CN109082425A - 油菜硼高效基因BnA3NIP5;1Q的转座子插入片段TEQ和引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q的转座子插入片段TE^Q，涉及基因工程技术领域，所述转座子插入片段TE^Q的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述的转座子插入片段TE^Q来源于油菜硼高效基因的BnA3NIP5；1^Q启动子，全长1415bp，通过确定油菜中是否具有该转座子插入片段TE^Q可快速有效的鉴别油菜是否具有抗低硼胁迫性能，加快具有高硼利用率的油菜育种速度。

Description

油菜硼高效基因BnA3NIP5；1Q的转座子插入片段TEQ和引物及 其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种油菜硼高效基因 BnA3NIP5；1^Q的转座子插入片段TE^Q及其引物和应用。

背景技术

硼是植物生长发育所必需的微量营养元素，在植物维持细胞壁的结构和 稳定、光合作用和碳水化合物运输、蛋白质和核酸代谢、花器官发育和产量 品质形成等方面起着不可替代的作用。

油菜是中国重要的油料作物，每年种植面积在700万公顷以上，总产 1100多万吨，由此生产的菜籽油为中国居民提供40％以上的食用植物油、以 及大量的高蛋白饼粕饲料。中国油菜产区主要分布在长江中下游地区，占全 国种植面积的80％以上。在这一区域，土壤有效硼含量属于缺乏或严重缺乏 地区。而油菜又是对缺硼反应极敏感的作物，土壤缺硼导致减产或颗粒无收。 因此，施用硼肥已成为油菜种植的常规技术。

然而，油菜对土壤有效硼浓度的适应范围很窄，土壤连年施用硼肥，引 起土壤有效硼累积，部分区域甚至达到过量或毒害的水平，从而对油菜及其 后茬作物的生产产生不利影响。所以，通过油菜硼营养性状的遗传改良提高 油菜对土壤硼的吸收利用，增强油菜自身抗缺硼胁迫的能力，从而减少硼肥 过量施用带来的风险、促进中国油菜的高产稳产，具有重要的经济和生态意 义。

植物对土壤硼的吸收利用是受遗传基因调控的。2002年日本科学家从拟 南芥中克隆得到第一个硼的转运蛋白基因BOR1，该基因所编码的是一个向 根木质部导管装载硼的转运蛋白，促进根从土壤吸收的硼向地上部转运 (Takano et al.,2002)。Miwa等(2006)创建了超表达BOR1的转基因拟南 芥株系，发现转基因植株对缺硼胁迫的抗性显著提高，地上部的硼含量和生 物量均显著高于野生型植株，而且结实率也明显提高(Miwa et al.,2006)。 拟南芥从土壤吸收硼受NIP5；1基因调控，在缺硼土壤中拟南芥NIP5；1基因 上升表达，合成的NIP5；1硼转运蛋白定位在根表皮细胞靠土壤一侧的细胞 膜上，高效地从土壤中吸收转运硼(Takano et al.,2006；Wang et al.,2017)。 然而，目前并没有关于利用遗传手段有效调控相关油菜硼营养性状的相关报 道。

发明内容

针对目前缺乏有效利用遗传手段改善硼营养性状油菜选育的问题，本发 明提供了一种油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q的转座子插入片段TE^Q，该转座 子插入片段TE^Q来自于油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q启动子，以该转座子插 入片段作为靶标检测可快速确定油菜的抗缺硼能力，加快抗缺硼油菜育种。

本发明还提供了一种油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q的转座子插入片段 TE^Q的扩增引物，可用于抗缺硼油菜品种的育种中。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q的转座子插入片段 TE^Q，所述转座子插入片段TE^Q的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种上述技术方案所述转座子插入片段TE^Q的扩增引 物，包括SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明提供了前述技术方案所述转座子插入片段TE^Q作为抗缺硼油菜 的分子标记物中的应用。

本发明提供了前述技术方案所述转座子插入片段TE^Q在油菜育种中的 应用。

优选的，所述转座子插入片段TE^Q在提高抗缺硼油菜育种效率中的应 用。

本发明提供了前述技术方案所述转座子插入片段TE^Q的扩增引物在油 菜育种中的应用。

优选的，所述转座子插入片段TE^Q的扩增引物在提高抗缺硼油菜育种效 率中的应用。

一种包括前述技术方案所述转座子插入片段TE^Q的油菜硼高效基因 BnA3NIP5；1^Q启动子在构建转基因抗缺硼植物中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供了一种油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q的转座子插入片段 TE^Q，所述转座子插入片段TE^Q的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明 所述的转座子插入片段TE^Q来源于油菜硼高效基因的BnA3NIP5；1^Q启动子， 全长1415bp，通过确定油菜中是否具有该转座子插入片段TE^Q可快速有效 的鉴别油菜是否具有抗低硼胁迫性能，加快育种速度。以本发明所述转座子 插入片段TE^Q作为分子标记可快速定位油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q启动子。

现有研究显示，油菜硼吸收运转基因BnA3NIP5；1在硼高效与低效亲本 间氨基酸序列无差异，在前期研究中猜测是在BnA3NIP5；1基因上游的5'UTR 区存在11个SNP及1个InDel变异，该5'UTR区可能是调控不同基因型硼 效率差异的关键因子。本发明研究表明，5'UTR区并非主要调控不同油菜硼 效率差异的关键因子，硼高效运转的亲本主要是通过带有本发明所述转座子 插入片段TE^Q的启动子提高油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q的表达量，进而提 高油菜根系从土壤中吸收转运硼的能力，表现出对土壤缺硼胁迫的抗性，因 而通过鉴别油菜中是否含有本发明所述转座子插入片段TE^Q即可判断油菜 是否具有抗低硼胁迫能力。

本发明还提供了上述油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q的转座子插入片段 TE^Q的扩增引物，包括SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。所 述转座子插入片段TEQ的扩增引物根据SEQ ID No.1所示的转座子插入序 列的两侧翼序列设计，可用于鉴别油菜是否存在转座子TE^Q插入片段而判断 它的抗缺硼能力，还可加快抗缺硼油菜的选育进程。

附图说明

图1为实施例1中不同材料的油菜硼转运基因BnA3NIP5；1启动子的PCR扩增片段电泳图；

图2为实施例2中功能性分子标记引物在硼高效和低效亲本中扩增得到 的PCR扩增片段电泳图；

图3为实施例2中功能性分子标记引物在油菜自然群体不同种质中的 PCR扩增片段电泳图；

图4为实施例2中油菜自然群体不同种质在正常硼和缺硼条件下的表 型；

图5为实施例3中油菜硼转运基因BnA3NIP5；1启动子驱动的GUS活性 示意图；

图6为实施例4中BnA3NIP5；1^Q启动子驱动BnA3NIP5；1的转基因油菜 抗缺硼表现型。

具体实施方式

本发明提供了一种油菜硼高效基因BnA3NIP5；1^Q的转座子插入片段 TE^Q，所述转座子插入片段TE^Q的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明 所述转座子插入片段TE^Q来源于BnA3NIP5；1^Q启动子，全长1415bp。所述 转座子插入片段TE^Q的核苷酸序列具体如下：SEQ IDNo.1

CTAGAGATTTTTTCCGCGCTTCGCGCGAATTGTGTCTTATAAATTTA TTTTATAATATTATTTGTCGGTTTATTTCTTTTACATTAATTTTTTTCAATG TTAGTTTTTCTTAATTTAAATGTATATGTTTATAATTTTTCATTTTTCTGGT TGTAGATGGAGAATTATATTTTTTATTGATAGTTTTTGTATGTGACATAAA CTTTTTGAAATTTTAAAATAATGTTATATATAGTAGGATTAACACATTAAA GAAGAGAAACATATTTAGGCATATTTTACACAGGTTTTATATACATAATT TTAAACATTATATATGTATATATTATAAGTTTGAAACATGTAAATGATTTCT AAAGTTAAATACTTGTTATGAGTTTACAAAACTTATCGAAAGTTTTATCT TTTTTTAAATTTAAATCACAGAAAAAAGTCAACACTGAAAATTTACATG AATCAGATAACAACAGTTTTATAAACAACTTGATAAAATTTGACCGAGC CAAAGATTTTCACACAATATGTTCTTTCTTCTTCAAATTGCGAAGAGCC TATAAGCACAAGAAAAAAATCATAATTTTTGTTTTCACTTATATAACATT TTTTCCCTTTACACACGGAATTTATTACACTGCTATAAGCAATTGAGAAC TCTATTCATATAAGATTCACATCTATGCATTTTGACAAAGAAGAATTTTA GCCATCTTTAGTTTCATAATGGATCAACTTCAGTCATATACACTATATTTT CTCTATGATTCAAATCTTACAATTTTAATATATGTGCAGATTTCCATGTAA AAAAACACGCACGCCATCTATCGTTCAACCTATTACTTTTTCCAAAGTA AACACTATAATCCTCGTTTGGTTAGCTCCACAAACTAATCTCTTTGGATC AGTGTAACCTTTCAGAAAATGATAATCTTAACATTTTACCAAAAAAAAA CAACAAATATTGACTTATTTATATGAATATATATTATTTTAAATCATTATAG TGGACGAAGAAAACACCATAATTTGTACAACAAATTTTCTTAGATTCAC CTCATCATACTCACCATTTTACTATTTTAATTACATAATTTTATATGAGTTT CTTCACCTTTTCCGGTTATTCTCTTTATTTATAACTACAATATAAAGTTAT AAACTAAATATATTATAAATTAATAATTTATTTACTCTTAAAGTCTAACGA TTACAAAAAGAACATAATTCAATATAGATATATGATTCTATTAATAAATTA GCAGTTACAAATTTGAAATTTCTAGAAATATCAAAAGTTTTATGTTAGTT AATTATCTTCTAAATGATATTTATTTTTAATTTTTTTTGGATGAGAATATTT TGGCTGAGGTGGATAGTCTCAAAAGCCTTGAATTTAGTCCCTTTTATATAGTAGG。

现有研究从油菜硼高效利用品种中定位了一个具有调控油菜硼运转吸 收作用的基因，该基因位于油菜A3染色体上，该基因与拟南芥中已报到的 硼酸通道蛋白基因NIP5；1同源，命名为BnA3NIP5；1，该BnA3NIP5；1基因 能够控制油菜的根系从土壤中吸收运转硼。进一步研究发现，在高抗缺硼能 力的油菜(比如青油10号)和低抗缺硼能力的油菜(比如Westar 10)中均 存在BnA3NIP5；1，二者仅存在两个SNPs位点的不同，但这两个SNPs位点均为同义变异，未导致其编码的蛋白质氨基酸变异。本发明进一步研究显示， 高抗缺硼能力的油菜中启动子(命名为BnA3NIP5；1^Q启动子)具有增强 BnA3NIP5；1基因表达量的作用，而低抗缺硼能力的启动子(命名为 BnA3NIP5；1^w启动子)则不具有这一功能，并且二者的核苷酸序列存在差异。

本发明将BnA3NIP5；1^Q启动子与BnA3NIP5；1^w启动子的核苷酸序列进行 对比后发现，二者的转座子插入序列存在差异(BnA3NIP5；1^w启动子中的转 座子插入片段命名为TE^W，全长1706bp)，并经过进一步研究表明 BnA3NIP5；1^Q启动子中的转座子插入片段TE^Q对于BnA3NIP5；1^Q启动子驱动 BnA3NIP5；1基因的表达量有显著影响，进而以转座子插入片段TE^Q作为目 的基因扩增即可有效鉴别油菜中是否具有BnA3NIP5；1^Q启动子，判断油菜的 抗缺硼能力。

本发明提供的转座子插入片段TE^Q可作为抗缺硼性状的分子标记应用 到抗缺硼油菜的育种中，有益于油菜硼营养性状的遗传改良，缩短育种周期。

本发明将所述转座子插入片段TE^Q作为靶标基因，通过检测育种中的油 菜中是否含有转座子插入片段TE^Q来判断油菜的抗缺硼能力，无需等待油菜 生长周期，为油菜育种提供了快速筛选的手段，提高育种效率。

在本发明中，所述油菜包括但不限于白菜型油菜、芥菜型油菜和甘蓝型 油菜，本发明对此无特殊限定。

本发明还提供了前述技术方案所述转座子插入片段TE^Q的PCR扩增引 物，包括SEQID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明所述的转 座子插入片段TEQ的扩增引物是基于转座子插入片段TE^Q的两边侧翼序列 设计的，这样依据两侧翼设计的引物就能扩增出完整的转座子插入片段TE^Q序列。具体的，所述转座子插入片段TE^Q的两个侧翼序列为：

TE^Q的左翼序列共200bp，如SEQ ID No.7所示：

TGATGCACCAGGGTTAGGTGAGATGTCCGAGTCTAAATCTCATAAA GTGCAATTCTTTTTTTTCATTTTTCAGCCATTTTTCTATTTTGGGCTTATGATCTTTATAAAACTTAGGACCGGCTCTGCTGATAACCAGTATTAGTATCACATGTTACAGAAAGGAAAAGTATTTATTTTTTATACATTTACGTTTA TAACAA

TE^Q的右翼序列200bp，如SEQ ID No.8所示：

ATATGGAATAGTTCTCTTTAAAAATTGTTCCAAGAATCAAACGCTCTTCCCCAGACTTAAGAACAATTTTCTATTCAATTATTGGAGGATTGTG GGGTGGCAAATGATCAGTGATACCGTCACGGCCATGTGGGGTTCGTAAGAATCACATACAGATATGTTGCTTAGATCGAACGGTAACGAAGATGCCG GTGACAAAG

在本发明中，所述转座子插入片段TE^Q的PCR扩增引物，包括根据TE^Q左翼序列SEQID No.7设计的上游引物序列SEQ ID No.2和根据TE^Q右翼序 列SEQ ID No.8设计的下游引物序列SEQ ID No.3，其核苷酸序列如下：

SEQ ID No.2：5’-CAGCCATTTTTCTATTTTGGGCTTATGA-3’(BE-F)；

SEQ ID No.3：5’-TGGGGAAGAGCGTTTGATTCTTGG-3’(BE-R)。

利用本发明提供的转座子插入片段TE^Q的扩增引物进行扩增，当得到目 的片段全长为1598bp时，即确定该植物中含有转座子插入片段TE^Q的核苷 酸序列，进而能够确定该植物中带有BnA3NIP5；1^Q启动子，具有良好的抗缺 硼能力。

本发明提供了上述技术方案所述转座子插入片段TEQ的扩增引物在鉴 别抗缺硼油菜中的应用。以上述技术方案所述的引物对抗缺硼能力未知的油 菜进行PCR扩增，当得到的目的片段全长为1598bp时，则判断油菜具有抗 缺硼能力；当得到的目的片段全长为1896bp时，则判断油菜不具有抗缺硼 能力。

本发明前述技术方案所述转座子插入片段TE^Q或前述技术方案所述转 座子插入片段TEQ的扩增引物在油菜育种中的应用，优选的，提高抗缺硼 油菜育种效率中的应用。

本发明还提供了包括前述技术方案所述转座子插入片段TE^Q的油菜硼 高效基因BnA3NIP5；1^Q启动子在构建转基因抗缺硼植物中的应用。本发明研 究表明，前述技术方案转座子插入片段TE^Q在BnA3NIP5；1^Q启动子中起到主 要调控作用，BnA3NIP5；1^Q启动子含有转座子插入片段TE^Q即可实现促进 BnA3NIP5；1基因高表达，进而提高植物根系转运硼的能力，提高植物对低 硼土壤的抗逆性。

本发明对所述包括前述技术方案所述转座子插入片段TE^Q的油菜硼高 效基因BnA3NIP5；1^Q启动子具体序列无特殊限定，只要能够包含转座子插入 片段TE^Q并且可用成功启动BnA3NIP5；1基因即可。

所述转基因抗缺硼植物构建时，植物类型包括但不限于油菜、拟南芥、 水稻或其他对硼元素敏感的植物。

本发明从作物对养分高效利用的生物学遗传特性角度考虑，挖掘作物养 分高效的优异等位基因并用于新品种的育种改良而实现作物高产优质，这样 既可节约矿质资源，又可因过量施肥而污染生态环境。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行 详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 油菜硼高效优异等位基因BnA3NIP5；1^Q启动子的获得

以甘蓝型油菜硼高效品种‘青油10号’(QY10)和硼低效品种‘Westar 10’ (W10)为材料，培养植株，分别采集两材料0.2克鲜样，利用试剂盒提取基 因组总DNA。以两材料的基因组总DNA为模板，设计BnA3NIP5；1启动子 的特异的引物对，利用PCR扩增全长的启动子序列。

引物对为：

p^BnA3NIP5；1-F:5’-CAATTCCAATGTTTTGATTTTACTTTTGGGCT-3’(SEQ ID No.5)

p^BnA3NIP5；1-R:5’-CACCAGGAGAGGGAAAATCGGC-3’(SEQ ID No.6)。

所述PCR反应体系为：

KOD FX(Code No.KFX-101)50μl体系：

所述PCR扩增条件为：

分别对来源于两个材料的PCR产物进行测序分析，并进行电泳分析， 电泳图如图1所示。来自硼高效品种‘青油10号’的硼高效优异等位基因 BnA3NIP5；1^Q启动子序列全长为2928bp(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)， 而来自硼低效品种‘Westar 10’的等位基因BnaA3.NIP5；1^W启动子序列全长 为3176bp。

实施例2

油菜BnA3NIP5；1^Q的转座子插入序列作为功能性分子标记物在鉴定油 菜硼高效种质鉴定中的应用

1)功能性分子标记引物及其在硼高效和低效亲本间扩增片段长度差异

取实施例1扩增得到的BnA3NIP5；1^Q启动子以及BnA3NIP5；1^W启动子， 以上述两种启动子为模板DNA，根据油菜硼高效优异等位基因BnA3NIP5；1^Q启动子中的转座子(TE)插入序列(SEQ ID No.1)设计功能性分子标记引 物对：

BE-F：5’-CAGCCATTTTTCTATTTTGGGCTTATGA-3’(SEQ ID No.2)；

BE-R：5’-TGGGGAAGAGCGTTTGATTCTTGG-3’(SEQ ID No.3).

利用该功能性分子标记引物对分别对上述获得的两材料基因组总DNA 进行PCR扩增，所述PCR扩增体系为：

KOD FX(Code No.KFX-101)50μl体系：

所述PCR扩增条件为：

对PCR扩增得到的目的片段进行测序以及电泳分析。在硼高效品种‘青 油10号’(QY 10)的BnA3NIP5；1^Q启动子中扩增片段长度为1598bp，包含 TE^Q插入片段1415bp，在硼低效品种‘Westar 10’(W10)的BnA3NIP5；1^W启 动子中扩增片段长度为1896bp，包含TE^W插入片段1706bp。PCR扩增产 物的电泳图如图2所示。

可以看出，本申请所述的转座子插入片段TE^Q来源于BnA3NIP5；1^Q启动 子。

2)功能性分子标记引物在甘蓝型油菜自然群体中扩增片段长度。

以甘蓝型油菜自然群体中随机选取编号29,30,32,40,45,60,69,94,97, 113,152,155,180，以及已鉴定的硼高效品种‘青油10号’(QY10)和硼 低效品种‘Westar10’(W10)、‘Bakow’(B)为材料，培养植株，采集 各材料鲜样0.2克，提取基因组总DNA。以基因组总DNA为模板，利用1) 中设计的功能性分子标记引物对进行PCR扩增，PCR反应体系以及反应条 件同1)中。

结果显示，各材料的PCR扩增产物的电泳图如图3所示，其中W为 ‘Westar 10’，B为‘Bakow’，Q为‘青油10号’，M为maker。编号 30,69,152,60,97,155,180的甘蓝型油菜和硼高效品种‘QY10’都扩增出 1598bp的片段，而29,32,40,45,94,113和硼低效品种‘Westar10’、‘Bakow’ 的PCR扩增片段为1896bp。

3)甘蓝型油菜自然群体不同种质抗缺硼胁迫的表型鉴定。

以上述甘蓝型油菜自然群体中编号29,30,32,40,45,60,69,94,97,113, 152,155,180，以及已鉴定的硼高效品种‘青油10号’和硼低效品种 ‘Westar10’、‘Bakow’为材料，采用营养液培养的方法鉴定各材料对缺 硼胁迫的抗性。

营养液培养试验在光照培养室中进行，温度设置为22℃，光照周期为14h(光照)/10h(黑暗)，光照强度为300-320μmol/m²/s，湿度为60-75％。选 取大小一致的各材料油菜种子，使用1％的NaClO灭菌处理10min；将种子 表面冲洗干净后，4℃下用灭菌超纯水(>18.25MΩ)浸泡24h。将浸泡过后 的种子均匀播种到塑料育苗盘表面固定的纱布上，育苗盘中加适量超纯水。 育苗一周后，将长势一致的幼苗移栽至盛有10L营养液的黑色塑料盆中。营养液试验中的大量元素营养液采用Hoagland配方，微量元素营养液采用 无硼的Arnon配方(Hoagland andArnon,1950)。试验设置两个硼水平：正 常硼(25μM B)和缺硼(0.25μMB)。每隔5d更换一次营养液，初始营 养液为1/4浓度营养液，随后为1/2浓度营养液，最后为全量营养液。从移 栽开始培养15d调查各油菜种质的抗缺硼能力。在缺硼条件下植株大小和叶 片数接近正常硼水平，而且没有产出明显缺硼症状的为抗缺硼胁迫(硼高效) 油菜种质。反之在缺硼条件下植株大小和叶片数显著小于正常硼水平，而且 表现出根系和地上部生长受抑制、叶色深绿，新生叶卷曲增厚，茎尖生长困 难，甚至坏死等典型缺硼症状的材料为缺硼敏感(硼低效)油菜种质。

调查结果如图4所示，图中每个材料2个单株，左侧为正常硼条件下(25 μM B)生长的油菜单株，右侧为缺硼条件下(0.25μM B)生长的油菜单株。 由图4可以看出，基因功能性分子标记引物扩增出1598bp片段的所有材料 30，60，69，97，152，155，180和‘QY10’都表现为抗缺硼胁迫的特性，而 扩增片段为1896bp的所有材料29，32，40，45，94，113，‘W10’和‘Bakow’ 均出现典型的缺硼症状。

综上，可以看出，以本发明提供的转座子插入序列TE^Q作为分子标记物， 并设计引物对油菜DNA进行PCR扩增，所得扩增产物的片段大小与油菜的 抗缺硼性能一致，表明利用本发明提供的转座子插入序列TE^Q及其引物能够 快速有效的鉴别油菜抗缺硼能力。

实施例3 油菜硼高效优异等位基因BnA3NIP5；1^Q启动子提高GUS基因 的活性

将实施例1扩增得到的BnA3NIP5；1^Q启动子以及BnaA3.NIP5；1^W启动子 分别与GUS报告基因连接，构建植物转化体PQY10::GUS和PW10::GUS， 植物转化体中的基因结构如图5A所示。

载体构建采用双酶切和T4连接的方法构建：

设计引物在启动子两段添加Asc I和EcoR I两个酶切位点。进行启动子 片段扩增(方法参考上述启动子扩增方法)

GUS-F：5’-TTGGCGCGCCCCAATGTTTTGATTTTACTTTTGGG-3’ (SEQ ID No.9)

GUS-R：5’-GGAATTCCCTAATCTTTTCGGGTATTTTTTGTATT-3’(SEQ ID No.10)

同时对启动子片段和载体片段(载体采用本实验改造的GUS+Red3载 体)进行双酶切。

双酶切反应体系为：

双酶切反应条件为：37℃ 3小时

采用康为世纪生物科技有限公司生产的快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂 盒(CW2302)对启动子片段和载体片段进行回收。

对回收得到的片段进行T4连接酶连接。

T4连接酶连接反应体系：

T4连接酶连接反应条件：4℃过夜

连接体系取2μl采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞，于带有卡那霉素 的LB平板中涂板，37℃培养16小时，挑取阳性单克隆送测序。选取测序结 果正确的单克隆利用公司返回的质粒样品转化农杆菌感受态细胞。

采用农杆菌蘸花法将构建的植物转化体分别转化到拟南芥中，筛选并培 养，得到阳性转基因植株。阳性转基因植株T1代植株进行两次自交加代得 到T3代植株，并对T3代植株进行筛选，可得到T3代纯合株系。(农杆菌 蘸花法参考：Xiuren Zhang etal.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using thefloral dip method.Nature Protocols,2006, 1:641-646.doi:10.1038/nprot.2006.97)

T3代纯合株系的GUS染色结果如图5的B、C所示，PQY10::GUS在 整个根系都有高水平的表达，而PW10::GUS只在根尖有表达。表明，利用 含有本发明所述转座子插入片段TE^Q的油菜启动子具有提高BnA3NIP5；1基 因表达量的功能，而未含有本发明所述转座子插入片段TE^Q的启动子则不具 有这一作用。

实施例4：利用含有本发明所述转座子插入片段TE^Q的BnA3NIP5；1^Q启 动子创建抗缺硼转基因油菜

取实施例1扩增得到的硼高效优异等位基因BnA3NIP5；1^Q为启动子，连 接BnaA3.NIP5；1基因的CDS序列，构建油菜转化载体。BnA3NIP5；1^Q启动 子是以QY10基因组DNA为模板，采用上述GUS-F，GUS-R引物扩增得到。 CDS序列是以QY10cDNA为模板扩增得到，具体为利用TriZol试剂提取 QY10根系总RNA，利用TOYOBO公司ReverTra qPCR RTMasterMix with gDNA Remover(FSQ-301)逆转录试剂盒获得cDNA之后，采用下列 CDS引物扩增序列。

CDS引物：

CDS-F：5’-CGGAATTCATGTCTCCGCCGGAGGCT-3’(SEQ ID No.11)

CDS-R：5’-GCTCTAGAACGACGGAAGCTTCTAACCTGA-3’(SEQ ID No.12)

QY10CDS扩增的反应体系：

KOD FX(Code No.KFX-101)50μl体系：

QY10CDS扩增的PCR反应条件为：

载体采用改造的GFP载体。载体构建方法采用上述双酶切加T4连接的 方法，两次分别加CDS序列和启动子序列接入载体序列。

采用农杆菌介导的油菜下胚轴暗培养转化方法转化硼低效品种‘Westar 10’(W10)，筛选，获得阳性转基因植株。将得到的阳性转基因植株分别标 记为P_Q-1，P_Q-2，P_Q-3，P_Q-4，P_Q-5，P_Q-6，并以硼高效品种‘青油10号’(QY10) 作为阳性对照，野生型硼低效品种W10作为阴性对照。(农杆菌介导的油 菜下胚轴暗培养转化方法参考：Marc De Block etal.Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacteriumtumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenicplants.Plant Physiol,1989, 91:694-701.doi:0032-0889/89/91/0694/08/$01.00/0)

将上述转基因植株以及阳性对照、阴性对照在缺硼条件下(0.25μM B) 培养15天，具体条件同实施例2的3)部分。

结果如图6所示，P_Q-1，P_Q-2，P_Q-3，P_Q-4，P_Q-5，P_Q-6阳性转基因植株以 及硼高效品种‘青油10号’均没有出现明显的缺硼症状，表现出抗缺硼的 特性，而野生型硼低效品种W10根系生长受抑制，叶色深绿，新生叶卷曲 增厚，茎尖生长困难。表明，利用含有本发明所述转座子插入片段TE^Q的 BnA3NIP5；1^Q启动子构建转基因植物能够有效改善植物的抗缺硼能力。

综合实施例1～4，可以看出，本发明提供的转座子插入片段TE^Q可以作 为鉴别油菜抗缺硼能力的分子标记物，所述转座子插入片段TE^Q引物能够用 于油菜抗缺硼能力的分子标记物。本发明利用转座子插入片段TE^Q的油菜 BnA3NIP5；1^Q启动子构建到无抗缺硼能力的油菜中，成功改善了油菜的抗缺 硼能力，即通过带有转座子插入片段TE^Q的启动子提高BnA3NIP5；1基因的 表达量，进而增强植物对硼的转运能力，提高植物在低硼浓度下的耐受，在 正常的硼浓度下也能够起到提高转基因植物硼运转吸收效率的作用，降低硼 肥的施用量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 油菜硼高效基因BnA3NIP5;1Q的转座子插入片段TEQ和引物及其应用

<130> GW2018I2789

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1415

<212> DNA

<213> Brassica napus L.

<400> 1

ctagagattt tttccgcgct tcgcgcgaat tgtgtcttat aaatttattt tataatatta 60

tttgtcggtt tatttctttt acattaattt ttttcaatgt tagtttttct taatttaaat 120

gtatatgttt ataatttttc atttttctgg ttgtagatgg agaattatat tttttattga 180

tagtttttgt atgtgacata aactttttga aattttaaaa taatgttata tatagtagga 240

ttaacacatt aaagaagaga aacatattta ggcatatttt acacaggttt tatatacata 300

attttaaaca ttatatatgt atatattata agtttgaaac atgtaaatga tttctaaagt 360

taaatacttg ttatgagttt acaaaactta tcgaaagttt tatctttttt taaatttaaa 420

tcacagaaaa aagtcaacac tgaaaattta catgaatcag ataacaacag ttttataaac 480

aacttgataa aatttgaccg agccaaagat tttcacacaa tatgttcttt cttcttcaaa 540

ttgcgaagag cctataagca caagaaaaaa atcataattt ttgttttcac ttatataaca 600

ttttttccct ttacacacgg aatttattac actgctataa gcaattgaga actctattca 660

tataagattc acatctatgc attttgacaa agaagaattt tagccatctt tagtttcata 720

atggatcaac ttcagtcata tacactatat tttctctatg attcaaatct tacaatttta 780

atatatgtgc agatttccat gtaaaaaaac acgcacgcca tctatcgttc aacctattac 840

tttttccaaa gtaaacacta taatcctcgt ttggttagct ccacaaacta atctctttgg 900

atcagtgtaa cctttcagaa aatgataatc ttaacatttt accaaaaaaa aacaacaaat 960

attgacttat ttatatgaat atatattatt ttaaatcatt atagtggacg aagaaaacac 1020

cataatttgt acaacaaatt ttcttagatt cacctcatca tactcaccat tttactattt 1080

taattacata attttatatg agtttcttca ccttttccgg ttattctctt tatttataac 1140

tacaatataa agttataaac taaatatatt ataaattaat aatttattta ctcttaaagt 1200

ctaacgatta caaaaagaac ataattcaat atagatatat gattctatta ataaattagc 1260

agttacaaat ttgaaatttc tagaaatatc aaaagtttta tgttagttaa ttatcttcta 1320

aatgatattt atttttaatt ttttttggat gagaatattt tggctgaggt ggatagtctc 1380

aaaagccttg aatttagtcc cttttatata gtagg 1415

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagccatttt tctattttgg gcttatga 28

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggggaagag cgtttgattc ttgg 24

<210> 4

<211> 2928

<212> DNA

<213> Brassica napus L.

<400> 4

ccaatgtttt gattttactt ttgggctatt ttatatttta aagttaattt ttattattta 60

tattagacat ttaaacattt gttaatttta attttgttgt atttttatca tatcttgtaa 120

cttataactt gttacaaaaa ttattaaata atttaaataa ttttaatact tattatattt 180

tcttaatgta aaatatttct tatattttaa taattaatct acagttatat atttattact 240

gtttcatggt ttattcatga tcgatacact gacccgataa gaaaagaagt aatccgattg 300

agatttaaaa atattggttt ctacgttttt gcatttgcgc tttcattgtt aactagagcc 360

ggccttaggt ccaaatgaat gaagtccatg ctttcgaccg tcattttatt aagtattaaa 420

ccggccacag tttctcaaaa ctagtcaatg gtttagctgt tagtgatgca ccagggttag 480

gtgagatgtc cgagtctaaa tctcataaag tgcaattctt ttttttcatt tttcagccat 540

ttttctattt tgggcttatg atctttataa aacttaggac cggctctgct gataaccagt 600

attagtatca catgttacag aaaggaaaag tatttatttt ttatacattt acgtttataa 660

caactagaga ttttttccgc gcttcgcgcg aattgtgtct tataaattta ttttataata 720

ttatttgtcg gtttatttct tttacattaa tttttttcaa tgttagtttt tcttaattta 780

aatgtatatg tttataattt ttcatttttc tggttgtaga tggagaatta tattttttat 840

tgatagtttt tgtatgtgac ataaactttt tgaaatttta aaataatgtt atatatagta 900

ggattaacac attaaagaag agaaacatat ttaggcatat tttacacagg ttttatatac 960

ataattttaa acattatata tgtatatatt ataagtttga aacatgtaaa tgatttctaa 1020

agttaaatac ttgttatgag tttacaaaac ttatcgaaag ttttatcttt ttttaaattt 1080

aaatcacaga aaaaagtcaa cactgaaaat ttacatgaat cagataacaa cagttttata 1140

aacaacttga taaaatttga ccgagccaaa gattttcaca caatatgttc tttcttcttc 1200

aaattgcgaa gagcctataa gcacaagaaa aaaatcataa tttttgtttt cacttatata 1260

acattttttc cctttacaca cggaatttat tacactgcta taagcaattg agaactctat 1320

tcatataaga ttcacatcta tgcattttga caaagaagaa ttttagccat ctttagtttc 1380

ataatggatc aacttcagtc atatacacta tattttctct atgattcaaa tcttacaatt 1440

ttaatatatg tgcagatttc catgtaaaaa aacacgcacg ccatctatcg ttcaacctat 1500

tactttttcc aaagtaaaca ctataatcct cgtttggtta gctccacaaa ctaatctctt 1560

tggatcagtg taacctttca gaaaatgata atcttaacat tttaccaaaa aaaaacaaca 1620

aatattgact tatttatatg aatatatatt attttaaatc attatagtgg acgaagaaaa 1680

caccataatt tgtacaacaa attttcttag attcacctca tcatactcac cattttacta 1740

ttttaattac ataattttat atgagtttct tcaccttttc cggttattct ctttatttat 1800

aactacaata taaagttata aactaaatat attataaatt aataatttat ttactcttaa 1860

agtctaacga ttacaaaaag aacataattc aatatagata tatgattcta ttaataaatt 1920

agcagttaca aatttgaaat ttctagaaat atcaaaagtt ttatgttagt taattatctt 1980

ctaaatgata tttattttta attttttttg gatgagaata ttttggctga ggtggatagt 2040

ctcaaaagcc ttgaatttag tcccttttat atagtaggat atggaatagt tctctttaaa 2100

aattgttcca agaatcaaac gctcttcccc agacttaaga acaattttct attcaattat 2160

tggaggattg tggggtggca aatgatcagt gataccgtca cggccatgtg gggttcgtaa 2220

gaatcacata cagatatgtt gcttagatcg aacggtaacg aagatgccgg tgacaaaggc 2280

accggtgact ctagcagata tctttataaa ggacgttagt aatgaactgt tattggagtt 2340

gactttttat tattgatctt tttgggttca atgcataaca atctcttttt ctatataaac 2400

acacacacat ataaatataa cttaagctcg agcattaacc aaacctttca tacatctctc 2460

tatctttctt ttctttcaga accacagatt cgagaattag tctttgttca gtgctaactt 2520

acgcatccat atgtgtgtcg tctttgcttt ttatatgatt cggtttctga atttggtttt 2580

ttgaggtggc tatcttcgtt catatttttc ttcttacgta gtaacagctt cataaaaatc 2640

cttacaagca tgtaaattaa cgtcccagat cccttttctt ctccttcaaa acaaaaagaa 2700

aattttaatc ggtagataag tttgattcat tggcgtccct ggttttaatt tctgtttggt 2760

gaaactagtc ctggcaaagt ttgaagtaca agtgtaaacc caaatttaaa aaaacctcaa 2820

atcatgtaaa tttcgtctct tcaaatttat ctccctccta ccaaaaaaac aaaataaaag 2880

aagtattttc ttcaaaacaa aatacaaaaa atacccgaaa agattagg 2928

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caattccaat gttttgattt tacttttggg ct 32

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccaggaga gggaaaatcg gc 22

<210> 7

<211> 200

<212> DNA

<213> Brassica napus L.

<400> 7

tgatgcacca gggttaggtg agatgtccga gtctaaatct cataaagtgc aattcttttt 60

tttcattttt cagccatttt tctattttgg gcttatgatc tttataaaac ttaggaccgg 120

ctctgctgat aaccagtatt agtatcacat gttacagaaa ggaaaagtat ttatttttta 180

tacatttacg tttataacaa 200

<210> 8

<211> 200

<212> DNA

<213> Brassica napus L.

<400> 8

atatggaata gttctcttta aaaattgttc caagaatcaa acgctcttcc ccagacttaa 60

gaacaatttt ctattcaatt attggaggat tgtggggtgg caaatgatca gtgataccgt 120

cacggccatg tggggttcgt aagaatcaca tacagatatg ttgcttagat cgaacggtaa 180

cgaagatgcc ggtgacaaag 200

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggcgcgcc ccaatgtttt gattttactt ttggg 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaattccct aatcttttcg ggtatttttt gtatt 35

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggaattcat gtctccgccg gaggct 26

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctctagaac gacggaagct tctaacctga 30

Claims (9)

1.一种油菜的转座子插入片段TE^Q，所述转座子插入片段TE^Q的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.一种权利要求1所述转座子插入片段TE^Q的扩增引物，包括SEQ ID No.2所示的上游引物核苷酸序列和SEQ ID No.3所示的下游引物核苷酸序列。

3.权利要求1所述转座子插入片段TE^Q作为抗缺硼油菜的分子标记物中的应用。

4.权利要求2所述转座子插入片段TE^Q的扩增引物在鉴别抗缺硼油菜中的应用。

5.权利要求1所述转座子插入片段TE^Q在油菜育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转座子插入片段TE^Q在提高抗缺硼油菜育种效率中的应用。

7.权利要求2所述转座子插入片段TE^Q的扩增引物在油菜育种中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转座子插入片段TE^Q的扩增引物在提高抗缺硼油菜育种效率中的应用。

9.一种包括权利要求1所述转座子插入片段TE^Q的油菜启动子在构建转基因抗缺硼植物中的应用。