CN109182373A - 一种利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用基因编辑技术培育高油酸油菜的方法，具体是利用CRISPR/Cas9系统对FAD2基因进行定点编辑从而得到转基因油菜植株，具体包括以下步骤：(1)选择FAD2基因的两个gRNA的靶位点分别为S1和S2，并合成构建载体相关引物；(2)双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建；(3)抽提质粒，转化农杆菌；(4)利用农杆菌介导转化，将表达载体转入油菜，筛选获得FAD2基因发生突变的转基因植株。所述转基因油菜植株相比于野生型油菜植株含油量显著增高。而且本发明提供的方法有比较高的编辑效率，具有良好的应用前景。

Description

一种利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型 油菜FAD2基因进行编辑，进而获得高油酸含量的油菜品种。
背景技术
甘蓝型油菜(Brassica napus L.,2n＝38，AACC)为十字花科芸薹属植物，是我 国种植面积最大的油料作物。经过长期自然选择和人工选择，甘蓝型油菜的农艺 性状也在不断向更适应人类日常需求的方向进行定向的改良。良好的甘蓝型油菜 农艺性状主要包括高含油量、高不饱和脂肪酸含量、低硫甙、低芥酸、抗逆以及 良好的株型等。其中，具有低芥酸、低硫甙的“双低”性状油菜培育是近年来甘蓝 型油菜育种的研究热点。另外，“双低”油菜的菜籽油中包括了油酸、亚油酸等优 良不饱和脂肪酸的组分，优良品种中油酸含量甚至可以高达80％。品质优良的 甘蓝型油菜对国民经济的增长以及国民生活质量的提升都具有至关重要的作用， 而优良脂肪酸含量的菜籽油对人类心血管健康非常有利。在人体的健康功效方面， 高油酸菜籽油能够良好的调节人体内脂质代谢，维持心脑血管功能的正常进行， 促进人体内消化吸收，降低人体内胆固醇，甘油三酯等含量，从而进一步控制血 糖含量，对青少年智力发育、人体免疫、骨质形成等方面都有良好的促进作用。 因此，高油酸菜油被认为是与橄榄油、葵花籽油相媲美的高级食用类植物油。因 此，培育高油酸低亚麻酸甘蓝型油菜是油菜品质育种工作的重要目标。
前人研究表明抑制脂肪酸脱氢酶(fatty acid desaturase-2，FAD2)基因表达从而 降低种子中脂肪酸脱氢酶的活性，便能抑制油酸向亚油酸转化，以使种子中的 油酸增加。官春云等通过对甘蓝型油菜进行辐射诱变的方法，获得了油酸含量 高达93.5％的高油酸材料，通过对高油酸材料基因序列与公布的甘蓝型油菜基 因组序列进行比对发现，在FAD2基因270bp处出现碱基的替换，从而形成终 止密码子，使FAD2基因不再具有功能性。陈苇等通过RNAi方法阻碍FAD2 基因的功能，以此得到的材料油酸量高达83.9％。
CRISPR/Cas系统是一种最新基因编辑技术。该技术不仅对基因功能的研究 提供了新思路，更广泛的应用于生物医药的研发和农作物的遗传改良等领域。随 着该系统进行一系列特异性改造，被迅速应用到拟南芥、水稻、玉米、小麦等植 物中。CRISPR/Cas9基因编辑技术不仅能够快速、便捷的实现基因的靶向突变， 更能高效的聚合作物某些优良农艺性状，为作物育种提供创新高效的新途径。
经检索，未发现利用CRISPR/Cas9技术调节甘蓝型油菜油酸含量的报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，在甘蓝型油菜中初步建立稳 定高效的CRISPR/Cas9体系，通过对甘蓝型油菜进行基因定点突变，创建高油 酸油菜新材料。
本发明选择对目的基因A5FAD2进行定点的突变，所述基因A5FAD2的序 列信息从Darmor-bzh49参考基因组数据库(Chalhoub et al 2014, http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中提取，用Geneious软件比对生成。
本发明提供了一种利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，具体是利用CRISPR/Cas9系统对A5FAD2基因进行定点编辑从而得到转基因油菜植株，主 要包括以下步骤：
1.gRNA靶点选择：登录到网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/筛选靶点，选 取靶位点S1和S2，所述S1序列为：5'-TACCGCTACGCTGCTGTCCA-3'(SEQ ID No.1)， 所述S2序列为：5'-CTCCTTGGACAGCAGCGTAG-3'(SEQ ID No.2)。
2.根据所设计的靶位点合成构建载体相关引物，见表1：
表1 CRISPR/Cas9载体靶点接头引物
3.双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建程序(图1)，具体如下：
(1)gRNA表达盒组装：以高保真酶稀释100倍的pCBC-DT1T2为模板进 行四接头引物(表1)PCR扩增并纯化回收PCR产物。
(2)靶点与载体组装：同时用Bsa酶切步骤(1)中的扩增产物与 CRISPR/Cas9载体PKSE401，T4连接酶组装最终载体。
(3)转化大肠杆菌感受态，Kan板筛选，菌落PCR鉴定。
4.步骤3中鉴定为正确的单克隆，抽提质粒，转化农杆菌，测序后筛选含 有Cas9和靶位点的单克隆，得到装载FAD2基因靶位点S1和S2的CRISPR/Cas9 表达载体PKSE401菌种，-80℃保菌。
5.利用步骤4得到的农杆菌介导油菜转化，将表达载体转入油菜，筛选获 得FAD2基因发生突变的转基因植株。
优选的，步骤3所述高保真酶为 Max Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞公司)。
优选的，步骤4所述农杆菌类型为GV3101。
优选的，步骤5所述油菜为甘蓝型油菜。
优选的，步骤5所述农杆菌介导转化的部位为油菜下胚轴。
实验结果证明，通过CRISPR/Cas9基因技术编辑后，A5FAD2基因突变， 编辑类型主要以单碱基替换和单碱基缺失为主，而且得到的转基因油菜植株与野 生型植株相比，油酸含量显著增加。
本发明的有益效果是：提供了能增加油菜含油量的CRISPR/Cas9系统的靶 标序列S1和S2，该靶位点可以定点编辑FAD2基因且具有比较高的编辑效率； 通过CRISPR/Cas9系统可以不同程度的提高多种甘蓝型油菜的含油量，为高油 酸含量的油菜品质育种工作提供了一种全新的途径，具有良好的应用前景。
附图说明
图1双靶点CRISPR/Cas9双元表达载体；RB:右边界；LB：左边界； U6-26p-SpR-gRNA-Sc-U6-26t：sgRNA表达元件组，包括启动子U6-26p， gRNA-Sc:gRNA骨架结构，U6-26t终止子，2X35Sp：2倍的CaMV35启动子， zCas9：根据玉米密码子优化后的Cas9，Kan：卡那霉素抗性基因。
图2 FAD2突变单株相对于非转基因受体材料种子中油酸含量比较图(“**” 表示与非转基因受体材料对照相比在0.01水平上差异极显著)。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用 以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：转基因油菜植株的获得
无菌受体材料的准备：选取饱满、干净的甘蓝型油菜ZY50，627R和DT共 15粒油菜种子用76％乙醇浸泡3min，然后在0.1％升汞中灭菌15min，无菌水冲 洗4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，接种于发芽培养基上，25-28℃下置于纸 盒子中暗培养一周。其中种子萌发培养基为：MS培养基+琼脂粉6.0～8.0g/L， pH值为5.8～6.0。
供体菌株培养：取出-80℃长期保存的菌种管，置于冰上，在无菌条件下， 用接种针刮取冻结的培养物表面，迅速把黏附在接种针上的农杆菌划线于含 50mg/L卡那霉素(Kan)+50mg/L硫酸庆大霉素(Gen)+50mg/L利福平(Rfi) 的LB琼脂平板表面。将接种的琼脂平板在28℃下暗培养36-48h。用灭菌的牙 签从琼脂平板上挑取生长良好的单菌落，接种到液体LB培养基(加入50mg/L Kan+50mg/L Gen+50mg/L Rfi)中，28℃振荡培养(200r/min)过夜(16～18h)， 使农杆菌培养至对数生长期，OD600值达0.4左右。
外植体的制备及侵染：吸2mL培养好的菌液到无菌离心管中，3000rpm 3min 离心，弃上清；加2mL DM悬浮，3000rpm 3min离心，弃上清；再2mL DM(AS+) 悬浮，放4℃冰箱备用。在无菌平皿中加入18mL DM，用无菌剪刀剪取幼苗下 胚轴到该平皿中，每个外植体长度约为0.8cm。切取外植体时尽量一刀垂直切下， 每皿大概180个外植体。在切好的外植体皿中倒入刚才准备的2mL DM菌液， 浸染10min，2min摇晃一次，当侵染8min时开始用移液器吸掉DM菌夜，用无 菌镊子夹取外植体到无菌滤纸上放置片刻，再转到M1培养基中，外植体暗光下 24℃放置(放在光照培养室避光处即可)。其中DM培养基成分：MS培养基+30g/L 蔗糖，pH值为5.80-6.0，高温灭菌后温度降低为50℃加入1ml的100μmol/ml浓 度的乙酰丁香酮(AS)。M1培养基成分：MS培养基+30g/L蔗糖+甘露醇16～ 20g/L+2,4-D 0.8～1.2mg/L+Kinetin 0.25～0.35mg/L+琼脂粉6g/L，pH值为5.8～6.0。
外植体与农杆菌的共培养：外植体与农杆菌共培养36h-48h后将外植体转到 M2培养基中，培养时间过长会导致外植体被农杆菌降解死亡，变得软蔫、出水， 所以培养时间尽量不超过48h，控制在36h左右为宜。M2培养基成分是MS培 养基+蔗糖28～32g/L+甘露醇16～20g/L+2,4-D 0.8～1.2mg/L+Kinetin 0.25～ 0.35mg/L+琼脂粉6g/L，pH值为5.8～6.0；高温灭菌后温度低至50℃后加入特美 汀抑菌剂(TMT)终浓度为300mg/L，卡那霉素(Kan)终浓度50mg/L，AgNO3终浓度为5mg/L。
诱导愈伤培养：将M1上的外植体依次转移至M2培养基中并摆放整齐，放 置光照培养室中培养20天左右，若中间出现长菌的情况则及时对外植体进行转 皿处理。
诱导出芽培养：挑选M2中变绿的外植体转移至M3培养基中并摆放整齐， 放置光照培养室中培养每2-3周可继代一次，直到出现绿芽，若中间出现长菌的 情况则及时对外植体进行转皿处理，用刀将愈伤组织分化出的芽组织从其与愈伤 的粘合处切下，放置于新的M3培养基长，直至芽生长到1-2cm。M3培养基的 成分：MS培养基+葡萄糖8.0～12g/L+木糖0.23～0.27g/L+MES 0.5～0.7g/L+ 反式-Zeatin 1.8～2.2mg/L+IAA 0.08～0.12mg/L+琼脂粉5.8～6.2g/L，pH值为 5.8～6.0；高温灭菌后温度低至50℃后加入特美汀抑菌剂(TMT)终浓度为 300mg/L，卡那霉素(Kan)终浓度50mg/L，AgNO3终浓度为5mg/L。
生根培养：将有完整生长点的绿芽转入M4生根培养基中长大生根，再进行 移栽，得到T0代甘蓝型油菜植株。其中M4培养基成分：MS培养基+蔗糖8～ 12g/L+琼脂粉8～12g/L，pH值为5.8～6.0。
实施例2：转化植株的DNA提取程序
采用CTAB小样法提取实施例1中得到的T0代油菜叶片中的DNA。具体 的包括以下步骤：
(1)用写好编号的2mL离心管取少量油菜的幼嫩叶片；
(2)将取好样的离心管置于冰上，打开盖子加入干净的钢珠和100μL 2％ 的CTAB溶液，盖好盖子后置于磨样机适配器(TissulyserⅡ,QIAGEN)研 磨(28times/s,30s)；
(3)待样品磨碎后取出离心管，打开盖子，倒出钢珠，再加入300μL CTAB 溶液；
(4)将离心管置于离心盒板上，置于55℃-60℃的恒温水浴锅中水浴 50min-60min，每10min轻轻摇晃1次，水浴完后置于工作台上冷却至室温；
(5)在通风橱中加入等体积(400μL)24:1(三氯甲烷与异戊醇按24:1 的体积比配制的溶液)，轻轻摇晃10min-15min，再置于离心机中12000r/min 离心10min；
(6)将离心好的离心管小心取出置于操作板上，利用移液器吸取200μL 的上清液转至与原编号相同的1.5mL离心管(预先加入上清液1/10体积的 3mol/L的NaAc溶液)，加入两倍体积(400μL)的在-20℃冰箱冰冻过夜的 无水乙醇，静置30min；
(7)如果1.5mL离心管中析出的DNA絮状物较大，则可以直接用枪头挑 出DNA，倒出酒精后再将DNA放回到离心管底部；如果1.5mL离心管中析 出的DNA絮状物较少，则可以置于离心机中8000r/min离心2min后再倒出 酒精；
(8)加入76％(无水乙醇与ddH2O的体积比)酒精洗涤DNA，上下颠 倒使得DNA充分洗涤，再将离心管置于离心机中8000r/min离心2min后倒 出76％酒精，重复上述步骤1次；
(9)将DNA置于管底，室温下吹干(一般过夜)；
(10)加入100μL-200μL的ddH2O室温溶解(如果急用，可放入37℃恒温 箱中2h，然后摇匀即可)，溶解好的DNA长期保存需要放置于-20℃的冰箱 中。
以进行遗传转化得到的单株提取出的基因组DNA为模板，质粒为阳性对照， 未进行遗传转化的受体材料基因组DNA及ddH2O为阴性对照。
引物设计为载体特异序列，PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，以2K Plus DNAMarker(Transgen)作为对照，使用1×TAE缓冲液(0.04M Tris acetate, 0.01M EDTA,pH8.0)，电压18V/cm，电泳10min，反应体系在PCR仪上进行。 设计扩增反应体系如表2所示：
表2 常规PCR反应
引物序列如下：
545PKSE-Cas9-1171/2315F：5'-GGGACCTACCACGATCTCCT-3'(SEQ ID No.7)
545PKSE-Cas9-1171/2315R：5'-CCCTTCTGCGTGGTCTGATT-3'(SEQ ID No.8)
实施例3.转基因阳性单株的FAD2基因编辑位点检测
对两对阳性检测引物都有目标条带的转基因阳性单株的基因组DNA进行编 辑检测。首先利用PCR产物相互部分重叠的引物(表3)对转基因阳性单株中 FAD2基因的拷贝进行目标区段的扩增。采用高保真度的PMSFDNA聚合酶 (Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase,Vazyme)进行目标区段的扩增， Max中添加了在常温下能够抑制其5’→3’聚合酶活性和3’→5’外 切酶活性的两种单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。该酶具有5’→3’ 聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，扩增产物为平端。根据表4中PCR反应配制方法完成对目标片段的扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后将有 条带的PCR产物进行测序，测序序列用Geneious软件进行分析，测序引物为 AFCS1-1，反应程序见表4。
对扩增后PCR产物进行测序分析，并利用Geneious软件对测序结果与野生 型FAD2基因的核酸序列进行比对，比对靶位点处出现差异的单株为疑似编辑单 株，可挑选出做进一步的TA克隆验证。对FAD2基因在T0代收获的164株阳 性单株中进行编辑检测后发现有118株靶位点处或靶位点上下游处存在编辑的 情况，编辑效率为72％。根据单克隆测序结果进一步对突变类型进行统计分析， 结果表明编辑类型主要以单碱基替换和单碱基缺失为主，其中1bp的缺失占全部 编辑单株的58.5％，1bp的插入为6.8％，缺失碱基长度在2bp以上的单株占全部 编辑单株的6.7％。
表3 扩增FAD2基因靶位点所用引物
表4 高保真酶PCR反应程序
实施例4.油菜种子脂肪酸含量检测
采用气相色谱仪测定实施例1获得的T0代油菜种子中脂肪酸含量，主要测 定油菜种子中7种主要的脂肪酸：棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、 亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、二十碳烯酸(C20:1)和芥酸(C22:1)。采用的方法 为乙醚石油醚法测定单粒/半粒油菜种子，具体如下：
(1)选取饱满的单粒油菜种子放入研钵中挤压至挤出黄色子叶；半粒样： 用刀片切取1/8-1/4不带胚的油菜种子，放人10mL离心管中(带胚部分保存 备用)；
(2)将磨好的种子放入2mL离心管中，加入乙醚-石油醚，0.5mol/L氢氧 化钾-甲醇各800μL，静置1h；
(3)加入400μL ddH2O，静置15min，吸取500μL上清至进样瓶，注意 不要吸到下方油层，若吸取的上清液不足500μL，可加入乙醚石油醚溶液进 行补充。
(4)参考进样量：0.3-0.5μL
结果表明(图2)，其中编号为FT29的以DT为受体材料A5FAD2靶基因杂 合突变体单株油酸含量最高可达82.12％±1.01％，而在相同环境下生长的非转基 因受体材料DT油酸含量仅为54.21％±1.79％，突变单株相对于非转基因受体材 料而言油酸含量增幅为51.50％，达到极显著水平(P＝0.000072)。编号为7R86 的以627R受体材料A5FAD2靶基因杂合突变体单株油酸含量最高可达 79.51％±2.65％，而在相同环境下生长的非转基因受体材料627R油酸含量为 62.19％±3.39％，突变单株相对于非转基因受体材料而言油酸含量增幅为27.85％， 达到极显著水平(P＝0.000142)。编号为ZY148的以ZY50受体材料中A5FAD2 靶基因杂合突变体单株油酸含量最高可达76.61％±2.81％，而在相同环境下生长的非转基因受体材料ZY50油酸含量为64.45％±3.19％，突变单株相对于非转基 因受体材料而言油酸含量增幅为18.87％，达到极显著水平(P＝0.000656)。收获 所有的转FAD2靶基因A5位点的突变体单株种子中油酸的含量变化范围为 63.40％-83.13％，而非转基因受体材料中油酸含量范围为53.89％-65.58％，实验 结果证明，对甘蓝型油菜A5FAD2靶基因实行定点突变后，能够显著增加油菜 种子中油酸的含量。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其 它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利 要求的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉市农业科学院
<120> 一种利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法
<130> 2018-9-18
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taccgctacg ctgctgtcca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctccttggac agcagcgtag 20
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacctacgct gctgtccaag gacaatctct tagtcgactc tac 43
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attattggtc tcgaaaccta cgctgctgtc caaggacaa 39
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggacctacc acgatctcct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccttctgcg tggtctgatt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtacctcaa caaccctttg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtagtctct gtcaacggtg 20
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggatccat gggcgcaggt ggaagaat 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagagctctc ataacttatt gttgtaccag 30
<210> 13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccgctacg ctgctgtcca agg 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttggacag cagcgtagcg gta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagaccttac gacggcggc 19

Claims (9)

1.一种利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9系统对FAD2基因进行定点编辑从而得到编辑后的油菜植株，具体包括以下步骤：
步骤S1、选择FAD2基因的两个gRNA的靶位点分别为S1和S2，并合成构建载体相关引物；
步骤S2、双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建；
步骤S3、抽提质粒，转化农杆菌；
步骤S4、利用农杆菌介导转化油菜，筛选获得FAD2基因发生突变的转基因植株。
2.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述油菜为甘蓝型油菜。
3.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步骤S1中，靶位点S1序列为SEQ ID No.1，靶位点S2序列为SEQ ID No.2。
4.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步骤S1中引物序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6。
5.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步骤S2中双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建过程如下：
步骤S21、gRNA表达盒组装：用高保真酶以稀释100倍的pCBC-DT1T2质粒为模板进行PCR扩增并纯化回收PCR产物；
步骤S22、靶点与载体组装：用BsaI单酶切以及T4连接酶对步骤S21中的扩增产物与CRISPR/Cas9载体组装最终载体；
步骤S22、转化大肠杆菌感受态，Kan板筛选，菌落PCR鉴定。
6.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步骤S3中转化后的农杆菌，含有Cas9和靶位点。
7.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述步骤S4中农杆菌介导转化的部位为油菜下胚轴。
8.根据权利要求1、5或6所述的利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述农杆菌类型为GV3101。
9.根据权利要求1所述利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法，其特征在于：所述基因编辑位点为FAD2基因A5位点。
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