CN113151352B - 一种八倍体油菜转基因方法以及在基因编辑中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种八倍体油菜转基因方法以及在基因编辑中的应用，属于遗传育种技术领域。本发明首次建立八倍体油菜农杆菌介导的转基因方法，将基因编辑载体成功的转化到具有诱导能力的八倍体油菜中，并将具有基因编辑元件活性的花粉直接对母本授粉，进而直接对其进行基因编辑，克服了基因编辑对于遗传转化的依赖性，直接通过授粉的方式对难于进行遗传转化的育种材料进行基因编辑，获得染色体倍性和母本一致双单倍体材料，且获得突变体材料不含有转基因元件，突变效率高达100％。

Description

一种八倍体油菜转基因方法以及在基因编辑中的应用
技术领域
本发明属于遗传育种技术领域，尤其涉及一种八倍体油菜转基因方法及在基因编辑中的应用。
背景技术
油菜，甘蓝等十字花科作物是人们日常生活中最主要的油料和蔬菜作物。多倍体育种技术是一种利用人工杂交，化学诱变等方式获得多倍体新物种的方法。多倍体育种技术对于研究基因组多倍体化后作物器官发育，作物抗逆性和品质改变，以及染色体加倍对异源花粉杂交的影响具有重要的理论研究价值和育种应用前景。
我们前期通过人工杂交结合秋水仙素加倍的方式人工合成了新的油菜异源八倍体材料。田间种植中发现，新合成的油菜八倍体材料形态上和普通四倍体油菜有明显的差异，比如角果更宽，花粉活力强且具有对主要十字花科作物的双单倍体诱导能力。
基因编辑转基因技术是研究基因功能以及作物性状改良的重要工具。但对八倍体油菜转基因的方法还没有建立。到目前为止，只有一篇上世纪80年代发表的关于八倍体油菜组织培养再生的报道，但是否能够达到转基因的条件，还没有有效突破。这严重阻碍了油菜多倍体相关性状的功能研究。
此外，油菜和甘蓝等十字花科作物的基因编辑技术利用农杆菌介导的基因转化方法将基因编辑载体引入到植物细胞中，主要存在以下两个缺点：(1)农杆菌介导的基因转化方式存在基因型的依赖性，不同的转化受体材料转化能力和转化效率存在巨大差异；(2)农杆菌介导的遗传转化方式引入的大的片段插入，后期需要经过大量的筛选鉴定不含转基因元件的突变体材料。利用单倍体诱导系可以快速的创建基因组纯和的单倍体材料，加速育种进程。单倍体诱导系技术已经广泛的应用在玉米的育种项目中。此外，利用单倍体诱导系的花粉对母本授粉，诱导系的基因组会在授粉的过程中发生降解，不污染母本基因组，单倍体诱导系可以用来传递基因编辑元件，直接对母本的基因组进行编辑，然后通过人工加倍的方式获得不含转基因元件的突变体材料。玉米和小麦种的单倍体诱导系是利用MTL基因的突变获得，但存在以下不足：(1)应用范围狭窄，MTL基因只特异的存在于禾本科植物，不能通过基因编辑的方法在双子叶植物中应用；(2)诱导效率低，MTL单倍体诱导系在禾本科作物中的诱导率为1％到2％，后期筛选强度很大；(3)MTL单倍体诱导系产生的后代为单倍体材料，需要后期人工加倍才能获得可用的整倍体材料，耗时耗力；(4)难于进行遗传转化，只能通过杂交和回交的方式将基因编辑元件转移到诱导系中。
我们以基因编辑载体作为遗传转化的测试载体，成功建立了油菜八倍体遗传转化体系。并利用该遗传转化方法筛选到基因编辑元件发挥效应的转基因材料，使用该材料的花粉对十字花科作物授粉后发现，作为母本受体材料的基因组也产生定点的变异。因此，该方法可以有效规避组织培养对基因型的限制，直接通过授粉的方式对育种材料进行基因突变，可以加速基因编辑技术在育种材料应用的进程。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种八倍体油菜转基因方法以及在基因编辑中的应用。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种八倍体油菜转基因方法，该方法包括以下步骤：
(1)基因编辑载体构建；
(2)八倍体油菜种子预处理及灭菌；
(3)转化根癌农杆菌；
(4)遗传转化八倍体油菜。
进一步的，所述步骤(1)中基因编辑载体中含有基因编辑功能元件，基因编辑功能元件为CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1和prime editing中的任一种。
进一步的，所述步骤(4)中遗传转化八倍体油菜的步骤如下：
(1)无菌种植培养八倍体油菜种子；
(2)将八倍体油菜下胚轴切成小段，并将其转移到培养完成的农杆菌菌液中进行侵染试验；
(3)侵染完成后，对八倍体油菜下胚轴小段进行培养。
更进一步的，所述步骤(3)中培养过程如下：
(1)将无菌的八倍体油菜下胚轴小段转移到共培养培养基中，培养基配方为：4.0～4.5g/LMS粉末，15～25g/L甘露醇，30～40g/L蔗糖，6～9g/L琼脂糖，0.3～06mg/L激动素，pH＝5.8～6.2，60～90uM/L乙酰丁香酮，28℃培养36～72小时；
(2)将八倍体油菜下胚轴小段转移到诱导培养基中，培养基配方为：4.0～4.5g/LMS粉末，15～25g/L甘露醇，30～40g/L蔗糖，40～50mg/L抗生素，20～40mg/L硝酸银，300～600mg/L特美汀，6～9g/L琼脂糖，0.3～06mg/L激动素，pH＝5.8～6.2，60～90uM/L乙酰丁香酮，培养3～5周；
(3)将八倍体油菜下胚轴小段转移到分化培养基中，培养基配方为：4.0～4.5g/LMS粉末，0.3～0.6g/L木糖，10～20g/L葡萄糖，0.5～1g/LMES，0.3～0.6mg/L IAA，6～9g/L琼脂糖，30～60mg/L抗生素，1-3mg/L反式玉米素，pH＝5.8～6.2，培养2～3周；
(4)继代培养，使用的培养基同步骤(3)，直到产生分化的幼苗，幼苗长出后，并将其切小后，插入到生根培养基中，生根培养基：1/2MS粉末，0.01～0.05mg/LNAA，15～25g/L蔗糖，pH＝5.8～6.2，培养2～3周，然后转移到灭菌的营养土中炼苗生长。
本发明还提供了八倍体油菜转基因方法在遗传育种方面的应用，包括如下步骤：
(1)在油菜转基因后代中，鉴定筛选基因编辑元件具有活性的转基因植株，将之作为父本授粉材料；
(2)使用父本授粉材料的花粉对母本进行授粉，授粉后代鉴定染色体倍性与母本倍性一致的植株；
(3)与母本倍性一致的后代，通过分子标记、测序、性状鉴定筛选得到突变体植株。
进一步的，还包括步骤(4)鉴定不含转基因元件的突变体植株。
进一步的，所述步骤(1)中油菜转基因后代中含有基因编辑功能元件CRISPR/Cas9，从阳性转化系中筛选与非转基因对照相比Cas9表达量升高的转基因系作物授粉父本材料。
进一步的，所述步骤(2)中的母本为十字花科作物。
进一步的，所述油菜材料为具有诱导能力的油菜。
在一个实施例中，通过构建靶基因的规律成簇间隔短回文重复(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9,CRISPR/Cas9)基因编辑载体，采用农杆菌遗传转化方法，将基因编辑载体转化到具有诱导能力的八倍体油菜中，鉴定八倍体油菜CRISPR/Cas9基因编辑载体阳性转化系，利用流式细胞仪观察和PCR鉴定技术获得了具有基因编辑元件活性的转基因株系，成功的建立了八倍体油菜农杆菌介导的基因编辑载体遗传转化方法。
在一个实施例中，利用八倍体转基因油菜花粉直接对十字花科作物(甘蓝，甘蓝型油菜为例)进行基因编辑的方法，使用转基因八倍体油菜，作为杂交的父本，分别以甘蓝和甘蓝型油菜为例，对十字花科作物授粉，获得了不含转基因元件的甘蓝和甘蓝型油菜突变体材料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
八倍体油菜基因编辑载体遗传转化技术还未有报道，更没有利用八倍体油菜对十字花科作物进行基因编辑的报道。本发明首次建立了八倍体油菜农杆菌介导的转基因方法，为八倍体油菜基因功能研究和育种应用提供了方法支撑。此外，我们以八倍体油菜基因编辑载体转基因系作为媒介，传递基因编辑元件，直接对母本受体进行基因编辑，其具有以下优点：(1)克服了基因编辑对于遗传转化的依赖性，可以直接通过授粉的方式对难于进行遗传转化的育种材料进行基因编辑；(2)不需要进行人工加倍，直接获得染色体倍性和母本一致双单倍体材料；(3)获得突变体材料不含有转基因元件；(4)突变效率高达100％。
附图说明
图1为本发明的试验流程图。
图2a为实施例1中八倍体油菜Y3380的下胚轴小段在共培养培养基中的培养图。
图2b为实施例1中八倍体油菜Y3380的下胚轴小段在分化培养基中的培养图。
图2c为实施例1中八倍体油菜Y3380遗传转化再生的幼苗在1/2MS培养基中的培养图。
图2d为实施例1中八倍体油菜Y3380遗传转化再生的幼苗移栽到土中的生长图。
图2e为实施例1中八倍体油菜Y3380遗传转化再生的幼苗角果图。
图3为实施例2中用F和R引物鉴定筛选不含转基因元件的PCR扩增图。
图4为实施例2中利用Hi-tom方法检测B-1至B-9的突变结果图。
具体实施方式
以下实施例中所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均可购买得到。本发明以CRISPR/Cas9基因编辑载体为例，建立了八倍体油菜转基因方法，筛选到具有基因编辑元件活性的转基因株系，并以编辑甘蓝BoFAD2基因和甘蓝型油菜BnFAD2为例，将八倍体油菜转基因系应用到十字花科作物的基因编辑中，该方法可用于八倍体油菜的基因编辑以及以甘蓝和甘蓝型油菜为代表的十字花科作物的基因编辑。
实施例1
八倍体油菜遗传转化基因编辑载体
(1)基因编辑载体构建
根据甘蓝型油菜基因组数据库(https://wwwdev.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)提供的油菜FAD2基因的DNA序列，结合基因编辑靶点设计网站(http://cbi.hzau.edu.cn/)设计sgRNA靶点，两个靶点序列分别为：SgRNA1:GACGCCACCATTCCAACAC(SEQ ID NO.1)，SgRNA2:ACTTAGCCTTCAACGTCTC(SEQ ID NO.2)，载体构建步骤参照[Li,C.,Hao,M.Y.,Wang,W.X.,Wang,H.,Chen,F.,Chu,W.,...Hu,Q.(2018).An Efficient CRISPR/Cas9 Platform for Rapidly Generating Simultaneous Mutagenesis of MultipleGene Homoeologs in Allotetraploid Oilseed Rape.Frontiers in Plant Science,,9.]。使用引物U6-26p-F:TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC(SEQ ID NO.3)测序，挑选成功构建的载体。
(2)八倍体油菜种子预处理及灭菌
在超净工作台中，用无菌水配置11％的氯化钠溶液，选取颗粒饱满的诱导系种子，放入氯化钠溶液中轻轻晃动5分钟，然后用无菌水漂洗5遍，用灭菌滤纸吸干水分后，放入烘箱，45摄氏度,干燥5-8个小时。
种子灭菌程序为：75％酒精消毒5-6分钟分钟，1.5％的升汞消毒8-10分钟，无菌蒸馏水冲洗8次。将清洗好的种子种植于1/2MS无菌培养基中，25摄氏度黑暗培养8天。
(3)转化根癌农杆菌
将测序成功的载体菌液采用液体LB培养基过夜培养(10小时)，采用常规方法提取质粒DNA，使用Nanodrop测定质粒DNA浓度，一般应在200ng/ul以上，提取合格的质粒DNA用于转化根癌农杆菌GV3101菌株。
具体操作如下：从超低温冰箱中取出农杆菌GV3101感受态细胞，放置于冰上，让其自然解冻；使用无菌枪头，向感受态细胞加入2ul阳性质粒DNA，冰浴10min；迅速放入液氮中6min，然后37℃水浴6min后放于冰上；加入300ul不含抗生素的液体LB培养基，28摄氏度200rpm振荡培养1.5小时；用无菌枪头吸取取150ul菌液均匀涂于添加抗生素的LB固体培养基上，添加的抗生素及其浓度分别为50mg/L利福平，50mg/L庆大霉素，50mg/L卡那霉素；将涂布好的培养皿放置于28摄氏度培养箱中，培养2天；用无菌枪头挑取阳性农杆菌克隆，加10％甘油保存于超低温冰箱。
(4)遗传转化八倍体油菜
①待无菌的八倍体油菜幼苗子叶靠近玻璃瓶顶部时，从超低温冰箱中取出甘油保存的阳性农杆菌菌株，LB平板划线，28摄氏度培养1天，即可用于农杆菌侵染实验。
②用无菌枪头吸取少量农杆菌菌体，加入到液体侵染培养基中，农杆菌侵染培养基成分为：4.2g/L MS粉末，15g/L蔗糖，pH＝6.2，100uM/L乙酰丁香酮，28摄氏度，200rpm振荡培养20分钟，OD600约为0.8。在农杆菌培养的同时，用锋利的手术刀片将暗培养的诱导系下胚轴切成约0.5厘米的小段，然后将这些下胚轴小段转移到培养完成的农杆菌菌液中，28摄氏度，侵染20分钟。侵染完成后，将液体菌液沥出。
③将八倍体油菜下胚轴小段转移到共培养培养基中，培养基配方为：4.2g/L MS粉末，20g/L甘露醇，35g/L蔗糖，8g/L琼脂糖，0.5mg/L激动素，pH＝6.2，80uM/L乙酰丁香酮。28摄氏度培养48小时，结果如图2a所示。
④将八倍体油菜下胚轴小段转移到诱导培养基中，培养基配方为：4.2g/LMS粉末，20g/L甘露醇，35g/L蔗糖，50mg/L卡拉霉素，30mg/L硝酸银，500mg/L特美汀，8g/L琼脂糖，0.5mg/L激动素，pH＝6.2，80uM/L乙酰丁香酮。培养4周。
⑤将八倍体油菜下胚轴小段转移到分化培养基中，培养基配方为：4.2g/L MS粉末，0.5g/L木糖，15g/L葡萄糖，0.8g/L MES，0.5mg/L IAA，8g/L琼脂糖，50mg/L卡拉霉素，2mg/L反式玉米素，pH＝6.2，培养结果如图2b所示。
⑥继代培养，使用的培养基同步骤⑤，直到产生分化的幼苗。幼苗长出后，用锋利的手术刀片切小后，插入到1/2MS培养基中培养生根，如图2c所示，然后转移到灭菌的营养土中，如图2d所示。
(4)筛选具有基因编辑元件活性的八倍体转基因油菜
取幼嫩的八倍体油菜转基因植株叶片，用CTAB法提取基因组DNA。用F:GGCAGGAGGACTTCTACCCT(SEQ ID NO.4)，R：TCAGCTGCATGAAATTGCGG(SEQ ID NO.5)引物初步筛选阳性的转化植株。
提取阳性植株RNA，反转录后，用以上F和R引物检测Cas9蛋白的表达量，鉴定Cas9表达量升高的的八倍体油菜转化植株。使用流式细胞仪从Cas9高表达(与非转基因对照相比)的材料中鉴定筛选八倍体再生材料，命名为转基因八倍体油菜。以上结果表明：基因编辑载体已经成功转化到油菜基因组，并且基因编辑元件已经发挥作用，其中遗传转化再生的油菜角果如图2e所示。
实施例2
利用八倍体转基因油菜花粉直接对十字花科作物(甘蓝，甘蓝型油菜为例)进行基因编辑的方法，包括以下步骤：
(1)杂交
种植转基因八倍体油菜，作为杂交的父本；同时种植需要基因编辑的甘蓝(比如甘蓝X1)和甘蓝型油菜育种材料(如中双11号，中双9号，中双7号等)，作为杂交的母本。甘蓝开花时间较甘蓝型油菜一般晚4到5周左右，应该提前种植。开花期，对需要基因编辑的母本育种材料提前人工去雄，用转基因八倍体油菜的花粉对甘蓝X1和油菜中双7号分别进行人工授粉，标记后，套袋防止外援花粉的污染，收获杂交F1代种子。(2)鉴定发生基因编辑的双单倍体后代
种植F1杂交后代，4周左右取幼嫩叶片，用CTAB法提取基因组DNA，用(4)中的F和R引物筛选阴性植株，结果如图3所示，其中条带的大小1000bp，在阳性对照中有明显的条带，而在阴性对照和F1杂交后代B-1至B-9中没有条带，表明B-1至B-9植株中不含有转基因元件。Fad2基因A03，C01和C05拷贝的第一个靶点检测的正向引物为：Fad-A03/C01/C05-sg1-F：ggagtgagtacggtgtgcTCTTCCACT CCTTCCTCCTCGTC(SEQ ID NO.6)；Fad2基因A03，C05拷贝第一个靶点反向检测的反向引物为：Fad-A03/C05-sg1-R:gagttggatgctggatggTCTTGGGGACAAACACTTCGTC(SEQ ID NO.7)；Fad2基因C01拷贝第一个靶点反向检测的反向引物为：Fad-C01-sg1-R:gagttggatgctggatggTCTT GGGGACGAACACTTCATC(SEQ ID NO.8)；Fad2基因A03和C05拷贝的第二个靶点检测的正向引物为：Fad-A03/C05-sg2-F:ggagtgagtacggtgtgcGTACCTCAACAACCCTTTGGGA(SEQ ID NO.9)；Fad2基因C01拷贝的第二个靶点检测的正向引物为Fad-C01-sg2-F:ggagtgagtacggtgtgcCGGAAA GTACCTCAACAACCCG(SEQ ID NO.10)；Fad2基因A03和C05拷贝的第二个靶点检测的反向引物为：Fad-A03/C05-sg2-R:gagttggatgctggatggGTTGTAGATGGGAGCGTTGGG(SEQ ID NO.11)；Fad2基因C01拷贝的第二个靶点检测的反向引物为：Fad-C01-sg2-R:gagttggatgctggatggGTTGTAGATGGGAGC GTTCGG(SEQ ID NO.12)。样品采用Hi-Tom混合测序法筛选鉴定杂交F1后代B-1至B-9中的基因突变，结果如图4所示，图4中WT为野生型对照的序列信息，Allelle1和Allelle2为突变的序列信息，百分比是编辑效率，可知共鉴定得到的9株杂交F1后代中均发现了突变，因此突变效率为100％。采用Bnapus 50K Illumina Infinium SNP array检测发生突变的双单倍体植株与母本植株的遗传相似性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种八倍体油菜转基因方法以及在基因编辑中的应用
<130> 2021.5.6
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gacgccacca ttccaacac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
acttagcctt caacgtctc 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tgtcccagga ttagaatgat taggc 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ggcaggagga cttctaccct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tcagctgcat gaaattgcgg 20
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ggagtgagta cggtgtgctc ttccactcct tcctcctcgt c 41
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gagttggatg ctggatggtc ttggggacaa acacttcgtc 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gagttggatg ctggatggtc ttggggacga acacttcatc 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ggagtgagta cggtgtgcgt acctcaacaa ccctttggga 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ggagtgagta cggtgtgccg gaaagtacct caacaacccg 40
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gagttggatg ctggatgggt tgtagatggg agcgttggg 39
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gagttggatg ctggatgggt tgtagatggg agcgttcgg 39

Claims (4)

1.一种八倍体油菜转基因方法在遗传育种方面的应用，其特征在于，所述八倍体油菜转基因方法包括以下步骤：
（1）基因编辑载体构建；
（2）八倍体油菜种子预处理及灭菌；
（3）转化根癌农杆菌；
（4）遗传转化八倍体油菜；
所述步骤（1）中基因编辑载体中含有基因编辑功能元件，基因编辑功能元件为CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1和prime editing中的任一种；
所述步骤（4）中遗传转化八倍体油菜的步骤如下：
①无菌种植培养八倍体油菜种子；
②将八倍体油菜下胚轴切成小段，并将其转移到培养完成的农杆菌菌液中进行侵染试验；
③侵染完成后，对八倍体油菜下胚轴小段进行培养；
所述应用包括如下步骤：
a.在油菜转基因后代中，鉴定筛选基因编辑元件具有活性的转基因植株，将之作为父本授粉材料；
b.使用父本授粉材料的花粉对母本进行授粉，授粉后代鉴定染色体倍性与母本倍性一致的植株；
c.与母本倍性一致的后代，通过分子标记、测序、性状鉴定筛选得到突变体植株；
d.鉴定不含转基因元件的突变体植株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤a中基因编辑功能元件为CRISPR/Cas9时，油菜转基因后代中含有基因编辑功能元件CRISPR/Cas9，从阳性转化系中筛选与非转基因对照相比Cas9表达量升高的转基因系作物授粉父本材料。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤b中的母本为十字花科作物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编辑功能元件为CRISPR/Cas9时，设计2个sgRNA靶点，序列分别为：SgRNA1: GACGCCACCATTCCAACAC，SgRNA2:ACTTAGCCTTCAACGTCTC。
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