CN103333887B - 一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记 - Google Patents

Abstract

本发明为一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记开发，属生物技术领域。本发明针对传统的水稻Pita基因凝胶电泳的检测方法，提出一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记。本发明根据水稻等位基因Pita与pita在编码区第918氨基酸的G/T变异（Pita为G，pita为T），设计功能标记Pita-G/T。利用该标记进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以基因组DNA为模板，利用Pita-G/T-out引物扩增；第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用Pita-G/T-in引物扩增。利用仪器检测第二轮PCR扩增产物DNA熔解温度，通过熔解温度高低区分Pita和pita序列差异，从而判别水稻材料的稻瘟病抗性。

Description

一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记开发。

背景技术

水稻是我国重要的农作物，其产量的稳定性直接关系到国计民生。稻瘟病是水稻的毁灭性病害，对水稻的产量造成重大影响，高抗稻瘟病一直是水稻新品种培育的关键目标。提高稻瘟病抗性最有效的方法是培育携带抗病基因的品种，这就需要对抗病基因的准确高效鉴定。传统的稻瘟病抗性检测，是通过人工剪叶然后接种稻瘟病菌的方式鉴定，该方法检测结果稳定性较差、周期较长、技术条件要求高，无法满足在育种低世代大群体的鉴定要求。最有效的抗性鉴定方法，应是直接对稻瘟病抗性基因进行选择。

    研究表明，Pita基因与水稻稻瘟病抗性相关。Pita基因位于水稻第12染色体靠近着丝点附近的区域，定位于BAC克隆BAC142E8上。Pita基因包含2个外显子和1个1463bp 的内含子，编码一个长度为928 个氨基酸的细胞质膜受体蛋白，该蛋白含NBS结构域和富亮氨酸结构域(LRD)，Pita位点上的抗感两基因的编码产物仅有一个氨基酸的差异，即第918氨基酸由抗病产物的丙氨酸变异为感病产物的丝氨酸，其抗病机制是Pita基因的编码产物能与稻瘟病菌的无毒基因AVR-Pita表达产物相互作用引发抗病反应。根据Pita基因第918氨基酸的G/T变异，王忠华等设计了半显性标记YL155/YL87、YL183/YL87区分抗病基因Pita和感病基因pita，抗病基因利用YL155/YL87可扩增出1.2kb的片段，而YL183/YL87无法扩增出片段。但是，由于这一功能标记需两次聚丙烯酰胺凝胶电泳后方能判别基因型，成本较高、操作较繁杂，使其难以得到普遍应用。

    成本低、简便实用、重复性好的共显性标记，是有效开展分子辅助选择育种的重要基础。DNA序列的差异会导致DNA熔解温度的不同，如Pita和pita两种等位基因在第918氨基酸的G/T变异，将导致该DNA区段Pita比pita的熔解温度高1℃。如果能利用DNA熔解温度检测基因型，将可避免凝胶电泳的缺陷，实现批量化、自动化、全封闭的基因型检测。利用DNA熔解温度判别基因型在人类疾病的研究中已有报道，但是，该技术涉及环节较多、需详尽的前期优化工作，目前在水稻上系统开展此技术研究的报道较少，这在一定程度上限制了其在水稻育种中的广泛应用。

发明内容

为了解决背景技术的技术问题，本发明提供一种稻瘟病抗性基因功能标记Pita-G/T，所述的Pita-G/T由两对引物Pita-G/T-out、Pita-G/T-in构成，引物序列如下：

    Pita-G/T-out：正向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:1 CCCAGGTTACAACTTACAAGGA；反向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:2 CTCTG AAGAC GTGAA GAGGA TT，

Pita-G/T-in：正向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:3 CTTCT TTCTT TCTCT GCCGT GG；反向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:4 TCATC AAGTC AGGTT GAAGA TGC。

    根据需求提供该区别稻瘟病抗性基因功能标记Pita-G/T的应用，所述的应用为区分稻瘟病抗性基因与稻瘟病感病基因。

    并根据实际的需要，提供一种区分稻瘟病抗性基因Pita与稻瘟病感病基因pita的方法，包括以下步骤：

S1. 以待测基因组DNA为模版，利用根据权利要求1所述的Pita-G/T-out扩增；

S2. 将步骤S1扩增所得的基因组稀释，并以之为模版，利用根据权利要求1所述的Pita-G/T-in扩增；

S3. 利用仪器检测步骤S2扩增所获的DNA的熔解温度，如果待测DNA的熔解温度在78.8~79.3℃之间，待测水稻为抗稻瘟病水稻，如果待测DNA的熔解温度在77.8~78.3℃之间，待测水稻为感稻瘟病水稻。

本发明通过研究发现稻瘟病抗性基因Pita的熔解温度为79.1，稻瘟病感病基因pita的熔解温度为78.1，稻瘟病抗性基因Pita的熔解温度比等位基因pita的熔解温度高了1℃，所以，通过熔解温度就可以区分Pita和pita序列差异，从而判别水稻材料的基因型（抗病或感病）。如果待测水稻的DNA的熔解温度在78.8~79.3℃之间，可判断待测水稻为抗稻瘟病水稻；如果待测DNA的熔解温度在77.8~78.3℃之间，可判断待测水稻为感稻瘟病水稻。

不同品种的抗稻瘟病水稻的Pita基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是含有Pita基因的抗稻瘟病水稻，无论是什么品种，通过Pita-G/T标记扩增的DNA序列的熔解温度都会在79.1℃左右范围，这个范围前后不会超过0.2℃。

    步骤S2所述的稀释为稀释15-25倍。

    步骤S3所述的仪器为LightScanner 96 分析系统。

    步骤S3所述的熔解温度曲线为60℃-95℃的熔解曲线。

步骤S3所述的对比，熔解温度曲线为76℃-81℃的熔解曲线。

本发明的优点如下：

1. 提供的检测方法简单，比原来的通过基因测序或凝胶电泳的方法来确定基因型更加的简便，快捷。

2. 本发明提供的功能标记通过两轮PCR扩增目的产物，可显著提高目的产物的特异性，提高后代判读准确率。

3. 本发明所提供的方法，检测准确率高，可用于大规模的筛选目标基因。

附图说明

图1为利用Pita-G/T鉴定Pita、pita及其杂合型的DNA片段熔解温度。

图2为利用Y155/Y87和Y83/Y87鉴定Pita、pita基因型。

图2中： M DNA ladder；2、4 Pita（抗病品种H4）；1、3、5、6 pita（感病品种日本晴）。

具体实施方式

    以下为本发明的具体实施方式。

实施例1：一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记开发。

    1.水稻品种H4、日本晴基因组DNA的提取。

    具体方法：1）取少量水稻插秧后一月幼叶置于液氮冷冻的2.0 mL灭菌离心管中搅拌至粉末状，加1000μL2×CTAB-DNA提取液（质量分数W/V 2%的CTAB，pH8.0；质量分数W/V 1%的PVP；100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1.4 mol/L NaCl；20 mmol/L EDTA，pH8.0；体积分数V/V 0.2% 的巯基乙醇）；2）置于65 ℃恒温水浴锅中每隔10 min摇动一次，30~45 min后取出；3）冷却2 min后加1000 μL氯仿-异戊醇（体积比24：1），上下剧烈充分摇动，使两者混合均匀；4）10000 rpm离心10 min，轻取上清至1.5 ml 灭菌新离心管中，加入600 μL预冷异丙醇上下轻摇均匀；5）-20℃放置30 min使DNA沉淀；6）10000 rpm离心6 min，立即倒掉上清倒立离心管于纸巾上；7）1 min后直立离心管，加入800 μL 70%乙醇和3 M NaAc(体积比9：1)，轻摇使DNA悬浮放置30 min；8）10000 rpm离心6 min，立即倒掉上清加入800 μL 70%乙醇将DNA再次漂洗30 min；9）10000 rpm离心3 min，通风橱内烘干；10）加入100-200 μL1×TB Buffer(10 mM Tris-HCl，pH8.0；1 mM EDTA，pH8.0)溶解，4 ℃保存备用。

    2. 水稻品种H4、日本晴稻瘟病鉴定方法。

    具体方法：1）将水稻品系干种子催芽后，按顺序穴播于秧盘中（30×20×8 cm3），每盘播28穴，每个品系播一次（8~10粒种子/穴）。稻苗采取旱育栽培，长至一叶一心期采用硫酸铵进行施肥，每盘施0.5 g，接菌前共施肥3次，待苗长至3.5~4片叶时，分别采用GD00193和T13两个菌分别接种。2）采用广东省农科院植物保护研究所的方法进行稻瘟病菌的单孢分离和孢子培养。用无菌蒸馏水洗下孢子悬浮液，接菌液浓度为5×104个每毫升。采用高压喷雾接菌法。每个育秧盘内接30~40 ml孢子悬浮液。接菌后于25℃暗室中保湿培育24 h，然后移至遮蔽阴网室，环境温度保持在22~30℃，定期喷雾保湿，使相对湿度保持在90%以上，促进发病。接菌后7天进行病情鉴定。病级划分按全国统一的0~9级标准进行，将病级0~3级定为抗病，4~9级定为感病。

    3. 水稻品种H4、日本晴Pita基因标记Pita-G/T开发及扩增。

    1）比较H4、日本晴Pita基因两者在编码区第918氨基酸的G/T变异，设计涵盖差异位点的功能标记Pita-G/T（图1）。相比日本晴该区段，H4在该位点为G，导致该区段DNA熔解温度比日本晴高1℃。所述的Pita-G/T由两对引物Pita-G/T-out、Pita-G/T-in构成，引物序列如下：

    Pita-G/T-out：正向引物序列（5’-3’）CCCAGGTTACAACTTACAAGGA；反向引物序列（5’-3’）CTCTGAAGACGTGAAGAGGATT。

    Pita-G/T-in：正向引物序列（5’-3’）CTTCTTTCTTTCTCTGCCGTGG；反向引物序列（5’-3’）TCATCAAGTCAGGTTGAAGATGC。

    2）利用功能标记Pita-G/T进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以基因组DNA为模板，利用Pita-G/T-out引物扩增；第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用Pita-G/T-in引物扩增。

    第一轮PCR：反应体系依次加入2×Power Taq PCR MasterMix母液（百泰克，北京）5 μL、外部引物F/R（10 μmol/L）各0.3 μL以及0.5 μL基因组DNA，最后以双蒸水补足10 μL。在GeneAmp 9700型PCR仪(Applied Biosystems, USA)上进行PCR扩增，扩增程序为95℃, 5min; 25× (95℃, 20s; 57℃, 20s; 72℃, 10s); 72℃, 5min。反应完成后，向PCR管加入200 μL双蒸水，以稀释第一轮PCR产物（约20倍）。

    第二轮PCR：反应体系依次加入2×Power Taq PCR MasterMix母液（百泰克，北京）4 μL、外部引物F/R（10 μmol/L）各0.3 μL、0.5 μL 20×EvaGreen染料(Biotium, USA)、以及0.5 μL稀释过的第一轮PCR产物，最后以双蒸水补足10 μL。PCR扩增程序为95℃, 2min; 25× (95℃, 20s; 59℃, 20s; 72℃, 10s); 72℃, 5min; 95℃, 2min；25℃, 2min。

    4.功能标记Pita-G/T扩增产物DNA熔解温度检测方法。

    第二轮扩增产物分别全部转移至带裙边、白底不透明的96孔板，加入20 μL矿物油(SIGMA，USA)，离心(1000 rpm，1 min)以消除气泡。将待测的检测板放入LightScanner 96 (Idaho Technology，USA)分析系统，读取60℃-95℃的熔解曲线。所采集的原始数据用LightScanner Call IT软件(Idaho Technology，USA)进行分析，选用Small Amplicon模式进行自动化分析。

    5.利用半显性标记Y155/Y87、Y83/Y87区分抗病基因Pita和感病基因pita。

   具体方法：1）利用Y155/Y87（5’-3’AGCAGGTTATAAGCTAGGCC /5’-3’CTACCAACAAGTTCATCAAA）、Y83/Y87（5’-3’AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT/5’-3’CTACCAACAAGTTCATCAAA）扩增H4、日本晴基因组DNA；2）将扩增产物从冰箱取出，每个产物加3.4 μl上样缓冲液（0.25 %溴酚蓝，0.25 %二甲苯青FF，1:1混合），离心机离心使上样缓冲液与扩增产物混匀；取上样针吸取2 μl混合液，在8 %的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以1.0×TBE为电泳缓冲液，110 V电压下电泳2~4 h；电泳结束后，取出凝胶在ddH2O中漂洗2次，每次1 min，转入0.1 % AgNO3溶液中轻摇染色10 min，然后用ddH2O漂洗2次，每次1 min，倒入显影液中（3.27 g NaOH，0.05 g四硼酸钠，1 ml甲醛，加ddH2O至250 ml）显色至适中后倒掉显影液，加ddH2O保持，在凝胶成像系统的白光灯下观察拍照。

实施例2：利用Pita-G/T检测水稻Pita基因型。

    1.供试材料。

    本实验所研究材料为籼稻品种H4、粳稻品种日本晴。

    2.2份供试材料稻瘟病抗性鉴定。

    稻瘟病抗性鉴定方法同实施例1所述。

    结果表明，H4为高抗稻瘟病品种，日本晴为高感稻瘟病品种。

    3.2份供试材料DNA提取，PCR扩增分析。

    DNA提取和PCR扩增方法同实施例1所述。

    4.功能标记Pita-G/T扩增产物DNA熔解温度检测方法。

    熔解温度检测方法同实施例1所述。

    结果表明，H4扩增产物DNA熔解温度较日本晴高1℃（图1），说明H4含有Pita，而日本晴为pita；表明所利用的功能标记可以区分抗稻瘟病与感稻瘟病的水稻品种，准确率达100%。

    5.利用半显性标记Y155/Y87、Y83/Y87区分抗病基因Pita和感病基因pita。

    鉴定方法同实施例1所述。

    结果表明，抗病品种H4利用Y155/Y87可扩增出1.2kb的片段，Y83/Y87无法扩增出片段；感病品种日本晴利用Y155/Y87无法扩增出片段，而Y83/Y87可扩增出1.2kb的片段（图2）。可见，功能标记Pita-G/T的分型结果与半显性标记Y155/Y87、Y83/Y87标记的检测结果是完全一致的，两种标记都能够准确区分Pita、pita及其杂合型。上述结果说明熔解温度检测与常规凝胶电泳结果一致，可代替凝胶电泳检测Pita基因型，提高检测效率。

〈110〉华南农业大学

〈120〉一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记

 

〈160〉4

 

〈210〉1

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Pita-G/T-out：正向引物序列（5’-3’）

〈400〉1

 CCCAG GTTAC AACTT ACAAG GA               22

 

〈210〉2

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Pita-G/T-out：反向引物序列（5’-3’）

〈400〉2

  CTCTG AAGAC GTGAA GAGGA TT               22

 

〈210〉3

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Pita-G/T-in：正向引物序列（5’-3’）

〈400〉3

CTTCT TTCTT TCTCT GCCGT GG               22

 

〈210〉4

〈211〉23

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉Pita-G/T-in：反向引物序列（5’-3’）

〈400〉4

TCATC AAGTC AGGTT GAAGA TGC     23

 

Claims (2)

1.一种区分稻瘟病抗性基因Pita与稻瘟病感病基因pita的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 以待测基因组DNA为模版，利用Pita-G/T-out扩增；

S2. 将步骤S1扩增所得的基因组稀释，并以之为模版，利用Pita-G/T-in扩增；

S3. 利用仪器检测步骤S2扩增所获的DNA的熔解温度，如果待测DNA的熔解温度在78.8~79.3℃之间，待测水稻为抗稻瘟病水稻，如果待测DNA的熔解温度在77.8~78.3℃之间，待测水稻为感稻瘟病水稻；

  其中， Pita-G/T-out：正向引物序列为SEQ ID NO:1；反向引物序列为SEQ ID NO:2，

Pita-G/T-in：正向引物序列为SEQ ID NO:3；反向引物序列为SEQ ID NO:4；步骤S2所述的稀释为稀释15-25倍。

2. 根据权利要求1所述的区分稻瘟病抗性基因Pita与稻瘟病感病基因pita的方法，其特征在于，步骤S3所述的仪器为LightScanner 96 分析系统。