩增产物DNA的测序方法。

PCR产物纯化、序列测定和序列拼接以及重组子的测序均由深圳华大基因生物技术有限公司完成。利用正反向引物进行双向测序，然后根据双向测序结果，拼接出完整序列，序列拼接采用DNAstar软件的SeqMan模块。

实施例2：利用Pik-C/T检测水稻Pik基因型。

1.供试材料。

本实验所研究材料为籼稻品种H4、粳稻品种日本晴。

2.供试材料稻瘟病抗性鉴定。

稻瘟病抗性鉴定方法同实施例1所述。

结果表明，H4为高抗稻瘟病品种，日本晴为高感稻瘟病品种。

3.2份供试材料DNA提取，PCR扩增分析。

DNA提取和PCR扩增方法同实施例1所述。

4.功能标记Pik-C/T扩增产物DNA熔解温度检测方法。

熔解温度检测方法同实施例1所述。

结果表明，H4扩增产物DNA熔解温度较日本晴低1℃（图2），说明H4含有Pik，而日本晴为pik；表明所利用的功能标记可以区分抗稻瘟病与感稻瘟病的水稻品种，准确率达100%。

5.功能标记Pik-C/T扩增产物DNA的测序方法。

鉴定方法同实施例1所述。

结果表明，Pik-C/T扩增片段内抗病品种H4和日本晴只存在1个SNP的差异，其中H4为T，而日本晴为C（图2）。可见，功能标记Pik-C/T的分型结果与及引进测序结果是完全一致的，两种标记都能够准确区分Pik、pik。上述结果说明熔解温度检测与测序结果一致，可代替测序检测Pik基因型，提高检测效率。

〈110〉华南农业大学

〈120〉一种利用DNA熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记

〈160〉4

〈210〉1

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Pik-C/T-out：正向引物序列（5’-3’）

〈400〉1

CAATGCCAGCACTCGAAATCAT22

〈210〉2

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Pik-C/T-out：反向引物序列（5’-3’）

〈400〉2

CAGTGACGATGCCATCAACAAA22

〈210〉3

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Pik-C/T-in：正向引物序列（5’-3’）

〈400〉3

TGAAAATCTCCGTGAGGTGCAT22

〈210〉4

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Pik-C/T-in：反向引物序列（5’-3’）

〈400〉4

TTGGTTATTGCTTCTGCCCCAT22

Claims (3)

1.一种区分稻瘟病抗性基因Pik与稻瘟病感病基因pik的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.以待测基因组DNA为模版，利用Pik-C/T-out扩增；

S2.将步骤S1扩增所得的基因组稀释，并以之为模版，利用Pik-C/T-in扩增；

S3.利用仪器检测步骤S2扩增所获的DNA的熔解温度，如果待测DNA的熔解温度在78.5~79.1℃之间，待测水稻为抗稻瘟病水稻，如果待测DNA的熔解温度在79.5~80.1℃之间，待测水稻为感稻瘟病水稻，

所述的Pik-C/T由两对引物Pik-C/T-out、Pik-C/T-in构成，引物序列如下：

Pik-C/T-out：正向引物序列5’-3’为SEQIDNO:1；反向引物序列5’-3’为SEQIDNO:2，

Pik-C/T-in：正向引物序列5’-3’为SEQIDNO:3；反向引物序列5’-3’为SEQIDNO:4；步骤S2所述的稀释为稀释15-25倍；步骤S3所述的熔解温度曲线为60℃-95℃的熔解曲线。

2.根据权利要求1所述的区分稻瘟病抗性基因Pik与稻瘟病感病基因pik的方法，其特征在于，步骤S3所述的仪器为LightScanner96分析系统。

3.根据权利要求1所述的区分稻瘟病抗性基因Pik与稻瘟病感病基因pik的方法，其特征在于，步骤S3所述的熔解温度曲线为75℃-82℃的熔解曲线。