CN117866958A - 一种OsRUBQ2pro启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种OsRUBQ2pro启动子及其应用。启动子包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该启动子为组成型启动子，其可以驱动基因在水稻的愈伤组织、营养生长期的主要功能组织(根、茎、叶、花、幼苗、幼穗等)或生殖器官中高效表达，特别在种子芽前/后花序时期高效表达，可替代非植物源启动子，可有效降低外源DNA引起的转基因植物的潜在安全风险，为植物遗传转化的筛选提供了有效的工具和方法。

Description

一种OsRUBQ2pro启动子及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种OsRUBQ2pro启动子及其应用。

背景技术

基因工程在实现重要作物遗传性状的改良中较传统植物育种具有较大的优势。特别是通过基因工程手段可同时引入两个或多个基因以此实现植物多种性状的改良，缩短育种时间，因此自该技术诞生以来一直被广泛应用于植物研究领域。基因工程技术作为改良植物性状的有效途径，其中加强对植物转录水平的调控研究一直是该研究领域的热点之一。

转录水平的调控在植物基因调控中发挥着重要作用，涉及多种顺式作用元件和反式作用因子。启动子(Promoter)是指一段能使特定RNA转录本进行转录的DNA序列，RNA转录本包括编码蛋白的mRNA，或者是tRNA，rRNA。其是一类与启动基因表达相关的顺式作用元件，通过与特定的转录因子结合，控制基因转录的起始与表达。启动子作为转录水平上重要的调控元件，根据其对转录水平的调控程度，将其分为弱启动子和强启动子；按其转录模式，其又可分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。在基因工程领域开发和利用高效特异的启动子具有重要的研究意义和应用价值。

植物启动子在转录水平上发挥着重要的调控作用，对其功能进行研究不仅可以反映相应基因的表达模式，还能为利用植物基因工程手段实现基因的高效特异性表达提供有效途径。组成型启动子的基因表达不具组织和时间特异性，外界因素对组成型启动子启动的外源基因表达几乎没有影响。目前常用的花椰菜花病毒(CaMV35S)启动子与玉米泛素(Ubiquitin)启动子等均属于这一类型。而CaMV35Spro是植物DNA病毒的启动子，在应用于植物转基因中时，可能引起不必要的担忧；ZmUbipro虽然来源于植物，但在转化时频繁使用同一种启动子会增大引起基因沉默或共抑制的概率。

外源基因的组成型表达会使大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，植物原有的代谢平衡被扰乱，或者一些有毒代谢产物阻碍植物的正常生长，甚至导致死亡。因此，挖掘新的高效的植物本源的组成型启动子显得尤其重要。

发明内容

为了解决现有技术中缺少植物本源的、低生物安全风险启动子的缺陷，特提出本发明。

第一方面，本发明提供了一种OsRUBQ2pro启动子，其包括至少一条如下核苷酸序列：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

iii)与i)或ii)完全互补的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了扩增所述启动子的引物对。

优选地，所述引物对为如SEQ ID NO.3-4所示的引物对；或如SEQ ID NO.5-6所示的引物对。

如SEQ ID NO.3-4所示的引物对用于扩增如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO.5-6所示的引物对用于扩增如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了含有上述任一OsRUBQ2pro启动子的生物材料。

优选地，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞中的至少一种。

在一些实施方案中，所述宿主细胞不能发育为完整的植株个体。

优选地，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的所述OsRUBQ2pro启动子、功能基因和终止子；

优选地，所述功能基因包括筛选标记基因和/或植物农艺性状相关基因。

筛选标记基因是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否；在基因定位意义上来说，它是对目的基因进行标志的工具，通常用来检测目的基因在细胞中的定位。

植物农艺性状，即和农作物的生育期、株高、叶面积、果实重量、品质、除草剂抗性、病虫害抗性等可以代表作物品种特点的相关性状。相应的，植物农艺性状相关的基因即是和这些性状相关的基因。

第三方面，本发明提供了一种试剂或试剂盒，其中含有上述任一OsRUBQ2pro启动子、或引物对、或生物材料。

第四方面，本发明提供了上述任一OsRUBQ2pro启动子、或引物对、或生物材料、或试剂或试剂盒在以下至少一方面的应用：

1)制备转基因植物；

2)驱动基因在植物中的表达；

3)植物遗传育种或种质改良；

4)植物杂交制种。

优选地，所述驱动基因在植物中的表达具体为：驱动基因在植物的愈伤组织和/或营养生长期的功能组织和/或生殖器官中的表达；

优选地，驱动基因在种子芽前/后花序时期的表达。

优选地，所述营养生长期的功能组织和/或生殖器官包括：根、茎、叶、花、幼苗、幼穗。

优选地，所述基因为功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因；

优选地，所述功能基因为植物农艺性状相关基因或筛选标记基因。

优选地，所述小RNA基因为能够干扰功能基因表达的小RNA基因。

在一些实施过程中，所述应用为，将所述OsRUBQ2pro启动子构建至载体中后导入植物中制备转基因植物；或，将所述生物材料导入植物中制备转基因植物。

在一些实施过程中，所述应用为，向植物中引入可操作地连接于所述OsRUBQ2pro启动子的目的DNA。

在一些实施过程中，在制备得到转基因植物后，通过筛选标记基因进行筛选。

优选地，所述植物包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱、小米中的至少一种。

作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，包括：

通过农杆菌转化法将包括所述OsRUBQ2pro启动子的载体转化至水稻愈伤组织中；

将所述水稻愈伤组织经过抗性筛选和分化得到水稻幼苗；

将所述水稻幼苗进行生根培养得到转基因水稻。

进一步地，所述水稻愈伤组织通过如下方法制备得到：

水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，28～30℃暗培养30～50天；

进一步地，在将植物组成型启动子OsRUBQ2pro转化至水稻愈伤组织中后，还包括共培养，所述共培养为在22～24℃暗培养至愈伤组织表面出现菌体；

进一步地，所述抗性筛选为将经过共培养的愈伤组织接种到添加潮霉素的筛选培养基中，28～30℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；

进一步地，所述分化为将经过抗性筛选的愈伤组织添加至添加潮霉素的分化培养基上，28～30℃光照培养25-40天。

进一步地，所述生根培养为将水稻幼苗接种到添加潮霉素的生根培养基上生根，30～32℃光照培养5～20天。

进一步地，在生根培养后，包括PCR检测，选择检测为阳性的植株种植。

本发明具备如下有益效果：

(1)本发明筛选得到一种OsRUBQ2pro启动子，该启动子为组成型启动子，来源于水稻中，其可以驱动基因在水稻的愈伤组织、营养生长期的主要功能组织(根、茎、叶、花、幼苗、幼穗等)或生殖器官中高效表达，特别在种子芽前/后花序时期高效表达。

本发明提供的OsRUBQ2pro启动子可与植物内源或外源筛选标记基因组成植物转基因筛选表达盒，或植物遗传转化筛选载体，并添加其他功能元件进行植物组织培养或植物遗传转化，为植物遗传转化的筛选提供了有效的工具和方法。

(2)本发明提供的引物对，可高效扩增目的基因OsRUBQ2pro启动子。

(3)本发明提供的生物材料可以提高载体的构建和遗传转化效率。

(4)本发明提供的OsRUBQ2pro启动子还可驱动基因在转化苗的营养生长期地上和地下部分的主要功能组织中高效表达。除此之外，OsRUBQ2pro启动子为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源基因片段，不仅丰富了植物转基因的启动子资源，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，具有良好的市场价值和社会效益。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的琼脂糖凝胶电泳结果；

其中，a、b、c分别为启动子OsRUBQ2pro-1808扩增片段、OsRUBQ2pro-2785的扩增片段以及载体1300gusplus酶切片段。

图2为本发明实施例2提供的1300gusplus载体的载体图谱。

图3为本发明实施例2提供的1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808和1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785载体经BamHI和HindIII酶切的电泳图；

其中，M为Marker，ck1-ck3为未酶切的1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808重组质粒，1-3为酶切的1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808重组质粒；ck4-ck6为未酶切的1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785重组质粒，4-6为酶切的1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785重组质粒。

图4为本发明实施例2提供的1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808载体的载体图谱。

图5为本发明实施例2提供的1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785载体的载体图谱。

图6为本发明实施例3提供的转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，ck1+为1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808重组质粒阳性对照，ck2+为1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785重组质粒阳性对照，1-4为1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808重组质粒农杆菌单克隆菌液样品，5-8为1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

图7为本发明实施例3提供潮霉素筛选培养基筛选愈伤组织的结果示意图；

其中，WT为潮霉素筛选热粳237愈伤组织示意图，1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808为潮霉素筛选1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808转热粳237愈伤组织示意图，1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785为潮霉素筛选1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785转热粳237愈伤组织示意图。

图8为本发明实施例3提供的转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，H₂O为空白对照，CK-为热粳237非转基因植株基因组DNA、CK+为1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808/2785重组质粒阳性对照，1-7为筛选获得的转基因植株基因组DNA。

图9为本发明实施例4提供的1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808质粒和1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785质粒转基因T0代株系愈伤组织、幼苗叶片、抽穗期(根、茎、叶、花药)及灌浆20天籽粒的GUS染色结果；

其中，CK-为阴性对照(热粳237)各发育阶段染色结果，CK+为阳性对照(转pC1301载体株系)各发育阶段染色结果，pro-1808为1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808转基因株系染色结果，pro-2785为1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785转基因株系染色结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

本实施例通过启动功能预测软件PlantCARE及PlantPAN等对OsRUBQ2p基因上游序列进行生物信息学分析发现，该序列富含多种与启动子相关的顺式作用元件，例如TATA-box，CAAT-box等，表明该启动子能开始转录、控制录起始频率和激活转录，具有植物细胞启动子的结构特征。同时，PlantPAN分析结果显示，该基因1bp至1808bp序列富含GC box，而GCbox也是真核生物启动子的序列特征之一，因此本发明推测这段序列应具有启动子活性。

本实施例进一步分别截取不同长度的OsRUBQ2基因上游序列进行启动子活性鉴定，经不断筛选和对比，最终确定将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列作为启动子序列，并将其命名为OsRUBQ2pro，OsRUBQ2pro启动子能够驱动基因在水稻的愈伤组织和营养生长期的主要组织中高效表达。

启动子OsRUBQ2pro可采用如下引物扩增得到：

SEQ ID NO.1所示的启动子的扩增引物序列如下：

SEQ ID NO.3：

5’-CTACCATGGTACCGTGGATCCCTGCAAGAAATAATCACCAAA CAGATAGGG-3’；

SEQ ID NO.4：

5’-AAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGACCACCCTTAAACCT ATCTTTTC-3’。

SEQ ID NO.2所示的启动子的扩增引物序列如下：

SEQ ID NO.5：

5’-TACCATGGTACCGTGGATCCCTGCAAGAAATAATCACCAAAC AGATAGG-3’；

SEQ ID NO.6：

5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCTGCAGAAATGCAAATTTCAT AAAAC-3’。

实施例2

本实施例将实施例1的启动子OsRUBQ2pro构建至表达盒和载体中，具体流程如下：

1、含启动子OsRUBQ2pro-1808的植物转基因表达盒的制备

本实施例的植物转基因表达盒OsRUBQ2pro-GUS-nosT(序列如SEQ ID NO.7)的构建方法如下：

利用引物1300-OsRUBQ2pro-F1(SEQ ID NO.3)/1300-OsRUBQ2pro-Rv1(SEQ IDNO.4)从水稻基因组中扩增启动子OsRUBQ2pro-1808片段。其中，引物1300-OsRUBQ2pro-F1的5’端有19个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；引物1300-OsRUBQ2pro-Rv1的5’端有25个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；以便后续利用ClonExpress IIOne StepCloning Kit重组连接。

PCR扩增反应体系如下：

表1PCR扩增反应体系

PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃结束。

引物1300-EPSPSpro-F1和1300-OsRUBQ2pro-Rv1扩增的PCR产物为EPSPSpro-1808片段，经1.0％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1808bp产物(结果如图1中的a图中1-5所示)。

2、含启动子OsRUBQ2pro-2785的植物转基因表达盒的制备

本实施例的植物转基因表达盒OsRUBQ2pro-2785-GUS-nosT(序列如SEQ ID NO.8)的构建方法如下：

利用引物OsRUBQ2pro-2785-F2(SEQ ID NO.5)/EPSPSpro-2785-Rv2(SEQ IDNO.6)从水稻基因组中扩增启动子OsRUBQ2pro-2785片段。其中，引物1300-OsRUBQ2pro-F2的5’端有18个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；引物1300-OsRUBQ2pro-Rv2的5’端有24个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；以便后续利用ClonExpress IIOne StepCloning Kit重组连接。

PCR扩增反应体系如下：

表2PCR扩增反应体系

PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35min，35个循环；72℃延伸10min，4℃结束。

引物1300-OsRUBQ2pro-F2和1300-OsRUBQ2pro-Rv2扩增的PCR产物为OsRUBQ2pro-2785片段，经1.0％琼脂糖凝胶电泳回收大小为2785bp产物(结果如图1中的b图中所示)。

3、植物遗传转化载体的构建

使用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit方法，将上述步骤1中的扩增产物插入到1300gusplus载体(载体图谱见图2)，BamHI和HindIII双酶切位点间，具体方法如下：

(1)用BamHI+HindIII对载体质粒1300gusplus进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A.Gel Extraction kit(Omega，下同)回收10kb左右大小条带，得到1300gusplus线性片段。

BamHI+HindIII双酶切反应体系如下：

表3酶切反应体系

酶切结果如图1中的c图所示。

(2)ClonExpress IIOne Step Cloning Kit连接试剂盒连接OsRUBQ2pro-1808或OsRUBQ2pro-2785片段到1300gusplus载体上，连接体系如下：

表4连接体系

连接程序：37℃，30min。

(3)转化：取步骤(2)的连接产物10μL，加入到大肠杆菌感受态细胞100μL中，轻微混匀，冰浴30min；42℃热激90s；冰水浴孵育2min 30s；加入SOC培养基900μL，37℃220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃900μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(1300-OsRUBQ2pro-test-F和1300OsRUBQ2pro-test-R)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(结果如图3所示，其中，M为Marker，ck1-ck3为未酶切的1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808重组质粒，1-3为酶切的1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808重组质粒，可切出大小约为1808bp片段；ck4-ck6为未酶切的1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785重组质粒，4-6为酶切的1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785重组质粒，可切出大小约为2785bp片段)，保存菌株并送测序。得到的载体命名为1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808和1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785，载体图谱见图4和图5。

引物序列：

1300-OsRUBQ2pro-test-F：

5’-AGACGCCATTGAGGTCGAAG-3’(SEQ ID NO.9)；

1300-OsRUBQ2pro-test-R：

5’-TCAGGATACGTGTGCTGTTACT-3’(SEQ ID NO.10)。

实施例3

本实施例将OsRUBQ2pro启动子转化至植物中制备相应的转基因植物，具体流程如下：

1、农杆菌转化及鉴定

取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μL实施例2中得到的测序正确1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808和1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785质粒，2.5KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(1300-OsRUBQ2pro-test-F/1300-OsRUBQ2pro-test-R和)菌液PCR验证(结果如图6所示，其中M为Marker，ck1+为1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808重组质粒阳性对照，ck2+为1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785重组质粒阳性对照，1-4为1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808重组质粒农杆菌单克隆菌液样品，5-8为1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785重组质粒农杆菌单克隆菌液样品)，可扩增得到约497bp的目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。

2、农杆菌介导遗传转化

(1)诱导：将热粳237的种子经次氯酸钠消毒后置于诱导培养基(N6+2.4-D 3mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L)上，28℃常温暗培养30-40d，得到诱导的愈伤后继代培养30-40d；

(2)筛选：将步骤1中得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化(1)中获得的愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，30℃暗培养30-50d，结果如图7所示，1300gusplus-OsRUBQ2pro-1808和1300gusplus-OsRUBQ2pro-2785的农杆菌侵染后筛选的愈伤，可筛选获得抗性愈伤；

(3)分化：筛选获得的抗性愈伤转移至含50mg/L潮霉素的分化培养基上，分化25-30d获得阳性苗；

(4)生根：经分化获得的阳性苗转移至含50mg/L潮霉素的生根培养基上，生根7-15d最后获得阳性转基因植株；

(5)炼苗及移栽：将根系生长旺盛的转化株系开启瓶口封口膜，加无菌水覆盖培养基1-2cm厚，置于室温下与空气接触进行炼苗2-3d后，移栽至温室栽培。

3、转基因株系鉴定

为了鉴定步骤2获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。

首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μL上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μL 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μL ddH₂O溶解DNA。

使用潮霉素引物(Hn-F/Hn-R)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因苗扩增获得片段大小为561bp。

引物序列如下：

Hn-F:5’-CTTAGCCAGACGAGCGGGTTC-3’(SEQ ID NO.11)；

Hn-R:5’-GCTTCTGCGGGCGATTTGT-3’(SEQ ID NO.12)。

以热粳237基因组DNA作为阴性对照，水为空白对照。PCR反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s；72℃延伸5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

PCR反应体系如下：

表5PCR反应体系

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，结果表明，大部分转基因样品中含有561bp的转基因条带，与载体对照大小相同；而空白对照和阴性对照热粳237无法扩出条带。

实施例4

本实施例对实施例3得到的转基因株系进行进一步分析，具体如下：

1、植物组织GUS染色分析

使用GUS染色试剂盒(中科瑞泰，货号：RTU4032)进行染色分析，筛选阳性愈伤组织染色明显，对苗期叶片、抽穗期(根、茎、叶、花药)及灌浆20天后籽粒进行GUS染色，均染上色，结果如图9所示，图9显示OsRUBQ2pro-1808启动子与OsRUBQ2pro-2785启动子驱动的GUS基因表达量较高。其中，阴性对照各阶段组织均未染上色，阳性对照均染上色。

2、玉米中组织表达分析

利用实施例3中水稻类似的方法，获得玉米转基因植株，对各组织GUS染色发现，玉米筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的苗期叶片、抽穗期(根、茎、叶、花药)及灌浆20天后籽粒进行GUS染色，均染上色。结果表明，OsRUBQ2pro-1808和OsRUBQ2pro-2785启动子也可驱动GUS基因在玉米愈伤组织水平、苗期叶片、抽穗期(根、茎、叶、花药)及灌浆20天后籽粒中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。

3、小麦中组织表达分析

利用实施例3中水稻类似的方法，获得小麦转基因植株，对各组织GUS染色发现，小麦筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的苗期叶片、抽穗期(根、茎、叶、花药)及灌浆20天后籽粒进行GUS染色，均染上色。结果表明，OsRUBQ2pro-1808和OsRUBQ2pro-2785启动子也可驱动GUS基因在小麦愈伤组织水平、苗期、成熟期叶片、抽穗期(根、茎、叶、花药)及灌浆20天后籽粒中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种OsRUBQ2pro启动子，其特征在于，其包括至少一条如下核苷酸序列：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

iii)与i)或ii)完全互补的核苷酸序列。

2.扩增权利要求1所述启动子的引物对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，其为如SEQ ID NO.3-4所示的引物对；或如SEQ ID NO.5-6所示的引物对。

4.含有权利要求1所述OsRUBQ2pro启动子的生物材料；优选地，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的所述OsRUBQ2pro启动子、功能基因和终止子；

优选地，所述功能基因包括筛选标记基因和/或植物农艺性状相关基因。

6.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求1所述的OsRUBQ2pro启动子、或权利要求2或3所述的引物对、或权利要求4或5所述的生物材料。

7.权利要求1所述的OsRUBQ2pro启动子、权利要求2或3所述的引物对、权利要求4或5所述的生物材料、或权利要求6所述的试剂或试剂盒在以下至少一方面的应用：

1)制备转基因植物；

2)驱动基因在植物中的表达；

3)植物遗传育种或种质改良；

4)植物杂交制种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述驱动基因在植物中的表达具体为：驱动基因在植物的愈伤组织和/或营养生长期的功能组织和/或生殖器官中的表达；

优选地，驱动基因在种子芽前/后花序时期的表达。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因为功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因；

优选地，所述功能基因为植物农艺性状相关基因或筛选标记基因；

优选地，所述小RNA基因为能够干扰所述功能基因表达的小RNA基因。

10.根据权利要求7～9中任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱、小米中的至少一种。