CN110423751A

CN110423751A - 用于提早水稻开花时间的方法、试剂盒、突变基因型

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Publication number: CN110423751A
Application number: CN201910659379.XA
Authority: CN
Inventors: 李甜甜; 花梦婷; 高利芬; 陈利红; 彭海; 周俊飞; 李论; 方治伟
Original assignee: Jianghan University
Current assignee: Jianghan University
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: CN110423751B

Abstract

本发明公开了一种提早水稻开花时间的方法、试剂盒、突变基因型。本发明提供了利用CRISPR‑Cas9方法编辑OsFBO14基因序列，实现水稻提早开花的方法，同时公开了编辑后具有水稻早花性状的基因型序列。本发明通过利用CRISPR/Cas9方法突变水稻F‑box蛋白编码基因OsFBO14，发现了OsFBO14基因对水稻开花时间的调控作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法，可以提早水稻的开花时间，从而可以缩短水稻生育期，减少种植成本，提高水稻的生态适应性。本发明还提供了开花时间提早的基因编辑植株的OsFBO14突变基因型，这些突变基因型序列能够造成水稻开花时间的提早，可以用来改良水稻开花期性状。

Description

用于提早水稻开花时间的方法、试剂盒、突变基因型

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种提早水稻开花时间的方法、试剂盒、突变基因型。

背景技术

在高等植物中，开花代表着从营养生长到生殖生长的转换过程，其在植物体的整个生长发育阶段中具有重要的作用。而何时开花这一生物性状则受到植物体自身遗传因子及外界环境因素的双重作用。在这双重作用的影响下，一系列开花诱导过程在高等植物中具有普遍的规律，即植物体叶片通过感受外界生长条件(光照，温度，湿度等)，在适宜的时间产生成花物质(或叫开花素florigen)，成花物质经过输导组织由叶片运送到茎尖生长点，刺激顶端分生组织成花。

开花期是水稻进化和适应过程中的重要性状，理解水稻开花期性状的遗传基础、克隆候选基因可以提高水稻的环境适应能力和可塑性，这对培育适应不同生态区的优良水稻品种具有重要的意义，同时也将促进产量等与开花期密切相关的重要生产性状的遗传改良进程。此外，水稻的整体生育期主要决定于开花期的长短，适度缩短开花期能够减少整体的生育期，从而降低种植成本。

F-box蛋白是一类含有40-50个保守氨基酸F-box结构域的蛋白家族成员，在真核生物中广泛存在。在泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)中，F-box蛋白因特异识别底物蛋白而参与细胞周期调控、转录调控、细胞凋亡、细胞信号转导等生命活动。在植物中，F-box蛋白质家族是最大的、也是进化最迅速的家族之一。水稻中的F-box蛋白编码基因多达687个(Jain M,Nijhawan A,Arora R,et al.F-box proteins inrice.Genome-wide analysis,classification,temporal and spatial gene expressionduring panicle and seed development,and regulation by light and abioticstress[J].Plant Physiol,2007,143(4):1467-83.)，他们对水稻的叶、根、花器官的发育、种子萌发、细胞分裂素信号均有调控作用(薛红卫，渠莉.调控叶倾角的F-BOX蛋白及其应用：中国专利，CN108727479[P]，2018-11-02.；Song S,Dai X,and Zhang W H.A rice F-box gene,OsFbx352,is involved in glucose-delayed seed germination in rice[J].J Exp Bot,2012,63(15):5559-68.；Kim H J,Kieber J J,and Schaller G E.The riceF-box protein KISS ME DEADLY2 functions as a negative regulator of cytokininsignalling[J].Plant Signal Behav,2013,8(12):e26434.；Yan Y S,Chen X Y,Yang K,et al.Overexpression of an F-box protein gene reduces abiotic stresstolerance and promotes root growth in rice[J].Mol Plant,2011,4(1):190-7.；LiL,Li Y,Song S,et al.An anther development F-box(ADF)protein regulated bytapetum degeneration retardation(TDR)controls rice anther development[J].Planta,2015,241(1):157-66.)。由于水稻中的F-box蛋白基因众多，因此尚有很多成员的功能尚不清楚。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于提早水稻开花时间的试剂盒、突变基因型及方法，本发明提供的利用CRISPR-Cas9方法编辑OsFBO14基因序列，同时公开了编辑后具有水稻早花性状的基因型序列，可以提早水稻的开花时间，从而可以缩短水稻生育期，减少种植成本，提高水稻的生态适应性。

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种提早水稻开花时间的方法，其特征在于：抑制水稻中OsFBO14蛋白的表达和/或活性，进而使水稻开花时间提早。

进一步地，所述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入、物理或化学诱变中任一种。

更进一步地，所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

更进一步地，所述CRISPR/Cas9方法在水稻中的基因组靶标区域的DNA序列为SEQID NO.1所示。

本发明另一方面提供一种用于提早水稻开花时间的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID No.2所示；

(2)所述sgRNA的编码DNA分子；

(3)表达所述sgRNA的载体。

本发明再另一方面提供的一种用于提早水稻开花时间的试剂盒得到的导致水稻提早开花的突变基因型，其特征在于：所述突变基因型序列如SEQ ID No.3-SEQ ID No.8任意一个所示。

上述提早水稻开花时间的方法，抑制水稻中OsFBO14蛋白的表达和/或活性，进而使水稻开花时间提早；在一些实施方案中，抑制蛋白表达和/或活性的方法包括但不限于基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入、物理或化学诱变；在一些实施方案中，该方法采用基因编辑；在一些实施方案中，基因编辑采用CRISPR/Cas9方法；在一些实施方案中，CRISPR/Cas9方法在水稻中的基因组靶标区域的DNA序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的优点及有益效果如下：本发明通过利用CRISPR/Cas9方法突变水稻F-box蛋白编码基因OsFBO14，发现了OsFBO14基因对水稻开花时间的调控作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法，可以提早水稻的开花时间，从而可以缩短水稻生育期，减少种植成本，提高水稻的生态适应性。本发明还提供了开花时间提早的基因编辑植株的OsFBO14突变基因型，这些突变基因型序列能够造成水稻开花时间的提早，可以用来改良水稻开花期性状。

附图说明

图1为本发明OsFBO14基因编码蛋白的结构域分布和CRISPR-Cas9靶点位置示意图。

图2为本发明pCXUN-U3/U6载体图。其中，各元件英文及各缩写含义列举如下：

UbiP 玉米泛素基因启动子

CAS9 Cas9蛋白基因

Nos 胭脂碱合成酶基因终

Terminator 止子

U3/U6 P U3/U6启动子

sgRNA sgRNA序列

U3/U6 T U3/U6终止子

35S p 35s启动子

hptII 潮霉素抗性基因

35S T 35s终止子

L border T-DNA区左边界序列

Kan 卡那霉素抗性序列

pBR pBR322骨架区

pVS1 pVS1复制子

R border T-DNA区右边界序列

图3为本发明OsFBO14基因编辑材料抽穗期表现。

其中，左：中花11野生型水稻；中、右：不同的OsFBO14基因编辑植株。照片摄于播种后73天。

具体实施方式

如本文所用，所述“水稻”是指水稻(Oryza sativa)，包括所有可与水稻繁殖的植物品种，包括野生稻种以及那些属于稻属的允许物种间繁殖的植物。

除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。

阴性或对照植物可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。

若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一水稻OsFBO14基因序列和gRNA序列

水稻OsFBO14(LOC_Os03g27250)基因的编码区序列见SEQ ID NO.9，其编码的蛋白包含F-box结构域(图1)，序列见SEQ ID NO.10。尚无资料表明该基因在水稻中的功能以及其所控制的具体性状。为了明确基因在水稻中的功能，本发明拟采用CRISPR/Cas9基因编辑方法突变OsFBO14基因序列，敲除该基因在水稻中的功能。本发明选取SEQ ID NO.1所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域，合成gRNA序列(序列见SEQ ID NO.2)。

实施例二水稻OsFBO14基因的功能以及利用CRISPR/Cas9方法提早水稻开花时间

1、CRISPR/Cas9载体的构建。

本发明选用水稻粳稻品种中花11(ZH11，中国农业科学院作物科学研究所选育并提供)作为基因编辑的受体。大肠杆菌菌株来自Tran1-T1 Phage Resistant感受态，购自全式金生物技术有限公司。根瘤农杆菌菌株为EHA105，购自上海士锋生物科技有限公司。sgRNA骨架载体pCXUN-U6来自加尼福利亚大学细胞和发育生物学学院赵云德实验室。主要试剂Taq酶购自TIANGEN、内切酶XbaI购自NEB；KT、6-BA、IAA、NAA、2,4-D购自Sigma；Cn、Hn、AS购自GiBco；其他无机试剂来自国药化工。

根据靶点序列和骨架载体序列设计引物，采用CRP-F(SEQ ID NO.11)+OsU6-R(SEQID NO.12)和OsU6F(SEQ ID NO.13)+CRP-R(SEQ ID NO.14)配对扩增得到PCR产物命名为J11-1和J11-2，两个产物分别有422bp和476bp。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为

用Overlap PCR的方式替换原有pCXUN-U6中的序列，构建重组载体，电泳确认后回收目标条带，同源重组将重组载体组装至终载体上。载体图谱见图2。

反应体系为：

反应程序为：

最终DNA被替换为目的片段的产物命名为J11。电泳检查产物条带大小，约898bp，回收目标条带。

胶回收步骤：

(1)在蓝光切胶仪上，从琼脂糖凝胶中回收含有目的条带的胶块放入干净离心管中。

(2)每0.1克胶块中加入0.1mL的Binding Buffer。然后在50-55℃的金属浴上加热直至胶块完全溶解，期间每隔2-3分钟翻转离心管。

(3)将上一步所得到的全部溶解液体转移至试剂盒提供的吸附柱中，室温条件下10,000g离心1min。

(4)倒掉收集管中的废液，再次向吸附柱中加入300μL的Binding Buffer，室温条件下10,000g离心1min。

(5)倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入700μL的Wash Buffer，室温条件下10,000g离心1min。

(6)重复上一个步骤，倒掉收集管中的废液。

(7)将吸附柱重新放入离心管中，13,000g离心2min，自然晾干。

(8)取出吸附柱放入新的离心管，在吸附膜中间悬空加入50μL的ddH₂O，室温下溶解1分钟，13,000g离心1min，得到回收片段溶液。

37℃酶切质粒pCXUN-Cas9两个小时，体系如下。

同源重组连接质粒与外源片段及其转化。

同源重组反应体系如下：

置于50℃反应20min，待反应完成后。之后取冷却反应液加入到200μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min。加入900μLSOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。筛选阳性克隆准备下一步诱导使用。

2、农杆菌介导的遗传转化

(1)愈伤组织诱导

事先准备灭过菌的诱导培养基倒至培养皿中，置于超净台上。水稻种子去掉颖壳，用75％的乙醇浸泡种子1分钟，再用0.1％的氯化汞为种子灭菌消毒，时间为十五分钟，期间反复摇晃，确保灭菌彻底，最后用无菌ddH₂O洗涤种子5-10次。灭过菌的种子接种是诱导培养基上，暗培养30-40天。从诱导愈伤中挑取黄色、颗粒状、干燥、活力强的愈伤组织转入继代培养基中暗培养二十天。继代次数过多会导致遇上转化率低下，因而最好选择继代一次后做侵染。

(2)重组质粒转入EHA105感受态细胞

取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入重组质粒，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

42℃水浴热激30ses，然后快速将管转移到冰浴中2min。

向每个离心管中加入500μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后置于37℃，200转/分培养1小时，使细菌复苏。

取50μl细菌加到含有卡那霉素的LB培养基上，均匀涂开，37℃条件下过夜倒置培养。

(3)侵染与共培养

实验前一天，将含有目的基因的农杆菌菌株在含有卡纳霉素的平板培养基上划线活化。

准备悬浮培养基和共培养基，将划线培养的农杆菌刮入悬浮培养基中，使培养基OD值至：0.5，28℃，200rpm摇动30min。

将愈伤组织收集到三角瓶中，倒入农杆菌菌液浸泡30min。

倒去菌液，将愈伤组织平铺在无菌滤纸上，用滤纸吸干愈伤组织表面菌液，之后自然干燥至愈伤表面无水分。

将充分干燥的愈伤组织平铺到共培养基上，19℃暗光培养2天。

(4)愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织转移至无菌烧杯中，加入灭菌蒸馏水至沒过愈伤组织，震荡烧杯20-30秒，倒掉蒸馏水后重复2-3次。加入灭菌蒸馏水完全沒过愈伤组织，剧烈震荡20-30秒，静置十分钟。如果蒸馏水澄清，则农杆菌基本洗干净了。最后倒掉灭菌水，加入含有羧苄青霉素的灭菌蒸馏水200rpm摇晃30min，倒去蒸馏水。

干燥愈伤，将愈伤组织转移至筛选培养基上，暗光培养14天后再更换一次筛选培养基，暗光培养20天，得到淡黄色的抗性愈伤。

(5)愈伤组织的分化与生根

提前3-4天准备分化培养基。

挑取淡黄色、致密、干燥的抗性愈伤组织，每瓶分化培养基中放入三块抗性愈伤。

光照条件下培养四十天，得到幼苗。

将分化的幼苗从分化培养基中拔出，一块愈伤可能有多株幼苗，只取一株，用剪刀剪去过长的叶子和根后接入生根培养基内，每根生根管接入1-2株幼苗。

光培养15-20天。

(6)炼苗和移栽

当转化幼苗生长至生根管封口膜处时，打开封口膜，加入适量自来水炼苗4-7天，采样进行阳性检验，检验结果呈阳性的转化幼苗移栽至大田。

3、转基因植株的检测

叶片DNA的提取：

(1)称取1.0g幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入1.5mL离心管中，加入600μL 65℃预热的CTAB溶液(用前加入2％的巯基乙醇)；

(2)将装有CTAB和样品的EP管放入65℃水浴，约1h；

(3)冷却后，加入600μL的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1＝300:288:12)，混匀，12,000rpm，离心15min；

(4)吸上清，装入一新的EP管；

(5)加入600μL氯仿：异戊醇(24:1＝576:24)，12,000rpm。离心15min；

(6)吸上清，转入一新的离心管中，加入1/3体积的NaAc(3moL/L)；

(7)加入-20℃预冷的无水乙醇1mL，混匀后置于-20℃(-80℃，30min)3-4h；

(8)12000rpm，10min弃上清；

(9)向离心管中加入75％的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干；

(10)加入ddH₂O(10-20μL)溶解。

转基因阳性植株的检测：

根据潮霉素基因设计引物(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)对转基因植株进行常规的PCR检测，以野生型ZH11为阴性对照。

PCR扩增体系为：

PCR扩增程序为：

琼脂糖凝胶电泳观察结果，筛选阳性植株。

4、CRISPR/Cas9的突变结果检测

以阳性转基因水稻的叶片DNA为模板，在靶标区域两侧设计引物(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)，扩增包含靶标区域的基因组序列，并对扩增得到的PCR产物进行测序，确定序列的编辑情况。

PCR反应体系为：

PCR发应程序为：

选取基因序列发生变化且导致移码突变的植株进行表型观察，发现发生基因编辑的植株的开花(抽穗)时间比对照中花11(ZH11)明显提早(生长环境：2017年和2018年武汉5中旬播种，6月12号插秧，于华中农业大学试验田)，结果见图3。性状调查结果表明，ZH11的开花时间为78天，基因编辑植株的开花时间在71-72天之间，结果见表1。OsFBO14基因敲除后能够导致水稻开花提早，这表明OsFBO14基因对水稻开花时间具有调控作用。而提早水稻开花时间有助于缩短水稻生育期，减少种植成本；同时，由于OsFBO14基因对水稻开花时间具有调控作用，因此可以根据种植地点的气候特征通过增加或降低OsFBO14基因的表达量，人为地调整水稻生育期，从而提高水稻的生态适应性。

表1 OsFBO14基因编辑材料的开花时间

“-”表示碱基删除，黑体表示碱基插入。

基因编辑后，OsFBO14基因靶点区的序列已经发生了变化，变化后的序列能够导致水稻开花提早。这些变化后的基因型(SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.8)可以通过传统有性杂交的方式导入其他水稻材料中，从而提早待改良水稻材料的开花时间。

序列表

<110> 江汉大学

<120> 用于提早水稻开花时间的方法、试剂盒、突变基因型

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atccagggtt gaccagtgcc tgg 23

<210> 2

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 2

auccaggguu gaccagugcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 3

atccagggtt gaccagcctg g 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 4

atccagggtt gagcctgg 18

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 5

atccagggtg cctgg 15

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 6

atccagggtt gaccagtagc ctgg 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 7

atccagggtt gaccgcctgg 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 8

atccagggtt gacgcctgg 19

<210> 9

<211> 2862

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 9

atggcggcgg ggaacggccg gatggaggcg gcgctgggct gcctcgcggc gctccccgac 60

gaggtgctct gcgccgtcgt cgacctcctc ccgcccaccg acgtcggccg cctcgcctgc 120

gtcagcagtg tcatgtacat actttgcaat gaggagcctc tctggatgag caagtgtctt 180

tcagttgggg gtcttcttgt gtatagaggt tcttggaaga aaacagcatt gtctagactt 240

aatctttgtt cagaaaatga tgagatttac cagaagcctc gccattttga tgggttcaat 300

tccatgcact tatacaggag atggtacaga tgttttacta atttgagtag cttttccttt 360

gataatgggc acgttgaaag gaaagatgac ctttctctag accaatttcg cgctcagtat 420

gatggaaaat gtccagtttt gcttactaaa ctggctgaaa cctggccagc aaggactaaa 480

tggacagcgc agcaactgac acatgattat ggtgaagttc cctttaggat atctcagaga 540

agccctcaaa agataaaaat gaaactaaaa gattatgttt tttacatgga actccagcat 600

gacgaagatc cactttacat atttgatgat aagtttggag aatcagcacc tacactattg 660

gaagattaca gtgtccctca tctatttcaa gaagatttct ttgaaatcat ggattacgac 720

caacgaccag ctttcagatg gcttattatt ggaccagaga gatcaggtgc ttcttggcat 780

gttgatccag ggttgaccag tgcctggaat actcttcttt gtggccgaaa aaggtgggca 840

atgtaccctc ctggaagagt accaggtggt gtcacagtac atgtcagtga tgaagatggt 900

gatgttgaca ttgaaactcc tacatctttg cagtggtggc tagatatcta cccaaatctt 960

gctgagcatg agaaaccact ggaatgcaca caattaccag gagagaccat atttgttcct 1020

agtgggtggt ggcattgtgt tttgaacctt gacatgacaa ttgctgtcac gcaaaatttt 1080

gtcaaccaat caaattttaa gcatgtatgt ttggacatgg cacctggtta ctgtcacaaa 1140

ggagtttgcc gtgctggctt acttgctgct ccagacaaat ctattagaga tattgaaaat 1200

cttcctagta taacgagtag attgaaccac tctgacatgg cctgtaagga aaaaagactg 1260

aaaagttcag agcctataag aacttcaaat aatgcaaatc agtgttctgc atttgagttc 1320

tcagatgttc atgaaaactt gggggaccaa gttttttcgt atgatataga tttcttatcc 1380

caattccttg agaaagaaaa ggatcactat tcttctgtct ggagccctac taattcaatt 1440

ggccagagag aagcaagaga atggctacgt aggctatggg ttcttaaacc tgaattgaga 1500

gaactaatat ggaagggtgc atgtctagca attaatgtag acaagtggta ttcatgctta 1560

gaggaaataa gtgcatgcca tagtttacca ccaccttctg aagatgagaa gcttcctgtt 1620

ggcacaggta gcaacccagt cttcattgtt tctggcaatg tgatcaaaat ttatgctgaa 1680

ggagggttgg gttattctat acatggtttg ggcacagagc ttgagttcta tgatcttctg 1740

caaaaacttg gctcgccatt gatcaaccat gtccctgaga tcattgcaag tggctttctt 1800

gtgtacctgg atggtgtcta caagacagtt ccatgggatg gaaacggaat accagatgtt 1860

ctagctaaat actactcttt ggaggtgtct tatgcaaacg gctcttttcc tcttggatta 1920

tggagcaagc aactgtttgg attgagtaat tcaactgatg ctccagacag accaatttgt 1980

ccttacatgg ttaccagaaa atgcaaaggg gatatttttg ctcgcatacg tgataaattg 2040

accaagactg atgttttgaa tcttgcatca tccttgggag ttcaaatgcg aaatattcat 2100

caattacccc ttccacatgt ggaacacata tccaaatctg ggaacgaaga tatcaaagca 2160

aaggaaaatt caatttctga tgtcactcat gttccgcctg aatggaaaca agtagtttct 2220

actctagaca ggagaaagaa aagtataaag aagcatctaa gtaactgggg tggttcaatt 2280

ccacaggttc taattgagaa ggctgaagaa tatctccctg acgacatccg ctttcttatc 2340

aagtttgtta aggacgatga tggtgattca gtctatgtgg taccttcttg gatacattca 2400

gatataatgg atgataacat tctcattgag gggaccacag aaccaggaac ttccactgat 2460

tgcattgccg ttgaagatct gaacaaaatg gatgcaattc atatcattga tttcagtgat 2520

ctgtccattg gggatcctct atgtgactta attccactgc acttggatgt attccgtggt 2580

gatattgatc ttctcaggca gtttttacga agctatcagc ttccttttct gagagcagaa 2640

tcaaataaag atatatacaa gtcaatacaa aattctaaat tcagcagggc atcgtatcgt 2700

gcgatgtgct actgcatact tcacgaggac aacgtcctgg gagccatatt tagcctgtgg 2760

aaggatctgg gcaccgcgac gtcatgggaa gatgttgaac acttggtttg gggagagctg 2820

aatcaatacc agcagtcatg cagcgtgggc gaaattaact ga 2862

<210> 10

<211> 953

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 10

Met Ala Ala Gly Asn Gly Arg Met Glu Ala Ala Leu Gly Cys Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Pro Asp Glu Val Leu Cys Ala Val Val Asp Leu Leu Pro Pro

20 25 30

Thr Asp Val Gly Arg Leu Ala Cys Val Ser Ser Val Met Tyr Ile Leu

35 40 45

Cys Asn Glu Glu Pro Leu Trp Met Ser Lys Cys Leu Ser Val Gly Gly

50 55 60

Leu Leu Val Tyr Arg Gly Ser Trp Lys Lys Thr Ala Leu Ser Arg Leu

65 70 75 80

Asn Leu Cys Ser Glu Asn Asp Glu Ile Tyr Gln Lys Pro Arg His Phe

85 90 95

Asp Gly Phe Asn Ser Met His Leu Tyr Arg Arg Trp Tyr Arg Cys Phe

100 105 110

Thr Asn Leu Ser Ser Phe Ser Phe Asp Asn Gly His Val Glu Arg Lys

115 120 125

Asp Asp Leu Ser Leu Asp Gln Phe Arg Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Cys

130 135 140

Pro Val Leu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Thr Trp Pro Ala Arg Thr Lys

145 150 155 160

Trp Thr Ala Gln Gln Leu Thr His Asp Tyr Gly Glu Val Pro Phe Arg

165 170 175

Ile Ser Gln Arg Ser Pro Gln Lys Ile Lys Met Lys Leu Lys Asp Tyr

180 185 190

Val Phe Tyr Met Glu Leu Gln His Asp Glu Asp Pro Leu Tyr Ile Phe

195 200 205

Asp Asp Lys Phe Gly Glu Ser Ala Pro Thr Leu Leu Glu Asp Tyr Ser

210 215 220

Val Pro His Leu Phe Gln Glu Asp Phe Phe Glu Ile Met Asp Tyr Asp

225 230 235 240

Gln Arg Pro Ala Phe Arg Trp Leu Ile Ile Gly Pro Glu Arg Ser Gly

245 250 255

Ala Ser Trp His Val Asp Pro Gly Leu Thr Ser Ala Trp Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Cys Gly Arg Lys Arg Trp Ala Met Tyr Pro Pro Gly Arg Val Pro

275 280 285

Gly Gly Val Thr Val His Val Ser Asp Glu Asp Gly Asp Val Asp Ile

290 295 300

Glu Thr Pro Thr Ser Leu Gln Trp Trp Leu Asp Ile Tyr Pro Asn Leu

305 310 315 320

Ala Glu His Glu Lys Pro Leu Glu Cys Thr Gln Leu Pro Gly Glu Thr

325 330 335

Ile Phe Val Pro Ser Gly Trp Trp His Cys Val Leu Asn Leu Asp Met

340 345 350

Thr Ile Ala Val Thr Gln Asn Phe Val Asn Gln Ser Asn Phe Lys His

355 360 365

Val Cys Leu Asp Met Ala Pro Gly Tyr Cys His Lys Gly Val Cys Arg

370 375 380

Ala Gly Leu Leu Ala Ala Pro Asp Lys Ser Ile Arg Asp Ile Glu Asn

385 390 395 400

Leu Pro Ser Ile Thr Ser Arg Leu Asn His Ser Asp Met Ala Cys Lys

405 410 415

Glu Lys Arg Leu Lys Ser Ser Glu Pro Ile Arg Thr Ser Asn Asn Ala

420 425 430

Asn Gln Cys Ser Ala Phe Glu Phe Ser Asp Val His Glu Asn Leu Gly

435 440 445

Asp Gln Val Phe Ser Tyr Asp Ile Asp Phe Leu Ser Gln Phe Leu Glu

450 455 460

Lys Glu Lys Asp His Tyr Ser Ser Val Trp Ser Pro Thr Asn Ser Ile

465 470 475 480

Gly Gln Arg Glu Ala Arg Glu Trp Leu Arg Arg Leu Trp Val Leu Lys

485 490 495

Pro Glu Leu Arg Glu Leu Ile Trp Lys Gly Ala Cys Leu Ala Ile Asn

500 505 510

Val Asp Lys Trp Tyr Ser Cys Leu Glu Glu Ile Ser Ala Cys His Ser

515 520 525

Leu Pro Pro Pro Ser Glu Asp Glu Lys Leu Pro Val Gly Thr Gly Ser

530 535 540

Asn Pro Val Phe Ile Val Ser Gly Asn Val Ile Lys Ile Tyr Ala Glu

545 550 555 560

Gly Gly Leu Gly Tyr Ser Ile His Gly Leu Gly Thr Glu Leu Glu Phe

565 570 575

Tyr Asp Leu Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Leu Ile Asn His Val Pro

580 585 590

Glu Ile Ile Ala Ser Gly Phe Leu Val Tyr Leu Asp Gly Val Tyr Lys

595 600 605

Thr Val Pro Trp Asp Gly Asn Gly Ile Pro Asp Val Leu Ala Lys Tyr

610 615 620

Tyr Ser Leu Glu Val Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Phe Pro Leu Gly Leu

625 630 635 640

Trp Ser Lys Gln Leu Phe Gly Leu Ser Asn Ser Thr Asp Ala Pro Asp

645 650 655

Arg Pro Ile Cys Pro Tyr Met Val Thr Arg Lys Cys Lys Gly Asp Ile

660 665 670

Phe Ala Arg Ile Arg Asp Lys Leu Thr Lys Thr Asp Val Leu Asn Leu

675 680 685

Ala Ser Ser Leu Gly Val Gln Met Arg Asn Ile His Gln Leu Pro Leu

690 695 700

Pro His Val Glu His Ile Ser Lys Ser Gly Asn Glu Asp Ile Lys Ala

705 710 715 720

Lys Glu Asn Ser Ile Ser Asp Val Thr His Val Pro Pro Glu Trp Lys

725 730 735

Gln Val Val Ser Thr Leu Asp Arg Arg Lys Lys Ser Ile Lys Lys His

740 745 750

Leu Ser Asn Trp Gly Gly Ser Ile Pro Gln Val Leu Ile Glu Lys Ala

755 760 765

Glu Glu Tyr Leu Pro Asp Asp Ile Arg Phe Leu Ile Lys Phe Val Lys

770 775 780

Asp Asp Asp Gly Asp Ser Val Tyr Val Val Pro Ser Trp Ile His Ser

785 790 795 800

Asp Ile Met Asp Asp Asn Ile Leu Ile Glu Gly Thr Thr Glu Pro Gly

805 810 815

Thr Ser Thr Asp Cys Ile Ala Val Glu Asp Leu Asn Lys Met Asp Ala

820 825 830

Ile His Ile Ile Asp Phe Ser Asp Leu Ser Ile Gly Asp Pro Leu Cys

835 840 845

Asp Leu Ile Pro Leu His Leu Asp Val Phe Arg Gly Asp Ile Asp Leu

850 855 860

Leu Arg Gln Phe Leu Arg Ser Tyr Gln Leu Pro Phe Leu Arg Ala Glu

865 870 875 880

Ser Asn Lys Asp Ile Tyr Lys Ser Ile Gln Asn Ser Lys Phe Ser Arg

885 890 895

Ala Ser Tyr Arg Ala Met Cys Tyr Cys Ile Leu His Glu Asp Asn Val

900 905 910

Leu Gly Ala Ile Phe Ser Leu Trp Lys Asp Leu Gly Thr Ala Thr Ser

915 920 925

Trp Glu Asp Val Glu His Leu Val Trp Gly Glu Leu Asn Gln Tyr Gln

930 935 940

Gln Ser Cys Ser Val Gly Glu Ile Asn

945 950

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 11

atccagggtt gaccagtgcc gttttagagc tagaaatagc aagtta 46

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 12

tacgaattcg agctcggtac cgatggtgct tactgtttag 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 13

cccctttcgc caggggtacc tatgtacagc attacgtagg 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 14

ggcactggtc aaccctggat aacctgagcc tcagcgcagc 40

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 15

agaagaagat gttggcgacc t 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 16

gtcctgcggg taaatagctg 20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 17

atttccttca gggttcaatt ccat 24

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 18

atcatctaca gatgagcctc caaca 25

Claims

1.一种提早水稻开花时间的方法，其特征在于：抑制水稻中OsFBO14蛋白的表达和/或活性，进而使水稻开花时间提早。

2.根据权利要求1所述提早水稻开花时间的方法，其特征在于：所述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入、物理或化学诱变中任一种。

3.根据权利要求2所述提早水稻开花时间的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

4.根据权利要求3所述提早水稻开花时间的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法在水稻中的基因组靶标区域的DNA序列为SEQ ID NO.1所示。

5.一种用于提早水稻开花时间的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID No.2所示；

(2)所述sgRNA的编码DNA分子；

(3)表达所述sgRNA的载体。

6.一种利用如权利要求5所述用于提早水稻开花时间的试剂盒得到的导致水稻提早开花的突变基因型，其特征在于：所述突变基因型序列如SEQ ID No.3-SEQ ID No.8任意一个所示。