CN117821455A - 一种OsGMS5pro启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种OsGMS5pro启动子及其应用。OsGMS5pro启动子序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的组成型OsGMS5pro启动子可驱动基因在转化苗的营养生长期地上和地下部分的主要功能组织中高效表达。除此之外，OsGMS5pro启动子为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源基因片段，不仅丰富了植物转基因的启动子资源，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，具有良好的市场价值和社会效益。

Description

一种OsGMS5pro启动子及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种OsGMS5pro启动子及其应用。

背景技术

转基因技术已经成为研究基因功能的基础研究和应用研究领域不可或缺的技术之一，启动子作为驱动基因表达的重要功能顺式作用元件，在转基因技术中占据重要地位。启动子按其表达方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和时空特异型启动子三类。组成型启动子能够在所有或大多数组织中启动基因转录，使基因表达具有时空持续性和表达恒定性。诱导型启动子能够在某些物理或化学信号的刺激下启动或大幅提高基因表达量，它们具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并表现出明显的专一性。时空特异型启动子只在特定的生长阶段或部位中启动基因表达。深入研究启动子的表达模式既有利于理解基因的表达调控机制和生物学功能，又有助于有效调控外源基因的表达。

目前，在植物转化过程中应用较多的启动子主要是花椰菜花病毒的启动子(CaMV35Spro)和玉米多聚泛素蛋白基因启动子(ZmUbipro)。CaMV35Spro是植物DNA病毒的启动子，在应用于植物转基因中时，可能引起不必要的担忧；ZmUbipro虽然来源于植物，但在转化时频繁使用同一种启动子易导致转基因沉默。

因此，挖掘新的高效的组成型启动子，尤其是植物本源的、生物安全性好的启动子显得尤其重要。

发明内容

本发明提供了一种水稻来源的、生物安全性好的组成型启动子。基于此，特提出如下发明内容。

第一方面，本发明提供了一种OsGMS5pro启动子，其包括至少一条如下核苷酸序列：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

ii)与i)完全互补的核苷酸序列；

iii)如i)所示的核苷酸序列经取代、缺失、增加一个或多个核苷酸序列得到的具有同等启动子功能的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了扩增所述启动子的引物对。

优选地，所述引物对为如SEQ ID NO.2-3所示的引物对。

SEQ ID NO.2-3所示的引物对可用于扩增如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了含有所述启动子的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞中的至少一种。

在一些实施方案中，所述宿主细胞不能发育为完整的植株个体。

优选地，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的所述OsGMS5pro启动子、功能基因和终止子；

优选地，所述功能基因包括筛选标记基因和/或植物农艺性状相关基因。

筛选标记基因是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否；在基因定位意义上来说，它是对目的基因进行标志的工具，通常用来检测目的基因在细胞中的定位。

所述筛选标记基因优选为β-葡萄糖苷酸酶基因GUS、潮霉素磷酸转移酶基因Hn、乙酰乳酸合酶突变基因ALS、Bar基因、抗性EPSPS基因或NptII基因中的一种或多种。

植物农艺性状，即和农作物的生育期、株高、叶面积、果实重量、品质、除草剂抗性、病虫害抗性等可以代表作物品种特点的相关性状。相应的，植物农艺性状相关的基因即是和这些性状相关的基因。

第四方面，本发明提供了一种试剂或试剂盒，其中含有所述启动子、或所述引物对、或所述生物材料。

第五方面，本发明提供了所述启动子、或所述引物对、或所述生物材料、或所述试剂或试剂盒在以下至少一方面中的应用：

1)制备转基因植物；

2)驱动基因在植物中的表达；

3)植物遗传育种或种质改良；

4)植物杂交制种。

优选地，所述应用包括：将所述OsGMS5pro启动子构建至载体上，然后转化至植物中；

或将所述生物材料导入植物中。

优选地，所述应用还包括：转化或导入植物中后，通过筛选标记基因进行筛选。

优选地，所述基因为功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因；

优选地，所述功能基因为植物农艺性状相关基因或筛选标记基因；

优选地，所述小RNA基因为能够干扰所述功能基因表达的小RNA基因。

优选地，驱动基因在植物中的表达具体包括驱动基因在植物愈伤组织、营养生长期的组织或生殖器官中的表达。

优选地，所述植物包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱、小米中的至少一种。

作为一种优选的具体实施方式，本发明提供了一种制备转基因水稻的方法，包括：

通过农杆菌转化法将包括所述OsGMS5pro启动子的载体转化至水稻愈伤组织中；

将所述水稻愈伤组织经过抗性筛选和分化得到水稻幼苗；

将所述水稻幼苗进行生根培养得到转基因水稻。

优选地，所述水稻愈伤组织通过如下方法制备得到：

水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，28～30℃暗培养30～50天。

优选地，在将所述OsGMS5pro启动子转化至水稻愈伤组织中后，还包括共培养，所述共培养为在22～24℃暗培养至愈伤组织表面出现菌体。

优选地，所述抗性筛选为将经过共培养的愈伤组织接种到添加潮霉素的筛选培养基中，28～30℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；

优选地，所述分化为将经过抗性筛选的愈伤组织添加至添加潮霉素的分化培养基上，28～30℃光照培养25-40天。

优选地，所述生根培养为将水稻幼苗接种到添加潮霉素的生根培养基上生根，30～32℃光照培养5～20天。

优选地，在生根培养后，包括PCR检测，选择检测为阳性的植株种植。

本发明具备如下有益效果：

本发明筛选得到了一种OsGMS5pro启动子，该启动子为组成型启动子，来源于水稻，其可以驱动基因在水稻、玉米或小麦等植物的愈伤组织、营养生长期的主要功能组织(根、叶、花、幼苗、幼穗等)或生殖器官中的高效稳定表达。

本发明提供的OsGMS5pro启动子可与植物内源或外源筛选标记基因组成植物转基因筛选表达盒，或植物遗传转化筛选载体，并添加其他功能元件进行植物组织培养或植物遗传转化，为植物遗传转化的筛选提供了有效的工具和方法。

本发明提供的OsGMS5pro启动子可驱动基因在转化苗的营养生长期地上和地下部分的主要功能组织中高效表达。除此之外，OsGMS5pro启动子为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源基因片段，不仅丰富了植物转基因的启动子资源，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，具有良好的市场价值和社会效益。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的琼脂糖凝胶电泳结果；其中左图为启动子OsGMS5pro的扩增片段，右图为载体1300gusplus酶切片段。

图2为本发明实施例2提供的1300gusplus载体的载体图谱。

图3为本发明实施例2提供的1300gusplus-OsGMS5pro载体经Eco147I/HindIII和BcuI/HindIII两组酶进行双酶切电泳图；

其中，M为Marker，ck1-4为挑选的1300gusplus-OsGMS5pro重组质粒，1、2分别为Eco147I/HindIII和BcuI/HindIII两组酶酶切的1300gusplus-OsGMS5pro重组质粒。

图4为本发明实施例2提供的1300gusplus-OsGMS5pro载体的载体图谱。

图5为本发明实施例3提供的转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，H₂O为空白对照，ck-为阴性对照1300gusplus，ck+为1300gusplus-OsGMS5pro重组质粒阳性对照，1-8为转1300gusplus-OsGMS5pro重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

图6为本发明实施例3提供的转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，H₂O为空白对照，ck-为ZH11非转基因植株基因组DNA、ck+为1300gusplus-OsGMS5重组质粒阳性对照，编号1-14为筛选获得的植株基因组DNA，其中编号1这1个株系为非转基因株系，其余13株系均为转基因株系。

图7为本发明实验例提供的1300gusplus-OsGMS5pro载体转基因T0代株系愈伤组织、分化苗、叶片和种子的GUS染色结果；其中，ck-为阴性对照(ZH11)各发育阶段染色结果，ck+为阳性对照(pC1301)各发育阶段染色结果，GMS5pro为1300gusplus-OsGMS5pro转基因株系染色结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中述及的试验方法，若无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中述及的材料和试剂，若无特殊说明，均可以市售购得。

实施例1

本实施例通过启动功能预测软件PlantCARE及PlantPAN等对LOC_Os02g07490基因上游序列进行生物信息学分析发现，该序列富含多种与启动子相关的顺式作用元件，例如TATA-box，CAAT-box等，表明该序列具有植物细胞启动子的结构特征。

本实施例进一步截取LOC_Os02g07490基因起始密码子ATG前约2000bp长度的上游序列进行启动子活性鉴定，经不断筛选，最终确定将SEQ ID NO.1所示的序列作为启动子序列，并将其命名为OsGMS5pro，OsGMS5pro启动子能够驱动基因在水稻的愈伤组织、3-5叶期幼苗和种子等主要组织中高效表达。

实施例2

本实施例将实施例1中获得的OsGMS5pro启动子构建至表达盒和载体中，具体流程如下：

1、含OsGMS5pro启动子的植物转基因表达盒的制备

本实施例的植物转基因表达盒OsGMS5pro-GUS-nosT(序列如SEQ ID NO.4所示)的构建方法如下：

设计引物1300-GMS5pro-F/1300-GMS5pro-RV从水稻9311基因组中扩增OsGMS5启动子片段。其中，引物1300-GMS5pro-F的5’端有22个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；引物1300-GMS5pro-RV的5’端有36个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；以便后续利用Gibson Assembly重组连接。上述引物序列如下：1300-GMS5pro-F：5’-TCAGATCTACCATGGTACCGTGgatccGGGGGGGGCCTCCTCGC-3’(SEQ ID NO.2)；

1300-GMS5pro-RV：5’-TAAAACGACGGCCAGTGCCAagcttTGTATTTATATTTTGTATAGGAAGATCATAC-3’(SEQ ID NO.3)。

PCR扩增反应体系如下：

表1PCR扩增反应体系

PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。

引物1300-GMS5pro-F和1300-GMS5pro-RV扩增的PCR产物为OsGMS5片段，经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收大小为2023bp产物(结果如图1中的左图所示)。

3、植物遗传转化载体的构建

使用Gibson Assembly方法，将上述步骤1中的扩增产物插入到1300gusplus载体(载体图谱见图2)，BamHI和HindIII双酶切位点间，具体方法如下：

(1)用BamHI+HindIII对载体质粒1300gusplus进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A.Extraction kit(Omega，下同)回收10kb左右大小条带，得到1300gusplus线性片段。

BamHI+HindIII双酶切反应体系如下：

表2酶切反应体系

酶切结果如图1中的右图所示。

(2)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒(Gene-)连接OsGMS5pro启动子片段到1300gusplus载体上，连接体系如下：

表3连接体系

连接程序：50℃，30min。

(3)转化：取步骤(2)的连接产物3μL，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入SOC培养基1mL，37℃220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃800μL上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(1300-GMS5pro-test-F和1300-GMS5pro-test-R)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(结果如图3所示，其中，M为Marker，ck1-4为挑选的1300gusplus-OsGMS5pro重组质粒，1、2分别为Eco147I/HindIII和BcuI/HindIII两组酶酶切的1300gusplus-OsGMS5pro重组质粒，Eco147I/HindIII可酶切出2767bp，BcuI/HindIII可酶切出2257bp，结果显示ck4为阳性重组质粒)，保存菌株并送测序。得到的载体命名为1300gusplus-OsGMS5pro，载体图谱见图4。引物序列如下：

1300-GMS5pro-test-F：

TCTTCCAGTCCTTTCCCGTAGT(SEQ ID NO.5)；

1300-GMS5pro-test-R：

AGACACGAAAACTTATAGCTGTGT(SEQ ID NO.6)。

实施例3

本实施例将上述OsGMS5pro启动子转化至植物中制备相应的转基因植物，具体流程如下：

1、农杆菌转化及鉴定

取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μL实施例2中得到的测序正确1300gusplus-OsGMS5pro质粒，2.5KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(1300-GMS5pro-test-F和1300-GMS5pro-test-R)菌液PCR验证(结果如图5所示，其中M为Marker，H₂O为空白对照，ck-为阴性对照1300gusplus，ck+为1300gusplus-GMS5pro重组质粒阳性对照，1-8为转1300gusplus-OsGMS5pro重组质粒农杆菌单克隆菌液样品，其扩增条带大小为479bp，大小正确)，可扩增得到约479bp的目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。

2、农杆菌介导遗传转化

(1)诱导：将中花11(ZH11)的种子经次氯酸钠消毒后置于诱导培养基(N6+2.4-D3mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L)上，28℃常温暗培养30-40d，得到诱导的愈伤后继代培养30-40d；

(2)筛选：将步骤1中得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化(1)中获得的愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，30℃暗培养30-50d，1300gusplus-OsGMS5pro的农杆菌侵染后筛选的愈伤，可筛选获得抗性愈伤；

(3)分化：筛选获得的抗性愈伤转移至含50mg/L潮霉素的分化培养基上，30℃光照培养分化25-30d获得阳性苗；

(4)生根：经分化获得的阳性苗转移至含50mg/L潮霉素的生根培养基上，30℃光照培养生根7-15d最后获得阳性转基因植株；

(5)炼苗及移栽：将根系生长旺盛的转化株系开启瓶口封口膜，加无菌水覆盖培养基1-2cm厚，置于室温下与空气接触进行炼苗2-3d后，移栽至温室栽培。

3、转基因株系鉴定

为了鉴定步骤2获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。

首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2mL离心管中；在研钵中加入800μL 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μL上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μL 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μL ddH₂O溶解DNA。

使用潮霉素引物(Hn-F/Hn-R)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因苗扩增获得片段大小为561bp。引物序列如下：Hn-F:5’-CTTAGCCAGACGAGCGGGTTC-3’(SEQ ID NO.7)；

Hn-R:5’-GCTTCTGCGGGCGATTTGT-3’(SEQ ID NO.8)。

以ZH11基因组DNA作为阴性对照，水为空白对照。PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

PCR反应体系如下：

表4PCR反应体系

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，其中，M为Marker，H₂O为空白对照，ck-为ZH11非转基因植株基因组DNA、ck+为1300gusplus-OsGMS5重组质粒阳性对照，编号1-14为筛选获得的植株基因组DNA，其中编号1这1个株系为非转基因株系，其余13株系均为转基因株系。

结果表明，大部分转基因样品中含有561bp的转基因条带，与载体对照大小相同；而空白对照和阴性对照ZH11无法扩出条带。

实验例

本实验例对实施例3得到的转基因株系进行进一步分析，具体如下：

1、植物组织GUS染色分析

使用GUS染色试剂盒(中科瑞泰，货号：RTU4032)进行染色分析，筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片和根染色也明显，对苗期叶片、种子进行GUS染色均染上色，结果如图7所示，其中，ck-为阴性对照(ZH11)各发育阶段染色结果，ck+为阳性对照(pC1301)各发育阶段染色结果，GMS5pro为1300gusplus-OsGMS5pro转基因株系染色结果。

图7显示OsGMS5pro启动子驱动的GUS基因表达量较高，阴性对照(ZH11)叶片各阶段组织均未染上色，阳性对照(转pC1301载体阳性株系)均染上色。

2、玉米中组织表达分析

利用实施例3中水稻类似的方法，获得玉米转基因植株，对各组织gus染色发现，玉米筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片、根、苗期叶片、种子进行GUS染色均染上色。可见OsGMS5pro启动子也可驱动GUS基因在玉米愈伤组织水平、根、苗期、成熟期叶片和种子中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。

3、小麦中组织表达分析

利用实施例3中水稻类似的方法，获得小麦转基因植株，对各组织gus染色发现，小麦筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片、根、苗期叶片、种子进行GUS染色均染上色。可见OsGMS5pro启动子也可驱动GUS基因在小麦愈伤组织水平、根、苗期、成熟期叶片和种子中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种OsGMS5pro启动子，其特征在于，其包括至少一条如下核苷酸序列：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

ii)与i)完全互补的核苷酸序列；

iii)如i)所示的核苷酸序列经取代、缺失、增加一个或多个核苷酸序列得到的具有同等启动子功能的核苷酸序列。

2.扩增权利要求1所述启动子的引物对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，其为如SEQ ID NO.2-3所示的引物对。

4.含有权利要求1所述OsGMS5pro启动子的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的所述OsGMS5pro启动子、功能基因和终止子；

优选地，所述功能基因包括筛选标记基因和/或植物农艺性状相关基因。

6.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求1所述的OsGMS5pro启动子、或权利要求2或3所述的引物对、或权利要求4或5所述的生物材料。

7.权利要求1所述的OsGMS5pro启动子、权利要求2或3所述的引物对、权利要求4或5所述的生物材料、或权利要求6所述的试剂或试剂盒在以下至少一方面中的应用：

1)制备转基因植物；

2)驱动基因在植物中的表达；

3)植物遗传育种或种质改良；

4)植物杂交制种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：将所述OsGMS5pro启动子构建至载体上，然后转化至植物中；

或将所述生物材料导入植物中。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因为功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因；

优选地，所述功能基因为植物农艺性状相关基因或筛选标记基因；

优选地，所述小RNA基因为能够干扰所述功能基因表达的小RNA基因。

10.根据权利要求7～9中任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱、小米中的至少一种。