CN108794607A

CN108794607A - 一种调控水稻开花期和每穗颖花数的产量基因OsAFB6及应用

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Publication number: CN108794607A
Application number: CN201710298063.3A
Authority: CN
Inventors: 邢永忠; 何芹
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-04-29
Filing date: 2017-04-29
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2037-04-29
Also published as: CN108794607B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控水稻开花期和每穗颖花数的产量基因OsAFB6及应用。该基因的核苷酸序列，蛋白质序列及启动子序列分别如SEQ ID NO：1，2，和3所示。通过突变体中分离侧翼序列，找到载体插入位点位于第三染色体上臂的特定位置，附近含有一个生长素受体基因OsAFB6，定位候选基因；发现OsAFB6基因被超表达；利用529份水稻核心种质做SNP和关联分析，该基因启动子中有4个SNP与开花期和产量显著相关，4个SNP都是同时变化，且变化后开花期提前。利用超表达和RNAi干扰载体转化水稻品种，超表达转基因植株的开花期延迟，枝梗数增多，产量提高，全部达显著水平。

Description

一种调控水稻开花期和每穗颖花数的产量基因OsAFB6及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控水稻开花期和每穗颖花数的产量基因OsAFB6及应用。从水稻中克隆到一个位于水稻第三染色体短臂上端控制水稻开花期、一次枝梗及每穗颖花数的多效基因OsAFB6的基因，对其进行功能验证及其应用。

背景技术

水稻开花期是一个受多基因控制的适应性性状，含有41个成员的CCT家族在水稻开花期调控方面起到了重要作用，如Hd1短日照下促进开花(Yano et al.2000)，长日照下抑制开花；Ghd7和Ghd7.1仅仅在长日照条件下抑制开花(Xue et al.2008；Yan etal.2013),这三个都是CCT家族的主效开花基因，在随后的研究中另外9个水稻CCT基因也被证实调控开花(Zhang et al.2015)。此外还有CO3基因仅在短日照条件下抑制开花(Kim etal.2008)，COL4,10,13和PhyB基因在长短日照下都抑制开花(Lee et al.2010,Tan etal.2016,Sheng et al.2016,Ishikawa et al.2011)，以及MADS家族基因(Bian etal.2011)等等。

水稻产量包括很多组成部分，比如源(可同化营养物质和生物量)、库(稻谷产量)、流(运输同化物的能力)(Cui et al.2003)。其中库的大小是产量的直接表现形式，在水稻中穗大小对产量有直接影响。枝梗主要包括一次枝梗和二次枝梗，其数目是重要的穗部性状，决定穗的大小，并且有研究表明枝梗数与穗长、每穗颖花数、穗重、产量等性状都呈显著正相关(匡勇等，2011)。因此，阐明枝梗数的遗传基础和分子机理可为构建理想的水稻穗形和优化产量构成因子提供理论基础，对指导高产育种具有重要意义。与水稻穗部表型相关的基因也是研究热点。比如细胞分裂素氧化酶基因Gn1a，其表达量降低引起花序分裂组织中细胞分裂素的积累，因而增加了颖花数量，即粒数，最终导致产量提高(Ashikari etal.,2005)。

随着水稻基因组功能研究的发展，许许多多的水稻开花期以及产量因子相关基因先后被克隆，水稻开花调控网络也逐步完整，本发明所涉及的OsAFB6属于AFB家族，作为生长素的受体，其单基因表达量的改变引起开花期、产量等性状同时发生变化，以前从未见报道，该基因遗传效应显著，对于水稻产量和品种性状的改良具有巨大的应用潜力和前景，为水稻的产量和品质育种提供新的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从水稻中分离克隆一个第三染色体上控制水稻开花期、枝梗数目以及单株产量的主效基因，利用这个基因能大幅度提高水稻产量。该基因为一个含有F-box结构域的生长素受体基因，根据其所属基因家族命名方式，申请人将该基因命名为OsAFB6(auxin-signaling F-box 6)基因。

本发明的技术方案如下所述：

在转基因过程中本发明得到一个与所转基因无关的3:1晚花为显性的突变体材料，利用TAIL-PCR技术分离得到一个侧翼序列，发现超表达载体插入于一个生长素信号途径F-box基因的启动子区域。通过对该基因表达量与开花期表型的关联，确定其为候选基因。进一步对该候选基因的表型性状进行考察，发现该基因超表达后除了开花期延迟之外，还增多了穗颈节的维管束数目，并且通过增加枝梗数导致增加每穗颖花数从而大幅提高了单株产量。再利用一个自然群体对该基因进行关联分析，认为该基因在自然群体中是保守的，但启动子区域自然变异仍较大并且在进化过程中受到了选择。最后，利用超表达转基因技术，通过农杆菌介导的遗传转化对该基因的功能进行了验证。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明利用一个超表达转基因事件得到的与目标基因表达量不相关的晚花：早花符合3:1的突变体材料F2家系(材料具体获得方式详见实施例1)，并且同时影响了很多其他表型(见图1)。通过southern检测，验证了该转基因突变体确实为单拷贝插入，符合3:1的孟德尔单基因分离规律。随后利用TAIL-PCR分离插入位点侧翼序列，得知该载体插入于一个auxin-signaling F-box基因(Loc_Os03g08850)的启动子区域(位于起始密码子上游560bp左右的位置，具体参见图1)。通过对插入区间23kb范围内3个基因(Loc_Os03g08850、Loc_Os03g08860、Loc_Os03g08870)的表达量检测，发现仅Loc_Os03g08850的表达量被提升了约20倍，另外两个基因表达量与阴性对照单株几乎无差异，因此认定Loc_Os03g08850(即OsAFB6基因)为候选基因。相对于阴性对照来说，突变体材料该基因启动子处插入了一个由35S介导的pCAMBIA1301骨架的超表达载体，导致其表达量几十倍上升。该候选基因的部分核苷酸如序列表SEQ ID NO：1中第1至1821位碱基对应的序列，该基因片段为编码区，共编码603个氨基酸，通过对529份水稻核心资源品种的SNP信息数据(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)分析发现在该基因编码区1818bp内，仅存在5个不改变氨基酸序列的同义突变SNP(图2)。然而，对起始密码子上游2kb的启动子区域进行分析，则发现共有37个SNP,其中4个SNP会造成开花期的显著差异(图3)。并且，利用超表达转基因技术，通过农杆菌介导的遗传转化，得到表达量上升倍数不等的两个家系(表达量分别上升9倍和19倍，具体表达量检测结果见图4，表型数据见表4)，发现该基因表达量的升高能够使转化受体水稻“中花11，简称ZH11”在短日照条件下的开花期延迟，一次枝梗数增加，每穗颖花数增加。表型改变程度全部与表达量变化程度符合，且都达到极显著水平的差异。抑制表达转基因并无发现表型差异(具体表达量检测结果见图5)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

(1)本发明在水稻中克隆了控制水稻开花期、枝梗数目以及单株产量的主效基因，为水稻的高产育种提供了新的基因资源；

(2)本发明结合基因定位，关联分析和遗传转化的方法，快速高效克隆基因，为其它作物中克隆相关基因提供了技术借鉴。

附图说明

SEQ ID NO：1是OsAFB6基因的编码区的核苷酸序列(1-1812碱基所示的序列)及其对应的氨基酸序列(1-1812碱基所示的序列)。编码603个氨基酸残基。该1812bp的序列只含外显子的编码区cDNA序列。

SEQ ID NO：2是OsAFB6基因的编码蛋白质序列，编码603个蛋白质。

SEQ ID NO：3是OsAFB6基因的启动子序列，序列全长为2000bp

SEQ ID NO：4是OsAFB6基因的超表达片段，序列全长为2020bp(该2020bp的序列包含外显子和内含子的完整DNA序列)。

SEQ ID NO：5是OsAFB6基因的双链抑制片段，序列全长为472bp(该472bp序列的前半部分为1812序列，即SEQ ID NO：1所示序列的3’末端的序列，后半部分序列为1812bp，即SEQ ID NO：1所示序列结束后紧接着的3’-UTR序列。由于抑制后没有表型，故将这个序列相关的部分删除)。

图1：一种超表达突变体T1代水稻植株的表型。附图标记说明：图1中的a图为突变体开花期延迟(图中：右图为转基因突变体，左图为阴性株对照)；图1中b图为苗期根长变长(其中：右图为转基因突变体，左图为阴性株对照)，图1中的c图显示转基因植株茎节多一节，穗长变长，然而株高不变(其中：右图为转基因突变体，左图为阴性株对照)；图1中的d图为枝梗及颖花数增多(其中：右图为转基因突变体，左图为阴性株对照)；图1中的e图和f图显示粒长粒宽变小(其中：下图为转基因突变体，上图为阴性株对照)。

图2:水稻第三染色体载体插入位点附近的示意图。

图3：529份水稻核心资源品种中OsAFB6基因编码区内部的5个SNP。

图4：529份水稻核心资源品种中OsAFB6基因启动子区2Kb范围内的37个SNP。

图5：一种超表达T0代转基因植株中OsAFB6基因的表达量检测示意图。附图标记说明：

图中：OX1；OX2分别代表两个T0代转基因家系，NP为转基因阴性对照株，WT为野生型ZH11材料。图6：一种抑制表达T0代转基因植株中OsAFB6基因的表达量检测示意图。附图标记说明：

图中：ds1；ds2分别代表两个T0代转基因家系，NP为转基因阴性对照株，WT为野生型ZH11材料。

图7：本发明的起始载体pCAMBIA1301的图谱。

图8：本发明构建的抑制表达载体pds1301图谱。

本发明载体pds1301的制备方法：将pMCG161(GenBank ID:AY572837.1)用EcoRI和HindIII(均购自宝生物工程大连有限公司)酶切后回收外源片段，再连入到起始载体pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)中得到表达载体pds1301。

具体实施方式

实施例1：OsAFB6突变体的获得与候选基因的确定

1、水稻CCT05基因(Loc_Os02g08150)超表达载体的构建

1)根据数据库Rice Genome Annotation Project(http:// rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/sequence_display.cgi？orf＝LOC_Os02g08150.1)公布的水稻CCT05基因(Loc_Os02g08150)序列)。设计一对如下所述带有限制性核酸内切酶SmaI和BamHI接头的PCR特异引物，以水稻品种明恢63(常规品种，简称MH63)作为供体模板，进行PCR扩增，得到完整的CCT05的基因片段。

CCT5OXF CCCGGGATGGAGATGGAGCTAGGGTT

CCT5OXR GGATCCCTAGAAGGTAGGCACGACGC

水稻CCT05基因(Loc_Os02g08150)的具体序列如下所述：

ATGGAGATGGAGCTAGGGTTGGGAAGGTACTGGGGGGTTGGGAGGAGGCGGTGCGGCGCGTGCGCGGTGGCGCCGGCGGCGGTGCACTGCCGGACGTGCGACGGCGACGGCGGCGGAGGTGGGTATCTGTGCGCGGGGTGCGACGCGGAGCATGGGAGGGCGGGGCACGAGAGGGTGTGGGTGTGCGAGGTGTGCGAGCTCGCGCCGGCGGCGGTCACCTGCAAGGCCGACGCGGCGGCGCTGTGCGCCGCCTGCGACTCCGACATCCACGACGCCAACCCGCTGGCCCGCCGCCACGAGCGCGTCCCCGTGCATCCGATCGGGTCATCCGCCGCCCCGCCGCCGGACGCGCTCCTGCTCGGCGGGGAGAACGACGCCGCTGCCGCCGTCGACGGCGGCGGCGGCGGCAAGGAGGTGAAGCTGGACTTCCTGTTCGCCGACTTCATGGACCCGTACCTCGGCGGCTCCCCCGAGCTCGCGCGCTTCCCTCACGCCGACAGCGTGGTGCCCAACCACAACGGATCGGCCGGTCCCGCGATGGAGCTGGGCTTCGCCGGTGGCGGCGGCGCCGCCGTCAAACCGTCGTACAGCTCCTACACGGCGGCTTCCCTCGGCAACAGCGGCTCGTCGTCGGAGGTCGGGCTGGTGCCGGACGCCATCTGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAATCATCGAGCTCGACTTCGCGCAGTCCAAGGCGGCCTACCTGCCATACGCCTCGACCCCTAGCCATAGCATGTCCTCGTCGATGGATATGGGCGTGGCGGCGCCGGAGATGAGCGACTGCGCGGCGGCGGCGGCCGGGAGGGCGTACGCGGCGGAGGGGAGAGCGGCGCGGCTGATGCGATACCGGGAGAAGCGCAAGAACCGGCGGTTCGAGAAGACGATCCGGTACGCGTCGCGCAAGGCCTACGCCGAGACGCGCCCCCGCGTCAAGGGCCGCTTCGCCAAGCGCGCCGACGACCACGACGCCGCCGCGCCGCCGCCGCAGATCATGCTCGACTTCGCCGGCTACGGCGTCGTGCCTACCTTCTAG

2)将得到的片段利用配套的连接酶连接到TA克隆T载体上(连接酶和载体均购自Promega公司，具体操作方法参见载体说明书)。

3)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，在含有250ppm氨苄青霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；

4)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm氨苄青霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002版)所述的方法抽提质粒，用SmaI和BamHI(购自宝生物工程大连有限公司)酶切检测，得到的阳性质粒用T7和SP6启动子通用引物进行测序验证，得到超表达中间载体；

5)利用限制性核酸内切酶SmaI和BamHI酶切阳性克隆，进行亚克隆，再连接到双元超表达载体pCAMBIA1301S)(即在pCAMBIA1301多克隆位点旁加上一个35S强启动子)上(图7)。

2、超表达载体的遗传转化

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液的缩写)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液的缩写)

2)溶液配方

a)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。

b)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

将上述试剂在20-25摄氏度下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

c)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

d)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

e)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

将上述试剂在20-25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

f)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)的配制

g)2,4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2,4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于20-25℃温度下保存。

h)6-苄氨基嘌呤(6-BA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，20-25℃温度保存。

i)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

j)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

k)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

l)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

m)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，20-25℃温度保存备用。

3)用于水稻遗传转化的培养基配方

a)诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

b)继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

c)预培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

d)共培养培养基

加蒸馏水至250毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

e)悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节pH值至5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

f)选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

g)预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

h)分化培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

i)生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

4)农杆菌介导的遗传转化步骤

a)愈伤诱导

将成熟的水稻品种“中花11”水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟，用灭菌水清洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上。将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

b)愈伤组织继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

c)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

d)农杆菌培养

在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，1998)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

e)农杆菌侵染

将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

f)愈伤洗涤和选择培养

灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

g)分化

将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，在光照强度为90000-100000lux下培养，培养温度为26℃。

h)生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

i)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

在得到的转基因后代中，仅一个T2代家系在2012和2013两年重复实验中，均出现晚花：早花性状出现3:1的性状分离。通过基因的表达量检测发现，在这个T2家系中，CCT05基因的表达量并没有发生变化，因此排除了CCT05基因被超表达造成晚花表型的可能性。于是考虑转基因插入事件造成突变。根据后面部分的验证工作，此突变体被命名为OXOsAFB6(OsAFB6基因的超表达突变体)，申请人将该突变体材料命名为稻属亚洲栽培稻IOXOsAFB6，Oryza Sativa IOXOsAFB6，于2017年4月5日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:P201709)。随后的表型考察中发现该突变体的开花期在长日照下延迟22天，短日照下延迟12天，分蘖数略少，苗期根长增加，主茎节数增加一个，穗长增长，一、二次枝梗数及每穗颖花数增多，尽管谷粒略变小，但单株产量在长短日照条件下均显著提高50％左右(检测结果如图1所示)。

2.拷贝数检测

抽提上述突变体及其阴性对照两个水稻材料植株叶片总DNA，DNA抽提方法参考CTAB法(见Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonicarice detected by RFLP analysis,1992,Theor Appl Genet,83,495-499)。利用pCAMBIA载体(一种常用载体，购自澳大利亚CAMBIA实验室)上的潮霉素基因片段做探针(引物序列如下编号所示的HNF和HNR)，采用高保真度的LA-Taq从这两个品种的基因组中进行PCR扩增(PCR反应总体系为20μl，具体配法为：DNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，双向引物各0.4μl，LATaq酶0.2μl，加双蒸水至20μl。所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg²⁺、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司产品。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃50秒，第⑤步是从②步－④步循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存)。此后，利用Roche公司的地高辛southern试剂盒(DIG-High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I)进行标记，并参照其说明书进行后续southern操作。

测序引物的DNA序列由上海生工生物服务有限公司合成，所述的引物组合如下所示：

HNF CGAAGCCCGCTGCTGCGA

HNR TCCTTGCCGAGCTGGGAT

结果表明该突变确实为单拷贝，这一结果与开花期性状呈3:1的表型分离结果完全吻合。

3.侧翼序列分离

同样利用上述方法抽提的水稻植株叶片总DNA。根据pCAMBIA载体序列(AF234297.1)设计了特异的SP1，SP2，SP3引物，还设计了五条短的低退火温度的简并扩增引物如AD2-1，AD2a，AD8，AD10和AD11，以及两条测序引物NTLB5和PFRB4(引物序列如下所示)。具体操作步骤为：

PCR1：

反应体系：

反应程序：

PCR2：

反应体系：

反应程序：

PCR3

体系：

反应程序：

然后，取5μl的PCR产物做测序前的消化反应。利用5U的EXOI(Biolabs公司产品)，0.13U的SAP(购自宝生物工程大连有限公司)以及1×PCR buffer(购自宝生物工程大连有限公司)在37℃反应，使PCR产物消化1小时。最后，利用美国PE公司的测序试剂盒BigDyeTerminator Cycle Sequencing v2.0和ABI 3730测序仪(美国ABI公司产品，按说明书操作)分别从每个PCR产物两端测序。

测序引物的DNA序列由上海生工生物工程服务有限公司合成，所述的引物组合如下所示：

测序结果显示载体插入一个auxin-signaling F-box基因(Loc_Os03g08850)的起始密码子上游560bp左右的位置(如图2所示)。

4.候选基因表达量检测

由于该插入位点不在基因内部，为了验证表达调控的可能，我们将包括Loc_Os03g08850基因在内的附近三个基因全部进行了表达量的检测。通过常规的RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)从水稻品种“中花11”苗期叶片中扩增得到cDNA序列。cDNA的具体扩增方法如下：

1)先抽提来自水稻超表达突变体及其阴性对照材料的苗期叶片RNA，RNA抽提使用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；

2)RT-PCR中反转录合成cDNA第一链：配混合液1：总RNA 2μg，DNaseI 2U,10xDNAseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligdT，④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：混合液1 10μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；

然后根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的三个候选基因全长cDNA序列，设计特异引物PCR扩增特异片段。引物的DNA序列如下所述：

试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。

结果表明Loc_Os03g08850的表达量被提升了20倍左右，另外两个基因(Loc_Os03g08860、Loc_Os03g08870)表达量与阴性对照单株相当，因此我们认为Loc_Os03g08850(即OsAFB6)为候选基因，并且表型是由于原位超表达造成。

实施例2：OsAFB6基因的启动子与蛋白质多态性及其与开花期的关联分析

Gl3基因的蛋白质多态性以及它与谷粒粒长的关联分析

1.OsAFB6基因cDNA的分离

1)本发明所对应的OsAFB6基因(LOC_Os03g08850)，在水稻功能基因组表达数据库(http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)中公布的该基因的转录本为1812bp(SEQ IDNO：1)，其编码603个氨基酸(SEQ ID NO：1)。cDNA的具体扩增方法如上所述。

2)然后根据公布的该基因全长cDNA序列，设计特异引物PCR扩增特异片段。引物的DNA序列如下所述：

AFB6F ATGTCCGAGGAGGACGACGA

AFB6R TTATAGGATCTTCACGAATG

PCR反应总体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，双向引物各0.4μl LATaq酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃50秒，⑤从②－④循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。

3)PCR扩增得到OsAFB6的cDNA产物，将其连接到T/A克隆载体pGEMT-vector(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)上并用T7和SP6引物(载体pGEMT-vector自带的引物)测序验证。

2.529份水稻核心种质资源材料OsAFB6基因及其等位基因的氨基酸及启动子序列比对

通过对ricevarmap网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)的529份水稻材料(主要分为籼稻、粳稻、秋稻)测序的SNP数据进行分析发现：

1)OsAFB6基因编码区的1812bp范围内仅有5个SNP，并且全部不造成氨基酸的变异。排除只存在一个品种的单倍型以及测序不确定的部分，总共还有510个品种进行分析。这些品种分为4个单倍型，其中单倍型1和2主要包含籼稻，单倍型3主要包括粳稻，秋稻则主要分布于单倍型1和4(图3)。

2)OsAFB6基因启动子区的2kb范围内有37个SNP，同理，除去只存在一个品种的单倍型以及测序不确定的部分，总共还有490个品种进行分析。这些品种分为7个单倍型，其中单倍型1、2、3主要包含籼稻，单倍型4、5、6主要包括粳稻，单倍型7则全部是秋稻品种(图4)。在490份品种的群体中，启动子部分的中性进化检验Tajima’s D和Fu and Li’s D都是显著大于零的(表1)，推断该区间受到了自然选择，属于平衡选择造成的中等频率等位基因占主导，或者是种群大小在经历瓶颈时使稀有等位基因丢失。

表1启动子及编码区核酸多样性及中性测验(S表示分离位点个数，π表示任意两个序列之间每个分离位点上的不同碱基平均数，θ表示Watterson值，D1表示Tajima's D值，D2表示Fu and Li’s D值，*,**分别表示P<0.05和0.01的显著水平)

3、OsAFB6基因与开花期的关联分析

1)通过对上述品种资源中OsAFB6基因编码区和启动子区的SNP分析发现，编码区的5个SNP与水稻开花期并无关联，启动子区的37个SNP中，有4个SNP(S_-1198、S_-955、S_-954、S_-652)与开花期性状显著相关，并且这四个SNP都同时仅仅出现在单倍型6中与早花紧密相关。这与单倍型6的平均开花期也相对来说比较早刚好吻合。

表2启动子中四个与开花期性状关联的SNP

阈值＝0.05/37＝0.0013

2)考虑到群体结构效应，申请人只比较单倍型6中的粳稻品种与其他单倍型的粳稻之间的开花期，发现差异达到极显著(p＝1.44E-05)，如表3。因此，申请人认为，粳稻自然群体的开花期差异，与OsAFB6基因启动子这四个SNP显著相关。

表3自然群体中含有这四个SNP的品种与其他品种之间的开花期差异

实施例3：OsAFB6基因的功能验证

1、超表达载体的构建

1)设计一对如下所述带有限制性核酸内切酶SmaI和BamHI接头的PCR特异引物扩增OsAFB6的基因组DNA片段。

AFB6OXF CCCGGGATGTCCGAGGAGGACGACGA

AFB6OXR GGATCCTTATAGGATCTTCACGAATG

2)具体载体构建过程详见实施例1的1、水稻CCT05基因(Loc_Os02g08150)超表达载体的构建部分。

2、RNAi双链抑制载体的构建

1)利用如下所述的引物组合对SEQ ID NO：1中的目标序列进行扩增：

AFB6dsF ACTAGTGGTACCTTCGCTGGAGACAGCAATCT

AFB6dsR GAGCTCGGATCCTGCAGCTCTGATAGATGGCT

得到的双链抑制片段，其序列如SEQ ID NO：5所示。

2)将得到的双链抑制片段用BamHI和KpnI先将其进行双酶切(购自宝生物工程大连有限公司，具体参见内切酶说明书)，回收目标片段后连到双链抑制载体上(图8所示)。连接酶购自NEB公司，反应体系参见说明书。

3)连接产物通过电转化的方法(参考文献、使用电压的参数参照实施例3的第1部分步骤3)的方法进行)导入农杆菌(A.tumefaciens)EHA105(购自澳大利亚CAMBIA实验室)菌株中。,

4)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照实施例3的第1部分步骤4)所述的方法抽提质粒，用KpnI和BamHI(购自宝生物工程大连有限公司)酶切检测，得到的阳性质粒用pMCG-1F和pMCG-1R测序验证，得到抑制表达第一链载体；所用引物的DNA序列如下：

pMCG-1F：CTGCTCCACACATGTCCATT

pMCG-1R：CCCACCATCTTGTGGAGCTA

5)用步骤2)中的方法，将方法1)中得到的序列用SacI和SpeI(购自宝生物工程大连有限公司)双酶切后连接到抑制表达第一链载体上，用pMCG-2F和pMCG-2R测序验证，得到完成的双链抑制表达载体；所用引物的DNA序列如下所示：

pMCG-2F：GGCTCACCAAACCTTAAACAA

pMCG-2R：CTGAGCTACACATGCTCAGGTT

6)将步骤5)的抑制表达载体通过电转化的方法(参考文献、使用电压的参数参照实施例3的步骤3)的方法进行)导入农杆菌(A.tumefaciens)EHA105(购自澳大利亚CAMBIA实验室)菌株中。

7)将步骤6)的抑制表达农杆菌向水稻受体品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所公开报道且公开发放的水稻品种)转化，遗传转化方法如下

3、载体的转化

具体操作步骤详见实施例1中的2、超表达载体的遗传转化部分。

3、转基因性状调查和表达分析

1)取T0代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，geneticdiversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis,1992,Theor Appl Genet,83,495-499)。然后用PCR方法对T0代超表达转化植株用引物GUSF和GUSR(序列如下)进行阳性检测，抑制转化植株用引物pMCG-2F和pMCG-2R进行阳性检测。

GUSF CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC

GUSR GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACCG

PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物各0.3μl，Taq酶0.2μl加去离子水到20μl(所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg²⁺、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃1分钟，第⑤步从②步－④步循环32次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。对T0代阳性植株收种子(T1代)，为T1代的大田种植和性状调查做准备。

2)为了检测超表达和抑制表达植株中的目标基因表达量，抽提了T0代转基因植株苗期叶片的总RNA，按照实施例2的方法进行反转录，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测OsAFB6的表达量。试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。结果见图5、图6，与阴性对照相比，超表达和抑制的转基因家系的OsAFB6基因的表达量发生了相应的变化。用到的OsAFB6基因定量的引物DNA序列如实施例1中所示。

3)将T1代植株种植大田后进行表型观察，观察结果见表4。

表4 OsAFB6基因超表达转基因家系在中国海南短日照条件下的表型

通过对50株转基因T1代阳性植株和阴性对照比较，发现该基因表达量的升高能够使转化受体水稻“中花11”短日照条件下的开花期从70.6天延迟到75.6(超表达9倍)或87.0天(超表达19倍)；一次枝梗数从8.7增加到9.2(超表达9倍)或9.9(超表达19倍)；每穗颖花数从95.3增加到111.7(超表达9倍)或118.7(超表达19倍)，表型改变程度全部与表达量变化程度符合，且都达到极显著水平的差异。抑制表达转基因并无发现表型差异。

参考文献

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SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控水稻开花期和每穗颖花数的产量基因OsAFB6及应用

<130>

<141> 2017-02-24

<160> 5

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1812

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1812)

<223>

<400> 1

atg tcc gag gag gac gac gac cag ccg ccg ccg ctg ccg gcg cag aag 48

Met Ser Glu Glu Asp Asp Asp Gln Pro Pro Pro Leu Pro Ala Gln Lys

1 5 10 15

cgg ccg cgc gcg tcg ccg ccg ccg gac cag gtg ctc gac aac gtc ctc 96

Arg Pro Arg Ala Ser Pro Pro Pro Asp Gln Val Leu Asp Asn Val Leu

20 25 30

gag acg gtg ctc cag ttc ctc gac tcg gcg cgg gac cgg tgc gcg gcg 144

Glu Thr Val Leu Gln Phe Leu Asp Ser Ala Arg Asp Arg Cys Ala Ala

35 40 45

tcg ctg gtg tgc cgc tcg tgg agc cgg gcc gag tcc gcc acc cgc gcc 192

Ser Leu Val Cys Arg Ser Trp Ser Arg Ala Glu Ser Ala Thr Arg Ala

50 55 60

tcc gtc gcc gtc cgc aac ctc ctc gcc gcg tcc ccg gcg cgc gtc gcg 240

Ser Val Ala Val Arg Asn Leu Leu Ala Ala Ser Pro Ala Arg Val Ala

65 70 75 80

cga cgc ttc ccg gcc gcg cgg cgc gtc ctc ctc aag ggc cgc ccg cgc 288

Arg Arg Phe Pro Ala Ala Arg Arg Val Leu Leu Lys Gly Arg Pro Arg

85 90 95

ttc gcc gac ttc aac ctc ctc ccg cca ggc tgg gcc ggc gcc gac ttc 336

Phe Ala Asp Phe Asn Leu Leu Pro Pro Gly Trp Ala Gly Ala Asp Phe

100 105 110

cgc ccc tgg gca gcc gcc gtc gcc gcc gcc gcg ttc ccc gcg ctc gcc 384

Arg Pro Trp Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Phe Pro Ala Leu Ala

115 120 125

tcc ctc ttc ctc aag cgc atc acc gtc acc gac gac gac ctg gac ctc 432

Ser Leu Phe Leu Lys Arg Ile Thr Val Thr Asp Asp Asp Leu Asp Leu

130 135 140

gtc tcc cgc tcc ctc ccc gcc tcc ttc cgc gac ctc tcg ctc ctc ctc 480

Val Ser Arg Ser Leu Pro Ala Ser Phe Arg Asp Leu Ser Leu Leu Leu

145 150 155 160

tgc gac ggc ttc tcc tcc gct ggc ctc gca tcc atc gct tcc cat tgc 528

Cys Asp Gly Phe Ser Ser Ala Gly Leu Ala Ser Ile Ala Ser His Cys

165 170 175

agg ggg ctg cga gtg ctc gat gtg gtt gac tgc gag atg aac gac gac 576

Arg Gly Leu Arg Val Leu Asp Val Val Asp Cys Glu Met Asn Asp Asp

180 185 190

gac gac gag gtg gtg gac tgg gtg gcg gcg ttc ccg ccg ggg acg acc 624

Asp Asp Glu Val Val Asp Trp Val Ala Ala Phe Pro Pro Gly Thr Thr

195 200 205

gac ctc gaa tcg ctc tcc ttc gag tgc tac gtc cgg ccg gtg tcc ttc 672

Asp Leu Glu Ser Leu Ser Phe Glu Cys Tyr Val Arg Pro Val Ser Phe

210 215 220

gcc gcg ctc gag gcg ctc gtg gcg cgc tcg ccg cgc ctc acc cgc ctg 720

Ala Ala Leu Glu Ala Leu Val Ala Arg Ser Pro Arg Leu Thr Arg Leu

225 230 235 240

ggc gtc aac gag cac gtg tcg ctg ggg cag ctg cgc cgg ctc atg gcg 768

Gly Val Asn Glu His Val Ser Leu Gly Gln Leu Arg Arg Leu Met Ala

245 250 255

aac acg cct cgc ctg acg cac ctc ggc acc gga gcg ttc cgg ccg ggg 816

Asn Thr Pro Arg Leu Thr His Leu Gly Thr Gly Ala Phe Arg Pro Gly

260 265 270

gac ggc ccc gag gat gtg ggg ctc gac atc gag cag atg gcg tcc gcg 864

Asp Gly Pro Glu Asp Val Gly Leu Asp Ile Glu Gln Met Ala Ser Ala

275 280 285

ttc gcg tcc gct ggc cgg acg aac acg ctg gtt tcg ctg tct ggc ttc 912

Phe Ala Ser Ala Gly Arg Thr Asn Thr Leu Val Ser Leu Ser Gly Phe

290 295 300

cgc gag ttc gag ccg gag tac ctg ccc acc att gcc gcc gtg tcc ggc 960

Arg Glu Phe Glu Pro Glu Tyr Leu Pro Thr Ile Ala Ala Val Ser Gly

305 310 315 320

aac cta acg aac ctc gac ttc agc tat tgc ccg gtc act ccc gat caa 1008

Asn Leu Thr Asn Leu Asp Phe Ser Tyr Cys Pro Val Thr Pro Asp Gln

325 330 335

ttc ctg ccc ttc atc ggg caa tgc cac aac ctt gag aga cta tat gtg 1056

Phe Leu Pro Phe Ile Gly Gln Cys His Asn Leu Glu Arg Leu Tyr Val

340 345 350

ctt gat tcg gtg cgt gac gag ggg ctc cag gcc acg gcg agg act tgc 1104

Leu Asp Ser Val Arg Asp Glu Gly Leu Gln Ala Thr Ala Arg Thr Cys

355 360 365

aag aag ctc cag gtt ctc cat gtg ctt cca ttg aac gca ctt gag gat 1152

Lys Lys Leu Gln Val Leu His Val Leu Pro Leu Asn Ala Leu Glu Asp

370 375 380

gcc gat gag ctg gtg tcg gag gtc ggg ctt act gcc att gct gag ggc 1200

Ala Asp Glu Leu Val Ser Glu Val Gly Leu Thr Ala Ile Ala Glu Gly

385 390 395 400

tgc cga ggg ctc cgt tcg acg ctt tac ttc tgc cag agt atg acc aac 1248

Cys Arg Gly Leu Arg Ser Thr Leu Tyr Phe Cys Gln Ser Met Thr Asn

405 410 415

gct gcg gtg atc gcc att tct caa aat tgc gtg gac ctt aag gta ttc 1296

Ala Ala Val Ile Ala Ile Ser Gln Asn Cys Val Asp Leu Lys Val Phe

420 425 430

cgg tta tgc ata atg gga cgt cac cag cct gac cat gtg act ggg gag 1344

Arg Leu Cys Ile Met Gly Arg His Gln Pro Asp His Val Thr Gly Glu

435 440 445

ccc atg gat gaa ggg ttt ggt gcc att gtt agg aac tgc agc aag ctt 1392

Pro Met Asp Glu Gly Phe Gly Ala Ile Val Arg Asn Cys Ser Lys Leu

450 455 460

act agg ctc tcc aca tct gga cac ctg act gat cga gct ttc gag tac 1440

Thr Arg Leu Ser Thr Ser Gly His Leu Thr Asp Arg Ala Phe Glu Tyr

465 470 475 480

att ggc aag tat gcc aag tcg ctc cgg acg ctc tct gtt gcg ttc gct 1488

Ile Gly Lys Tyr Ala Lys Ser Leu Arg Thr Leu Ser Val Ala Phe Ala

485 490 495

gga gac agc aat ctg gcg ttg caa cac atc ctc cag ggg tgc tcg aag 1536

Gly Asp Ser Asn Leu Ala Leu Gln His Ile Leu Gln Gly Cys Ser Lys

500 505 510

ctg gag aag ctg gag ata agg gat tgc cca ttt ggg gat gct ggc ctc 1584

Leu Glu Lys Leu Glu Ile Arg Asp Cys Pro Phe Gly Asp Ala Gly Leu

515 520 525

ctc tcc gga atg cac cat ttc tat aac atg cgg ttc ctc tgg atg tca 1632

Leu Ser Gly Met His His Phe Tyr Asn Met Arg Phe Leu Trp Met Ser

530 535 540

ggt tgc aac ctt acg ctg caa ggt tgc aag gag gtc gca cgg agg cta 1680

Gly Cys Asn Leu Thr Leu Gln Gly Cys Lys Glu Val Ala Arg Arg Leu

545 550 555 560

cca aga ttg gtg gtg gag ctg ata aat agc cag cct gag aac gaa agg 1728

Pro Arg Leu Val Val Glu Leu Ile Asn Ser Gln Pro Glu Asn Glu Arg

565 570 575

acc gac agc gtg gac atc tta tac atg tat cgg tcg ctt gaa ggg cca 1776

Thr Asp Ser Val Asp Ile Leu Tyr Met Tyr Arg Ser Leu Glu Gly Pro

580 585 590

aga gag gat gta cca cca ttc gtg aag atc cta taa 1812

Arg Glu Asp Val Pro Pro Phe Val Lys Ile Leu

595 600

<210> 2

<211> 603

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

Met Ser Glu Glu Asp Asp Asp Gln Pro Pro Pro Leu Pro Ala Gln Lys

1 5 10 15

Arg Pro Arg Ala Ser Pro Pro Pro Asp Gln Val Leu Asp Asn Val Leu

20 25 30

Glu Thr Val Leu Gln Phe Leu Asp Ser Ala Arg Asp Arg Cys Ala Ala

35 40 45

Ser Leu Val Cys Arg Ser Trp Ser Arg Ala Glu Ser Ala Thr Arg Ala

50 55 60

Ser Val Ala Val Arg Asn Leu Leu Ala Ala Ser Pro Ala Arg Val Ala

65 70 75 80

Arg Arg Phe Pro Ala Ala Arg Arg Val Leu Leu Lys Gly Arg Pro Arg

85 90 95

Phe Ala Asp Phe Asn Leu Leu Pro Pro Gly Trp Ala Gly Ala Asp Phe

100 105 110

Arg Pro Trp Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Phe Pro Ala Leu Ala

115 120 125

Ser Leu Phe Leu Lys Arg Ile Thr Val Thr Asp Asp Asp Leu Asp Leu

130 135 140

Val Ser Arg Ser Leu Pro Ala Ser Phe Arg Asp Leu Ser Leu Leu Leu

145 150 155 160

Cys Asp Gly Phe Ser Ser Ala Gly Leu Ala Ser Ile Ala Ser His Cys

165 170 175

Arg Gly Leu Arg Val Leu Asp Val Val Asp Cys Glu Met Asn Asp Asp

180 185 190

Asp Asp Glu Val Val Asp Trp Val Ala Ala Phe Pro Pro Gly Thr Thr

195 200 205

Asp Leu Glu Ser Leu Ser Phe Glu Cys Tyr Val Arg Pro Val Ser Phe

210 215 220

Ala Ala Leu Glu Ala Leu Val Ala Arg Ser Pro Arg Leu Thr Arg Leu

225 230 235 240

Gly Val Asn Glu His Val Ser Leu Gly Gln Leu Arg Arg Leu Met Ala

245 250 255

Asn Thr Pro Arg Leu Thr His Leu Gly Thr Gly Ala Phe Arg Pro Gly

260 265 270

Asp Gly Pro Glu Asp Val Gly Leu Asp Ile Glu Gln Met Ala Ser Ala

275 280 285

Phe Ala Ser Ala Gly Arg Thr Asn Thr Leu Val Ser Leu Ser Gly Phe

290 295 300

Arg Glu Phe Glu Pro Glu Tyr Leu Pro Thr Ile Ala Ala Val Ser Gly

305 310 315 320

Asn Leu Thr Asn Leu Asp Phe Ser Tyr Cys Pro Val Thr Pro Asp Gln

325 330 335

Phe Leu Pro Phe Ile Gly Gln Cys His Asn Leu Glu Arg Leu Tyr Val

340 345 350

Leu Asp Ser Val Arg Asp Glu Gly Leu Gln Ala Thr Ala Arg Thr Cys

355 360 365

Lys Lys Leu Gln Val Leu His Val Leu Pro Leu Asn Ala Leu Glu Asp

370 375 380

Ala Asp Glu Leu Val Ser Glu Val Gly Leu Thr Ala Ile Ala Glu Gly

385 390 395 400

Cys Arg Gly Leu Arg Ser Thr Leu Tyr Phe Cys Gln Ser Met Thr Asn

405 410 415

Ala Ala Val Ile Ala Ile Ser Gln Asn Cys Val Asp Leu Lys Val Phe

420 425 430

Arg Leu Cys Ile Met Gly Arg His Gln Pro Asp His Val Thr Gly Glu

435 440 445

Pro Met Asp Glu Gly Phe Gly Ala Ile Val Arg Asn Cys Ser Lys Leu

450 455 460

Thr Arg Leu Ser Thr Ser Gly His Leu Thr Asp Arg Ala Phe Glu Tyr

465 470 475 480

Ile Gly Lys Tyr Ala Lys Ser Leu Arg Thr Leu Ser Val Ala Phe Ala

485 490 495

Gly Asp Ser Asn Leu Ala Leu Gln His Ile Leu Gln Gly Cys Ser Lys

500 505 510

Leu Glu Lys Leu Glu Ile Arg Asp Cys Pro Phe Gly Asp Ala Gly Leu

515 520 525

Leu Ser Gly Met His His Phe Tyr Asn Met Arg Phe Leu Trp Met Ser

530 535 540

Gly Cys Asn Leu Thr Leu Gln Gly Cys Lys Glu Val Ala Arg Arg Leu

545 550 555 560

Pro Arg Leu Val Val Glu Leu Ile Asn Ser Gln Pro Glu Asn Glu Arg

565 570 575

Thr Asp Ser Val Asp Ile Leu Tyr Met Tyr Arg Ser Leu Glu Gly Pro

580 585 590

Arg Glu Asp Val Pro Pro Phe Val Lys Ile Leu

595 600

<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(2000)

<223>

<400> 3

ttagggttct ctcctcctcc aaggtcttat catataaacc aactggccaa attttgaata 60

caaggcgcct gcatagatcg atcaaattcg gagaatataa aaattgggac agtatgagct 120

gtgtttcttg ttttctaaaa ctaaagaaat aattctttcg aaaaaaaata cattggaatt 180

aaagaactgg gaggggggta aacaagggtg tgcgtaaact actgtctgca ctaagaatcc 240

caatgccttg actgacagca atccctgcct gaaaggccga ccaagcacaa taaaagatgt 300

ggaaggaaac aaaaacaaag aacctttcct tggcctatct ctcgcctctt tactgttgcg 360

tttctaaaca aagtcccttg tgcatgtgga ctggggcaag ggtgaaggat ttgttttttc 420

ggatcatttt caaatgcctt tccggatggg caagggggct catcatctgt gagcatatga 480

caagttcaaa ggttagtaat gaccaccatg ctcctacacc acatcaccaa ctaaaagaac 540

aaacacgata tttgtttaaa ttagattgat tgaaattaag gacctttcaa ggactttctc 600

ccattcagat gaacggtttt ggtcgctatt ctttgtatcc aatatataag gaagtagtag 660

ttgagagttg agactagaca gaagttattc tgtagctaga aagtcttttg tttgtcatgt 720

atgcgagtgt gaaaacactt tcatatctgg aataatttaa ccaattcctc agaagctatt 780

tccaatcatt attcagctcc agaccatcct taggggggtt ttaacttgaa ataccatcat 840

cgcttcaata gagaagacaa ctagatatcc gagttgttaa tactataaga gtaaaatctt 900

gtgctaacaa gaaactgaac aatttctttc tttacataag ttagatcaca cattttgatc 960

ttatgaatcg ctttaatgtc tacacatata tatgtcctcc acttttcgtc ttttcatggc 1020

taatgtcact tccacactac cactcatctc atatccattc tctctcgcca tagtcgcaag 1080

ccatactatc ctgtttgcgt gcctcatcct atatctcagg tatagatctc aaaggctagt 1140

gtgatcgaac aattgtttca ccatcgcggt tggtccattc tttcaaaatg cataactcca 1200

cgttcttccg tctctacgtt gctacttgta tttacacgta tcttcctcct cagctagtag 1260

ctatcagtga cactttttag tacatattac tcaaatctat atagatgata ggacatatgt 1320

gacaaccgaa gacactaaaa tttgattttg ataataaact gtaattgaaa taaccatctt 1380

cactaccaga acaaagcatt caaatagctt tcaacgaatc aaaacatgcc tagctggaag 1440

agagaaattc aggtgtccaa aactcccccc gtgcatacaa tctctttcac gctttcatca 1500

caccatctga aaaaagcaca aaggccgagt ttagttccaa attttttctt caaacttcaa 1560

acttttacat cacatcaaaa ctttcctaca cacataaact ttcaactttt tcatcacatc 1620

gttccaattt tattttgaca tgaactaacc acacctaagc aaataatgag agatgtttac 1680

atctatccca gcttccctct ctttgccttt gccagtccca cggggggggc gggcactgtg 1740

gtggtgccgc cgtggtgtgt gccgttctgt agagcactgc ggctcccggc ccaaccgcag 1800

cagcagcagc aaacatacaa cacaacaaca agtacacgcc tccctcccac acaccacccc 1860

ccctccaccc tcgatctcac tcacgcacac ccacctcccc cctccccccc ctcctccgcc 1920

gcggcgcgtc tccactccac tccactcctc gccggccacc aaccaaccac gcgagtggtg 1980

ggggggtggg tggggcccac 2000

<210> 4

<211> 2020

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2020)

<223>

<400> 4

atgtccgagg aggacgacga ccagccgccg ccgctgccgg cgcagaagcg gccgcgcgcg 60

tcgccgccgc cggaccaggt gctcgacaac gtcctcgaga cggtgctcca gttcctcgac 120

tcggcgcggg accggtgcgc ggcgtcgctg gtgtgccgct cgtggagccg ggccgagtcc 180

gccacccgcg cctccgtcgc cgtccgcaac ctcctcgccg cgtccccggc gcgcgtcgcg 240

cgacgcttcc cggccgcgcg gcgcgtcctc ctcaagggcc gcccgcgctt cgccgacttc 300

aacctcctcc cgccaggctg ggccggcgcc gacttccgcc cctgggcagc cgccgtcgcc 360

gccgccgcgt tccccgcgct cgcctccctc ttcctcaagc gcatcaccgt caccgacgac 420

gacctggacc tcgtctcccg ctccctcccc gcctccttcc gcgacctctc gctcctcctc 480

tgcgacggct tctcctccgc tggcctcgca tccatcgctt cccattgcag gtaatgcatc 540

tctccatgga actttccaac ttccaactta ctagtagtag ttgttgttct tgttgttgtc 600

tagtcgtccg tggtaatggc ggattcgatg cggtttgctc tcgctctgtt tcttgcaggg 660

ggctgcgagt gctcgatgtg gttgactgcg agatgaacga cgacgacgac gaggtggtgg 720

actgggtggc ggcgttcccg ccggggacga ccgacctcga atcgctctcc ttcgagtgct 780

acgtccggcc ggtgtccttc gccgcgctcg aggcgctcgt ggcgcgctcg ccgcgcctca 840

cccgcctggg cgtcaacgag cacgtgtcgc tggggcagct gcgccggctc atggcgaaca 900

cgcctcgcct gacgcacctc ggcaccggag cgttccggcc gggggacggc cccgaggatg 960

tggggctcga catcgagcag atggcgtccg cgttcgcgtc cgctggccgg acgaacacgc 1020

tggtttcgct gtctggcttc cgcgagttcg agccggagta cctgcccacc attgccgccg 1080

tgtccggcaa cctaacgaac ctcgacttca gctattgccc ggtcactccc gatcaattcc 1140

tgcccttcat cgggcaatgc cacaaccttg agagactata tgtaatgcct ggattgcttc 1200

atcagcttgg tttcgactga actgcgcgat tctgcttttc tgacgatgat ttgtttgcca 1260

ggtgcttgat tcggtgcgtg acgaggggct ccaggccacg gcgaggactt gcaagaagct 1320

ccaggttctc catgtgcttc cattgaacgc acttgaggat gccgatgagc tggtgtcgga 1380

ggtcgggctt actgccattg ctgagggctg ccgagggctc cgttcgacgc tttacttctg 1440

ccagagtatg accaacgctg cggtgatcgc catttctcaa aattgcgtgg accttaaggt 1500

attccggtta tgcataatgg gacgtcacca gcctgaccat gtgactgggg agcccatgga 1560

tgaagggttt ggtgccattg ttaggaactg cagcaagctt actaggctct ccacatctgg 1620

acacctgact gatcgagctt tcgagtacat tggcaagtat gccaagtcgc tccggacgct 1680

ctctgttgcg ttcgctggag acagcaatct ggcgttgcaa cacatcctcc aggggtgctc 1740

gaagctggag aagctggaga taagggattg cccatttggg gatgctggcc tcctctccgg 1800

aatgcaccat ttctataaca tgcggttcct ctggatgtca ggttgcaacc ttacgctgca 1860

aggttgcaag gaggtcgcac ggaggctacc aagattggtg gtggagctga taaatagcca 1920

gcctgagaac gaaaggaccg acagcgtgga catcttatac atgtatcggt cgcttgaagg 1980

gccaagagag gatgtaccac cattcgtgaa gatcctataa 2020

<210> 5

<211> 472

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(472)

<223>

<400> 5

gttcgctgga gacagcaatc tggcgttgca acacatcctc caggggtgct cgaagctgga 60

gaagctggag ataagggatt gcccatttgg ggatgctggc ctcctctccg gaatgcacca 120

tttctataac atgcggttcc tctggatgtc aggttgcaac cttacgctgc aaggttgcaa 180

ggaggtcgca cggaggctac caagattggt ggtggagctg ataaatagcc agcctgagaa 240

cgaaaggacc gacagcgtgg acatcttata catgtatcgg tcgcttgaag ggccaagaga 300

ggatgtacca ccattcgtga agatcctata agctgcttct gcagagtggc acttgatacg 360

ctgaatgcgg cctaagcaac aagggaaggt aagatagctg gagtcaggcg tatgatcatt 420

ttttgtatgc ttgaagttgg aaggagttct aaagccatct atcagagctg ca 472

Claims

1.OsAFB6基因在控制水稻开花期和枝梗数、每穗颖花数以及单株产量中的应用，其特征在于，该基因的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

2.OsAFB基因的启动子，其特征在于，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.包含外显子和内含子的完整DNA序列的OsAFB6基因的超表达片段在控制水稻开花期和枝梗数、每穗颖花数以及单株产量中的应用，其特征在于，该片段的蛋白质序列如SEQ IDNO：4所示。