CN116064508A - 一种CEPro722启动子及其应用 - Google Patents

一种CEPro722启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种CEPro722启动子及其应用。所述CEPro722启动子包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明经过研究，在GRMZM2G069722基因中筛选发现了CEPro722启动子，该启动子可以驱动基因在例如水稻、小麦或玉米等植株中表达；尤其是在植物愈伤组织、营养生长期的叶片，幼穗及种子等各组织中高效稳定的表达，可替代非植物源启动子。本发明提供的CEPro722启动子在植物的基因工程领域有重要意义，可有效降低外源DNA引起的转基因植物的潜在安全风险。

Description

一种CEPro722启动子及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种CEPro722启动子及其应用。
背景技术
转基因技术已经成为研究基因功能的基础研究应用研究领域不可或缺的技术之一，启动子作为驱动基因表达的重要功能顺式作用元件，在转基因技术中占据重要地位。启动子按其表达方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和时空特异型启动子三类。组成型启动子能够在所有或大多数组织中启动基因转录，使基因表达具有时空持续性和表达恒定性。诱导型启动子能够在某些物理或化学信号的刺激下启动或大幅提高基因表达量，它们具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并表现出明显的专一性。时空特异型启动子只在特定的生长阶段或部位中启动基因表达。深入研究启动子的表达模式既有利于理解基因的表达调控机制和生物学功能，又有助于有效调控外源基因的表达。
目前，在植物转化过程中应用较多的启动子主要是花椰菜花病毒的启动子(CaMV35Spro)和玉米多聚泛素蛋白基因启动子(ZmUbipro)。CaMV35Spro是植物DNA病毒的启动子，在应用于植物转基因中时，可能引起不必要的担忧；ZmUbipro虽然来源于植物，但在转化时频繁使用同一种启动子易导致转基因沉默。因此，挖掘新的高效的组成型启动子，尤其是植物本源的、生物安全低风险的启动子在显得尤其重要。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供一种CEPro722启动子及其应用。
本发明提供一种CEPro722启动子，所述CEPro722启动子包括如下任一核苷酸序列：
i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
ii)与i)互补的核苷酸序列；
iii)如i)所示的核苷酸序列经取代、缺失、增加一个或多个核苷酸序列得到的具有同等启动子功能的核苷酸序列。
本发明进一步提供用于扩增权利要求1所述的CEPro722启动子的引物对，包括：如SEQ ID NO.3-4所示的引物对，和/或如SEQ ID NO.5-6所示的引物对。
进一步地，如SEQ ID NO.3-4所示的引物对用于扩增如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；如SEQ ID NO.5-6所示的引物对用于扩增如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
本发明进一步提供包含所述CEPro722启动子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
进一步地，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒还包括功能基因和终止子。
进一步，所述功能基因为植物农艺性状相关基因或标记基因。
标记基因，即可以起到特异性标记作用的基因，通常用于检验基因转化成功与否，优选为β-葡萄糖苷酸酶基因GUS、潮霉素磷酸转移酶基因Hn、乙酰乳酸合酶突变基因ALS、Bar基因、抗性EPSPS基因或NptII基因中的一种或多种。
植物农艺性状，即和农作物的生育期、株高、叶面积、果实重量、品质、除草剂抗性、病虫害抗性等可以代表作物品种特点的相关性状。相应的，植物农艺性状相关的基因即是和这些性状相关的基因。
本发明进一步提供包括所述CEPro722启动子，或所述引物对，或所述生物材料的试剂盒。
本发明进一步提供所述CEPro722启动子，或所述引物对，或所述生物材料，或所述试剂盒在制备转基因植物中的应用。
进一步地，所述应用为，将所述CEPro722启动子构建至载体中后导入植物中制备转基因植物；或，将所述生物材料导入植物中制备转基因植物。
进一步地，在制备得到转基因植物后，通过标记基因进行筛选。
作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，包括：
通过农杆菌转化法将包括所述CEPro722启动子的载体转化至水稻愈伤组织中；
将所述水稻愈伤组织经过抗性筛选和分化得到水稻幼苗；
将所述水稻幼苗进行生根培养得到转基因水稻。
进一步地，所述水稻愈伤组织通过如下方法制备得到：
水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，28～30℃暗培养30～50天；
进一步地，在将植物组成型启动子CEPro432转化至水稻愈伤组织中后，还包括共培养，所述共培养为在22～24℃暗培养至愈伤组织表面出现菌体；
进一步地，所述抗性筛选为将经过共培养的愈伤组织接种到添加潮霉素的筛选培养基中，28～30℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；
进一步地，所述分化为将经过抗性筛选的愈伤组织添加至添加潮霉素的分化培养基上，28～30℃光照培养25-40天。
进一步地，所述生根培养为将水稻幼苗接种到添加潮霉素的生根培养基上生根，30～32℃光照培养5～20天。
进一步地，在生根培养后，包括PCR检测，选择检测为阳性的植株种植。
本发明进一步提供所述CEPro722启动子或所述生物材料在驱动基因在植物中表达中的应用，例如在植物愈伤组织、营养生长期的组织或生殖器官中的一种或多种中表达的应用。
进一步地，所述基因包括：功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因；
所述功能基因优选包括植物农艺性状相关基因或标记基因，所述小RNA基因优选为能够干扰功能基因表达的小RNA基因。
进一步地，所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米中的一种或多种。
本发明具备如下有益效果：
本发明筛选得到一种CEPro722启动子，该启动子为组成型启动子，来源于玉米中，其可以驱动基因在水稻、玉米或小麦的愈伤组织、营养生长期的主要功能组织(根、叶、花、幼苗、幼穗等)或生殖器官中高效表达，特别是别是3-5叶期幼苗中高效表达。
本发明提供的启动子CEPro722可与植物内源或外源筛选标记基因组成植物转基因筛选表达盒，或植物遗传转化筛选载体，并添加其他功能元件进行植物组织培养或植物遗传转化，为植物遗传转化的筛选提供了有效的工具和方法。
本发明提供的启动子CEPro722还可驱动基因在转化苗的营养生长期地上和地下部分的主要功能组织中高效表达。除此之外，启动子CEPro722为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源基因片段，不仅丰富了植物转基因的启动子资源，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，具有良好的市场价值和社会效益。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的琼脂糖凝胶电泳结果；其中从左到右依次为启动子CEPro722-676的扩增片段、CEPro722-1542的扩增片段以及载体1300gusplus酶切片段。
图2为本发明实施例2提供的1300gusplus载体的载体图谱。
图3为本发明实施例2提供的1300gusplus-722pro-676和1300gusplus-722pro-1542载体经BamHI和PstI酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK-为1300gusplus骨架载体，0为酶切的1300gusplus骨架载体，ck1-ck4为未酶切的1300gusplus-722Pro-676重组质粒，1-4为酶切的1300gusplus-722Pro-676重组质粒；ck5-ck8为未酶切的1300gusplus-722Pro-1542重组质粒，5-8为酶切的1300gusplus-722Pro-1542重组质粒。
图4为本发明实施例2提供的1300gusplus-722Pro-676载体的载体图谱。
图5为本发明实施例2提供的1300gusplus-722Pro-1542载体的载体图谱。
图6为本发明实施例3提供的转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，ck+为1300gusplus-722Pro-676或者1300gusplus-722Pro-1542重组质粒阳性对照，1-10为转1300gusplus-722Pro-676或者1300gusplus-722Pro-1542重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。
图7为本发明实施例3提供潮霉素筛选培养基筛选愈伤组织的结果示意图。
图8为本发明实施例3提供的转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，H2O为空白对照，ck-为ZH11非转基因植株基因组DNA、ck+为1300gusplus-722Pro-676重组质粒阳性对照，1-13为筛选获得的转基因植株基因组DNA。
图9为本发明实验例1提供的1300gusplus-722Pro-676质粒和1300gusplus-722Pro-1542质粒转基因T0代株系愈伤组织、分化苗、叶片和种子的GUS染色结果；其中，Ck-为阴性对照(ZH11)各发育阶段染色结果，Ck+为阳性对照(pC1301)各发育阶段染色结果，Pro-676为1300gusplus-722Pro-676转基因株系染色结果，Pro-1542为1300gusplus-722Pro-1542转基因株系染色结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中述及的试验方法，若无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中述及的材料和试剂，若无特殊说明，均可以市售购得。
实施例1
本实施例通过启动功能预测软件PlantCARE及PlantPAN等对GRMZM2G069722基因上游序列进行生物信息学分析发现，该序列富含多种与启动子相关的顺式作用元件，例如TATA-box，CAAT-box等，表明该序列具有植物细胞启动子的结构特征。同时，PlantPAN分析结果显示，该基因1bp至618bp序列富含CpG岛，而CpG岛也是真核生物启动子的序列特征之一，因此本发明推测这段序列应具有启动子活性。
本实施例进一步分别截取不同长度的GRMZM2G069722基因上游序列进行启动子活性鉴定，经不断筛选和对比，最终确定将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列作为启动子序列，并将其命名为CEPro722，CEPro722启动子能够驱动基因在水稻的愈伤组织和营养生长期的主要组织中高效表达。
启动子CEPro722可采用如下引物扩增得到：
如SEQ ID NO.1所示的启动子的扩增引物序列如下：
SEQ ID NO.3：5’-AGATCTACCATGGTACCGTGGATCCGGTCGTGGTCGTGGAGCAG-3’；
SEQ ID NO.4：5’-CAAGCTTGCATGCCTGCAgACAATTTTTTTTACTCCCGTCGCA-3’。
如SEQ ID NO.2所示的启动子的扩增引物序列如下：
SEQ ID NO.5：5’-AGATCTACCATGGTACCGTGGATCCGGTCGTGGTCGTGGAGCAG-3’；
SEQ ID NO.6：5’-CAAGCTTGCATGCCTGCAGTCACGGGGTGTAGATATGTAAGTATG-3’。
实施例2
本实施例将启动子CEPro722-676构建至表达盒和载体中，具体流程如下：
1、含启动子CEPro722-676的植物转基因表达盒的制备
本发明的植物转基因表达盒CEPro722-676-GUS-nosT(序列如SEQ ID NO.7)的构建方法如下：
设计引物1300-722Pro-F2/1300-722Pro-Rv2从玉米B73基因组中扩增启动子CEPro722-676片段。其中，引物1300-722Pro-F2的5’端有25个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；引物1300-722Pro-Rv2的5’端有19个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；以便后续利用Gibson Assembly重组连接。
上述引物序列如下：
1300-722Pro-F2：5’-AGATCTACCATGGTACCGTGGATCCGGTCGTGGTCGTGGAGCAG-3’(SEQID NO.3)；
1300-722Pro-Rv2:5’-CAAGCTTGCATGCCTGCAGACAATTTTTTTTACTCCCGTCGCA-3’(SEQID NO.4)。
PCR扩增反应体系如下：
表1 PCR扩增反应体系
Figure BDA0003418951580000061
PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。
引物1300-722Pro-F2和1300-722Pro-RV2扩增的PCR产物为CEPro722-676片段，经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收大小为676 bp产物(结果如图1中的左图所示)。
2、含启动子CEPro722-1542的植物转基因表达盒的制备
本发明的植物转基因表达盒CEPro722-1542-GUS-nosT(序列如SEQ ID NO.8)的构建方法如下：
设计引物1300-722Pro-F1/1300-722Pro-Rv1从玉米B73基因组中扩增启动子CEPro722-1542片段。其中，引物1300-722Pro-F1的5’端有25个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；引物1300-722Pro-Rv1的5’端有19个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；以便后续利用Gibson Assembly重组连接。
上述引物序列如下：
1300-722Pro-F1:5’-AGATCTACCATGGTACCGTGGATCCGGTCGTGGTCGTGGAGCAG-3’(SEQID NO.5)；
1300-722Pro-Rv1:5’-CAAGCTTGCATGCCTGCAgTCACGGGGTGTAGATATGTAAGTATG-3’(SEQ ID NO.6)；
PCR扩增反应体系如下：
表2PCR扩增反应体系
Figure BDA0003418951580000071
PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。
引物1300-722Pro-F1和1300-722Pro-RV1扩增的PCR产物为CEPro722-1542片段，经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1542bp产物(结果如图1中的中间图所示)。
3、植物遗传转化载体的构建
使用Gibson Assembly方法，将上述步骤1中的扩增产物插入到1300gusplus载体(载体图谱见图2)，BamHI和PstI双酶切位点间，具体方法如下：
(1)用BamHI+PstI对载体质粒1300gusplus进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A.
Figure BDA0003418951580000074
Extraction kit(Omega，下同)回收10kb左右大小条带，得到1300gusplus线性片段。
BamHI+PstI双酶切反应体系如下：
表3酶切反应体系
Figure BDA0003418951580000072
酶切结果如图1中的右图所示。
(2)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒
Figure BDA0003418951580000073
连接CEPro722-676或CEPro722-1542片段到1300gusplus载体上，连接体系如下：
表4连接体系
Figure BDA0003418951580000081
连接程序：50℃，30min。
(3)转化：取步骤(2)的连接产物3μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入SOC培养基1ml，37℃220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(1300-722Pro-test-F和1300-722Pro-test-R)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(结果如图3所示，其中，M为Marker，CK-为1300gusplus骨架载体，0为酶切的1300gusplus骨架载体，ck1-ck4为未酶切的1300gusplus-722Pro-676重组质粒，1-4为酶切的1300gusplus-722Pro-676重组质粒，可切出大小约为676bp片段；ck5-ck8为未酶切的1300gusplus-722Pro-1542重组质粒，5-8为酶切的1300gusplus-722Pro-1542重组质粒，可切出大小约为1542bp片段)，保存菌株并送测序。得到的载体命名为1300gusplus-722pro-676和1300gusplus-722pro-1542，载体图谱见图4和图5。
引物序列：
1300-722pro-test-F：5’-CCACGGGTCTCGGTGTTGA-3’(SEQ ID NO.9)；
1300-722pro-test-R:5’-GCGAGCCCAACAAGAAATGC-3’(SEQ ID NO.10)。
实施例3
本实施例将CEPro722启动子转化至植物中制备相应的转基因植物，具体流程如下：
1、农杆菌转化及鉴定
取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μl实施例2中得到的测序正确1300gusplus-722Pro-676和1300gusplus-722Pro-1542质粒，2.5KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(1300-722Pro-test-F和1300-722Pro-test-R)菌液PCR验证(结果如图6所示，其中M为Marker，ck+为1300gusplus-722Pro-676或者1300gusplus-722Pro-1542重组质粒阳性对照，1-10为转1300gusplus-722Pro-676或者1300gusplus-722Pro-1542重组质粒农杆菌单克隆菌液样品，其扩增条带大小为612bp，大小正确)，可扩增得到约612bp的目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。
2、农杆菌介导遗传转化
(1)诱导：将中花11(ZH11)的种子经次氯酸钠消毒后置于诱导培养基(N6+2.4-D3mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L)上，28℃常温暗培养30-40d，得到诱导的愈伤后继代培养30-40d；
(2)筛选：将步骤1中得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化(1)中获得的愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，30℃暗培养30-50d，结果如图7所示，1300gusplus-722pro-676和1300gusplus-722pro-1542的农杆菌侵染后筛选的愈伤，可筛选获得抗性愈伤；
(3)分化：筛选获得的抗性愈伤转移至含50mg/L潮霉素的分化培养基上，分化25-30d获得阳性苗；
(4)生根：经分化获得的阳性苗转移至含50mg/L潮霉素的生根培养基上，生根7-15d最后获得阳性转基因植株；
(5)炼苗及移栽：将根系生长旺盛的转化株系开启瓶口封口膜，加无菌水覆盖培养基1-2cm厚，置于室温下与空气接触进行炼苗2-3d后，移栽至温室栽培。
3、转基因株系鉴定
为了鉴定步骤2获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。
首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH2O溶解DNA。
使用潮霉素引物(Hn-F/Hn-R)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因苗扩增获得片段大小为561bp。
引物序列如下：
Hn-F:5’-CTTAGCCAGACGAGCGGGTTC-3’(SEQ ID NO.11)；
Hn-R:5’-GCTTCTGCGGGCGATTTGT-3’(SEQ ID NO.12)。
以ZH11基因组DNA作为阴性对照，水为空白对照。PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。
PCR反应体系如下：
表5 PCR反应体系
Figure BDA0003418951580000101
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，结果表明，大部分转基因样品中含有561bp的转基因条带，与载体对照大小相同；而空白对照和阴性对照ZH11无法扩出条带。
实验例1
本实验例对实施例3得到的转基因株系进行进一步分析，具体如下：
1、植物组织GUS染色分析
使用GUS染色试剂盒(中科瑞泰，货号：RTU4032)进行染色分析，筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片和根染色也明显，后续对苗期叶片、种子进行GUS染色均染上色，结果如图9所示，图9显示CEPro722-676启动子与CEPro722-1542启动子驱动的GUS基因表达量较高。其中，阴性对照(ZH11)叶片各阶段组织均未染上色，阳性对照(转pC1301载体阳性株系)均染上色。
2、玉米中组织表达分析
利用实施例3中水稻类似的方法，获得玉米转基因植株，对各组织gus染色发现，玉米筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片、根、苗期叶片、种子进行GUS染色均染上色。可见CEPro722-676和CEPro722-1542启动子也可驱动GUS基因在玉米愈伤组织水平、根、苗期、成熟期叶片和种子中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。
3、小麦中组织表达分析
利用实施例3中水稻类似的方法，获得小麦转基因植株，对各组织gus染色发现，小麦筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片、根、苗期叶片、种子进行GUS染色均染上色。可见CEPro722-676和CEPro722-1542启动子也可驱动GUS基因在小麦愈伤组织水平、根、苗期、成熟期叶片和种子中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 一种CEPro722启动子及其应用
<130> KHP211119691.1
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 676
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtcgtggtc gtggagcagg agatgttctg gcccacgagc tttgattgat cgatcgatcg 60
ctgctttggt gtttgtatgt ggcgctggca ccatcctgca tggctgcaca tatatataca 120
cacatacata cagcacccag ctgactggag gcgatcaacg acgccacgcc ttgaaggaga 180
agattgtcat acaaatattg cagacgcaat ggctgacgtt tggcgaggag gatggttcgt 240
gtagggtcag gatctcggcg atcatgttag ggagagaatg catgggagag ggcacgggcg 300
tctcccagga tgccgccctc cagcggccgg catttcttgt tgggctcgcg aaggccaact 360
tgaactgcga gatctgtgcg tgactttctt tggaagcgga actccattcg cgagtattat 420
acttcctggg gttttacttc tgatgaccaa tactggaacg ggtcctgatc agccgattct 480
tctgcaagta aagtcagcaa ggtcacggta acttactaac ttaaatgtaa acaatgagca 540
ttttcactcc accctgcgta ttggctgggc acccttgcgg ccttgtttgg atatttaata 600
aactaattta catctcaatt tatcttaata cattagatga gtgcctgtac gttgcgacgg 660
gagtaaaaaa aattgt 676
<210> 2
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtcgtggtc gtggagcagg agatgttctg gcccacgagc tttgattgat cgatcgatcg 60
ctgctttggt gtttgtatgt ggcgctggca ccatcctgca tggctgcaca tatatataca 120
cacatacata cagcacccag ctgactggag gcgatcaacg acgccacgcc ttgaaggaga 180
agattgtcat acaaatattg cagacgcaat ggctgacgtt tggcgaggag gatggttcgt 240
gtagggtcag gatctcggcg atcatgttag ggagagaatg catgggagag ggcacgggcg 300
tctcccagga tgccgccctc cagcggccgg catttcttgt tgggctcgcg aaggccaact 360
tgaactgcga gatctgtgcg tgactttctt tggaagcgga actccattcg cgagtattat 420
acttcctggg gttttacttc tgatgaccaa tactggaacg ggtcctgatc agccgattct 480
tctgcaagta aagtcagcaa ggtcacggta acttactaac ttaaatgtaa acaatgagca 540
ttttcactcc accctgcgta ttggctgggc acccttgcgg ccttgtttgg atatttaata 600
aactaattta catctcaatt tatcttaata cattagatga gtgcctgtac gttgcgacgg 660
gagtaaaaaa aattgtatga aacatagaaa cgtaacaaga aacatcacta tgatatccaa 720
aattcgtgtg gtaaatatta tcaatatcac acaaattatt tataagagtc aatttagaat 780
tttgtaatga cagacaaatg tgtcgacaac tatacactaa tctaatcctt tttagcgata 840
ccgataagtc attgttgtat gtttgcaggg atgatacatc gacacaaatt gtcctcataa 900
cttaacagat caatcacaaa gttcattcga agaatctttg ctttctacat acaaacacat 960
aagagaacaa aacgtcaaat ttgtattatg taaccagaat gtatgtttga aaatgaaaca 1020
aatgtactat actcacccta ataaattcta ttcgtctatt attcccccac atggtcatag 1080
cttgtagcat gaggtagctg gtattaagcc tatagaataa tgtttggcca actatgttat 1140
atacaatgat tatcatagaa aaatttaaac tgctgagaag gtgatacgaa gaaaatacac 1200
tcttaagtca attggaacac cagtcctaat tatttgttcc cacttaaaaa tatcctctgc 1260
ccatcctgaa tgtttcttgt tgtaggcaat cttatatttc tgaggctatg ataatcgctt 1320
ccgcgaacct cctgtatgac atgtgcttat accaatcttg agtcggtgta aagtcgataa 1380
aagtcacgtg ctttttaaca tgatctatta caaaaagggt gtgacattca tgaatttcca 1440
tggcataaga acctgcaaag tattagtcat caggattgca aagaagtgcc ctttataaat 1500
acatttaaaa tgaacacata cttacatatc tacaccccgt ga 1542
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatctacca tggtaccgtg gatccggtcg tggtcgtgga gcag 44
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagcttgca tgcctgcaga caattttttt tactcccgtc gca 43
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agatctacca tggtaccgtg gatccggtcg tggtcgtgga gcag 44
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcttgca tgcctgcagt cacggggtgt agatatgtaa gtatg 45
<210> 7
<211> 2987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta 60
catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag 120
accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa 180
attcgagctc ggtagcaatt cccgaggctg tagccgacga tggtgcgcca ggagagttgt 240
tgattcacac gtgatggtga tggtgatggc tagcgttctt gtagccgaaa tctggaatgt 300
tggtccagcg ctcgcgaaag acgtgcgcgg cgagcttcgg cttgcggtca cgagtgaaca 360
cgcccttctt gtttccttgg acgcgcatca cgccctgaga ggtcgcgaag tccgcgaagt 420
tccacgcttg ctcacccacg aagttctcaa actcatcgaa cacgacgtgg ttcgcctggt 480
agtactcgac ttgatattcc tcggtgaaca tcactggatc aatgtcgtga aagcccgcaa 540
cggtgtctgc gccgtactca gtgatcatga tcggctttcc tgggcaacgc ttgttccacg 600
cgtgaaattc ctggcggaga tggactttgg ccgcttcgag atcaccgcca tcgaagtacc 660
atccgttata gcgattgagc gcgatgacgt caatcagttc ggcgactttg tccgtctccg 720
gggtagccat cacaaacagc acgatcgtga ccggacgctt ctgtgggtcg agttccttgg 780
tcagctccac caacggcttg aagtactcgt acgcgccctc ttcctcagtc gccgcctcgt 840
tggcgatgct ccacatcacg acgcttggat ggttcttgtc acgagacacc agttcacgga 900
gaacgtcttg atggtgctca aacgtccgaa tcttctccca ggtactgacg cgctcgctgc 960
cttcgccgag tcccgtggtg gccatgaagt tgaggtgcac gccaactgcc ggagtctcgt 1020
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gtgcggtccg gaagctgttg gcgccgatcc atttgaggat attgaaatcc atcacattgc 1140
tcgcttcgtt aaagccacgg ccgttgatag gagtgtcctc atgtttgcca aagcccttga 1200
agtagaacgg tttgttgttg atgaggaact tgccgtcgtt gacttccacg gtccgcacgc 1260
cgaacggctc ttcatagaca tcgatggtca gtccgtcgtt caccagttcc actttgatct 1320
ggtagagata cgtgttcagt ggttcccaga ggatgacatt cggaatctcc acgttaccgc 1380
tcaggccctc ggtgcttgcg accactttgc cttcctcatc cacgaccgac actttcacgg 1440
tctcggcttt gccttgaaag tccaccgtat aggtcacagt cccggttggg ccattgaagt 1500
cggtcacaac cgagatgtcc tcgacgtacg taaacggggt cgtgtagatt ttcaccggac 1560
ggtgcaggcc tgcatagttg aagaagtcga agttcggctt gttacgaatg acttttccga 1620
ggccctcttc gtggcgctcg ctgtacagcc ccaccgggag ggtgctatcg tcgaggatgt 1680
tgtccacggc gacggtgacg cgattcatgc catcacgcag cgagttgttg atttccgctt 1740
cgaatggcag gaatccgccc ttgtgctcca cgaccagctc accattgaca tagacaattg 1800
ctttgtgagt tgcagagccg aagcggagca cgatacgctg atccttcaga taggccggca 1860
ccgtgaactc acgttcgtac cagacatatc cgatatggtt gcggatttcc ttggtcacgc 1920
caatgtcatt gtaactgctt gggacggcca tactaatagt gtcggtcagc ttgctttcgt 1980
accacttctc ttccagtcct ttcccgtagt ccagcttgaa gttccagacg ccattgaggt 2040
cgaagacgcc acgggtctcg gtgttgatcg ggtacagact agttcgtcgg ttctgtaact 2100
atcatcatca tcatagacac acgaaataaa gtaatcagat tatcagttaa agctatgtaa 2160
tatttacacc ataaccaatc aattaaaaaa tagatcagtt taaagaaaga tcaaagctca 2220
aaaaaataaa aagagaaaag ggtcctaacc aagaaaatga aggagaaaaa ctagaaattt 2280
accctcagat ctaccatggt accgtggatc cggtcgtggt cgtggagcag gagatgttct 2340
ggcccacgag ctttgattga tcgatcgatc gctgctttgg tgtttgtatg tggcgctggc 2400
accatcctgc atggctgcac atatatatac acacatacat acagcaccca gctgactgga 2460
ggcgatcaac gacgccacgc cttgaaggag aagattgtca tacaaatatt gcagacgcaa 2520
tggctgacgt ttggcgagga ggatggttcg tgtagggtca ggatctcggc gatcatgtta 2580
gggagagaat gcatgggaga gggcacgggc gtctcccagg atgccgccct ccagcggccg 2640
gcatttcttg ttgggctcgc gaaggccaac ttgaactgcg agatctgtgc gtgactttct 2700
ttggaagcgg aactccattc gcgagtatta tacttcctgg ggttttactt ctgatgacca 2760
atactggaac gggtcctgat cagccgattc ttctgcaagt aaagtcagca aggtcacggt 2820
aacttactaa cttaaatgta aacaatgagc attttcactc caccctgcgt attggctggg 2880
cacccttgcg gccttgtttg gatatttaat aaactaattt acatctcaat ttatcttaat 2940
acattagatg agtgcctgta cgttgcgacg ggagtaaaaa aaattgt 2987
<210> 8
<211> 3853
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta 60
catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag 120
accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa 180
attcgagctc ggtagcaatt cccgaggctg tagccgacga tggtgcgcca ggagagttgt 240
tgattcacac gtgatggtga tggtgatggc tagcgttctt gtagccgaaa tctggaatgt 300
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cgcccttctt gtttccttgg acgcgcatca cgccctgaga ggtcgcgaag tccgcgaagt 420
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cggtcacaac cgagatgtcc tcgacgtacg taaacggggt cgtgtagatt ttcaccggac 1560
ggtgcaggcc tgcatagttg aagaagtcga agttcggctt gttacgaatg acttttccga 1620
ggccctcttc gtggcgctcg ctgtacagcc ccaccgggag ggtgctatcg tcgaggatgt 1680
tgtccacggc gacggtgacg cgattcatgc catcacgcag cgagttgttg atttccgctt 1740
cgaatggcag gaatccgccc ttgtgctcca cgaccagctc accattgaca tagacaattg 1800
ctttgtgagt tgcagagccg aagcggagca cgatacgctg atccttcaga taggccggca 1860
ccgtgaactc acgttcgtac cagacatatc cgatatggtt gcggatttcc ttggtcacgc 1920
caatgtcatt gtaactgctt gggacggcca tactaatagt gtcggtcagc ttgctttcgt 1980
accacttctc ttccagtcct ttcccgtagt ccagcttgaa gttccagacg ccattgaggt 2040
cgaagacgcc acgggtctcg gtgttgatcg ggtacagact agttcgtcgg ttctgtaact 2100
atcatcatca tcatagacac acgaaataaa gtaatcagat tatcagttaa agctatgtaa 2160
tatttacacc ataaccaatc aattaaaaaa tagatcagtt taaagaaaga tcaaagctca 2220
aaaaaataaa aagagaaaag ggtcctaacc aagaaaatga aggagaaaaa ctagaaattt 2280
accctcagat ctaccatggt accgtggatc cggtcgtggt cgtggagcag gagatgttct 2340
ggcccacgag ctttgattga tcgatcgatc gctgctttgg tgtttgtatg tggcgctggc 2400
accatcctgc atggctgcac atatatatac acacatacat acagcaccca gctgactgga 2460
ggcgatcaac gacgccacgc cttgaaggag aagattgtca tacaaatatt gcagacgcaa 2520
tggctgacgt ttggcgagga ggatggttcg tgtagggtca ggatctcggc gatcatgtta 2580
gggagagaat gcatgggaga gggcacgggc gtctcccagg atgccgccct ccagcggccg 2640
gcatttcttg ttgggctcgc gaaggccaac ttgaactgcg agatctgtgc gtgactttct 2700
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tcttatattt ctgaggctat gataatcgct tccgcgaacc tcctgtatga catgtgctta 3660
taccaatctt gagtcggtgt aaagtcgata aaagtcacgt gctttttaac atgatctatt 3720
acaaaaaggg tgtgacattc atgaatttcc atggcataag aacctgcaaa gtattagtca 3780
tcaggattgc aaagaagtgc cctttataaa tacatttaaa atgaacacat acttacatat 3840
ctacaccccg tga 3853
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccacgggtct cggtgttga 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcgagcccaa caagaaatgc 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cttagccaga cgagcgggtt c 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcttctgcgg gcgatttgt 19

Claims (10)

1.一种CEPro722启动子，其特征在于，所述CEPro722启动子包括如下任一核苷酸序列：
i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
ii)与i)互补的核苷酸序列；
iii)如i)所示的核苷酸序列经取代、缺失、增加一个或多个核苷酸序列得到的具有同等启动子功能的核苷酸序列。
2.一种引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增权利要求1所述的CEPro722启动子，所述引物对包括：如SEQ ID NO.3-4所示的引物对，和/或如SEQ ID NO.5-6所示的引物对。
3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求1所述CEPro722启动子，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
4.根据权利要求3所述生物材料，其特征在于，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒还包括功能基因和终止子；
所述功能基因优选为标记基因或植物农艺性状相关基因。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述CEPro722启动子、权利要求2所述引物对、或权利要求3所述生物材料中的一种或多种。
6.权利要求1所述CEPro722启动子，或权利要求2所述引物对，或权利要求3或4所述生物材料，或权利要求5所述试剂盒在制备转基因植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为将权利要求1所述CEPro722启动子构建至载体上，后转化至植物中。
8.权利要求1所述CEPro722启动子，或权利要求3或4所述生物材料在驱动基因在植物中表达中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述基因为功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因；
所述功能基因优选为植物农艺性状相关基因或标记基因。
10.根据权利要求6-10任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米中的一种或多种。
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