CN108118054B

CN108118054B - 拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子和其缺失突变体及其应用

Info

Publication number: CN108118054B
Application number: CN201611073099.3A
Authority: CN
Inventors: 李坤朋; 姜平平; 张珂; 亓守美; 张可炜
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2036-11-29
Also published as: CN108118054A

Abstract

本发明公开一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子和其缺失突变体，其中所述启动子命名为PD1，是位于拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30翻译起始密码子ATG上游2093bp的调控序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述缺失突变体是将PD1的序列从5'端删除不同长度的片段后，获得的八段连续序列，顺序命名为PD2～PD9，其对应的核苷酸序列如SEQ ID No.2～SEQ ID No.9所示。本发明还公开了所述启动子及其缺失突变体在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用。实验证明PD1‑PD9能够启动下游基因(如GUS报告基因)在转基因植物受体各组织中高强度表达，且基本不受高盐、渗透胁迫、低温和低磷等逆境胁迫的诱导或抑制，是组成型强启动子，预示其应用价值巨大。

Description

拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子和其缺失突变体及其应用

技术领域

本发明属于植物生物工程育种和分子生物学技术领域，具体说，涉及一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子序列和其缺失突变体及其应用。

背景技术

自然条件下，植物经常遭遇不良环境,严重影响了作物的生长发育和产量。随着分子生物学和生物技术的迅速发展，已为作物新品种的培育提供了新思路、新方法和新资源。利用植物固有的生物学特性，发掘并克隆植物重要功能基因和调控元件，进行作物的分子设计与遗传改良，以提高作物对不良环境的适应性，是培育作物优良新品种的重要环节，也是保证粮食稳产、高产的有效措施(Khush et al.2010)。

植物遭受逆境时会产生一系列的适应性改变，涉及众多基因的差异表达调控。基因的表达调控是一个非常复杂的过程，涉及多个层次，其中转录水平是基因表达调控的关键环节之一，通过基因5’上游的DNA调控序列与反式作用因子互作以实现目的基因的特定表达。目前，利用基因工程手段改良作物时，如何实现目标基因在受体组织中高水平稳定表达是研究的热点之一，也是制约基因工程发展的一个重要因素，而启动子在起始基因转录和调控基因表达效率方面发挥关键作用(Ahmad et al.2012)。选择合适的启动子构建植物表达载体，以驱动目的基因的高效表达是转基因成功的关键环节。

近年来，随着分子生物学的迅速发展，越来越多的抗逆基因被克隆，与之相对的是可用于启动这些抗逆基因在植物受体中高效、稳定表达的启动子的数量及其种类非常有限。此外，人们对启动子上的顺式调控元件的种类和调控机理的了解也相对较少，限制了我们高效利用启动子调控目的基因。目前在作物遗传改良中能够被广泛使用的启动子非常有限，在单子叶植物中主要是玉米泛素(ubiquitin)基因启动子和水稻肌动蛋白(actin)基因启动子，在双子叶植物中主要是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(Ye et al.2012)。随着人们对转基因社会关注度和生物安全性要求的提高，病毒或者细菌来源的启动子也必将引起人们的高度关注，存在一定的安全隐患(Koia et al.2013)。另外，病毒来源的CaMV 35S启动子在作物育种中时常引发转基因沉默的发生(Elmayan et al.2003)。此外，作物的非生物胁迫适应性是非常复杂性，单个基因的导入可能不足以提高作物对自然环境的应对能力，多基因转化已成为必然趋势，然而在同一宿主体内用同一个启动子驱动多个基因的表达，可增加同源启动子的甲基化等，进而大大提高转基因沉默的发生概率(Mette etal.2000；Dong et al.2003)。然而，由于目前可用于作物遗传转化育种的启动子非常有限，在植物表达载体中利用CaMV 35S启动子同时启动目的基因和筛选标记基因的表达非常常见，这将大大增加同源依赖性基因沈默的发生(Han et al.2015；Kai et al.2005；Mccabeet al.1999)。分离植物来源的高效启动基因表达的组成型启动子不仅可实现目标基因在植物受体中高强度稳定表达，减少转基因沉默的概率，并且大大降低未来病毒来源的启动子带来的转基因安全隐患问题(Hernandez-Garcia et al.2009)。因此，发掘并鉴定植物来源的、高水平稳定启动基因表达的启动子已成为当务之急。

丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidase,SCP)属于SC族羧肽酶中的S10家族，含有由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸形成的活性位点，分为羧肽酶I、II和III 3种类型，是真核生物中广泛存在的一类蛋白水解酶。此外，在植物中存在一类与丝氨酸羧肽酶SCP的氨基酸序列高度同源的蛋白，称为丝氨酸羧肽酶类蛋白(serine carboxypeptidase-likeproteins,SCPLs)。在高等植物中SCPLs大都与I和II型SCP蛋白的氨基酸序列高度同源，参与植物多种生物学过程，包括蛋白的水解、油菜素内酯的代谢、植物损伤应答等(Hause etal.2002)。丝氨酸羧肽酶类蛋白SCPLs类型丰富，在水稻和拟南芥中分别预测到71个和54个编码SCPLs的基因，广泛分布在各条染色体上。目前已从多种植物中分离出SCP/SCPLs的编码基因，包括拟南芥、水稻、大麦、小麦、番茄、豌豆等。在高等植物中，SCP/SCPLs基因通常在各组织中广泛表达，仅有少部分基因具有组织特异性。Bienert等(2012)发现在烟草的根、茎、叶和花中均能够检测到NtSCP1和NtSCP2基因的表达。Liu等(2008)研究发现水稻丝氨酸类蛋白基因OsBISCPL1在叶片、根、茎及叶鞘中均表达，其中在叶片及叶鞘中的表达水平相对较高。

SCP/SCPLs在植物生长发育及胁迫耐受性等方面均发挥重要作用。Li等(2011)研究发现GS5编码一个丝氨酸羧肽酶，过表达GS5可以使谷粒宽度和重量增加，产生更大的谷粒，相反GS5的功能缺失则导致谷粒显著减小。烟草和拟南芥中的研究表明SCP/SCPLs在调控心皮数和细胞伸长方面均发挥重要作用(Manuela et al.2012；Wen et al.2012)。Wen等(2012)发现ECS1编码一个丝氨酸羧肽酶，在拟南芥中过表达ECS1导致其心皮数和种子数显著高于野生型，并且过表达植株的千粒重比野生型植株提高了约33％。在番茄中的研究表明，SCP酰基转移酶(SCPLa)参与葡萄糖聚酯的合成及昆虫的防御反应，在拟南芥中参与芥子酸胆酯的合成(Fraser et al.2007)。Zhou等(2005)发现拟南芥BRS1编码蛋白属于分泌型SCP II类蛋白，参与油菜素内酯(BR)信号传导过程，进而参与植物逆境胁迫响应等。刘丽等(2013)在烟草中过表达玉米ZmSCP，转基因植株的抗病性、抗氧化性以及耐盐性与野生型对照相比显著提高。总之，目前人们对SCP/SCPLs家族的部分蛋白的功能有了一定的了解，然而对其基因的表达调控机制研究很少。

拟南芥AtSCPL30是丝氨酸羧肽酶类蛋白中的一员，Morcuende等(2007)通过Affymetrix ATH1 arrays分析发现该基因在拟南芥中具有非常高的表达水平，但迄今为止，未见该基因及其启动子克隆和应用的相关报道。基因的转录表达与启动子密切相关，克隆AtSCPL30的启动子序列并对其进行系统的功能分析，发掘其启动子核心功能区段或关键调控元件不仅可促进我们对SCP/SCPLs家族基因的表达调控机制的了解，而且对于启动子的改造和应用具有重要意义。

发明内容

针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子序列和其缺失突变体及其改造与应用。

本发明所述的拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子，命名为PD1，其核苷酸序列为以下序列之一：

(1)来源于拟南芥的基因组，位于拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30翻译起始密码子ATG上游2093个核苷酸组成的连续序列，该序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，与启动子克隆方法无关；

(2)核苷酸序列与SEQ ID No.1互补的DNA；

(3)在高严紧条件下能够与上述(1)或(2)DNA杂交且具有启动子功能的DNA；

(4)对上述(1)或(2)所示DNA进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有启动子功能的DNA；

(5)与上述(1)或(2)所示DNA具有至少90％同源性且具有启动子功能的DNA；

(6)采用缺失突变体构建、新的顺式作用元件的引入或利用PD1缺失突变体片段进行不同组合获得的核苷酸序列同源性≧60％且仍具有启动子功能的派生启动子。

上述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子中：所述启动子PD1的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示。

上述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因的启动子序列是首先根据AtSCPL30基因的序列号At4g15100检索拟南芥TAIR数据库，获取其核酸序列，然后利用AtSCPL30基因翻译起始密码子ATG上游约2.5kb的碱基序列和其CDS 5'端序列设计引物，以拟南芥基因组DNA为模板进行PCR扩增获得的AtSCPL30基因5'端翻译起始密码子ATG上游的2093bp的连续的核苷酸序列，其为组成型强启动子。

本发明所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变体来源于拟南芥的基因组，是将启动子PD1的核苷酸序列从5'端删除不同长度的片段后，获得的剩余的连续核苷酸序列，共有独立的八段，其序列长度分别为1479bp、1135bp、874bp、731bp、601bp、456bp、294bp和189bp，其顺序对应的核苷酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9所示，与启动子克隆方法无关；所述八段缺失突变体顺序命名为：缺失突变体PD2、缺失突变体PD3、缺失突变体PD4、缺失突变体PD5、缺失突变体PD6、缺失突变体PD7、缺失突变体PD8、缺失突变体PD9。

上述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体中：所述缺失突变体优选是缺失突变体PD7，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

依据SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，利用primer5.0软件设计PD1启动子5′系列缺失突变体引物，同时在上下游引物的5′端分别引入BamHI和NcoI酶切位点。利用PCR扩增获得不同长度的启动子缺失片段，利用两端的酶切位点将启动子系列缺失片段分别连入植物表达载体pCAMBIA1391Z中GUS报告基因上游的多克隆位点处，构建启动子PD1的系列缺失植物表达载体(见附图1中PD1启动子及其缺失片段PD2-PD9与GUS基因的连接示图，翻译起始密码子ATG中的A为+1)。将上述构建好的载体转入大肠杆菌，提取质粒进行测序确认和酶切鉴定，正确质粒依次分别命名为：PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8和PD9，其中PD1为AtSCPL30基因的全长启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；PD2-PD9为缺失突变体，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.2～SEQ ID No.9所示。

鉴于本领域专业人员很容易通过定向优化或者点突变等方法对本发明专利中所述的启动子及其系列缺失突变体的核苷酸序列进行修饰或突变，那些经过人工修饰改造后具有与本发明所提供的启动子或系列缺失片段的碱基序列同源性≧60％且仍具有启动子活性的核苷酸序列均为本发明中所述启动子或系列缺失突变体的序列衍生物，等同于本发明所述序列，属于本专利的保护范畴。

含有上述启动子及其系列缺失突变体片段的载体、转基因愈伤组织或细胞系、重组菌株和转基因植株等均属于本发明的保护范围。

本发明所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用。

本发明所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用。

上述应用中：所述启动子PD1或其缺失突变体PD2、PD3、……、或PD9为组成型强启动子，将其作为启动子分别与功能基因融合构建植物表达载体，并转入植物中，能够实现转基因植物的组成型高强度表达。

其中：所述植物优选是农作物、经济林木、牧草或草坪草；所述农作物优选是玉米、小麦、棉花、大豆、水稻或烟草。所述应用包括在植株器官、组织、细胞或整株水平。

本发明利用拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的序列号At4g15100检索拟南芥TAIR数据库，获取该基因的上游调控序列和CDS 5'端序列，依据获取的序列设计引物，以实验室提取的拟南芥基因组为模板，通过PCR扩增最终获得了该基因5′端上游2093bp的核苷酸序列作为全长启动子PD1，以此启动子碱基序列为模板设计5′端系列缺失突变体引物，PCR扩增获得了不同长度的缺失片段PD2-PD9，将上述片段PD1-PD9分别连入植物表达载体pCAMBIA1391Z中GUS报告基因上游的多克隆位点处，鉴定正确后，将上述植物表达载体导入农杆菌GV3101中，鉴定后用于后续烟草和玉米等作物的转化。

具体的，将拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因(AtSCPL30)的全长启动子PD1及其系列缺失突变体片段PD2-PD9分别构建植物表达载体，通过农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化本生烟草，随后在含有潮霉素的诱导培养基上筛选抗性细胞，生成抗性愈伤。将抗性愈伤转至分化培养基上分化成苗。分化出的小苗进行PCR和GUS组织化学染色鉴定，阳性植株繁种，后代进行遗传学分析鉴定，最终筛选出T3代单拷贝纯合转基因株系用于后续的实验。

通过对PD1-PD9转基因烟草进行组织表达模式和胁迫响应特性分析，明确了启动子PD1及其缺失突变体PD2-PD9为组成型表达的强启动子，其中PD2-PD7片段的活性相对更高(附图2)，并且PD1-PD9的启动基因表达能力基本不受高盐、高渗(PEG处理)和低温胁迫的影响(附图3)。尤其PD7启动子，长度仅有456个碱基，它不仅能够在不同发育时期的植物各组织中高强度启动目的基因的表达，而且碱基序列短，可以缩减载体的大小，更有利于转化，具有极高的应用价值。

上述实验也明确了PD7与PD8间的163bp(-456～-294bp)片段、PD8与PD9间的106bp(-294～-189bp)片段和PD7与PD9间的268bp(-456～-189bp)片段具有很高的促进基因表达能力。将上述163bp、106bp和268bp片段连接至mini35S启动子前边启动GUS基因的表达，瞬时转化本生烟草叶片，发现它们分别增强mini35S的启动子活性达到16、18和22倍左右(附图4)，也就是说这些片段具有很好的增强子活性，为后续启动子的人工改造提供了重要的序列资源。

将上述PD1启动子以及PD2-PD9缺失突变体片段转入玉米中启动GUS基因表达，经潮霉素筛选、PCR检测和GUS组织化学染色筛选出阳性植株，连续自交结实收获纯合系种子用于后续实验。检测PD1-PD9转基因玉米植株中GUS基因的表达情况，明确了PD1-PD9在玉米各组织中也能够高效驱动目的基因组成型表达，在玉米等农作物基因工程育种中具有很好的应用前景。

综上所述，本发明公开了拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因(AtSCPL30)的启动子PD1及其系列缺失突变体PD2-PD9的序列，检测PD1-PD9在转基因烟草中启动GUS报告基因的特性，确定了PD1-PD9能够启动基因在烟草(双子叶植物)各组织中高强度、组成型稳定表达，是组成型强启动子。进一步在转基因玉米中检验PD1-PD9启动子的特性，发现PD1-PD9在玉米(单子叶植物)中也能够很好地发挥功能，其启动子特性与在烟草(双子叶植物)中相一致，体现出了极高的应用价值。

本发明的主要价值和效果体现在以下几个方面：

1)外源基因在转基因植物中的低水平表达是制约植物基因工程发展的一个重要因素，主要原因是缺少理想的启动子。本发明为植物基因功能研究和基因工程育种提供了植物来源的组成型强启动子，这正是作物转基因育种所需要的。

2)组成型强启动子具有驱动基因在各种组织持续、恒定表达的特点，可产生大量的异源蛋白质，这在培育抗虫、抗除草剂等基因工程育种中尤为重要。

3)在PD1-PD9中，PD7启动子片段不仅具有高的组成型表达的强启动子活性，而且其核苷酸序列仅有456bp，可缩小载体的大小，便于基因的重组和植物的遗传转化。

4)为提高作物对多样性自然环境的适应能力，多基因转化已成为基因工程育种的必然趋势，由于目前可用于作物基因工程育种的启动子非常有限，如在双子叶植物基因工程育种中主要为病毒来源的35S启动子，单子叶植物中主要为玉米泛素(ubiquitin)基因启动子，而且35S启动子和玉米ubiquitin启动子在单双子叶植物中的启动子活性存在很大差异，在实际转基因育种中无法实现在单双子叶作物中通用，因此在转基因育种中用同一个启动子在同一载体中同时启动多个基因的转化非常常见，这大大增加同源依赖性基因沉默的发生。本发明为植物基因工程育种提供了新的植物来源的组成型强启动子，不仅大大降低未来病毒来源的启动子带来的转基因安全隐患问题，而且减少转基因沉默的发生概率。此外，本发明提供的启动子可在单双子叶植物中通用，这也大大便利了其在转基因育种中的应用。

5)本发明提供的PD7与PD8间的163bp片段、PD8与PD9间的106bp片段和PD7与PD9间的268bp片段具有很高的增强子活性，这些序列元件可为后续人工改造和创制新的启动子提供有用资源。

附图说明

图1：不同长度的AtSCPL30的启动子片段与GUS报告基因的连接示图(ATG中的A为+1)。

图2：正常条件下PD1-PD9转基因本生烟草叶片中GUS酶活的测定结果。

图3：NaCl、4℃和PEG胁迫处理前后PD1-PD9转基因烟草叶片中GUS酶活的测定结果。

图4：筛选获得的163bp(-456～-294bp)片段、106bp(-294～-189bp)片段和268bp(-456～-189bp)片段增强基因表达能力的功能验证。

具体实施方式

下述将通过具体实施例子对本发明作进一步的说明，但本发明并不仅限于以下具体实施例子。下面实施例子中所描述的方法内容若无特殊说明，均为常规实验方法。

实施例1：AtSCPL30基因的启动子序列克隆

1)根据AtSCPL30基因的序列号At4g15100检索拟南芥TAIR数据库，获得AtSCPL30基因翻译起始密码子ATG上游约2.5kb的调控序列和CDS 5'端序列用于该启动子克隆的引物设计与筛选。

2)依据上述序列，利用PRIMER5.0软件设计PCR扩增引物。

上游引物为5'CTAATCTCAATGTTTCCGCCTTTC 3'；

下游引物为5'CACATGAAACCATTTCTACTAATAT 3'。

3)采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA，具体参见《分子克隆实验指南Ⅲ》，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下所示：

PCR反应体系：10mM Tris·Cl，1.5mM MgCl₂，50mM KCl，200μM dNTP each，0.8μM引物，0.625U高保真DNA polymerase，1μL模板，无菌水补足25μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min 30s，循环35次；72℃延伸5min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

4)电泳结束后，利用DNA片段回收试剂盒(AXYGEN)回收目的条带，凝胶回收具体步骤参见其说明书。回收的目的条带利用全式金公司的基因克隆试剂盒连入Peasy-B克隆载体，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TransT-1，具体参照试剂盒说明书进行。向转化的大肠杆菌管中加入约1ml LB培养基37℃200rpm振荡培养1小时，4000rpm离心5min收菌，涂布在含有50μg/mL卡那霉素、20mg/mL X-gal、0.1M IPTG的LB固体平板上过夜培养，挑白色单克隆在含有50mg/L Kan的液体LB培养基中振荡培养6-8小时后提取质粒DNA，经PCR鉴定插入片段的大小，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认，以确保启动子的正确克隆，正确克隆的启动子命名为PD1。

实施例2：AtSCPL30的启动子PD1及缺失突变体PD2-PD9的植物表达载体构建和大肠杆菌与农杆菌的转化

1)依据上述克隆的全长启动子PD1的序列，利用primer5.0软件设计PD1启动子及系列缺失突变体PD2-PD9的引物，共9对，同时引入BamHI和NcoI酶切位点，以便于后续的质粒重组。引物序列如下表所示：

2)以含PD1启动子序列的质粒为模板，PCR扩增获得系列启动子缺失片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收(具体步骤参考其说明书)。

PCR反应体系：5×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)5μL，引物Ⅰ(10μM)1μL，引物Ⅱ(10μM)1μL，dNTP(2.5mM)，2μL，高保真DNA polymerase(5U/μl)0.25μL，质粒1μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR程序:95℃预变性5min；95℃变性1min；56℃退火1min；72℃延伸1.5min(可依据序列长短进行适当调整)；36个循环；最后72℃延伸5min。

3)将扩增获得的目的片段及其表达载体pCAMBIA1391Z用BamHI和NcoI两种限制性内切酶双酶切(购自Fermentas公司，具体酶切的条件和程序参见其说明书)。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收(参考说明书)。

4)将3)中获得的酶切后的目的DNA片段与载体进行连接。通常目的DNA片段与质粒载体连接时的摩尔比为3:1～5:1，连接体系如下：10×buffer 2μL，T4DNA Ligase 1μL，载体50-100ng，DNA片段与载体摩尔比对应的量，ddH2O补足至20μL。轻轻混匀，置于PCR仪中，22℃10min，65℃10min，10℃10min，随后连接产物直接用于转化大肠杆菌。

5)大肠杆菌的转化

-80℃冰箱中取出约50μL感受态大肠杆菌置于冰上，加入连接产物后轻轻混匀；冰浴30分钟，同时融化固体培养基，待冷却到50℃左右时加入Kan抗生素至50mg/L，混匀后倒平板；42℃热激90s，随后迅速冰浴2min；向管中加入800μL液体LB培养基(不含抗生素)混匀后放入摇床，37℃，200rpm，1h复苏；在上述倒好的平板表面将100μL IPTG(0.1M)和20μL X-gal(20mg/mL)涂抹均匀，用于后续的蓝白斑筛选；复苏结束后，5000rpm，离心3min，将上清吸至剩余约100μL左右，轻轻将菌悬浮；将其涂布于上述准备好的平板上，倒置平板，放入培养箱中37℃过夜培养；挑单克隆摇菌，保菌并提取质粒进行酶切鉴定和测序确认。

6)农杆菌的转化

向25mL含50mg/L利福平的YEP培养基中接入100μL农杆菌GV3101，28℃，200rpm，过夜培养；次日，取2mL加入到25mL含利福平50mg/L的YEP培养基中，培养至OD值0.7左右；将菌液分装到7mL管中，每个5mL菌液，置于冰上30min，在此过程中配20mM的CaCl₂于7mL管中，放置在冰上备用；菌液5000rpm离心10min后收菌，每管加入2mL0.15mol/L的NaCl溶液(4℃预冷)，轻轻弹起；4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，每管加入200μL 20mmol/L的CaCl₂，轻轻弹起，混匀后合并一处，以200μL每管分装于1.5mL离心管中；每管中加入8μL重组质粒，混匀，静置冰浴30min；液氮速冻90s，迅速置入37℃水浴锅3min；加入1mL未加抗生素的YEP培养基，28℃,180rpm复苏1h；融化YEP固体培养基，冷却至50℃左右，加入利福平和Kan(均为50mg/L)倒平板；5000rpm，离心3min收菌涂平板，28℃，倒置暗培养约2天；挑单克隆，鉴定正确后保菌备用。

实施例3：烟草的遗传转化

1)农杆菌介导的烟草叶盘转化如下所述：

(1)将过夜培养的农杆菌转接后培养至OD＝0.6左右，5000rpm 10min收菌后用等体积A2液体培养基悬浮。

(2)将烟草无菌苗叶片切割成约0.5cm2大小的叶盘，浸入上述A2液体培养基中，浸染10min。

(3)用无菌虑纸吸去叶片表面多余的菌液，正面朝上置于A2固体培养基上，25℃黑暗处共培养3天。

(4)共培养后的叶盘转移至含有400mg/L头孢霉素和15mg/L潮霉素的A3培养基上培养，每7-9天继代一次。

(5)切下抗性小芽转移至含200mg/L头孢霉素的A4培养基上壮苗。

(6)将(6)中小苗转移至A5生根培养基中诱导生根。

(7)生根小苗长到5～6厘米左右后移栽到购买的营养土中。

培养基如下：

A1培养基：1/2浓度MS培养基无机盐，MS培养基维生素，1％蔗糖，0.7％琼脂，pH5.8-6.0；

A2培养基：B5培养基成分，250mg/L NH₄NO₃，3％蔗糖，0.5g/L MES，0.7％琼脂(forplate)，pH5.8-6.0；

A3培养基：B5培养基成分，250mg/L NH₄NO₃，2％蔗糖，0.5g/L MES，1mg/L 6-BA，0.1mg/L IAA，0.7％琼脂，pH5.8-6.0；

A4培养基：A3培养基，去掉IAA，pH5.8-6.0；

A5培养基：1/2浓度MS培养基无机盐，MS培养基维生素，3％蔗糖，0.5g/L MES，0.7％琼脂，pH5.8-6.0。

2)转化植株的鉴定

上述小苗移栽成活后进行PCR检测，PCR阳性植株进一步进行GUS染色，两者均为阳性的植株用于收获后代种子

PCR检测：

CTAB法提取烟草叶片DNA，根据潮霉素基因序列设计引物，hptf:5'-CGTCTGCTGCTCCATACAA-3'，hptr：5'-TGTCCTGCGGGTAAAATAGC-3'进行PCR扩增鉴定。

其中：CTAB法小量提取烟草叶片DNA的具体步骤如下：

(1)取烟草叶片1-2cm²，放入1.5mL离心管中，液氮冷冻后用DNA研磨仪研磨。

(2)加入400μL 65℃预热的2×CTAB，65℃温育40-60min。

(3)取出冷却至室温后，加入氯仿∶异戊醇(24∶1)400μL，抽提10min，室温下12500rpm，离心10min。

(4)取上清250μL转移至新的含有提前-20℃预冷的500μL无水乙醇的1.5mL离心管中，-20℃放置20-30min。

(5)取出后4℃12500rpm离心10min，弃上清，用500-700μL70％乙醇洗涤沉淀两次。

(6)轻轻倒掉乙醇，在37℃烘箱中将DNA晾干，毎管加入适量的无菌水或1×TE 65℃溶解30min。

PCR反应程序：

95℃预变性5min；95℃变性40s；56℃退火40s；72℃延伸40s；35个循环；72℃延伸5min。

GUS组织化学染色：

PCR阳性植株进一步进行GUS组织化学染色鉴定，具体方法如下:

(1)每个植株用打孔器取3片直径约0.3cm的叶盘放入1.5mL离心管中，加入反应液(2mM X-gluc、50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、10mM EDTA、0.1％Triton X-100)浸没材料，避光条件下0.05MPa抽真空15min。

(2)37℃染色，染色时间根据具体实验情况而定；

(3)70％乙醇脱色后观察，拍照。

实施例4：PD1-PD9转基因烟草的GUS酶活测定

我们以PD1-PD9突变体烟草叶片为材料进行了GUS酶活测定。

1)相关试剂的配制：

反应缓冲液：0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.0)50mL，10％十二烷基肌氨酸钠1mL，0.5MEDTA(pH＝8.0)2mL，10％Trition 100 1mL，β-巯基乙醇100μL，水补至100mL。

10mM 4-MUG母液的配制：5mg 4-MUG加到1.42mL反应缓冲液中。

1mM 4-MUG检测液的配制：450μL反应缓冲液+50μL 10mM/L 4-MUG母液。

反应终止液(0.2mol/L NaCO3)：NaCO₃ 10.6g，水定容至500mL。

2)标准曲线的制定：

用反应终止液将1mM的4-MU母液稀释成10nM，100nM，500nM，1μM，2μM，4μM的浓度梯度，利用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，扫描时间10s，狭缝宽度5nm，电压550V的条件下测定各浓度溶液的荧光值，并绘制标准曲线。

3)GUS酶活测定

用打孔器取适量叶片，加1mL 4℃预冷的反应缓冲液快速磨碎，转入1.5ml离心管中置于冰上约10min，期间不断颠倒混匀；12500rpm，4℃，离心10min；取100μL上清加入到37℃预热的1mL检测液中迅速混匀，即刻取出80μL加入到720μL反应终止液中终止反应，并将该管的酶活值作为酶促反应空白对照。剩余上清液用于蛋白含量的测定；分别在10min、20min、30min、40min、60min时取出80μL上述检测液加入到720μL终止液中，并迅速混匀；利用荧光分光光度计测定上述终止液的荧光值，测定条件是激发波长365nm、发射波长455nm，狭缝宽度5nm，扫描时间10s，电压550V；各样品酶活力的计算(单位：nM 4-MU/min mgprotein)：依据上述2)中绘制的标准曲线求出相应的4-MU含量，以反应时间对4-MU的含量作图，直线部分的斜率为酶反应的速率。

4)蛋白定量

取叶片提取液30μl，采用Bradford法测定蛋白含量(Bradford MM,A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein–dye binding.Ann.Biochem.,1976，72:248–254.)。

酶活测定结果显示PD1-PD9均能够在本生烟草叶片中高效启动基因表达，其中PD2-PD7启动基因表达的能力相对较强。上述结果表明AtSCPL30启动子在本生烟草叶片中具有很高的启动基因表达的能力，尤其是PD2-PD7片段，体现出了很高的应用潜质。

此外，由附图2可见PD8的启动基因表达能力大约是PD7的60％左右(附图2)，PD9的启动基因表达能力大约是PD8的65％和PD7的35％，预示着PD7与PD8之间的163bp(-456～-294bp)序列和PD8与PD9之间的106bp(-294～-189bp)片段中可能含有促进基因表达的相关元件。

实施例5：对筛选获得的增强基因表达片段的功能验证

1)载体构建

分别将PD7-PD8(-456～-294bp)、PD8-PD9(-294～-189bp)和PD7-PD9(-456～-189bp)之间的片段连入mini35S(-46～+10bp)启动子上游的多克隆位点处，构建了融合启动子驱动GUS报告基因的表达，其质粒分别命名为PD7～8-mini35S、PD8～9-mini35S和PD7～9-mini35S。重组质粒转化大肠杆菌，酶切鉴定正确后转化农杆菌GV3101用于后续实验。

2)增强基因表达片段的活性分析

选取生长60天且状态一致的野生型本生烟草植株，通过叶脉注射法瞬时转化烟草叶片。PD7～8-mini35S、PD8～9-mini35S和PD7～9-mini35S以及mini35S质粒各注射至少30片烟草叶片，注射后的烟草植株置于培养室中恢复48h，然后用打孔器在注射过的叶片中心取材，进行GUS染色和荧光活性测定，统计其酶活速率。通过比较PD7～8-mini35S、PD8～9-mini35S和PD7～9-mini35S质粒侵染的烟草叶片与mini35S质粒侵染的叶片的GUS活性差异，以验证上述片段促进基因表达的能力。

烟草的瞬时转化流程如下：

(1)携带PD7～8-mini35S、PD8～9-mini35S和PD7～9-mini35S以及mini35S质粒质粒的农杆菌GV3101培养至对数生长期(OD600＝0.6左右)。5000rpm，常温下离心10min收菌，弃上清，沉淀用等体积含10mM MES，10mM MgSO₄和100μM AS的水溶液重悬，黑暗处室温下静置3h以上。

(2)将静置后的菌液轻轻混匀，通过叶脉注射法瞬时转化烟草叶片，每个菌株注射30株烟草，注射后烟草植株置于培养室中恢复24h。

(3)取注射侵染过的叶片中心区域，用打孔器取材进行GUS酶活测定，统计其酶活速率。酶活测定流程见上述实施例4。

酶活测定结果表明，PD7～8-mini35S、PD8～9-mini35S和PD7～9-mini35S质粒侵染的烟草叶盘的GUS酶活性分别达到了同样条件下mini35S质粒侵染的烟草叶盘的16、18和22倍左右(见附图4)。上述结果充分证明了该163bp(-456～-294bp)、106bp(-294～-189bp)和268bp(-456～-189bp)片段的确具有很高的促进基因表达的活性，这些片段可为后续人工改造启动子提供重要的序列资源。

实施例6：PD1-PD9转基因本生烟草在逆境胁迫下的GUS酶活分析

以野生型烟草为对照，对生长状态一致的60天左右的T3代PD1-PD9转基因烟草叶片进行胁迫处理实验。

1)对高盐和渗透胁迫处理材料首先分别浇灌含100mM NaCl和10％PEG(W/V)的1/2MS营养液处理6h，对照组浇等量1/2MS营养液；然后分别浇灌含150mM NaCl和15％PEG(W/V)的1/2MS营养液处理12h，对照组同样浇等量1/2MS营养液；最终浇灌含200mM NaCl和18％PEG(W/V)的1/2MS营养液，对照组浇等量1/2MS营养液，处理24h后取材，进行GUS染色和酶活测定。

2)低温处理的植株放于12℃、8℃培养箱分别处理6h和12h，然后在4℃条件下处理24h后取材，对照组在28℃培养箱中培养，进行GUS染色和酶活测定。

3)GUS染色3h后脱色观察。统计分析GUS荧光活性测定结果，计算出最终的酶活速率。GUS酶活测定具体步骤按照实例4中的程序进行。

通过PD1-PD9启动子的高盐、渗透胁迫和低温胁迫响应特性分析的结果，我们发现虽然AtSCPL30启动子启动基因表达的能力不受上述逆境胁迫的诱导，但是也不受上述逆境胁迫的抑制，在受到严重胁迫时仍能高强度启动GUS表达，尤其是PD2-PD7在上述逆境胁迫前后均具有相对更高的启动GUS基因表达的能力(见附图3)，表现出了一种组成型高强度启动子的特性，在作物基因工程育种中具有重要应用价值。

实施例7：PD1-PD9启动子转化玉米评估其在玉米抗逆遗传改良中的应用价值

1)选取玉米自交系齐319进行农杆菌介导的遗传转化。种子灭菌后萌发，其茎尖离体培养产生丛生芽，最终以丛生芽作为受体进行转化。培养基如下：

种子萌发培养基：KI 0.83mg/l，KNO₃ 1900mg/l，CaCl₂·2H₂O 440mg/l，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/l，KH₂PO₄·H₂O 170mg/l，H₃BO₃ 10mg/l，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l，FeSO₄·7H₂O27.8mg/l，MgSO₄·7H₂O 370mg/l，NH4NO₃ 1650mg/l，ZnSO₄·7H₂O 10mg/l，CoCl₂·6H₂O0.025mg/l，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，肌醇100.0mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，酪蛋白水解物500mg/l,烟酸1.0mg/l，蔗糖30g/l,生物素0.05mg/l，琼脂粉7g/l，pH 5.8-6.0，用于种子萌发(液体培养基不加琼脂)。

A培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加2,4—D 1.0-3.0μmol/l和6-BA 4.5-9.0μmol/l。

B培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加和6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l。

成苗培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l。

生根培养基：在上述种子萌发培养基的基础上添加IBA 2.5-3.6μmol/l。

培养基经高温高压灭菌，抗生素及除草剂等活性成分应经高压过滤灭菌。

2)种子的灭菌与萌发：将玉米种子用70％乙醇灭菌7min，0.1％氯化汞溶液灭菌8min，无菌水洗涤5-6遍。将灭菌后的种子置于培养瓶中(培养瓶封口且瓶内放少量无菌水)，28℃黑培养2天。当种子露白后，将其转移到基本培养基中继续培养(28℃，黑暗)。

3)茎尖的离体培养：当萌发种子的胚芽长到4-5厘米左右时，将胚芽鞘和幼叶进行剥离，最后将5毫米左右的上胚轴和茎尖切取并接种在A培养基中25℃暗培养(在此过程中要注意及时切除伸长的下胚轴和幼叶)。

4)丛生芽组织的诱导、继代与分化：离体茎尖在培养7-9天左右后开始发生不规则的膨大，在膨大的分生组织处有瘤状和指状的突起。20天后，在突起的表面开始有不定芽和胚状体的生成。一般情况下4周进行1次继代。在继代培养的过程中，如若发现在丛生芽组织块上丛生小芽过多，则将2,4-D浓度调整为3.0μmol/l；如若发现在丛生芽组织块上愈伤组织化较严重而不定芽很少，则将2，4-D浓度降至1.0μmol/l，进行继代培养直至产生大量的瘤状或指状突起(在A培养基上进行培养的组织块中，有少数材料可能会产生不定根，不定根的出现与幼叶一样会影响到组织块的膨大和胚状体或丛生芽的产生，所以要注意及时切除)。将丛生芽组织块再次转移到B培养基上培养2-3天后，其质地变得较为柔韧，色泽则慢慢变黄。利用扫描电镜观察可看到各个时期的胚状体和不定芽。胚状体和不定芽迅速发育，在其表面上产生丛生小芽。

5)以丛生芽组织块为受体进行农杆菌介导的遗传转化

将含有D8质粒的农杆菌GV3101在含有50mg/L Kan的LB液体培养基中震荡培养(28℃，200rpm)至对数生长期。3500rpm,离心10min，弃上清。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(种子萌发培养基成分浓度减半，且不加琼脂粉)进行洗涤，离心收菌。用含100μM/L的乙酰丁香酮的1/2浓度的丛生芽诱导培养基进行悬浮(稀释5-20倍)后用于遗传转化。

以准备好的已培养12-18天的丛生芽组织块为受体进行转化，转化后在黑暗处进行恢复培养。将经农杆菌感染后的丛生芽或者组织块在含250mg/L头孢霉素(Cefotaxime)的培养基上进行抑菌培养(黑暗处)，然后将丛生芽或组织块转移到筛选培养基中进行筛选(一般3-4代)。筛选过程中大量丛生芽组织块死掉，将存活的组织块转移到不含筛选剂且不含2,4-D的A培养基上进行培养，直至产生抗性小芽。

将抗性小芽切下并转移到成苗培养基上培养(光强约2000-3000lx，光照14-16h/d)。当小苗至3-4叶期时再次转移到生根培养基中以诱导生根。将生根后的小苗移栽到蛭石中进行生长(移栽时洗去粘附的培养基)。植株的生长条件为：自然光下，日温22-28℃，夜温16-21℃，隔天浇灌含1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分的营养液。大约两周后移植苗产生大量根系，最后将其定植在田间生长。

6)转基因植株的鉴定

取移栽成活的玉米植株的叶片提取DNA并进行PCR，将PCR结果为阳性的植株进一步进行叶片的GUS染色。两者均为阳性的植株收获种子繁殖后代。玉米少量叶片DNA的提取同实例3中烟草叶片的提取程序；PCR反应体系及程序和转基因玉米的GUS组织化学染色程序同实例3中所述。

7)PD1-PD9 T3代转基因纯合玉米植株的GUS酶活测定

将种子播种在花盆中，培养至4叶1心期时分别取材进行GUS染色和GUS酶活测定。实验结果表明PD1-PD9在玉米种仍能高效启动目的基因表达，为组成型表达的强启动子，在玉米的基因工程育种中具有重要的应用价值。

序列表

<110> 山东大学

<120>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子和其缺失突变体及其应用

<141> 2016-11-25

<160> 9

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211>2093

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子PD1

<222>（1）…（2093）

<400>1

ctaatctcaa tgtttccgcc tttccggtaa cttaaatgag atcggaaaat atgtaattat 60

actaacaaca cgtctcaagt tcgggacttt gtggtctagt gataaagaga tgggtttgag 120

gcatcaacac ttctcaagtt gtgtgaaact ccaacacatt gtttctggat aaccatatgg 180

atctgaagcc ttgcttacgg ccatttgaat atctgaaaag agggtatatc catagtgttc 240

tactgttctc tatagacgta ggacttacct tgagttatcc aaaaaaaaac tatagtaaca 300

acacaaaaat tacctaaaat aaaccttatt ttatcattat gatttaatgt aaaatcagaa 360

tcaaattact ttcggcatca gagaccagct ttttatcacc cactgaattt tacgaatcaa 420

gacttatatg gtagactatt aaacacaaat atatccaatg agagcataga agatccgaaa 480

atcatgactt ccctctcact catcaaacaa agttggagtc tatgtcataa cccataatca 540

gttttctttt ttcttttttt tttcgaacat cttctaaaca tgttttcaaa ttattgccga 600

gactaacagc tgtcaaggga actacgcaag agtaaaatgt gtgcatattt acgattagtc 660

aaatgaacta aagcgtaggc attaagtgaa atatatatat tttagttttg accaacgtgg 720

ttttaaatca ctcagttatt taattattcc atgcgttagt ggtatatcaa ttcgttgttt 780

ggtaaagttc ctacacactc actactcagt tgaatagtta ccaaaaaaaa actacaattc 840

acaatctata catagaattt atatggtcag tatgtattaa ctcaaaagtg ggaaaacatg 900

tcttcttttt aattatctct tatgtgcata atttttcttt gttttcctct cgtactttct 960

gctttcgatc atttcagaaa aattatacaa gctccgctat tttactaaaa agtattaaat 1020

ttataccgta cttgttacgt tttaaatttt gttaaaacga acacaaatgt ttggagacat 1080

gtatatgtga ttttaaatgg aaaacatcaa gttatattat atagaaagta aaatatcgtt 1140

ttttatttct gatttatcaa tataatcata tagaaaaatt agaatgtact actatcaaaa 1200

ttatggaaac ctactgcata tggagttaga gtttacttta caaggaattt aaaattaata 1260

ttaataaaaa attttaacaa ttttaagttt cggtttatta taaattgagt acagttactc 1320

attttgatac tcctgcaaat aattttgaaa accctattat gataagtcga tcaatccgcc 1380

taatttctta cggattaaag caatctacag aaaaataaaa caacattact actctaattg 1440

catatgattg ctagagagcg cataaggcta agtcgtaaag agaaacaccg attccgaatc 1500

cacgaaactc aaaatatttt gtggaattgt cacataacca aaaatctgga atcctcatcc 1560

tacttgccac gaacatatct atccgagact tgtccacaaa accacgagag agaagccgaa 1620

aactaacaca aaaatgcata ggcaaccgtg gacttcttca ctagctcatc gagatagcaa 1680

tgccactagc taatttctta cgttgtatct tatttgtttt actttggggc atgacatggt 1740

taaaccccat caaagagaaa gtgtttcatc cactagtcaa tatacgaatt cattcgaatt 1800

tatccctgta aatcctagtt cttaggatga actggtgtaa taaacagcaa aaaaaaaaaa 1860

aaaaaaaaaa atctggaatc attcgaccac ctcaataaac taaagctacc aattaccaca 1920

atatagtctt ccatatccac ttagatataa aagataaaag taaacaaata ttaaatttca 1980

tatgcacgca taggaaactc atgatcttat cttttaaata gacatctagt tttcttaggt 2040

tataaataga cattttgtcc tagaacttct tcactactaa aacctagcct caa 2093

<210> 2

<211>1479

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体PD2

<222>（1）…（1479）

<400>2

aagggaacta cgcaagagta aaatgtgtgc atatttacga ttagtcaaat gaactaaagc 60

gtaggcatta agtgaaatat atatatttta gttttgacca acgtggtttt aaatcactca 120

gttatttaat tattccatgc gttagtggta tatcaattcg ttgtttggta aagttcctac 180

acactcacta ctcagttgaa tagttaccaa aaaaaaacta caattcacaa tctatacata 240

gaatttatat ggtcagtatg tattaactca aaagtgggaa aacatgtctt ctttttaatt 300

atctcttatg tgcataattt ttctttgttt tcctctcgta ctttctgctt tcgatcattt 360

cagaaaaatt atacaagctc cgctatttta ctaaaaagta ttaaatttat accgtacttg 420

ttacgtttta aattttgtta aaacgaacac aaatgtttgg agacatgtat atgtgatttt 480

aaatggaaaa catcaagtta tattatatag aaagtaaaat atcgtttttt atttctgatt 540

tatcaatata atcatataga aaaattagaa tgtactacta tcaaaattat ggaaacctac 600

tgcatatgga gttagagttt actttacaag gaatttaaaa ttaatattaa taaaaaattt 660

taacaatttt aagtttcggt ttattataaa ttgagtacag ttactcattt tgatactcct 720

gcaaataatt ttgaaaaccc tattatgata agtcgatcaa tccgcctaat ttcttacgga 780

ttaaagcaat ctacagaaaa ataaaacaac attactactc taattgcata tgattgctag 840

agagcgcata aggctaagtc gtaaagagaa acaccgattc cgaatccacg aaactcaaaa 900

tattttgtgg aattgtcaca taaccaaaaa tctggaatcc tcatcctact tgccacgaac 960

atatctatcc gagacttgtc cacaaaacca cgagagagaa gccgaaaact aacacaaaaa 1020

tgcataggca accgtggact tcttcactag ctcatcgaga tagcaatgcc actagctaat 1080

ttcttacgtt gtatcttatt tgttttactt tggggcatga catggttaaa ccccatcaaa 1140

gagaaagtgt ttcatccact agtcaatata cgaattcatt cgaatttatc cctgtaaatc 1200

ctagttctta ggatgaactg gtgtaataaa cagcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatct 1260

ggaatcattc gaccacctca ataaactaaa gctaccaatt accacaatat agtcttccat 1320

atccacttag atataaaaga taaaagtaaa caaatattaa atttcatatg cacgcatagg 1380

aaactcatga tcttatcttt taaatagaca tctagttttc ttaggttata aatagacatt 1440

ttgtcctaga acttcttcac tactaaaacc tagcctcaa 1479

<210> 3

<211>1135

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体PD3

<222>（1）…（1135）

<400>3

ctgctttcga tcatttcaga aaaattatac aagctccgct attttactaa aaagtattaa 60

atttataccg tacttgttac gttttaaatt ttgttaaaac gaacacaaat gtttggagac 120

atgtatatgt gattttaaat ggaaaacatc aagttatatt atatagaaag taaaatatcg 180

ttttttattt ctgatttatc aatataatca tatagaaaaa ttagaatgta ctactatcaa 240

aattatggaa acctactgca tatggagtta gagtttactt tacaaggaat ttaaaattaa 300

tattaataaa aaattttaac aattttaagt ttcggtttat tataaattga gtacagttac 360

tcattttgat actcctgcaa ataattttga aaaccctatt atgataagtc gatcaatccg 420

cctaatttct tacggattaa agcaatctac agaaaaataa aacaacatta ctactctaat 480

tgcatatgat tgctagagag cgcataaggc taagtcgtaa agagaaacac cgattccgaa 540

tccacgaaac tcaaaatatt ttgtggaatt gtcacataac caaaaatctg gaatcctcat 600

cctacttgcc acgaacatat ctatccgaga cttgtccaca aaaccacgag agagaagccg 660

aaaactaaca caaaaatgca taggcaaccg tggacttctt cactagctca tcgagatagc 720

aatgccacta gctaatttct tacgttgtat cttatttgtt ttactttggg gcatgacatg 780

gttaaacccc atcaaagaga aagtgtttca tccactagtc aatatacgaa ttcattcgaa 840

tttatccctg taaatcctag ttcttaggat gaactggtgt aataaacagc aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaatctggaa tcattcgacc acctcaataa actaaagcta ccaattacca 960

caatatagtc ttccatatcc acttagatat aaaagataaa agtaaacaaa tattaaattt 1020

catatgcacg cataggaaac tcatgatctt atcttttaaa tagacatcta gttttcttag 1080

gttataaata gacattttgt cctagaactt cttcactact aaaacctagc ctcaa 1135

<210>4

<211>874

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体PD4

<222>（1）…（874）

<400>4

atggagttag agtttacttt acaaggaatt taaaattaat attaataaaa aattttaaca 60

attttaagtt tcggtttatt ataaattgag tacagttact cattttgata ctcctgcaaa 120

taattttgaa aaccctatta tgataagtcg atcaatccgc ctaatttctt acggattaaa 180

gcaatctaca gaaaaataaa acaacattac tactctaatt gcatatgatt gctagagagc 240

gcataaggct aagtcgtaaa gagaaacacc gattccgaat ccacgaaact caaaatattt 300

tgtggaattg tcacataacc aaaaatctgg aatcctcatc ctacttgcca cgaacatatc 360

tatccgagac ttgtccacaa aaccacgaga gagaagccga aaactaacac aaaaatgcat 420

aggcaaccgt ggacttcttc actagctcat cgagatagca atgccactag ctaatttctt 480

acgttgtatc ttatttgttt tactttgggg catgacatgg ttaaacccca tcaaagagaa 540

agtgtttcat ccactagtca atatacgaat tcattcgaat ttatccctgt aaatcctagt 600

tcttaggatg aactggtgta ataaacagca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatctggaat 660

cattcgacca cctcaataaa ctaaagctac caattaccac aatatagtct tccatatcca 720

cttagatata aaagataaaa gtaaacaaat attaaatttc atatgcacgc ataggaaact 780

catgatctta tcttttaaat agacatctag ttttcttagg ttataaatag acattttgtc 840

ctagaacttc ttcactacta aaacctagcc tcaa 874

<210>5

<211>731

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体PD5

<222>（1）…（731）

<400>5

taagtcgatc aatccgccta atttcttacg gattaaagca atctacagaa aaataaaaca 60

acattactac tctaattgca tatgattgct agagagcgca taaggctaag tcgtaaagag 120

aaacaccgat tccgaatcca cgaaactcaa aatattttgt ggaattgtca cataaccaaa 180

aatctggaat cctcatccta cttgccacga acatatctat ccgagacttg tccacaaaac 240

cacgagagag aagccgaaaa ctaacacaaa aatgcatagg caaccgtgga cttcttcact 300

agctcatcga gatagcaatg ccactagcta atttcttacg ttgtatctta tttgttttac 360

tttggggcat gacatggtta aaccccatca aagagaaagt gtttcatcca ctagtcaata 420

tacgaattca ttcgaattta tccctgtaaa tcctagttct taggatgaac tggtgtaata 480

aacagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaat ctggaatcat tcgaccacct caataaacta 540

aagctaccaa ttaccacaat atagtcttcc atatccactt agatataaaa gataaaagta 600

aacaaatatt aaatttcata tgcacgcata ggaaactcat gatcttatct tttaaataga 660

catctagttt tcttaggtta taaatagaca ttttgtccta gaacttcttc actactaaaa 720

cctagcctca a 731

<210>6

<211>601

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体PD6

<222>（1）…（601）

<400>6

tccgaatcca cgaaactcaa aatattttgt ggaattgtca cataaccaaa aatctggaat 60

cctcatccta cttgccacga acatatctat ccgagacttg tccacaaaac cacgagagag 120

aagccgaaaa ctaacacaaa aatgcatagg caaccgtgga cttcttcact agctcatcga 180

gatagcaatg ccactagcta atttcttacg ttgtatctta tttgttttac tttggggcat 240

gacatggtta aaccccatca aagagaaagt gtttcatcca ctagtcaata tacgaattca 300

ttcgaattta tccctgtaaa tcctagttct taggatgaac tggtgtaata aacagcaaaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaat ctggaatcat tcgaccacct caataaacta aagctaccaa 420

ttaccacaat atagtcttcc atatccactt agatataaaa gataaaagta aacaaatatt 480

aaatttcata tgcacgcata ggaaactcat gatcttatct tttaaataga catctagttt 540

tcttaggtta taaatagaca ttttgtccta gaacttcttc actactaaaa cctagcctca 600

a 601

<210>7

<211>456

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体PD7

<222>（1）…（456）

<400>7

ataggcaacc gtggacttct tcactagctc atcgagatag caatgccact agctaatttc 60

ttacgttgta tcttatttgt tttactttgg ggcatgacat ggttaaaccc catcaaagag 120

aaagtgtttc atccactagt caatatacga attcattcga atttatccct gtaaatccta 180

gttcttagga tgaactggtg taataaacag caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatctgga 240

atcattcgac cacctcaata aactaaagct accaattacc acaatatagt cttccatatc 300

cacttagata taaaagataa aagtaaacaa atattaaatt tcatatgcac gcataggaaa 360

ctcatgatct tatcttttaa atagacatct agttttctta ggttataaat agacattttg 420

tcctagaact tcttcactac taaaacctag cctcaa 456

<210>8

<211>294

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体PD8

<222>（1）…（294）

<400>8

ttatccctgt aaatcctagt tcttaggatg aactggtgta ataaacagca aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aatctggaat cattcgacca cctcaataaa ctaaagctac caattaccac 120

aatatagtct tccatatcca cttagatata aaagataaaa gtaaacaaat attaaatttc 180

atatgcacgc ataggaaact catgatctta tcttttaaat agacatctag ttttcttagg 240

ttataaatag acattttgtc ctagaacttc ttcactacta aaacctagcc tcaa 294

<210>9

<211>189

<212>cDNA

<213>拟南芥

<221>拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体PD9

<222>（1）…（189）

<400>9

gctaccaatt accacaatat agtcttccat atccacttag atataaaaga taaaagtaaa 60

caaatattaa atttcatatg cacgcatagg aaactcatga tcttatcttt taaatagaca 120

tctagttttc ttaggttata aatagacatt ttgtcctaga acttcttcac tactaaaacc 180

tagcctcaa 189

Claims

1.一种拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子，命名为PD1，其核苷酸序列为以下序列之一：

(2)核苷酸序列与SEQ ID No.1互补的DNA。

2.如权利要求1所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子，其特征在于：所述启动子PD1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变体来源于拟南芥的基因组，是将启动子PD1的核苷酸序列从5'端删除不同长度的片段后，获得的剩余的连续核苷酸序列，共有独立的八段，其序列长度分别为1479bp、1135bp、874bp、731bp、601bp、456bp、294bp和189bp，其顺序对应的核苷酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9所示，与启动子克隆方法无关；所述八段缺失突变体顺序命名为：缺失突变体PD2、缺失突变体PD3、缺失突变体PD4、缺失突变体PD5、缺失突变体PD6、缺失突变体PD7、缺失突变体PD8、缺失突变体PD9。

4.如权利要求3所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变体是缺失突变体PD7，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

5.拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用，其中所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子命名为PD1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30的启动子PD1为组成型强启动子，将其作为启动子与功能基因融合构建植物表达载体，并转入植物中，实现转基因植物的组成型高强度表达。

6.权利要求1所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用，其中所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体是PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8或PD9，其核苷酸序列顺序对应如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示；所述拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白基因AtSCPL30启动子的缺失突变体为组成型强启动子，将其作为启动子分别与功能基因融合构建植物表达载体，并转入植物中，实现转基因植物的组成型高强度表达。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物是指农作物、经济林木、牧草或草坪草。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述农作物是玉米、小麦、棉花、大豆、水稻或烟草。