CN100445383C - 一个被二化螟取食特异诱导表达的水稻启动子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。从水稻中克隆到一个不被机械损伤诱导、只被二化螟取食特异性诱导表达的B1-A04启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1所示。在SEQ ID No：1所示的1-1568位碱基处是该启动子的序列。本发明还公开了该启动子及其表达载体的制备方法，以及通过农杆菌介导的转基因方法导入水稻受体中的应用。本发明利用分子生物学方法分析该片段控制下的报告基因GUS的表达模式，结果表明：未被二化螟取食时，该启动子在水稻叶鞘、叶片中不表达，只在水稻幼穗、茎杆中表达；被二化螟取食后，在叶鞘、孕穗、茎杆中的表达量上升，在叶片中仍然不表达。

Description

一个被二化螟取食特异诱导表达的水稻启动子及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和水稻分子育种技术领域，具体涉及到一个二化螟取食特异诱导表达的水稻启动子的克隆及其在转基因水稻中的应用。

背景技术

二化螟(Chilo suppressalis)是水稻的重要害虫，其危害分孽期水稻，造成枯鞘和枯心苗；危害孕穗期、抽穗期水稻，造成枯穗和白穗；危害灌浆期、乳熟期水稻，造成半枯穗和虫伤株。进入二十世纪九十年代以来，由于异常气候、耕作制度变化以及水稻品种结构的改变，二化螟危害在我国水稻主产区常大规模发生且呈不断上升趋势。由于耕作制度变革后呈现出以单季稻为主，单、双季稻混栽的局面，增加了二化螟世代过渡的桥梁田，改善了二化螟的营养条件，为二化螟危害的发生提供了有利条件。自1995年以来，二化螟危害在长江流域稻区连续大发生，1999年和2000年造成危害的面积均超过2亿亩。因此，对二化螟进行有效防治已成为当前水稻丰产的重要措施。

在水稻的害虫防治策略中，选育和栽培抗虫品种是一条经济有效且保护环境的措施。但因为目前在水稻野生和栽培品种中还没有发现高抗二化螟的抗性基因资源，因而难以通过常规的杂交育种方法培育有效的抗二化螟水稻品种。转基因育种方法突破了生物学上物种的界限，可以使遗传物质在动物、植物和微生物之间交流。将来源于苏云金芽胞杆菌的δ-内毒素基因借助转基因方法导入水稻已经培育出多个高抗二化螟等鳞翅目害虫的转基因水稻株系或品系(Nayak等Transgenic elite indica plants expressing cryA(c)δ-endotoxin of Bacillus thuringiensis are resistant against yellow stem borer(Scirpophaga incertulas).Proc NatlAcad Sci USA，1996，94：2111-2116；Cheng等，Agrobacteriun transformed rice plants expressing syntheticcrylAb and crylAc genes are highly toxic to stripedstem borer and yellow stem borer.Proc Natl Acad Sci USA1998，95：2767-2772；Tu等，Field performance of transgenic elite commercial hybrid rice expressing Bacillusthuringiensisδ-endotoxin.NatBiotech，2000，18：1101-1104；Ye等，Field evaluation of resistance of transgrnicrice containing a synthetic crylAb gene from Bacillus thuringiensis Berliner to two stem borers.J Econ Entomol，2001，94：271-276；Ramesh等，Development of stem borer resistant transgenic parental lines involved in theproduction of hybrid rice.J Biotech，2004，111：131-141)。在上面已经报道的转基因抗虫水稻中，一般是利用组成型、高表达的CaMV 35S启动子、水稻β-actin启动子或玉米Ubiquitin启动子。导入外源Bt基因水稻的抗虫效果主要取决于Bt蛋白的毒性强度、在水稻中的表达量以及表达稳定性。找到一个在水稻特定组织中特异且高效表达的启动子将对转基因水稻的抗虫性以及对转基因水稻的食品安全性和环境安全性具有重要作用和意义。利用来源于水稻且被害虫取食后特异诱导高效表达的启动子构建特异性表达的融合Bt基因而培育转Bt抗虫水稻的研究还未见报道。诱导型表达的启动子只在植物受到害虫进攻时才表达，不会加重植物的负担；并且一般诱导性表达启动子的启动表达的效率很高，可以保证抗虫蛋白在植株体内的表达量。正是基于这些考虑，本发明试图找到一个水稻中被二化螟取食特异诱导表达的启动子，为水稻或类似作物的抗虫转基因育种提供新的资源和方法。

在昆虫与植物的长期进化过程中，植物形成了一套特有的防御体系。虽然机械损伤与昆虫都对植物造成伤口，但是植物能够区分二者，并对昆虫取食造成的伤口做出特异性反应。在拟南芥中已经发现只被昆虫取食特异诱导而不被机械损伤诱导的基因。Reymond等通过cDNA芯片技术发现了一个只被Piers rapae诱导表达而不被机械损伤诱导表达的基因HEL(编码hevein-like蛋白)(参见Reymond P等，Differentialgene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis.Plant Cell，2000，2：707-719)。Berger等发现拟南芥的VSP1与VSP2基因(编码植物生长储存蛋白)只被Plutella xylostella和Spodoptera littoralis诱导表达而不被机械损伤诱导表达(Berger S等，Local and differential control ofvegetative storage protein expression in response to herbivore damage in Arabidopsis thaliana.Physiol Plant，2002，114：85-91)：有关昆虫特异诱导表达的启动子的克隆的报道很少。显然，对害虫特异诱导表达启动子的研究和技术发明将有助于了解昆虫胁迫诱导表达基因的时空表达模式，诱导表达的顺式与反式调节因子，同时在作物育种中具有巨大的应用前景。本发明是就是利用有关分子生物学方法，从水稻基因组中克隆得到一个二化螟特异诱导表达的启动子，将该启动子基因导入水稻植株中，从而得到转基因水稻植株.

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，从水稻基因组中分离、克隆一个被二化螟特异诱导的启动子，将该启动子导入水稻，从而得到转基因抗二化螟水稻植株。

本发明的具体内容为：

一个从水稻基因组中分离、克隆得到的不被机械损伤诱导、只被二化螟诱导表达的基因B1-A04启动子序列，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。所述的B1-A04启动子序列，它是序列表SEQ IDNO：1所示1-1568碱基位所示的序列或者是与序列表SEQ ID NO：1所示序列同源性在90％以上，且能被二化螟诱导表达的同源序列。该启动子序列具有以下技术特征：在水稻分蘖期，未被二化螟取食时，该启动子在水稻叶鞘、叶片中均不表达，被二化螟取食后，该启动子在水稻叶鞘中明显上升表达，在叶片中仍然不表达；在水稻孕穗期，未被二化螟取食时，该启动子在幼穗、茎杆中表达，在叶片与叶鞘中不表达，被二化螟取食后，在叶鞘中明显上升表达，在叶片中仍然不表达，在水稻幼穗、茎杆中的表达量明显升高。

本发明的具体方法是：

从水稻基因组中分离、克隆一个二化螟特异诱导启动子，将水稻差减文库与cDNA Microarray技术、Northern blot分析相结合，得到分蘖期水稻叶鞘中不被机械损伤诱导、只被二化螟诱导表达的cDNA克隆；通过生物信息学方法预测该cDNA的启动子候选片段；然后设计引物，在引物两端加上合适的酶切位点，利用聚合酶链式反应(PCR)从一个含有该区段的“明恢63”(中国大面积推广的一种水稻品种)基因组BAC克隆中扩增得到一个被命名为B1-A04启动子的候选片段。将该B1-A04启动子候选片段与报告基因GUS编码序列构建成融合基因并装载到双元Ti载体上，通过农杆菌介导的转基因方法，将候选片段及被候选片段控制下的报告基因转入水稻受体中，获得转基因植株；通过组织化学染色及Northern blot分析，考察该启动子在未被二化螟取食及被二化螟取食后两种情况下，在水稻分蘖期、孕穗期不同器官的表达变化，进而验证和鉴定该启动子。检测结果表明：未被二化螟取食时，该启动子在水稻叶鞘、叶片中不表达，只在水稻幼穗、茎杆中表达；被二化螟取食后，只在叶鞘、幼穗、茎杆中表达量上升，而在叶片中仍然不表达(如附图4、图5和表1所示)。

详细的技术方案如下所述：

(1)差减cDNA文库的构建

利用PCR-Select cDNA Subtraction Kit(购自Clontech公司，美国)分别将被二化螟取食后的分蘖期明恢63叶鞘的mRNA和对照(未被二化螟取食的叶鞘)mRNA作为tester和driver，构建正向和反向cDNA差减文库。

(2)microarray杂交

从文库中随机挑选864个克隆测序并拼接得到271条单一序列。将含有该271条序列的cDNA克隆及来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的明恢63全生育期平衡化cDNA文库(参见：Chu Z等，Construction and characterization of a normalized whole-life-cycle cDNA library of rice，2003，Chinese ScienceBulletin，48：229-235)的103个克隆抽提质粒后点在尼龙膜上，同时将含有水稻肌动蛋白基因(GenBank Acc.No.EI077C02)、猪三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GenBank Acc.No.AF017079)的质粒分别作为正控和负控随机点在尼龙膜上。反转录分蘖期水稻明恢63被二化螟取食后6h的叶鞘总RNA及对照总RNA，并用³²P标记作为探针与尼龙膜杂交，杂交重复2次，得到在2次重复中皆被二化螟诱导上升表达的克隆。

(3)Northern blot分析

在“明恢63”分蘖期，取被二化螟取食、机械损伤后不同时间段的水稻叶鞘抽提总RNA转膜，将以上检测到的上升表达克隆作为探针进行Northern杂交得到一个被二化螟取食强烈诱导表达，但不被机械损伤诱导的cDNA克隆，该克隆被命名为B1-A04。

(4)B1-A04基因启动子候选片段的克隆

根据水稻全基因组序列信息和水稻全长cDNA信息，并利用植物启动子预测软件(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)(Reese，M G，Application of a time-delay neural network topromoter annotation in the Drosophila melanogaster genome，Comput Chem，2001，26：51-56)预测出B1-A04基因的启动子序列，根据预测的启动子序列设计引物，并在引物两端加上合适的酶切位点，利用PCR方法从一个含有该区段的“明恢63”(一个中国大面积推广的水稻品种)基因组BAC克隆中扩增得到B1-A04基因的启动子候选片段(该序列如序列表SEQ ID NO：1所示)。考虑到B1-A04基因的5’-末端信号肽序列对蛋白质细胞内定位的影响，所以在设计引物时，使启动子候选片段的下游引物锚定在B1-A04基因翻译起始位点(ATG)的下游，因而B1-A04基因启动子候选片段包括B1-A04基因的5’-末端部分编码序列(具体见附图1)。将PCR扩增产物SalI和EcoRI双酶切后装载到双元Ti质粒载体上，使之控制报告基因GUS的表达。将构建好的Ti质粒载体通过农杆菌介导的方法转化水稻品种“中花11”(来自中国农业科学院作物研究所商业经营品种)。

(5)将获得的转基因水稻植株进行GUS组织化学染色、GUS活性测定、Northern blot分析考察转基因植株中该启动子的表达模式。

本发明的优点在于：

(1)本发明克隆了一个在水稻叶鞘中被二化螟取食特异诱导、不被机械损伤诱导的启动子，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。

(2)本发明中克隆及鉴定启动子的方法可以直接应用于水稻及其他作物昆虫特异诱导表达启动子的克隆。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1，公开了本发明克隆的包括B1-A04基因5’端部分编码序列的水稻二化螟特异诱导表达启动子的序列。

图1：显示的是B1-A04基因启动子候选片段结构图。阴影显示的是基本启动子元件序列；双下划线序列为扩增B1-A04基因启动子所用的引物序列；单下划线序列为预测的B1-A04基因翻译起始位点；预测的转录起始位点加文本框表示，此处的碱基编号为+1；在其上游的序列编号为负，在其下游的序列编号为正。

图2：显示的是cDNA B1-A04被二化螟、机械损伤诱导后在分蘖期水稻叶鞘中的诱导表达变化情况。图中：Wounding表示机械损伤；feeding表示二化螟(Chilo suppressalis)取食；C是对照。

图3：显示的是构建好的pCAMBIA1381b-pB表达载体。pB为B1-A04启动子候选序列；EcoRI、SalI为将pB导入pCAMIA1381b时所用的限制内切酶位点；LB、RB分别为pCAMIA1381b中T-DNA的左边界和右边界；Hpt为潮霉素抗性基因；gusA为报告基因GUS(β-葡萄糖苷酸酶)；Nos polyA为胭脂碱合成酶基因多聚腺苷酸序列。

图4：显示的是转基因水稻分蘖期、孕穗期不同器官中GUS组织染色情况(至少考察15株转基因植株)。图中：a：分蘖期对照叶鞘；b：分蘖期对照叶片；c：孕穗期对照茎杆；d：孕穗期对照叶鞘：e：孕穗期对照幼穗；f：孕穗期对照叶片；g：分蘖期被二化螟取食6h后的叶鞘；h：分蘖期被二化螟取食6h后的叶片；i：孕穗期被二化螟取食6h后的茎杆；j：孕穗期被二化螟取食6h后的叶鞘；k：孕穗期被二化螟取食6h后的幼穗；l：孕穗期被二化螟取食6h后的叶片。

图5：显示的是转基因水稻分蘖期及孕穗期被二化螟取食诱导前后GUS mRNA表达情况。图中：tilleringstage代表分蘖期；booting stage，代表孕穗期；control代表对照；feeding代表二化螟取食；L代表叶片；Sh，代表叶鞘；Cm代表茎杆；P代表幼穗。

具体实施方式

实施例1：分蘖期水稻叶鞘中二化螟取食特异诱导cDNA的获得

(1)取四个塑料盆，每个塑料盆中种植3株“明恢63：稻苗，共种植四盆，放在能够阻挡昆虫进入的网室中生长。在水稻的分蘖期，将每盆幼苗中的一株定为对照，一株用剪刀在叶鞘上模拟二化螟的蛀食孔剪一个小孔作为机械损伤处理，另一株接上1头3-4龄的二化螟幼虫。密切关注幼虫开始取食的时间并做好记载。从不同的塑料盆分别取对照及处理1h、3h、6h、12h的叶鞘，采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)抽提总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)。

(2)将分蘖期被二化螟取食后3h、6h的叶鞘总RNA等量混合，利用Dynabeads oligo dT(25)(购自挪威Dynal A.S.公司)分离纯化mRNA(纯化方法参照Dynabeads oligo dT(25)产品使用说明书)；同样的方法从对照的总RNA分离纯化mRNA待用。以二化螟取食后mRNA作为tester，以对照mRNA为driver，用购买的PCR-Select cDNA SubtractionKit试剂盒并参照该试剂盒的说明书(试剂盒购自Clontech，Palo Alto，Calif公司，美国)构建正向cDNA差减文库，得到被二化螟诱导后上升表达的基因；以对照mRNA作为tester，以二化螟取食后叶鞘mRNA为driver构建反向cDNA差减文库，得到被二化螟诱导后下降表达的基因。

(3)从上述正向和反向两个cDNA差减文库中随机挑选864个克隆，用T7作为通用引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′，购自北京博亚公司，中国)，利用BigDye Terminator CycleSequencing V2.0软件(来自美国Applied Biosystems公司)测序，得到724条长度大于100bp的序列。按照Zhang等(Zhang L D等，A new method for EST clustering.，2003，Acta Genetica Sinica，30：147-153)报道的方法将这724条序列进行拼接，得到271条单一序列。将含有此271条序列的cDNA克隆及来自华中农业大学国家作物遗传改良重点实验室的“明恢63”全生育期平衡化cDNA文库(Chu Z，等，Constructionand characterization of a normalized whole-life-cycle cDNA library of rice，2003，Chinese Science Bulletin，48：229-235)的103个克隆抽提质粒后利用Biomek 2000 robot(Beckman公司生产)点在尼龙膜(AmershamPharmacia公司生产)上，每个质粒点两个点。同时将含有水稻肌动蛋白基因(GenBank Acc.No.EI077C02)和猪3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GenBank Acc.No.AF017079)的质粒分别作为正控和负控也点在尼龙膜上。根据Zhou等(Zhou等，The defense responsive genes showing enhanced and repressed expression after pathogeninfection in rice(Oryza sativa L.).2002，Science China(Series C)，45：449-467)报道的方法将尼龙膜处理好待用。

(4)将分蘖期“明恢63”被二化螟取食后6h叶鞘总RNA及对照总RNA反转录并用³²P标记作为探针分别与尼龙膜杂交，杂交方法参照Zhou等的方法(ZhouB等，Thedefense responsive genes showing enhancedand repressed expression after pathogen infection in rice(Oryza sativa L).2002，Science China(Series C)，45：449-467)，杂交重复2次，找出在2次重复中皆上升表达的克隆。

(5)将以上被二化螟取食、机械损伤后1h、3h、6h、12h的水稻叶鞘总RNA及对照总RNA按照Chu等的方法(Chu Z等，Ge on me-wide analysis of defense-responsive genes in bacterial blight resistance of ricemediated by the recessive R gene xal3.2004，Mol.Gen.Genomics，271：111-120)转膜，将上升表达克隆作为探针进行Northern杂交。结果得到一个被二化螟强烈诱导上升表达，但不被机械损伤诱导的cDNA克隆B1-A04(如附图2所示)。

实施例2：B1-A04启动子候选片段的转化载体的构建

(1)根据B1-A04的序列找到了对应的粳稻“日本晴”(一种公开报道的水稻品种)的基因组序列(GenBank登录号为：AL731753)和全长cDNA(见GenBank登录号为：AK12169)。将上述信息与植物启动子预测软件(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)(Reese，M G，Application of a time-delay neural networkto promoter annotation in the Drosophila melanogaster genome.Comput.Chem.，2001，26：51-56)的预测结果结合，确定B1-A04基因的启动子候选片段(见图1所示)。

(2)用B1-A04为探针与“明恢63”基因组BAC文库(见Peng K M等，A BAC library constructed to therice cultivar“Minghui63”for cloning genes of agronomic importance，Acta Bot.Sinica，1998，40：1108-1114)膜杂交，分子杂交按照Liu等报道的方法(见Liu K D等，A genome-wide analysis of wide compatibility in riceand the precise location of the S5 locus in the molecular map.1997，Theor Appl Genet，95：809-814)。杂交后得到一个阳性克隆18M07。设计引物：BPF1(5′-AAC GGT GAA TTC ACA ATC CGC TCC CAC CGT-3′)和BPR(5′-CGA GAC TGT CGA CGA AGA TTC GGA CAC GGT-3′)(说明：引物序列中斜体下划线分别表示添加的限制性酶切位点)。BPF1中设计了一个EcoRI内切酶识别位点，BPR中设计了SalI内切酶识别位点。以18M07为模板，以BPF1、BPR为引物，利用Ex Taq酶(由宝生物工程(大连)有限公司提供，中国)扩增得到B1-A04的启动子候选片段。PCR扩增的条件为：94℃预变性5分钟；94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

(3)收集PCR产物，加入1/10体积的醋酸钠(3M，pH 5.2)和2倍体积95％乙醇，沉淀DNA；用75％的乙醇洗涤沉淀，沉淀自然风干后加超纯水溶解待用。上述PCR纯化产物经SalI、EcoRI双酶切，酶切产物在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳，切下目的条带后用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司生产，中国)回收，加30微升超纯水溶解。

(4)将植物双元Ti质粒载体pCAMBIA1381a，pCAMBIA1381b，pCAMBIA 1381c(来自CAMBIA公开使用的载体，载体含有GUS报告基因)SalI、EcoRI双酶切，酶切产物中加入1/10体积的醋酸钠(3M，pH 5.2)和2倍体积95％乙醇，沉淀DNA；用75％的乙醇洗涤沉淀，沉淀自然风干后加30微升超纯水溶解。

(5)用连接酶将上述纯化好的PCR酶切产物与双元Ti质粒载体酶切产物连接起来(连接酶及其缓冲液购自Invitrogen公司)。连接体系为：连接酶(1U/微升)1微升，连接酶缓冲液1微升，PCR酶切产物2微升，双元Ti质粒载体酶切产物1微升，在19℃过夜连接。

(6)连接产物电转化到大肠杆菌DH10B菌株(购自Promega公司)中。将电转化产物涂在含卡那霉素(50毫克/升)的LA培养基上(LA培养基的配制参照《分子克隆》，科学出版社，1999)，37℃培养16小时。挑取单菌落在含有卡那霉素的LB培养基中37℃培养16小时(LB培养基的配制参照《分子克隆》，科学出版社，1999)。抽提质粒，以BPF1、BPR为引物，以质粒为模板进行PCR检测阳性克隆(PCR扩增的条件参照实施例2(2))。阳性克隆的质粒进一步用SalI、EcoRI双酶切，检测插入片段的大小是否符合要求。构建好的转化载体分别命名为pCAMBIA1381a-pB，pCAMBIA1381b-pB，pCAMBIA1381c-pB(见图3)。

(7)以BPF1、BPR为引物，利用BigDye Terminator Cycle SequencingV2.0软件(Applied Biosystems，FosterCity，Calif.，USA)对分离的B1-A04的启动子序列候选片段进行测序，结果见SEQ ID NO：1所示。

(8)将pCAMBIA1381a-pB，pCAMBIA13g1b-pB，pCAMBIA1381c-pB导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105菌株(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)，构成转化菌株。

实施例3：农杆菌介导的遗传转化

农杆菌介导的遗传转化方法主要遵照本申请人华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的标准方法，(参见林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28(3)：294-300)。转化受体为水稻品种″中花11″(来自中国农业科学院作物研究所商业经营品种)的成熟种子。具体主要步骤和试剂如下：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlrophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

硝酸钾(KNO₃)            28.3克

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)      4.0克

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)       4.63克

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)     1.85克

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)     1.66克

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

碘化钾(KI)              0.08克

硼酸(H₃BO₃)             0.16克

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)     0.44克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)     0.15克

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

烟酸(Nicotinic acid)        0.1克

维生素B1(Thiamine HCl)      0.1克

维生素B6(Pyridoxine HCl)    0.1克

甘氨酸(Glycine)             0.2克

肌醇(Inositol)              10克

加蒸馏水定容至1000升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

硝酸铵(NH₄NO₃)              16.5克

硝酸钾                      19.0克

磷酸二氢钾                  1.7克

硫酸镁                      3.7克

氯化钙                      4.4克

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)         2.23克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)         0.86克

硼酸(H₃BO₃)                 0.62克

碘化钾(KI)                  0.083克

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)       0.025克

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)         0.0025克

氯化钴(CoCl₂·6H₂O)         0.0025克

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同)        100毫升

N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)       10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)  10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)    10毫升

2，4-D贮存液(取上述制备好的)                    2.5毫升

脯氨酸(Proline)                                 0.3克

CH                                              0.6克

蔗糖                                            30克

Phytagel                                        3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

N6max母液(10X)        100毫升

N6mix母液(100X)       10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)  10毫升

维生素贮存液(100X)    10毫升

2，4-D贮存液          2.0毫升

脯氨酸                0.5克

CH                    0.6克

蔗糖                  30克

Phytagel              3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述常规方法灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X)        12.5毫升

N6mix母液(100X)       1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)  2.5毫升

维生素贮存液(100X)    2.5毫升

2，4-D贮存液          0.75毫升

CH                    0.15克

蔗糖                  5克

琼脂粉    1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述常规方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X)            12.5毫升

N6mix母液(100X)           1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      2.5毫升

维生素贮存液(100X)        2.5毫升

2，4-D贮存液              0.75毫升

CH                        0.2克

蔗糖                      5克

琼脂粉                    1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述常规方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X)            5毫升

N6mix母液(100X)           0.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      0.5毫升

维生素贮存液(100X)        1毫升

2，4-D贮存液              0.2毫升

CH                        0.08克

蔗糖                      2克

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述常规方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X)            25毫升

N6mix母液(100X)           2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      2.5毫升

维生素贮存液(100X)        2.5毫升

2，4-D贮存液              0.625毫升

CH                        0.15克

蔗糖                      7.5克

琼脂粉                    1.75克

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述常规方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)

7)预分化培养基

N6max母液(10X)            25毫升

N6mix母液(100X)           2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      2.5毫升

维生素贮存液(100X)        2.5毫升

6-BA贮存液                0.5毫升

KT贮存液                  0.5毫升

NAA贮存液                 50微升

IAA贮存液                 50微升

CH                        0.15克

蔗糖                      7.5克

琼脂粉                    1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述常规方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X)            100毫升

N6mix母液(100X)           10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      10毫升

维生素贮存液(100X)        10毫升

6-BA贮存液                2毫升

KT贮存液                  2毫升

NAA贮存液                 0.2毫升

IAA贮存液                 0.2毫升

CH                        1克

蔗糖                      30克

Phytagel                  3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述常规方法灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X)            50毫升

MSmix母液(100X)           5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      5毫升

维生素贮存液(100X)        5毫升

蔗糖                      20克

Phytagel                  3克

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述常规方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

3.1愈伤诱导

1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照《分子克隆》，科学出版社，1999)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗移入培养盆，一星期后移入能够保护植株不被昆虫取食的网室中。

实施例4：GUS组织染色法分析B1-A04启动子在二化螟诱导前后不同水稻器官中的表达模式

由于水稻分蘖期和孕穗期是容易受到二化螟为害的时期，因此通过GUS染色法考察转基因植株中B1-A04启动子在这两个时期在不同器官中的表达情况。将分蘖期T0代植株接二化螟，接虫方法参照实施例1。二化螟取食后6h，取被取食后的叶鞘和叶片进行组织染色。染色、脱色方法参照Jefferson等报道的方法(见Jefferson R A等，GUS fusions：beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusionmarker in higher plants，EMBO J，1987，6：3901-3907)。结果表明：在pCAMBIA1381a-pB，pCAMBIA1381b-pB，pCAMBIA1381c-pB三种载体的转基因植株中，只有pCAMBIA1381b-pB的转化植株中的GUS可以表达。收集T0代GUS表达的植株的种子。将种子进行表面消毒后(消毒方法参照实施例3)，放在含有50毫克/升潮霉素的生根培养基(该生根培养基的成分参见上述实施例3所述的生根培养基配方)上进行发芽试验。选取生长正常的幼苗待用。为了提高准确性，在植株分蘖期，将一株稻株分蔸成两株，一株用于二化螟取食处理，一株用于对照。10天后，待植株生长正常后，进行二化螟取食处理。二化螟取食后6h取处理株和对照株的不同器官进行GUS染色，至少考察15个株系。结果表明：该启动子的表达模式为：未被二化螟取食时，该启动子在水稻叶鞘、叶片中不表达，在水稻幼穗、茎杆中表达；被二化螟取食后，在叶鞘、幼穗、茎杆中表达，在叶片中仍然不表达(附图4)。

实施例5：Northern Blot法分析B1-A04启动子在二化螟诱导前后不同水稻组织中的表达模式

按照实施例4的方法在转基因水稻植株分蘖期和孕穗期接二化螟。6h后用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)抽提处理和对照植株的不同器官总RNA并转膜(RNA提取方法及转膜方法参照上述实施例1)，以GUS为探针进行Northern杂交，Northern blot的方法参照实施例1。结果表明：取食前，GUS在叶鞘、叶片中不表达，在茎杆、幼穗中有表达；取食后，GUS在叶鞘、茎杆、幼穗中显著上升表达，在叶片中仍然不表达(见图5所示)。

实施例6：GUS活性测定法分析pB在分蘖期转基因植株中的二化螟诱导活性

试验材料的准备与种植参照实施例4。将接虫后6h的转基因植株叶鞘、叶片样品及对照通过GUS提取缓冲液(50mM NaHPO4，pH7.0，10mM β-mercaptoethanol，10mM Na₂EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton-100)抽提蛋白质，从样品蛋白质提取物中取10μl进行GUS活性的定量分析。具体操作如下：将10μl样品蛋白质提取物+0.4毫升GUS提取缓冲液+10μl40mM底物MUG(4-methylumbelifferylβ-D-glucuronide)在37℃水浴45分钟后，加入1.6毫升反应终止液(0.2M Na₂CO3)；将这2毫升反应液通过DyNA Quant 200荧光计(购自Hoefer公司)测量反应所生成4-MU(4-methylumbelifferyl)的相对荧光吸收值；然后对各样品的总蛋白质通过BSA法(见Bradford M M，A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem，1976，72：248-254)进行测量以便对各样品的GUS活性值进行比较分析；综合以上数据得出各个样品的GUS活性的绝对值(皮摩尔MU/分钟/毫克蛋白质)。至少测定5个株系的GUS活性。二化螟取食前后样品的GUS活性的绝对值见表1。

表1二化螟取食6h后，分蘖期转基因水稻植株叶鞘、叶片中GUS活性变化。

说明：表1中的数据单位是皮摩尔MU/分钟/毫克蛋白质。

表1的结果表明：在水稻分蘖期，叶鞘中GUS被二化螟强烈诱导，叶片中GUS不被二化螟诱导，B1-A04基因启动子的表达在分蘖期具有器官特异性。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一个被二化螟取食特异诱导表达的水稻启动子及应用

<130>

<141>2005-12-12

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2015

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>CDS

<222>(1773)..(2015)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1992)..(2015)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(24)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1568)

<223>

<220>

<221>TATA_signal

<222>(1538)..(1544)

<223>

<400>1

gattcacaat ccgctcccac cgttgtcgca tcaccatcac taccgcacgg gcgcccttcg     60

tcgccggcgg tttgccggcc ggattaagcc gacggctccg atcctcatcg gaatcggagg    120

ccggccgagc ccggacgcca ttcccggcac cccgttaggg agtgtacggc taggagagcc    180

atggggaacg gcgatgaagg tgtggcggag gccgggacgg agagtggcgg cttcaccggc    240

atgacgacga gacgaggacg gattgaagaa gggcggctcc cccgtgcgcg cagccagggt    300

accggttctg ccggacccca gtggcgcagg agtgggggaa cggagtcggc gtcggcttgg    360

tgtcggtgga ggtggtgaag ggcggtcagt ggtggcggca gcgactccat ctccggggaa   420

aggtcacatg gctcgccggg cagtgtcacc actgccgtcc atccgtggta ggcgcagtac   480

tgcaccccct gcacacagat acggcgaggc acggcggcaa ccggagacgg aggcggagga   540

ggagcagccg gagttgtggc caccacgatg cgtcggcgag ggtggtggcg acggccacca   600

gccctagccc gacgttcatg gtgttggtgg cgaccgtggt ggtggcggcg actcctctcc   660

gatcgacgga gaagatggtg aaggtgacgg gcgcgctgat tgcgagggag gccgagaacg   720

gcatccataa tccaatgaaa ggtaggcatc gtaccttctc tgttgaatct cttgttcgct   780

tttctgttag atcaaaagcg atgtttcttc cttctttcac ttcgcgatct ccttcgcgag   840

agcgaaagtg ctgataatgt gttgaatgtg gatagaattg attgagcgag agagagaatt   900

gaacacaaac agagcgaatc gatagatttc tcattgatca acagtacatt tatacaatgt   960

gaagcggtgt caaccgcagg ggacgcgata tttgggaaca tcgcgtcggt tgtcgagagg  1020

gacgccaaag ggagagagag gagcgatctc ctcttctcta ccggttagta tatgaaccgt  1080

tgttcctatt tccttgggtg gatgagatca cccgtagttt cttaacaaaa ggagcgcaat  1140

tgttgtgtga gaaaccaaac tggtttgttg ttcgtgtgga cactggacag agctgttgac  1200

tgatcgatgg tggtgcggtg gtgccatttc aaacttggca aaagtaggtg acacggtagg  1260

tgaatgtttt gtacgtagtg gccggccgct ggggccacga gcgtgccacg ccatcatcaa  1320

acacgtttct ctctttttct ttttggaggt ttcgttttct cttggtcaac attaatccgc  1380

tcgatcgcca cgtgatcctg ttgtgtctta attacttgag gctttgatca aacagcttga  1440

ccagcaacgt cgtgtggcat atgcatgcag gcacgtacac agtcagatcc accttggcaa  1500

gctataatcc tgatccaaac ctgcctctgg aactctatta taaatacgtg ccttgtatcg  1560

gtgctctcga tgaactctac aagtcatttt gtcgccatca gcttctttca tcaccaactc  1620

gatcagaccg tgagtggagt accttttaat tccttagttt tccttagttt atactgcctc  1680

tattttcctt ttaaataaac taattaacca atgcaacact gttcattaaa gaatagagga  1740

agtatatttt gttctcatgc gtgtatatat at atg tag cta gaa gtt att taa    1793

Met      Leu Glu Val Ile

1                    5

cta cct tta agg cat tta act tat cga tcc aca tgc agg cag aga cga    1841

Leu Pro Leu Arg His Leu Thr Tyr Arg Ser Thr Cys Arg Gln Arg Arg

10                  15                  20

ggg aag atg agc tcg tcg gcg aag acg tcg tgg ccg gag gtg gtt ggg    1889

Gly Lys Met Ser Ser Ser Ala Lys Thr Ser Trp Pro Glu Val Val Gly

25                  30                  35

ctg agc ata gag gag gcc aag aag gtg att ctc aag gac aag ccc gac    1937

Leu Ser Ile Glu Glu Ala Lys Lys Val Ile Leu Lys Asp Lys Pro Asp

40                  45                  50

gcc gac atc gtc gtg ctg cca ttc ggc acg gcg gtg cca gag gat ttt    1985

Ala Asp Ile Val Val Leu Pro Phe Gly Thr Ala Val Pro Glu Asp Phe

55                  60                  65

cgc ttc aac cgt gtc cga atc ttc gtc gac                            2015

Arg Phe Asn Arg Val Arg Ile Phe Val Asp

70                  75

<210>2

<211>4

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Leu Glu Val Ile

1

<210>3

<211>74

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>3

Leu Pro Leu Arg His Leu Thr Tyr Arg Ser Thr Cys Arg Gln Arg Arg

1               5                   10                  15

Gly Lys Met Ser Ser Ser Ala Lys Thr Ser Trp Pro Glu Val Val Gly

20                  25                  30

Leu Ser Ile Glu Glu Ala Lys Lys Val Ile Leu Lys Asp Lys Pro Asp

35                  40                  45

Ala Asp Ile Val Val Leu Pro Phe Gly Thr Ala Val Pro Glu Asp Phe

50                  55                  60

Arg Phe Asn Arg Val Arg Ile Phe Val Asp

65                  70

Claims (4)

1、一个分离克隆的来源于被二化螟取食的水稻上的启动子B1-A04，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2、包含权利要求1所述的B1-A04启动子序列的植物表达载体。

3、权利要求2所述的植物表达载体，该载体是pCAMBIA1381b-pB。

4、权利要求1所述的启动子在培育抗二化螟水稻中的应用。

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