CN112522270B

CN112522270B - 水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1及其在培育智能抗螟虫水稻中的应用

Info

Publication number: CN112522270B
Application number: CN202011524848.6A
Authority: CN
Inventors: 陈浩; 凃巨民; 都浩; 曹方彬; 梅磊
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112522270A; WO2022134132A1

Abstract

本发明公开了一种水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1、基因OsISA1及其在培育抗二化螟水稻中的应用；该启动子pOsISA1其至少包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；该基因OsISA1如SEQ ID NO.3所示。本发明找到了一种水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1和基因OsISA1，发现了该启动子和基因在培育抗二化螟水稻中的新用途，并为培育抗二化螟的水稻品种提供重要的基因资源。

Description

水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1及其在培育智能抗螟虫水稻中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1及其在培育智能抗螟虫水稻中的应用。

背景技术

虫害是造成水稻减产的最主要因素之一，数据统计显示每年因此造成的减产数量惊人。目前在农业生产上对害虫的防治主要依靠化学杀虫剂。化学杀虫剂的大量使用不仅增加了生产成本，造成了环境污染，甚至威胁人类健康。亟需培育抗虫水稻品种，以提高水稻自身抗虫性。但是，常规水稻育种技术培育抗虫新品种不仅需要较长的时间，而且对于水稻最主要的害虫二化螟、三化螟及稻纵卷叶螟等，目前在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源，因此通过常规育种提高水稻的抗虫性目前仍然走不通。所以最直接的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入受体水稻中创造出新的抗虫品种。迄今为止，人们在植物、动物甚至微生物中已鉴定并克隆了许多有用的抗虫基因，一些抗虫基因已转入水稻获得了转基因抗虫品系，而且有一些已进行了大田实验，对上述害虫表现出良好的抗性。

从转基因抗虫水稻的发展来看，从起步阶段开始利用35sCaMV、Actin I、Ubiquitin等组成型表达启动子驱动抗虫基因的表达，获得了很多对螟虫表现出较好抗性的转基因水稻新品系。随着转基因技术和检测手段的发展，人们发现使用组成型表达启动子在试验的过程中暴露出一些问题，比如过度消耗植物细胞内的物质和能量，增加水稻的代谢负担引起农艺性状的改变，同时，还存在着公众对食品安全的过度担忧等等。造成这些问题最主要的原因就是利用组成型表达启动子驱动目的基因，不能从时间和空间上有效的调控目的基因的表达，而只能在转基因受体植物各组织器官中中持续而恒定的表达。另外，当重复使用同一种组成型表达启动子驱动两个或两个以上的外源基因表达时，可能会引起转基因沉默或者共抑制现象，为多基因转化带来不少麻烦。为此，随着植物基因工程的发展，亟需寻找更为有效的组织、器官特异性表达启动子或诱导型表达启动子来代替组成型表达启动子，以期在时间和空间上更好地调控目的基因在目标组织或器官中表达。

诱导型启动子是指在某些物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高目的基因的转录水平。其中，主要有激素诱导启动子，例如SAUR15(Small Auxin-up RNA15)基因启动子受生长素和油菜素内酯诱导而上调表达(Walcher,C.L.,Nemhauser,J.L.,Bipartitepromoter element required for auxin response[J].Plant physiology,2012,158(1),pp 273-282.)；其次，有一类是非生物逆物境胁迫诱导启动子，水稻Wsi18基因可以被NaCl、ABA及干旱胁迫显著诱导而上调表达，但对低温胁迫无明显响应。分离克隆其启动子，研究发现该启动子在转基因水稻的本底活性非常低，但可被上述逆境胁迫诱导上升表达(Yi,N.,Oh,S.-J.,Kim,Y.S.,etc.,Analysis of the Wsi18,astress-inducible promoterthat is active in the whole grain of transgenic rice[J].Transgenic research,2011,20(1),pp 153-163.)。还有一类是生物逆境胁迫诱导启动子，例如PmTNL1基因启动子可以被白锈病特异高效的诱导(Liu,J.-J.,Ekramoddoullah,A.K.,Genomicorganization,induced expression and promoter activity of a resistance geneanalog(PmTNL1)in western white pine(Pinus monticola)[J].Planta,2011,233(5),pp1041-1053.)，水稻Xa13基因的启动子可以被白叶枯病特异诱导(Yuan,T.,Li,X.,Xiao,J.,etc.,Characterization of Xanthomonas oryzae-responsive cis-acting elementin the promoter of rice race-specific susceptibility gene Xa13[J].Molecularplant,2011,4(2),pp 300-309.)。Hua等(Hua,H.,Lu,Q.,Cai,M.,etc.,Analysis of ricegenes induced by striped stemborer(Chilo suppressalis)attack identified apromoter fragment highly specifically responsive to insect feeding[J].Plantmolecular biology,2007,65(4),pp 519-530.)分离克隆到一个二化螟取食特异诱导表达的启动子片段，在抗虫转基因研究上具有有非常好的前景。

但是，目前对于害虫危害诱导型启动子的研究仍然较少，而水稻中二化螟危害诱导性启动子的研究则更少，有必要做进一步地深入研究，挖掘更多二化螟危害诱导性启动子和基因。

发明内容

本发明提供了一种新的水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1、基因OsISA1及其在培育抗螟虫水稻中的新用途，为培育智能抗螟虫水稻提供了依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1，其至少包含如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

启动子pOsISA1是一个预测的类细胞色素P450基因的启动子，全长为2360bp，其中最后650bp区域经生物信息学预测包含启动子核心元件，即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。经New PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action＝newplace)和plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)等启动子预测网站预测其中包含有TATA box和CAAT box等启动转录的核心元件，以及预测的应激响应元件CATTTG。上述启动子可以快速响应二化螟危害并启动下游基因的转录。

根据水稻在接种二化螟处理前后的转录组测序数据显示，基因OsISA1在受到二化螟危害处理前在各个组织和部位中mRNA转录水平极低，几乎检测不到。而在二化螟危害后在茎秆等危害的组织中转录水平急剧上调，上调倍数超过500倍。表明该基因可以快速高效响应二化螟的危害，其启动子表现为二化螟危害诱导性启动子。因此，从粳稻品种日本晴中克隆上述启动子和抗虫元件组成抗虫模块并导入底盘作物水稻中，可以实现抗虫基因的智能表达。具体表现为在害虫不危害时抗虫模块不工作，无抗虫蛋白表达，从而不影响水稻的生长和发育，而在二化螟危害时快速高效表达抗虫蛋白以抵御害虫危害。最后，保证在食用部位无抗虫蛋白产生和积累。本发明还公开上述启动子的克隆及其相应表达载体的构建方法，以及水稻通过农杆菌介导的遗传转化方法。上述启动子的特征在培育新型智能抗虫水稻中具有较强的应用价值。

本发明还提供了水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1在培育智能抗螟虫水稻中的应用。

所述螟虫包括二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫。

进一步地，所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含权利要求1或2任一项所述的水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1的重组载体；

(2)将所述重组载体转入农杆菌感受态细胞中，构建含步骤(1)所述重组载体的基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述基因工程菌介导转化水稻愈伤组织，得到转基因阳性水稻植株。

进一步地，步骤(1)中，所述重组载体的原始表达载体为pSB130，重组载体中还包含抗虫基因。

进一步地，步骤(2)中，所述农杆菌为EHA105。

本发明还提供了水稻基因OsISA1作为二化螟危害诱导性基因在培育抗螟虫水稻中的应用，所述基因OsISA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述螟虫包括二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫。

进一步地，所述的应用包括以下步骤：

(A)构建含水稻基因OsISA1的重组载体，所述基因OsISA1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

(B)将所述重组载体转入农杆菌感受态细胞中，构建含步骤(A)所述重组载体的基因工程菌；

(C)将步骤(B)所述基因工程菌介导转化水稻愈伤组织，得到转基因阳性水稻植株。

进一步地，步骤(A)中，所述重组载体的原始表达载体为pSB130，重组载体中还包含水稻组成型启动型启动子pActin I。

进一步地，步骤(B)中，所述农杆菌为EHA105。

本发明还提供了一种重组载体，其包含所述的水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1；或者，包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的水稻基因OsISA1。

进一步地，所述重组载体还包括抗虫基因；进一步地，所述抗虫基因为Bt基因。

本发明还提供了一种转化子，其包含所述的水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1；或者包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的水稻基因OsISA1。

进一步地，所述转化子还包括抗虫基因；进一步地，所述抗虫基因为Bt基因。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明找到了一种水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1和基因OsISA1，发现了该启动子和基因在培育抗二化螟水稻中的新用途，并为培育智能抗螟虫的水稻品种提供重要的基因资源。

(2)本发明利用转基因技术提供一种培育智能抗螟虫水稻的方法，并获得了智能抗虫水稻材料。

附图说明

图1为本发明构建智能抗虫水稻的总流程示意图。

图2为实施例1中OsISA1基因在粳稻日本晴中各个组织的相对表达量，数据来源水稻基因注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

图3为实施例1中OsISA1基因在受到二化螟危害时转录本的平均相对表达量。

其中，HPL2为阳性对照，其启动子是二化螟危害诱导型。横坐标1-4分别代表处理前(0h)，处理24h,48h和72h。纵坐标代表转录本的相对表达量。共设置4个生物学重复。

图4为实施例1的pSB130-rbcS-TP-Bt表达载体示意图。

图5为实施例1的pOsISA1-Bt表达载体示意图。

图6为实施例1的转基因抗性愈伤中cry1Ab/cry1Ac目的基因的分子检测；

其中，M：DL 2000分子量标记；+：阳性对照；－：阴性对照；1-33：转化后的愈伤；箭头指示目标条带。

图7为实施例2的茎秆Cry1Ab/Cry1Ac中蛋白检测结果；

其中，IC-3、IC-5、IC-8为3个独立的转化体；ZY3(TT51衍生系)作为阳性对照，NT为非转基因阴性对照；IC3-T等3个为二化螟人工处理后结果，而IC-3等3个为相应未处理的对照样品。

图8为实施例4的种子中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白检测结果；

其中，IC-3、IC-5、IC-8为3个独立的转化体；ZY3(TT51衍生系)作为阳性对照；NT为非转基因阴性对照。

图9为实施例5中pOsISA1-OE表达载体示意图。

图10为实施例5中OsISA1基因过表达时其转录本的平均相对表达量。

其中，NT为阴性对照。横坐标代表4个独立的转化体。纵坐标代表转录本的相对表达量。共设置3个生物学重复。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1.二化螟危害诱导性基因及启动子的发掘

分别取水稻分蘖期茎秆在二化螟危害前(0h)以及危害后(24h、48h和72h)的转录组测序数据，利用生物信息学技术筛选快速响应二化螟危害而自身表达在无二化螟危害时几乎不表达的目标基因。

上述基因的特点如下：在二化螟危害处理前，基因转录水平低，以FPKM≤20为限；在二化螟危害处理后，表达量急剧上调，上调倍数以≥50倍为宜；并要求在水稻基因注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中各个组织和部位的FPKM值极低，尤其是要求胚乳中的检测值为0。

根据上述要求筛选到一个类细胞色素P450基因(Loc_04g08824)，将其命名为OsISA1(Induced by Striped stem borers Attacked 1)(附图2)。而上述茎秆接虫转录组测序数据显示，OsISA1在受到二化螟危害后急剧上调表达(附图3)。因此，预测其启动子具有快速高效响应二化螟危害的功能。根据水稻基因注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)公布的日本晴测序序列，在ATG前2Kb左右的大小作为预测的启动子区域。本专利中，选择OsISA1基因起始密码子ATG前2360bp为启动子，命名为pOsISA1。

2.智能抗虫表达模块的构建

根据水稻基因注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)提供的序列信息和表达载体pSB130-rbcS-TP-Bt的序列信息(附图4)，参考一步法快速克隆试剂盒Hieff

Plus One Step Cloning Kit说明书设计包含kozak序列的克隆引物(pOsISA1-F：5’-TAAAACGACGGCCAGTGCCGCTTGTGAAATTTACTCTGTAA-3’,pOsISA1-R：5’-GCAGTTGTTGTCCATGGTGGCGCTAGATAACTGATCAGGTGGC-3’)。

以日本晴野生型水稻高质量DNA为模板，利用KOD FX高保真酶扩增pOsISA1序列2360bp、Kozak序列(GCCACCATGG，不包含带下划线的部分碱基)及载体骨架两侧同源序列共2400bp DNA片段，连接到pSB130-rbcS-TP-Bt切除rbcS-TP片段后的载体骨架pSB130-Em-Bt上，并且不保留同源连接处的HindⅢ和SalⅠ酶切位点。

具体实验方法如下：

2.1目标片段克隆

KOD FX反应体系(40μL)：

反应程序为94℃ 3min，98℃ 10s，68℃ 3min 15sec，扩增32个循环，最后68℃延伸7min。将上述产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离。

2.2目标片段的回收

使用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit进行对上述目标片段胶回收，具体步骤如下：用刀片将琼脂糖胶上的目的条带切下，放入1.5mL离心管中；向离心管中加入3倍体积的ADB buffer，即100μL(mg)胶加300μL ADB buffer，然后置于55℃金属浴中5-10分钟使凝胶完全熔化；将琼脂糖溶液移至套在收集管上的吸附柱中，12000rpm离心30sec，弃流出液；向吸附柱中加200μL Wash Buffer，12000rpm离心1分钟，弃流出液；重复洗两次后空管离心2min；将吸附柱套在新的1.5mL离心管上，加入6-20μL Elution Buffer，静置1min后离心1min将DNA洗脱下来。

2.3载体线性化

使用TaKaRa公司的HindⅢ和SalⅠ对pSB130-rbcS-TP-Bt载体进行双酶切，具体步骤如下：

37℃孵育1小时后电泳回收片段较大的载体骨架pSB130-Em-Bt。

2.4目的载体构建

将回收的PCR产物和线性化载体用一步法快速克隆试剂盒Hieff

Plus OneStep Cloning Kit进行表达载体的构建，体系如下：

混匀离心后置于PCR仪50℃反应20分钟，冰上冷却5分钟后转化大肠杆菌DH5α，具体步骤如下：

将DH5α感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化，加入上述连接产物，轻轻混匀；冰浴30min后在42℃水浴锅中热激45s，冰上冷却2分钟；加入500μL LB液体培养基，置于37℃摇床，200rpm复苏1h；5000rpm离心3min沉淀菌体，吸除400μL上清，将剩余的上清与菌体吹打混匀；将菌液均匀涂在含有卡拉霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养过夜(12-16h)；挑选3个单克隆，接种至含有卡拉霉素的LB液体培养基中，置于37℃、250rpm摇床上培养至溶液浑浊，通过菌液PCR检测出阳性克隆，送测序鉴定。测序正确的样品保存菌液和质粒备用。

将测序正确的表达载体命名为pOsISA1-Bt。表达载体图谱如附图5所示。至此，智能抗虫表达模块构建成功。

3.农杆菌介导的水稻遗传转化

3.1表达载体转化农杆菌EHA105

pOsISA1-Bt载体转化农杆菌采用电击转化法进行，所用的农杆菌菌株为EHA105。具体程序如下：取0.5μL质粒加入含有50μL农杆菌EHA105电击感受态细胞的1.5mL离心管中，用移液器吸打混匀后移入电极杯中；电击后，迅速加入1mL的LB液体培养基，吸打混匀后移入之前的1.5mL离心管中，于28℃恒温振荡仪上振荡培养1h；待菌液复苏后，吸取100μL菌液，均匀涂布于LB固体筛选培养基(含50mg/L的卡那霉素、25mg/L的利福平)表面，培养皿倒置置于28℃培养箱培养2天；菌落PCR验证阳性克隆后，对阳性克隆摇菌保存菌液(1mL菌液加入250μL 80％无菌甘油)。-80℃保存备用。

3.2农杆菌介导的水稻遗传转化

水稻转化按陈浩(陈浩.“基因开关”系统的研制及其在培育胚乳零表达型“绿色”抗虫水稻中的应用[D].浙江:浙江大学,2016.)报道的方法步骤进行。

其具体程序如下：

取出保存于-80℃农杆菌菌液，从中吸取200μL均匀涂布于到含有25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基表面，于28℃条件下培养过夜；再从中挑单菌落扩大培养，所用液体培养基同前文所述；之后，从中吸取200-300μL的新鲜菌液接入到20mL含有25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡(220rpm)培养16-18h。取足量的菌液于4000rpm下离心15min，弃去LB培养基上清液；加入20mL 0.1M MgSO₄溶液重新悬浮农杆菌(用移液器轻轻吹打重悬)，于4000rpm下离心10-15min，弃去含有抗生素的MgSO₄上清液；再加入5mL含有200μM乙酰丁香酮(AS)的AA-AS侵染培养基重新悬浮农杆菌，再加入适量的AA-AS侵染培养基调整菌液的OD600值最终调整在0.2-0.8之间；用无菌的50mL离心管分装菌液，20-25mL/管，待用。

将预培养7天左右的秀水134胚性愈伤从继代培养皿中转移至覆有无菌滤纸的空培养皿中，在超净工作台上风干10-15min左右，期间用灭菌过的不锈钢小勺缓缓翻滚愈伤使之充分干燥；待其干燥后，移入盛有菌液的50mL离心管，在室温下轻轻摇晃(不可太剧烈)40min左右，将该离心管于超净工作台上静置10min；弃去菌液，将胚性愈伤置于无菌滤纸上干燥15min左右；然后，将侵染过的愈伤转移至表面以无菌滤纸覆盖的含有AS(200μM)的共培养培养基(表1)上，于28℃条件下暗培养50-55h；挑选表面农杆菌未大量生长或未污染的胚性愈伤，移至含有500mg/L头孢霉素的抑菌培养基上(表2)，28℃暗室中抑菌培养3-4d；再将抑菌培养后的愈伤移至含有500mg/L头孢霉素和75mg/L潮霉素的筛选培养基上，28℃暗室培养；在最初的一周内，每天都要检查农杆菌污染情况，若污染控制不住，需及时更换筛选培养基，每隔半月挑选生长状态良好的愈伤于新鲜筛选培养基上继代，并根据农杆菌自身污染的程度来调整培养基中头孢霉素的浓度，一般情况下至第三或第四轮继代筛选时可考虑将其浓度减半。

依照上述程序共获得33个独立转化体。

表1 AA培养基配方

表2.CC培养基配方

3.3转基因抗性愈伤的PCR鉴定

3.3.1抗性愈伤基因组DNA的抽提

从继代培养的每个独立转化体上称取0.1g的转基因抗性愈伤，置于灭菌装好研磨珠的1.5mL离心管中；加入500μL的1.5×CTAB抽提液于磨样机上研磨至匀浆，置于56℃水浴20-30min(水浴期间取出反复颠倒混匀2次)；之后加入500μL的氯仿，上下颠倒数次充分混匀后室温下离心10min(8000rpm)；吸取400μL上清到新的离心管，加入800μL的的无水乙醇，混匀后于-30℃中放置30min左右；12000rpm和室温下离心5min后弃去上清；用75％乙醇浸洗DNA沉淀，弃去乙醇并置于室温晾干；加入100μL无菌水溶解过夜待用。

3.3.2转基因抗性愈伤中cry1Ab/cry1Ac的分子检测

利用常规PCR技术对转基因抗性愈伤中cry1Ab/cry1Ac的分子检测是进行的。所用的检测引物为：Bt-F：5′-TGGTTCTGCCCAAGGTATCG-3′和Bt-R：5′-AACGGTTCCGCTCTTTCTGT-3′,扩增出的目的片段大小为369bp左右，其PCR反应体系同常规体系，所用的PCR反应程序为94℃变性5min；95℃变性15sec，55℃退火30sec和72℃延伸30sec(32个循环)；再经72℃延伸10min后12℃低温保存。所得PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。

PCR检测结果显示：筛选的33个转基因抗性愈伤中有18个约54.5％的比例可以检测到cry1Ab/cry1Ac基因(图6)。表明目的基因已经整合到受体植物中，而阴性单株表明该抗性愈伤可能只整合了Hpt基因而可以在选择培养基上生长，而没有整合目的基因。

因此，将上述阴性材料舍弃，只再生阳性材料进行再分化。

3.3.3 cry1Ab/cry1Ac阳性愈伤的分化

cry1Ab/cry1Ac阳性愈伤的分化按陈浩(陈浩.“基因开关”系统的研制及其在培育胚乳零表达型“绿色”抗虫水稻中的应用[D].浙江:浙江大学,2016.)报道的方法进行。具体实验程序如下：将目的基因cry1Ab/cry1Ac呈阳性的抗性愈伤转移至N6分化培养基(N6基本培养基+2mg/L Kinetin+1mg/L NAA +4％Gelrite)上，于28℃暗室中预分化7-9天，再转接到新鲜的分化培养基上，于25℃光室中进行绿苗的分化(一般7-14天后可见分化绿点，3周后可分化成绿苗)。所获得的绿苗，洗净粘附于根系上的培养基后，直接(根芽同时分化型)或经生根培养基壮根后(芽先分化型)移入Yoshida培养液中过渡培养，待其生长状态良好与稳定后，再移栽到温室，直至成熟。

实施例2阳性转基因植株IC-3等转化体中抗虫蛋白定性检测

阳性转基因植株IC-3等3个转化体中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白用上海佑隆公司的Cry1Ab/Cry1Ac试纸条进行检测分析。水稻抽穗期茎秆中的蛋白质抽提和试纸检测按产品说明书中描述的步骤稍加改动进行。分别选择二化螟危害后的茎秆(人工接虫48h)与未受二化螟危害的茎秆进行比较实验，对上述3个转化体进行检测以验证智能抗虫模块的功能。

具体步骤如下：分别取长2-3cm左右的转基因水稻茎秆置于研钵中，加入液氮充分研磨。取0.2g左右粉末加入预装0.5mL试剂盒自带的蛋白抽提Buffer的1.5mL离心管中，涡旋震荡混匀后12000rpm离心30sec。取0.3mL上清液转移至另一个无菌的1.5mL离心管。然后放入试纸条，3min左右观察试纸条的显色情况。

结果显示阳性转基因植株的蛋白样本在受到二化螟危害后均能检测到目标条带，而与之对应的对照中均检测不到(附图7)，结果说明Cry1Ab/Cry1Ac蛋白在受体基因组中不受二化螟危害时不表达，仅在二化螟危害之后表达。据此推断智能抗虫模块可以按照预期设计正常工作。

实施例3 IC-3等转化体To代单株的抗虫性鉴定

选择上述IC-3等3个独立转化体进行人工接虫鉴定，接虫鉴定采用人工离体茎秆法。

离体茎秆法的具体步骤如下：取抽穗期的主穗稻苗2根，把稻苗擦干，将2根稻苗截取成包含节和叶鞘的5cm茎秆2根，随后在茎秆两端压上用0.1g/L苯骈眯唑保鲜液浸渍过的小滤纸片。然后每根茎秆分别接入10头蚁螟(二化螟)，将2根茎秆移置小平底玻管(9.5cm×1.5cm)内径，管口塞紧脱脂棉花。自开始接虫后第7天分别考查或测定幼虫死亡率和活虫重量。其间，第3天在茎秆两端增加用0.1g/L苯骈眯唑保鲜液浸渍过的小滤纸片确保茎秆保湿。第7天剥检稻株，记录幼虫存活数，必要时称量每个玻璃管的活虫体质量。

试验结果证实IC-3等3个独立转化体对人工接虫的二化螟显示高度抗性。如附表3所示，所接种的二化螟在对照上的死亡率为10％，极显著地低于3个转化体的二化螟死亡率，其中IC-8中死亡率高达90％。表明：上述3个转化体可以智能响应二化螟的危害并定向表达抗虫蛋白达到抗虫的效果。最后，根据转基因新材料与亲本在接虫后二化螟死亡率差异极显著。

表3

实施例4 IC-3等转化体To代种子中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白定性检测

阳性转基因植株IC-3等3个转化体T0代种子中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白采用上海佑隆公司的Cry1Ab/Cry1Ac试纸条进行检测分析。

水稻种子中的蛋白质抽提和试纸检测按产品说明书中描述的步骤稍加改动进行。分别选择约50粒带颖壳的种子进行检测。

具体步骤如下：分别取50粒左右的转基因水稻种子置于装有直径为1.5cm钢珠的磨样盒，将磨样盒置于磨样机上将种子研磨成粉末。取0.2g左右粉末加入预装0.5mL试剂盒自带的蛋白抽提Buffer的1.5mL离心管中，涡旋震荡混匀后12000rpm离心30sec。取0.3mL上清液转移至另一个无菌的1.5mL离心管。然后放入试纸条，3min左右观察试纸条的显色情况。

结果显示，IC-3等转化体种子的蛋白样本中均检测不到目标蛋白，与野生型对照一致(附图8)，结果说明Cry1Ab/Cry1Ac蛋白在种子中不表达。至此，以IC-3等转化体为代表的智能抗虫水稻新种质已被证实创制成功。

实施例5 OsISA1基因过表达材料的获得及功能验证

在phytozome水稻基因组数据库中(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！search show＝KEYWORD&method＝Org_Osativa)利用关键词搜索OsISA1基因(LOC_Os04g08824)，并获取其基因组序列(包含外显子、内含子及5’和3’UTR序列)(SEQID No.3)，采用实施例1中的实验方法克隆OsISA1基因，并以相同的方式构建于表达载体pLB(陈浩.“基因开关”系统的研制及其在培育胚乳零表达型“绿色”抗虫水稻中的应用[D].浙江:浙江大学,2016.)切除LNL-Bt片段的骨架上。

该基因的克隆引物为(ISA1-OE-F：5′-GCTTTTTTGTAGGTAGACTGCAGTATCGTCTCTGCACTCACACTG-3′,ISA1-OE-R：5′-CGATCGGGGAAATTCGTCGACAATAAAAATGGTTTTATTTGTA-3′)，表达载体骨架采用Pst I和Sal I酶切线性化。构建方式同实施例1，构建后的表达载体命名为pOsISA1-OE(附图9)。

同样，利用农杆菌侵染法再将其转化至水稻品种秀水134中，检测其T0代阳性苗中OsISA1基因的表达量。与非转基因对照相比，该基因在4个独立转化体中的转录水平分别提高了约61.36至377.18倍(附图10)。根据前文接虫二化螟后OsISA1表达量急剧上调的特征，据此推断当过表达该基因时，可能会在一定程度上增强对二化螟的抗性。因此，该基因资源可被用于培育抗虫水稻新材料。

最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。客观上，本发明并不仅仅只限于以上实施例，还可以有相当一部分变性。因此，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变性，均应当认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1及其在培育智能抗螟虫水稻中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 650

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

aatattatta ttattattat aactactagt gccatttggt ggatctcaat ttagaaataa 60

agacttgaac ggagtagatc agagtcacgg ataggaaatt atgaattttt gaagttaaac 120

aataatttat agatttgaaa aagaatttat ttaaaactgg aaaaagaaca tgtgtcctca 180

ccttagagag ggtttttttt ttgctttaat gaagatagtc ttgggcacga cgtcttcctc 240

atgctgattg tgcagattgg atgttgtgaa ggttgtgatg tattactatc aacctatgtc 300

tagtttccat gttagaatat tcaaatggaa gaaaaaaaat gagccccaca tgtggatatg 360

gattttaatt acttggatgg atgtacaccc attttttaca tatcaactaa atgattatga 420

aaacaattca aaaaatcgac aaagtagatt aatatgaaat atatcactcc acaaacatac 480

aagttcaaat ccaacttcta taaattgtaa caaaaataac aaattacaac ctgtagaaat 540

ttaatttaaa ctcgcatgtt ggtagagtga catatgacat atcttgtcac attagcaacg 600

ttctttaaga attccagcta taaatttggc cacctgatca gttatctagc 650

<210> 2

<211> 2360

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

gcttgtgaaa tttactctgt aatatatatt gtcattttta atgttttgtt cttttttggt 60

tgtcaagcaa agaaaaatga tttatattca aagttaggaa agtgtttttc ttatatatat 120

agatttgatg ggttcatcgg tttaaacaat ccaaatactt aaatctaata gttggtgtac 180

atgtcggaag ttatactttt ttctatgaca aagcctctcg accccaaaat ataaacttct 240

agcaagtggg gacaactctc ttgttaaatt tgttccaacg tcgtcggtgc gagtgtggcc 300

accggcgtcg tggttctggt cgtgtccgat ccatgcttgc aaccttctct gccatggaga 360

atgccagaaa ccccaaatcg gctagccacc accgactcca agttggcagt ggtgctcttc 420

gtctagagtc acaaaaatgg aacgagaagg atgctcctca aactcttctc ccggcaggta 480

aagacagaga agggcggcga ggaatcggtc aactcagtag tatagccccg aatgagagat 540

ggttttgacc tcagtgcggg gtagaggtga gattgaagtt gccgagtgct cgctttattt 600

agctttcgca gcgcccctgt aagttccaaa aaagctgcct caacatagtc agcaagatgc 660

ttaggcggtg gggcttataa ttttagtaaa aacggtggcg acaccgatca gctgtatgac 720

ccactatagt gcaaatctgg cacacatggt tctcagtaga cttatcagta tcagtgaagt 780

cataagtatt ggtacgcccc cctgtctaac ttagcagctg acacaacatt gttccaagat 840

gcaagaaatt attttcttta cacttcagta ttcaagcgta aatatatttt gacgtttctt 900

acccttcttc taccttgatc tctagtaaag cttcgtcctt aataatgtac tcactctggt 960

tccataattc ttgacgtttt cgataatgat acggtcaaca aaatatatct tttactttgt 1020

ttttattata atatataatg catgtttact tttcttatat tactttgaag gacaaatcta 1080

tatatgctat tctagttcct ttaaagaaaa tacttttaaa gttattaata atcaaagtta 1140

caattgtttg acctcaatct tatccaaaac gtcaagaaat ataaaacccg atggagtatt 1200

atacaacccc tacagcctcg ctacagagta gtctgacgac gttgtataat ctaatagtaa 1260

agtggagaca ctgagattta gggtgagact ctctttctta taccaatcct tggaatcggt 1320

ccatgtatgc aaacactacg tgttggattt taaaatggtt tcacaaccca ttttcccaca 1380

tcgacaaaca aatttggtgt gagtgggacc attggtacta cgcccgaaag cgacaaaggg 1440

ttggggtcat caatatccta cagtagtaat gcaattattg ggtacatctg tcgatttgtc 1500

acacgaacaa aggccagtca aattaacata cgcgctagca atgcaatttc gcaaacaaac 1560

cattttggaa agtagaagca atatgatgaa atgttaactt aattacctct gtcctcatct 1620

taaaatcttc aaaaatcctc atccaaaata aattccgtcg gtgtcaacta tgcgcaaaac 1680

agagaaaacc aaataaactc ctaaaaagaa aatattatta ttattattat aactactagt 1740

gccatttggt ggatctcaat ttagaaataa agacttgaac ggagtagatc agagtcacgg 1800

ataggaaatt atgaattttt gaagttaaac aataatttat agatttgaaa aagaatttat 1860

ttaaaactgg aaaaagaaca tgtgtcctca ccttagagag ggtttttttt ttgctttaat 1920

gaagatagtc ttgggcacga cgtcttcctc atgctgattg tgcagattgg atgttgtgaa 1980

ggttgtgatg tattactatc aacctatgtc tagtttccat gttagaatat tcaaatggaa 2040

gaaaaaaaat gagccccaca tgtggatatg gattttaatt acttggatgg atgtacaccc 2100

attttttaca tatcaactaa atgattatga aaacaattca aaaaatcgac aaagtagatt 2160

aatatgaaat atatcactcc acaaacatac aagttcaaat ccaacttcta taaattgtaa 2220

caaaaataac aaattacaac ctgtagaaat ttaatttaaa ctcgcatgtt ggtagagtga 2280

catatgacat atcttgtcac attagcaacg ttctttaaga attccagcta taaatttggc 2340

cacctgatca gttatctagc 2360

<210> 3

<211> 2220

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 3

tatcgtctct gcactcacac tgcacaaaga tgtttcccag tagtgtaaat atgcgggagc 60

aaaataatat cataataata tcaatagcca tgaccatcct cctactcgtt gtgttcttct 120

gtcggatgtt gggtaacatg gcgggcaaga acaagaggaa gaagcaacct aagctaccac 180

ccgggccagc tactatgccg gtgttgggta acattcacca gattctgatg aacaagccgg 240

tgttcaggtg gatccaccgc cttctcgacg agatggacac cgagatcctg tgcctccgtc 300

tcggcagcgt ccatgtgatc gccatcgcct caccggagat ggcccgggag gccctgcgca 360

ggaacgatgc cgtgctgact tcccggccgg tatcgttcgc gtggcgggcg ttcagctttg 420

ggtacaagaa caccgttggg tcgacgggcg atcagtggaa gaaaatgagg cggatgctcg 480

cgtcggagat cctctcatcg gccatggagc ggcgaatgct tggccagcgc gtcgaggagg 540

ctgaccacct tgtcaattac atctacagga actgtaataa tggcactgta gacatccggc 600

acgtaacgag acacttctgt ggcaacatca tcaggaagct ggtgtttggc cggagacact 660

tcgccttcgg cgctggcaat atcggccctg gccgtgatga ggaggcccac attgacgcgc 720

tcttcacggc gctagactac ctcggcgcat tctccatctc cgactacttc ccgtcgttgg 780

ttctcaatgg cctgatgagt acattcagac ggctgcatga tccaatcata atggagagga 840

tggaagaatg gagggctccc aggagaaatg gtgatgagag gagagaagtt gccgattttc 900

tggatgtgtt gatctccttg gacgatgcac agggaaaacc gttgttgtca cttgatgagg 960

tcaaggcaga aacgctggta ataagctcta ttacaccgtc atatatatat atttcaaact 1020

aggactatag atatgtcctc ggaagaaaaa tagtacgctt gaagtgctta cattttggtc 1080

caaatttcta atactagaaa tgcttatatt ttacaattaa ttagtgaggt cttggtttcg 1140

ttataggaaa caatatacta tggtgtggtt ccgttcattt tgatgttaaa attaaccgtt 1200

ggttactatg actcaatagt gagcgcgcaa aatatctaag atttattttt tgaaaaatag 1260

ctatggaaat gtttgaaaaa aaaattgtaa gtctagtata tgcatatcta ttatctcatt 1320

ctaaactcca cccacgcatc gagaaacaaa gagacaaatc aaaataatat atgaacagta 1380

ttgtagtgtt catctatgga tttctcttgt tttctattta tttctccaat ctagatttga 1440

ttgttgtgac ctcagtagat gtcagtgcat acttaatatt gttgccaatt ttccaaaagt 1500

tttcatggaa attttgattg tatttgggaa gtaaagacat atcagaggtt gcccctggaa 1560

ggatgaaaat ccatcactgt tttaatttaa tcttatggct gcaggaaata atccttaatt 1620

cggtagacaa cccatcaaat gctgtagagt gggcactggc agagatggtg aacaatccaa 1680

aggtcatgaa gaaagcagta gatgaactcg atatggttgt cggtaaagaa aggcttgtcg 1740

aggaatccga cattcacagc ctcacatacc tcaaggcgtg tatccgggag gcgttccgca 1800

tccaccccta ccacccattc aacccttccc atgtcgcgat cgctaacatc accatcgctg 1860

gattcatgat cccaaagggt agccatatca ttttaagccg aattgggctt ggtcgaaacc 1920

ctagagcacg ggataaccca ctcgaattcc gaccagagcg acatttgaag aatactgata 1980

atgtggtgct agctgagcca gagttacggt ttttatcatt cagtgctggt aggcgtggct 2040

gccccgccgt atcactcgga acttcaatta caatgatgct ttgggccgaa aaactcaata 2100

ctgatgtaat aaaaaaacat atttgtaatt aaaaaatatt tacaaatagg tccttggcgc 2160

caataacgct ggcactgagg aactatttgt aaatatttta caaataaaac catttttatt 2220

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaaacgacg gccagtgccg cttgtgaaat ttactctgta a 41

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcagttgttg tccatggtgg cgctagataa ctgatcaggt ggc 43

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggttctgcc caaggtatcg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacggttccg ctctttctgt 20

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcttttttgt aggtagactg cagtatcgtc tctgcactca cactg 45

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgatcgggga aattcgtcga caataaaaat ggttttattt gta 43

Claims

1.一种水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.如权利要求1所述的水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1在培育智能抗螟虫水稻中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含权利要求1所述的水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1的重组载体；

4.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，还包括抗虫基因。

6.一种转化子，包含如权利要求1所述的水稻二化螟危害诱导性启动子pOsISA1。

7.如权利要求6所述的转化子，其特征在于，还包括抗虫基因。