CN104694551B - 水稻抽穗期基因dth10‑1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻抽穗期基因DTH10‑1及其应用。水稻抽穗期基因DTH10‑1，一个来自受体亲本圣稻16，一个来自其导入系；圣稻16的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其导入系的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；圣稻16的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其导入系的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明利用转基因技术获得了转DTH10‑1基因的水稻植株，转基因阳性植株抽穗期明显延迟。通过基因工程提高或减弱DTH10‑1基因的表达量能够控制水稻的抽穗期，从而提高品种的地区和季节适应性。

Description

水稻抽穗期基因DTH10-1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及到一个位于水稻第10染色体上控制抽穗期的基因DTH10-1及其应用。

背景技术

抽穗期是水稻重要的农艺性状，对品种的高产和稳产起到关键性的作用。作物培育一个主要的限制因素是其抽穗期，抽穗期主要通过光照和温度严格调节。水稻抽穗期受感光性、感温性和基本营养生长性的影响，三者相互作用决定了水稻品种的地区和季节适应性。抽穗期长短、水稻基因间互作及基因和环境间的互作使抽穗期的遗传行为十分复杂。水稻复杂性状遗传学基础的分类，不仅对水稻发展的基础研究方面有很大的影响，对水稻育种也有实际的价值。抽穗期性状成为水稻高产育种过程中关注的焦点。

随着分子生物学的迅速发展和水稻抽穗期研究的深入，目前已克隆了24个水稻抽穗期基因(郭梁等,2012)，其中10个为QTL、4个为突变基因，10个为应用反向遗传学方法确认了功能的同源基因，这些抽穗期基因中多数参与光周期调控途径(Komiya et al.,2009)。已报到的DTH7在水稻光周期和产量上扮演着重要的作用(Gao et al.,2014)。长日照条件下，导入Asominori中有功能的DTH8等位基因能显著增加CSSL61的抽穗期、株高和每穗粒数(Wei et al.,2010)。长日照条件下，Ghd8通过调节Ehd1、RFT1和Hd3a延迟水稻开花，但短日照条件下促进水稻开花。Ghd8能够上调控制水稻分蘖和侧枝发生的基因MOC1的表达，从而增加水稻的分蘖数、一级枝梗和二级枝梗数(Yan et al.2011)。Hd1和Ehd1这两个重要的开花基因调控水稻穗发育，可能是通过影响叶片中成花素基因的表达进而影响作物的大田产量(Endo-Higashi et al.2011)。HGW作为一个重要的上游调控蛋白促进抽穗和粒重相关类基因的表达，很可能直接通过GIF1控制水稻籽粒和重量(Li et al.2012)。

目前，已克隆的抽穗期基因Ehd2是水稻开花转换的关键因子，编码一个具有锌指基序的转录因子，是玉米中促进开花的INDETERMINATE1(ID1)基因的直系同源基因。在水稻开花的遗传调控网络中，Ehd2位于Hd1，Hd3a，RFT1的上游，是水稻开花的促进因子，它调节水稻的花期转变而不影响生长速率，这一功能是通过上调Ehd1和Hd3a、RFT1下游基因的表达而实现的(Kazuki et al.,2008)。

发明内容

本发明通过对背景材料圣稻16和其导入系的抽穗期基因的研究，在圣稻16和其导入系中发现一个抽穗期基因DTH10-1，并对其同一基因座上的等位基因进行克隆。通过试验证明：DTH10-1基因可以调控水稻的抽穗期。

本发明的目的在于提供一种水稻抽穗期基因DTH10-1，其特征是，一个来自受体亲本圣稻16，一个来自其导入系；圣稻16的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其导入系的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述水稻抽穗期基因DTH10-1，其中，圣稻16的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其导入系的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

上述导入系为：利用水稻品种圣稻16为背景材料，以水稻品种Khazar为供体，构建的染色体导入系，代换区间为RM271-RM269-RM258-RM304，得到导入系水稻材料。

本发明首先以受体圣稻16和其导入系水稻WY065为材料，对其同一基因座上的等位基因DTH10-1进行克隆。经过圣稻16与导入系WY065中DTH10-1基因CDS的序列比对结果可知，圣稻16共有核苷酸1045个，而WY065中DTH10-1基因含有核苷酸816个，两者在编码区核苷酸差距显著。圣稻16中，与抽穗期期有关的基因DTH10-1翻译产物包含170个氨基酸，WY065中，与抽穗期有关基因DTH10-1翻译产物共201个氨基酸。两者氨基酸序列差异非常显著，因此蛋白质的结构与功能显著不同。

本发明首先将导入系WY065的基因DTH10-1的cDNA序列经XhoI与AatII双酶切后，连接在进行同样的双酶切的植物表达载体pCAMBIA1300上，构建成重组表达载体p1300-DTH10-1；再利用农杆菌介导的遗传转化方法将重组表达载体p1300-DTH10-1转化至圣稻16，得到转DTH10-1基因的水稻植株，转基因阳性植株抽穗期明显延迟。通过分析表型变化，圣稻16抽穗期115±0.53天，WY065抽穗期130±0.82天，WY065比圣稻16晚抽穗。转基因阳性苗抽穗期天数变化范围为128-134天，转DTH10-1基因的水稻植株抽穗期明显延迟。

本发明的有益效果是：水稻抽穗期基因的成功研究，为下一步研究水稻抽穗开花的机制奠定了良好的基础，同时为不同生态区水稻育种提供了一个的新的思路。通过基因工程提高或减弱DTH10-1基因的表达量能够控制水稻的抽穗期，从而提高品种的地区和季节适应性。

附图说明

图1为SD16和WY065中DTH10-1基因的cDNA片段电泳图；其中，1为WY065目标基因片段，2为SD16目标基因片段，M为DL2000Marker；

图2为圣稻16和WY065中DTH10-1核苷酸序列比对图；

图3为圣稻16和WY065中DTH10-1氨基酸序列比对图；

图4为转化载体T-DNA示意图；

图5为圣稻16和转DTH10-1基因的水稻抽穗期图。

具体实施方式

实施例1：导入系水稻的构建

利用水稻品种圣稻16为背景材料，以Khazar为供体，构建的染色体导入系，代换区间为RM271-RM269-RM258-RM304，导入系水稻材料命名为WY065。具体的试验过程如下：利用水稻品种圣稻16为背景材料，以Khazar为供体，进行杂交，得到BC₁F₁，然后利用圣稻16为轮回亲本进行连续回交，得到BC₄F₁，并自交得到BC₄F₂，对其自交单株提取DNA进行片段检测，在BC₄F₃对BC₄F₂检出的供体代换片段进行追踪，所用的标记为BC₄F₂检出片段上的多态性标记，经检测在BC₄F₃获得了第一批染色体导入系。其中导入系WY065，代换区间为RM271-RM269-RM258-RM304，代换片段带有抽穗期基因DTH10-1，其基因来源于Khazar。

实施例2：水稻抽穗期基因DTH10-1的克隆

(1)选用背景材料SD16和导入系WY065作为实验材料，提取水稻叶片中的总RNA。以获得的总RNA为摸板，反转录合成第一链cDNA。以上述反转录合成的第一链cDNA为模板，对抽穗期基因的编码区进行PCR扩增；背景材料SD16和导入系WY065共同的引物具体为：正向引物：5’-GAGATGAGTTTCATAGGCATGGTG-3’(SEQ ID NO：5)，反向引物：5’-CAAGCCATTTTCACTACTCTACTGTG-3’(SEQ ID NO：6)。用Ex Taq Version 2.0(TaKaRa)进行PCR扩增。PCR产物回收后，用试剂盒18-T Vector(TaKaRa)连接，连接产物转化E.coli DH 5α感受态细胞，LB固体培养基涂板、过夜，筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得DTH10-1基因。

(2)PCR反应体系

以cDNA为模板，对抽穗期基因的编码区进行PCR扩增，扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析。PCR扩增反应的体系见表1。

表1 PCR反应体系

(3)PCR扩增程序

PCR扩增程序主要为：94℃预变性5min，循环(94℃45s，55℃30s，72℃45s)30个循环，72℃延伸10min。

(4)扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳

a)制胶(1％的琼脂糖凝胶的配制)：用1000mL三角瓶量取400mL 1×TBE缓冲液。称取4g琼脂糖，加入三角瓶；在微波炉内加热至琼脂糖完全溶解，沸腾；冷却到50-60℃后，加入1mg/mL的EB染色液200μL，摇匀；

b)倒胶：将制胶板放入制胶盒内，垂直向上插好梳子，把溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板内，直至厚度为5mm左右；倒胶时，要防止气泡产生；

c)点样：待胶完全凝固后，缓慢垂直向上拔出梳子，把制胶板两端的挡板取出，将凝胶置入电泳槽中，将电泳槽中的1×TBE缓冲液加至覆盖胶面1cm；将PCR产物20μL中加4μL6×Loading buffer，取24μL进行琼脂糖凝胶电泳，用移液枪点入点样孔；

d)电泳：调电压至180V，电泳约20-30分钟后用UVP凝胶成像仪器进行显像，观察条带位置，记录结果；

注意：电泳槽使用前需要用自来水冲洗干净，电泳缓冲液要勤换，保持干净，防止其他DNA的污染。

(5)PCR产物回收与纯化

切胶：在UVP凝胶成像仪器中切出目的条带放入1.5mL离心管，用OMEGA胶回收试剂盒回收。取2μL回收液进行琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1％，电压为180V，时间为15min)，检测目的条带是否已回收成功。

使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，对目的cDNA进行凝胶电泳后，在紫外灯下切出含有目的cDNA的琼脂糖凝胶，用纸巾轻轻吸尽凝胶表面的液体。(切胶时应注意尽量不要切出目的cDNA部分以外的凝胶，尽量减小胶的体积，提高DNA回收的纯度。)

柱式DNA胶回收试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0)使用方法：

a)将Binging BufferⅡ按400μL/100mg凝胶的比例加入，置于50-60℃水浴中10min，每1min混匀一次，使胶彻底融化；

b)将融化的胶溶液移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min；

c)6000rmp室温离心1min。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液；

d)将UNIQ-10柱放入收集管中，加入Wash Solution，600rpm室温离心1min；

e)重复洗涤一次；

f)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再次将UNIQ-10柱放回收集管中，12000rmp离心39sec；

g)将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml微量离心管中，在柱膜中央部分加20μLElution Buffer，室温放置2min；

h)12000rmp室温离心1min，离心管中的液体即回收产物。

(6)PCR纯化产物的连接

连接：用TaKaRa试剂盒18-T Vector，取4μL回收液，1μL pMD18-T，5μLSolution I，16℃过夜连接(12-16h)。

(7)感受态细胞的制备

a)从-80℃冰箱取出宿主细胞，待其稍微融化后取1μL加入到3mL LB液体培养基中(不含氨苄)，37℃震荡培养过夜(200rpm)；

b)取2mL培养液加入50mL LB液体培养基(不含氨苄)，37℃震荡培养，直到A600＝0.4-0.6。培养时间大约2-4小时，当培养液浑浊时开始测定OD600；

c)离心，7500rpm，4℃，5min，回收细胞，轻轻倒掉上清，用5ml预冷的0.1M的氯化镁悬浮细胞。

d)离心，7500rpm，4℃，5min，回收细胞，轻轻倒掉上清，用12.5ml预冷的0.1M的氯化镁悬浮细胞。冰浴中放置20min。

e)离心，7500rpm，4℃，5min，回收细胞，轻轻倒掉上清，用5ml预冷的0.1M的氯化镁(含甘油0.5ml)悬浮细胞。

f)分装，每管中50-100μL，-80℃保存。

(8)重组质粒的转化

转化、涂板：在超净工作台中，将大肠杆菌感受态置冰上融化，50μL感受态，10μL连接液(步骤(6)制备的)混匀，冰浴20-25min，42℃90s，冰浴5min，加入900μL LB液体培养基置37℃摇床，200rpm 1h，8000rpm离心1min，弃上清收集沉淀，取10μL LB液体培养基与沉淀混匀，涂板，37℃倒置培养16h。

挑菌：每个平板挑取10个单菌落，分别放入盛有4000ml LB液体培养基的试管中，在37℃200rmp摇床中过夜(12-16h)。

(9)重组质粒的菌液PCR鉴定

菌液检测及测序：PCR扩增，20μL菌液检测体系中包括2μL菌液，10μL Premix Taq(Ex Taq Version 2.0)(TaKaRa)，1μL 10μmol引物(正向引物：5’-GAGATGAGTTTCATAGGCATGGTG-3’SEQ ID NO：5；反向引物：5’-CAAGCCATTTTCACTACTCTACTGTG-3’SEQ ID NO：6。)，7μL RNase Free dH₂O。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1％，电压为180V，时间为15min)，将成功回收的目的菌液送山东省农业科学院生物测序中心进行测序，将测序结果用DNAstar(V5.0)软件进行分析，获得圣稻16全长cDNA序列如SEQ ID NO：1，含1045bp(图1)，获得导入系WY065全长cDNA序列如SEQ IDNO：2，含816bp(图1)。圣稻16含170个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3，WY065含201个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4。该等位基因位于水稻第10染色体上，控制水稻抽穗期，命名为基因DTH10-1。

将测序结果用DNAstar(V5.0)软件进行分析，同时通过DNAMAN 6.0.3.99软件对相关基因的序列进行比对分析。DTH10-1核苷酸序列比对结果如图2所示。两者序列比对结果显示WY065基因的编码区第106位到第335位之间发生碱基的缺失；分析其蛋白质的氨基酸序列，发现两者氨基酸序列有极大差异(图3)，圣稻16中，与抽穗期期有关的基因DTH10-1翻译产物包含170个氨基酸，WY065中，与抽穗期有关基因DTH10-1翻译产物为201个氨基酸，两者DTH10-1基因的氨基酸序列有极大差异，因此蛋白质的结构与功能显著不同。

实施例3：水稻抽穗期基因DTH10-1表达载体的构建

(1)载体构建

利用导入系WY065的DTH10-1的的cDNA序列，5’端添加XhoI酶切位点，3’端添加Nosterminator，Nos terminator的3’端添加AatII酶切位点。将合成的基因XhoI与AatII双酶切(含有Nos terminator)，回收。将双酶切后的基因片段连接到经XhoI与AatII双酶切的pCAMBIA1300载体上(本实验室优化处理，利用Bar基因作为筛选标记基因)。将重组载体转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定，获得含DTH10-1的重组表达载体p1300-DTH10-1。

(2)重组农杆菌的获得

用电击法将上述重组载体转化农杆菌LBA4404菌株，得到重组农杆菌。提取质粒进行酶切鉴定，获得包含重组表达载体p1300-DTH10-1的重组农杆菌(图4)。

实施例4：水稻抽穗期基因DTH10-1的转基因互补试验

(1)选取饱满圣稻16种子去皮，75％酒精消毒3-4分钟，NaClO浸泡40mins；无菌水清洗5-6次，晾干，转移到诱导培养基上，28℃暗培养7-10天，继代2-3次；

(2)选取相对紧凑干燥的愈伤颗粒进行预培养，26±1℃暗培养4天，备用；

(3)LA固体培养基接种携带有表达载体p1300-DTH10-1的农杆菌LBA4404，28℃暗培养2天。挑取菌落于悬浮培养基中，28℃震荡3小时，调节悬浮培养液浓度至OD₆₀₀0.8～1.0，备用，农杆菌培养使用的抗生素是卡那霉素(50ml/L)和利福平(50mg/L)；

(4)将步骤(2)表面干燥的经过预培养后的愈伤组织浸于步骤(3)的悬浮培养液中30mins，晾干，转移至共培养基中，19-20℃暗培养3天。无菌水清洗愈伤颗粒数次，于400ppm羧苄青霉素Cn中浸泡30分钟，晾干，转移至含有10mg/L草胺膦(Basta)和400ppm羧苄青霉素(Cn)的筛选培养基中，28℃培养2-3周。重复2-3次，逐级递Cn浓度；

(5)经过3～4次筛选后，选取生长正常、色泽亮黄的抗性愈伤组织接种到预分化培养基中暗培养5-7天，转移至分化培养基，26℃光培养30～50天，分化成苗；

(6)将2cm左右高的幼苗转到生根培养基上进行生根培养。当苗长至8～10cm左右时打开瓶口炼苗，7天左右移栽至大田；

(7)本发明共获得21株独立的携带WY065等位基因的转圣稻16的T0代水稻植株，利用Basta抗性鉴定和PCR分子鉴定，共获得15株阳性单株，转DTH10-1基因的水稻植株抽穗期延迟，在T2代抽穗期统计结果见表2。说明DTH10-1基因具有控制水稻抽穗期的功能。

表2 转DTH10-1基因的圣稻16在T₂群体中的抽穗期与圣稻16、WY065的抽穗期比较

实验材料	抽穗期(天)
		圣稻16	115±0.53
WY065	130±0.82
		转基因阳性苗	128-134

分析表型变化，圣稻16抽穗期115±0.53天，WY065抽穗期130±0.82天，WY065比圣稻16晚抽穗。转基因阳性苗抽穗期天数变化范围为128-134天，转DTH10-1基因的水稻植株抽穗期明显延迟，因此确定WY065带有迟抽穗基因。同时通过克隆序列的生物信息学与田间表型的分析，可以发现，导入系WY065和转基因阳性苗的抽穗期明显推迟，因此，与圣稻16遗传背景一致的代换系WY065或转基因DTH10-1的阳性苗，更适合于黄淮区南部种植。以黄淮区主栽品种为受体，以地域不同，生态区不同的材料为供体，发展的导入系或转基因DTH10-1的阳性苗，为黄淮区水稻育种开辟了一个新的途径，同时利用DTH10-1基因可以调控水稻的抽穗期(图5)，从而提高品种的地区和季节适应性。

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Claims (5)

1.一种水稻抽穗期基因DTH10-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种含有权利要求1所述的水稻抽穗期基因DTH10-1的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征是，所述表达载体为p1300- DTH10-1，DTH10-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求1所述的水稻抽穗期基因DTH10-1在控制水稻抽穗期方面的应用。

5.一种控制水稻抽穗期的方法，其特征是，用农杆菌介导的遗传转化方法将权利要求3所述的表达载体p1300- DTH10-1转化至圣稻16，得到转DTH10-1基因的水稻植株。