CN87106206A - 大豆属物种的变性、体胚胎发生及全植物再生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种应用未成熟的子叶组织，尤其是去除了胚胎轴的子叶组织的大豆(GLYCINEMAX)、野大豆(GLYCINESOJA)及其他大豆属物种的体胚胎发生方法，包括将上述组织放在含有生长素尤其是浓度至少约为15毫克/升NAA的培养基中培养。本发明还为这种体胚胎发生提供了另一种方法，其特征是，培养基含有协同作用的低量碳水化合物和低浓度的生长素。本发明指出了这种组织特别能产生胚胎的细胞，还描述了使这些细胞与再生和变性培养基接触的、改进了的浸解方法。本发明也提供了从大豆和其他大豆属物种变性体组织的方法。已经获得完整的、能育的、变了性的植株。

Description

发明领域：

本发明涉及一种从大豆和其他大豆属物种的体组织中使全植物变性和再生的方法。

交叉参考所涉及的申请：

本申请是待批申请（No.893256，申请日：1986年8月4日）的续篇。

发明的技术背景：

培养体组织以实现大豆及其亲缘物种再生的方法已经历了长时间的探索。大豆与易再生的物种如烟草和矮牵牛不同，以往从体组织再生全植物的偿试碰了壁。这些方法在借助于体细胞的无性变异，将所希望的特性诱导入大豆或其他能够与之繁殖的物种〔如野大豆（G.soja）〕方面非常有用。这些方法对基因工程师们也是有益的，通过土壤杆菌感染或其他手段使细胞变性，所产生的变性细胞含有外源DNA，通过培养，即可再生出具有繁殖种子和表现外源基因能力的全植物。

尽管在采用G.canescens和G.clandestina等野生的亲缘物种方面已经取得了巨大的成绩，但再生大豆属亚属大豆（soja）〔包括G.max（大豆）和G.soja（野大豆）〕的方法很少有进展。见P.A.Lazzeri等人的文章（1985），题目是“从大豆的未成熟子叶组织再生植物的过程”（《植物分子生物学报告》第3卷，第4期，160-167页）以及D.F.Hildebrand等人的文章（1986），题目是“大豆〔Glycine    max（L.）Merr.〕”《农业和林业的生物技术》第二卷，作物Ⅰ（Y.P.S.Bajaj编缉）283-308页。

在涉及胚胎发生的文献中，所描述的大多数处理大豆属物种的措施是提供一种含有生长素的基本培养基，以这种培养基作为使胚胎发生的诱导培养基。胚胎形成后，即可把它们转移到一种成熟培养基中，然后再转移到一种含有细胞动素并降低了生长素含量的培养基中抽枝。但是，使用高浓度的NAA或者协调使用低浓度的碳水化合物和生长素，以前认为无助于获得正常体胚胎的高频率。此外，在含有生长素的培养基中，尚未发现或分离出促使体胚胎生长的特殊子叶细胞，而有了这种细胞就能提高大豆（G.max）或其他大豆属物种的再生的效率。

W.D.Beversdorf等人在“大豆属物种的组织培养中达到的分化程度”〔（1977）《作物科学》（Crop    Sci.）第17期，307-311页〕一文中第一次报导了体胚胎的发生，但没有任何胚胎发芽。Beversdorf等人用含有2，4-D（即2，4-二氯苯氧乙酸）和/或NAA（即α-萘乙酸）以及2%蔗糖的诱导培养基来培养大豆（G.max）和几种亲缘物种的下胚轴或成熟的子叶组织或尖，或者胚胎。他们在一些培养物品上获得了类胚胎组织，但没有进一步发育为植株。在含有2毫克/升2，4-D和2毫克/升NAA的培养基中，从56个大豆培养品的胚胎发育而来的子叶组织发育成了“calli”及“非愈合组织”结构。但是，均未进一步发育。

T.Y.Cheng等人发表了一篇文章（1980），题目是“从培养中的大豆子叶茎节片断再生植物”《植物科学通讯》（Plant    Sci.Lett.）第19卷，91-99页，该文报导了用经过处理的子叶茎节片断来刺激培养中的大豆形成多芽。所用的培养基含有3%的蔗糖和0.25微重量克分子浓度（μM）的生长素IBA（即吲哚丁酸）。该方法没有涉及到体组织的应用，但却应用了由全能细胞组成的外植体来评价各种培养基的有效程度。这篇文章没有明确报导能够独立生长在土壤里的全植物被再生了。

H.Saka等人在“培养中大豆茎节片断上刺激形成多芽”〔《植物科学通讯》（Plant    Sci.Lett.）第19卷，193-201页〕一文（1980）中同样描述了在G.max大豆茎节或尖上嫩枝芽的形成，其应用的培养基含有生长素IBA和3%的蔗糖或者其他碳水化合物。这项工作没有涉及体组织的应用，而是应用正常情况下能产生嫩枝的组织来评价各种培养基在导致生长方面的有效程度。该文未报导全植物的再生。

T.Kameya等人发表了一篇文章（1981），题目是“从大豆属物种的下胚轴切片再生植物”《植物科学通讯》第21卷，289-294页，该文透露了用G.canescens和G.tomentella的下胚轴在补充有各种浓度的NAA和BA（即6-苯基氨基嘌呤）的MS培养基中培养，以再生正常植物。从包括大豆（G.max）和野大豆（G.soja）在内的八个物种的实验来看，仅仅从G.canescens的下胚轴切片采用1-5毫克/升BA和0.1-0.2毫克/升NAA时才以高频率再生出了嫩枝。全植物再生出来了。

G.C.Phillips等人发表了一篇文章（1981），题目是“从大豆的细胞悬浮培养物到体胚胎的诱导和发生”《植物细胞组织器官培养》（Plant    Cell    Tissue    Organ    Culture）第1卷，123-129页，该文报导了从胚生野大豆（G.soja）悬浮培养物中获得了单个嫩枝。对与基础培养基L2和SL2配合的各种生长素做了鉴定，其中包括0.1-13.4μM（0.02-2.7毫克/升左右）的NAA。（μM-即微重量克分子浓度，以后再出现此单位时均以μM表示）。所用蔗糖浓度为2.5-12.5%。获得的单个嫩枝来自野大豆培养物，先是在含有0.25μM2，4-D（0.45毫克/升）的SL2培养基中生长，然后转移到含有同样剂量的2，4-D、外加细胞动素、抗生长素和赤霉素生物合成抑制剂的L2培养基中。

K.K.Kartha等人发表了一篇文章（1981），题目是“从谷粒荚如大豆、豇豆、落花生、鹰嘴豆和菜豆的分生组织再生植物”《加拿大植物学杂志》（Can.J.Bot.）第59卷，1671-1679页，该文描述了在含有3%蔗糖和1μM/lNAA的培养基中，从大豆嫩枝尖的分生组织再生植物。全植物是再生了，但这篇文章没有透露用体组织来产生新植物，而宁可说是分生组织的组织的正常连续分化。这篇参考文献主要涉及的是确定为此目的的最佳生长培养基。

1982年8月8日-13日，在依阿华州的阿姆斯市（Ames）举行了“美国园艺科学协会”第七十九届年会，B.D.Reynolds等人在题目为“从大豆的初生的和愈合组织外植体生产胚胎”的报告的摘要中报导了从大豆（Glycine    max）的初生外植体（下胚轴、叶和根）在各种培养基中培养时生产胚胎的情况。这篇摘要没有清楚地限定培养基也没有提供可实施的细节。没有宣布超出胚胎阶段的植物再生。

M.L.Christianson等人发表了一篇文章（1983），题目是“有形态遗传能力的大豆悬浮培养”第222卷，632-634页，该文报导了从大豆（G.max）的胚胎轴的片断再生小植株，胚胎诱导培养基用的是MS（Murashige和Skoog）培养基，其中的硝盐被20μM的柠檬酸铵代替了而且还含有5毫克/升2，4-D或者IAA（即吲哚-3-乙酸）。这篇参考文献透露，对于这个方法来说，取代氮是关键。只有一个特殊的组织切片形成了胚胎，因此，这也许是一个偶然的和不能再重复的现象，事实上，这篇文献没有报导就该项工作曾成功地被重复做过。将胚胎转移到含有0.005毫克/升IBA和0.2毫克/升BA的培养基中去导致嫩枝形成。将嫩枝转移到含有0.1毫克/升IAA的基础培养基中引起根系形成，从而生产出小植株。

Christianson等人的US-4548901号美国专利就是基于上述工作而且声称在生产具有形态遗传能力的小植株的再生培养法上是个改进，再生培养包括：在含有外源生长素和铵盐的培养基中培养，所说的培养基中不含硝酸盐离子，在再生培养中，大粒荚果植物的外植体被逐次培养，而且被有选择的转移。这份专利也要求保护产生荚果双极胚胎的方法，该方法包括几个培养阶段，其中包括使用含有外源生长素和铵盐的培养基，所说的培养基中不含硝酸盐离子。这项申请的实施例在上述文章中有描述，唯有提及生根的叙述采用的是现在时态，这显然表明，在提出该项专利申请时尚未获得根系。

无论Christianson等人的文章还是他们的专利都未透露或声称再生出能单独在土壤中生长的全植物，也没有能力生产种子。

J.M.Widholm等人发表了一篇文章（1983），题目是“从Glycine    canescens的组织培养中再生嫩枝”《植物细胞报导》（Plant    cell    Reports）第2卷，19-20页，该文报导，用几种培养基从calli诱导嫩枝，calli是从G.canescens的子叶和下胚轴获得的，所用的培养基包括含有0.5毫克/升NAA和3%蔗糖的培养基。该方法未再生出全植物，而且根系的形成也不多见。

O.L.Gamborg等人发表了一篇文章（1983），题目是“在大豆属物种的细胞培养中体胚胎的发生”《植物细胞报导》第2卷209-212页，该文报导了在几个大豆属物种中，从下胚轴的细胞悬浮培养产生体胚胎，大豆属物种包括大豆（Glycine    max）的三个栽培品种（从七个实验的品种中选出）。其所用的胚胎诱导培养基由SL的大多数盐、微量营养元素以及维生素B5、10毫克/升酪蛋白氨基酸、15μM腺嘌呤硫酸盐、0.2μM（0.04毫克/升）佩克劳雷姆（Picloram）及0.025-0.25μM的AMO1618组成。已经发现，佩克劳雷姆对胚胎的诱导最为有效，但它也可被0.5-2.0μM（0.1-0.4毫克/升）2，4-D所代替。当NAA被用作生长素时，不能诱导出胚胎。胚胎被诱导出以后，即可把它们转移到含有细胞动素的SL生长培养基中。该方法中，形成了根系但未形成嫩枝。

三井工业有限公司（Sungene    Technologies    Crop.）的欧洲专利申请No.85109344.3（公布日：1986年2月19日）描述了一个大豆再生过程，包括使用四种独立的培养基：一种胚胎诱导培养基;一种胚胎成熟培养基;一种抽枝培养基和一种生根培养基。所描述的胚胎诱导培养基含有0.5-10毫克/升2，4-D或者1.0-3.0毫克/升IAA外加3.0-10毫克/升2，4-D以及2%-3%的蔗糖。所举的例子中没有明确透露根系形成;直接要求保护小植株。没有公开或者要求保护能够单独在土壤中生长的全植株的再生。

B.J.Li等人发表了一篇文章（1985），题目是，“在大豆-Glycine    max中体胚胎的发生和小植株的再生”《植物细胞报导》第4期344-347页，该文报导，他们从取自未成熟大豆胚胎的单个细胞中获得了小植株。该文透露，必须首先将荚冻在液氮中，然后将它们转移到60℃的水槽中浸20分钟，将未成熟的胚胎分割切成小片来培养，据报导，用过滤的方法从这种培养液中提取单个细胞的过滤技术，成功率可达95%。胚胎诱导培养基中含有2%蔗糖和1-2毫克/升2，4-D。文章介绍了小植株再生的情况，但未见报导全植株的再生。申请人曾试图重复这项工作，但未成功，因为组织的冷冻和回温杀死了它或者破坏了它进一步生长的能力。

B.Lippmann等人发表了一篇文章（1984），题目是“在大豆，Glycine    max    L.Merr.的子叶组织中体胚胎的诱导”《植物细胞报导》第3卷，215-218页，该文描述到，在含有0.5-1毫克/升2，4-D和0.25-2%蔗糖的培养基中，用来自G.max的未成熟子叶去形成胚胎。用含有0.5μM/l玉米素的L2培养基，观察到某些嫩枝分化和形成的根系。当用NAA而不用2，4-D作生长素时，没有观察到胚胎的形成。在含有2%以以上蔗糖或1.5%以上葡萄糖的培养基中，没有生成胚胎。未见报导导全植物的再生。

J.E.Grant发表了一篇文章（1984），题目是“从大豆亲缘四季野生物种Glycine    canescens的子叶组织再生植物”《植物细胞组织器官培养》（Plant    Cell    Tissue    Organ    Culture）第3卷169-173页，该文报导，用含有0.1μM（0.02毫克/升）NAA和3%蔗糖的MS培养基，诱导G.canescens的未成熟胚胎的子叶组织去形成胚胎。这项工作旨在描述大豆属物种的首次全植物再生，但并未透露G.max的再生。

J.P.Ranch等人发表了一篇文章（1985），题目是“从大豆的胚胎派生组织培养到植物再生”（“Plant    Regeneration    from    Embryo-Derived    Tissue    Culture    of    Soybeans”）《离体细胞生物学与发育生物学》（In    Vitro    Cellular    &    Developmental    Blology）第21卷，第11期653-658页，该文描述到，用大豆（G.max）和野大豆（G.soja）的未成熟胚胎以及取自这些胚胎的子叶来生产胚胎，进而再生成能育的全植株。所用的胚胎诱导培养基是含有22.5-45.2μM（5.0-10.0毫克/升）2，4-D和3%蔗糖的MS培养基。在转移到发芽培养基之前，胚胎成熟培养基用的是B5加上IBA和ABA。该方法培养出了能育全植株，但未见报导用NAA作诱导培养基。申请人不认为，这篇文章也许正好作为现有技术来反对他们的发明。

C.A.Newell等人发表了一篇文章（1985），题目是“Glycine    canescens的原生质体培养和植物再生”《植物细胞组织器官培养》第4卷，145-149页，该文描述了从原生质体再生G.canescens的全植物，原生质体取自下胚轴组织。在所报导的一些实验中，所用的生胚培养基含有0.4毫克/升BA和0.1--1.0毫克/升NAA。基本培养基由R-培养基的大多数盐类以及CL-培养基的渗压剂组成，而且含有6.84毫克/升蔗糖外加甘露糖醇、山梨醇、木糖醇以及肌醇各25μM。

U.B.Barwale等人发表了一篇文章（1986），题目是“从几种大豆遗传型的愈合组织培养经过胚胎发生和器官发生到植物再生”《Planta》第167卷473-481页，该文描述到，在含有43.0μM（8.9毫克/升）NAA和3%蔗糖的MS培养基中，用未成熟的大豆胚胎获得胚胎。该方法用的是完整的胚胎，包括子叶和胚胎轴。本方法再生出了全植物。

U.B.Barwale的硕士论文“为了解植物再生潜力而进行的大豆培养的筛选以及从未分化组织到大豆植物的再生”（1986年3月16日被伊里诺斯大学图书馆列入馆藏目录，从第59页起）描述到，培养未成熟的全胚胎来产生胚的calli。其所描述的培养基含有3%或者更多的碳水化合物以及不超过12毫克/升的NAA。

H.R.Kerns等人发表了一篇文章（1986），题目是“在大豆（Glycine    max    L.Merr.）悬浮物培养中毛叶茎节嫩枝的增生和体胚胎发育的相互关系”《植物细胞报导》第5卷140-143页，该文描述到，应用含有6%蔗糖和0.4毫克/升2，4-D的悬浮培养基，在从下胚轴和子叶组织派生的组织上诱导胚胎，下胚轴和子叶组织来自发芽的种子。未见报导胚胎再生成全植株。

虽然变性的大豆属物种植物的再生以前未见报导过，但有几篇文章论述过土壤杆菌属-大豆属之间的相互作用。

H.C.Pedersen等人发表了一篇文章（1983），题目是“大豆冠瘿病瘤的诱导和离体培养”《植物细胞报导》第2卷    201-204页，该文说，把接种的位置密封起来以防脱水，第一次成功地用土壤杆菌属感染了G.max植物。除了一些来自变性的愈合组织长出零星的根之外，这篇文章指出，变性的组织未发育成形态结构，而且指出，用BAP和NAA诱导再生未获得成功。

E.E.Hood等人发表了一篇文章（1984），题目是“pTiBo542的内切核酸限制酶图型-植物遗传工程的一个潜在的Ti质体媒介”《生物学/技术》（Bio./Technology）第2卷702-709页，该文描述了利用菌株A281的大豆（培养物种wayne）的土壤杆菌属感染。Hood等人后来又发表了一篇文章（1986），题目是“在大豆和苜蓿植物上，T-DNA和Opine在由根瘤土壤杆菌引起的瘤上的合成位置”《细菌学杂志》（J.Bacteriol）第168卷，1283-1290页，该文描述到，在土壤杆菌属感染的大豆中，T-DNA的长度与其在苜蓿中的长度不同。

W.Lranzheng等人发表了一篇文章（1984），题目是“借助根瘤土壤杆菌在一年生大豆属物种上瘤的诱导和基因转移”（1984年依阿华州阿姆斯市举行的“第二届世界大豆研究国际会议资料汇编”195-198页），该文描述到，试图通过感染984个G.max品种以及大量的其他大豆属物种的品种来诱导瘤，感染是通过接种培养十五个根瘤土壤杆菌的培养物实现的。所试验的3137个G.max植物当中，仅在四个植株上诱导出瘤。他们未偿试植物再生。

R.Wyndale等人发表了一篇文章（1985），题目是“在大豆冠瘿和未转变的愈合组织的生长周期中内生IAA和细胞动素的动力”《植物细胞生理学》（Plant    Cell    Physiol）第26卷1145-1154页，该文描述了在大豆上土壤杆菌属的感染及瘤的形成，而且发现在瘿组织中有大量的细胞动素。

L.D.OWens等人发表了一篇文章（1985），题目是“大豆对含Ti或Ri质体的土壤杆菌属菌种的应答的基因型变异性”《植物生理学》（Plant    Physiol）第77卷，87-94页，该文描述了各种大豆基因型对土壤杆菌感染的响应性，感染是通过瘤形成和位置合成达到的。

在H.Bialy（1985）的一篇未授权的报告“转变的大豆-cGMP的新角色”（《生物学/技术》第3卷200-201页）中描述了通过Ti质体传递的卡那霉素抵抗基因在大豆细胞培养中的表达。未见报导再生。

D.T.Kudirka等人发表了一篇文章（1986），题目是“在组织培养中根瘤土壤杆菌与叶外植体的相互关系”《加拿大遗传学细胞学杂志》（Can.J.Gent.Cytol.）第28卷808-817页，该文描述了大豆伤口组织对土壤杆菌属的感染仅对创伤后四小时保持敏感。

R.B.Simpson等人发表了一篇文章（1986），题目是“在土壤杆菌属根基因中从根瘤土壤杆菌的功能到无害的二元媒介”《植物分子生物学》（Plant    Molecular    Biology）第6卷403-415页，该文描述了利用二元媒介系统中的根瘤土壤杆菌的土壤杆菌根基因的Vir区段去转变大豆（低效率产生变性的毛根）。在依阿华州阿姆斯举行的“大豆的分子及细胞生物学”1986年会议上，有一篇题为“通过土壤杆菌属根基因将外基因引入大豆并表达”的报告，E.A.Shahim和R.B.Simpson在报告的摘要中概述了这篇文章所宣布的工作，并且指出，从转变的大豆根中形成了体胚胎。这篇摘要还推测，诱导毛根的根基因可以再生出全植株，但没有指明已获得全植株再生或者有能力完成这种再生。

L.D.OWens等人发表了一篇文章（1985），题目是“大豆对含Ti或Ri质体的土壤杆菌属菌种的应答的基因型变异性”《植物生理学》第77卷87-94页，该文描述了大豆（G.max）和野大豆（G.Soja）基因型和成熟度在被土壤杆菌属感染的敏感性方面的作用。未见报导从被感染的组织再生了植株。感染是通过将10毫升含有5×10¹⁰个细胞/升的细菌悬浮液喷洒到植物的第二和第三茎节间的伤口处实现的，植物的生长龄为二到三个星期。

D.Facciotti等人发表了一篇文章（1985），题为“在用土壤杆菌属转变的大豆组织中嵌合基因的可光诱导表现”《生物技术》（Biotechnology）第3卷241-246页，该文叙述了大豆植物幼苗的变性，这种变性是通过注射含有卡那霉素抵抗基因的根瘤土壤杆菌实现的，卡那霉素抵抗基因连接在大豆的小单元亚基羧基酶基因的5′段上。卡那霉素抵抗基因在变了性的肿块愈合组织上有所表现。未报导变性组织的再生。

M.C.Byrne等人发表了一篇文章（1987），题目是“在土壤杆菌属-大豆关系中菌株和培养品种的特征”《植物细胞、组织和器官培养》第8卷，3-15页，该文论述了在瘤形成期间各种大豆基因型对各种土壤杆菌属菌株的应答，而且描述了卡那霉素抵抗基因在变了性的瘤组织上的表达。

现有技术均未描述过在使用NAA时体胚胎的发生及大豆全植株的再生，或者用15毫克/升浓度的生长素再生任何大豆属物种，或者用低于2%的碳水化合物和低百分率的生长素混合配制来再生任何大豆属物种。此外，没有任何现有技术公开过变性全植物的再生。再者，在现有技术中没有这样一种暗示或透露-即把经过选择的细胞、尤其是生胚的细胞同要转移的DNA的接触，可以使再生效率达到足以进行切实的转变，也没有指出可不用可选择的标记物如抗菌素抵抗基因就能完成这种转变。

附图的简单说明：

图1是来自一个未成熟胚胎的大豆子叶的示意图，图中示出了最常形成体胚胎的“能育新月型”和“能育卵型”细胞区域。

发明摘要：

本发明提供一种用体组织产生胚胎的方法，其包括从大豆属物种的未成熟胚胎上切下子叶组织，最好是一并从其中除去胚胎轴。所用的大豆属物种最好是大豆（Glycine    max）或者易于同大豆（Glycine    max）杂交的野大豆（Glycine    soja），最为理想的大豆属物种是大豆（Glycine    max）。

这里所描述的体胚胎发生方法，适合于从大豆和其他大豆属物种的体组织中再生全植株。术语“体组织”是指不包括生殖细胞或者配子的组织。体组织由营养组织和细胞组成。“体胚胎发生”意思是具有由体组织或者体细胞长出的嫩枝和根轴的胚胎的形成，体组织或体细胞在培养前不包含嫩枝或根的分生组织。“分生组织”指的是由具有能够自然产生子细胞的细胞组成的组织。子组织分化即形成特殊的组织。术语“诱导培养基”、“胚胎诱导培养基”和“胚胎发生培养基”在这里作同义语使用。

在本发明的一个实施例中，子叶组织被放入具有高浓度的生长素的培养基中培养，这种生长素来自NAA族。这里定义的NAA族包括IAA（即吲哚-3-乙酸）、IBA（即吲哚-3-丁酸）和NAA（即α-萘乙酸）。NAA的浓度最好至少约为15毫克/升，也可以可达30-50毫克/升左右。培养基中也应含有碳水化合物，最好从蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖和木糖以及它们的混合物中选择，最为理想的是蔗糖，浓度约为3%或者更低。

在本发明的第二个实施例中，低浓度的生长素和低浓度的碳水化合物协同混合，用来诱导胚胎。生长素可以从NAA族或者从2，4-D族选择。在这里所定义的2，4-D族包括：2，4-D（即2，4-二氯苯氧乙酸）、佩克劳雷姆（Picloram）（道化学公司产品，即4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸）、PCPA（即对氯苯氧乙酸）、2，4，5-T（即2，4，5-三氯苯氧乙酸）以及狄克姆巴（Dicamba）（Sandoz公司产品即2-甲基，3，6-二氯-O-茴香酸）。为了实现本发明在这里要求的目的，与NAA相同效应和相同操作特点的生长素被看作是NAA族并与NAA等同。同样，与2，4-D相同效应和相同操作特点的生长素被看作是2，4-D族，并且与2，4-D等同。

在没有低浓度碳水化合物的情况下，已经发现2，4-D族的生长素的最佳浓度是5-10毫克/升左右，而NAA族的生长素的最佳浓度是15毫克/升以上，最好是30毫克/升左右。甚至在NAA的浓度低达6.25毫克/升的情况下，在碳水化合物含量为0.5%（单位体积重量）时，正常胚胎诱导仍可出现高的效率。申请人发现，胚胎发生效率与碳水化合物的浓度成反比，而且惊奇地发现，当生长素浓度降低时，胚胎发生效率一般不受影响，但有时还能提高。

还发现，应用NAA比应用2，4-D能产生更多的具有正常组织的再生体。因此，使用NAA或者NAA族的一种生长素较为合宜。

在第二个实施例中，碳水化合物（上述类型）应是低浓度的，2%左右或者更低为好，最好是1.5%左右或更低。一种较为理想的培养基含有约12.5毫克/升的NAA和2%左右的蔗糖，另一种较为理想的培养基含有约10毫克/升的NAA和1.5%左右的蔗糖。

理想的子叶组织应包括本发明所确定的和图1所示的胚胎发生区域。这个特定的胚胎发生区域与其余的子叶组织相比，包括有能使胚胎数量增加的细胞。

当胚胎诱导培养基包含一种NAA型生长素或者当胚胎诱导培养基包含一种2，4-D型生长素而且组织是近轴放置在培养基中时，则包含“能育新月型”的子叶区域就是特定的胚胎发生区域。这里所确定的“能育新月型”参见图1。各种子叶情况不同，这就难以精确地测定这个区域，但是对于熟练技术工人来说，要从子叶组织上切割，这个区域还是清晰可辨的。

当胚胎诱导培养基包含一种2，4-D型生长素而且组织是远轴放置在培养基中时，包含“能育卵型”的子叶区域则是特定的胚胎发生区域。此外，这个区域的确切尺寸也是不固定的，但是熟炼技术工人很容易识别和从子叶组织中把它取出来。

之所以优先使用NAA和包含有“能育新月型”的组织，其原因之一是因为这个体系为正常植物的再生提供了最好的效率。正常植物的再生是用胚胎，而胚胎多由单个体细胞（而不是细胞群）成长起来的。

在另外一个实施例中，应用了经过选择的“能育”区域（尤其是胚胎发生区域），这时，也可使用一种公知的不含生长素的营养基。这是因为“能育”区域由这样一些细胞组成一即这些细胞正在分化而且还没有从胚胎细胞状态变为子叶细胞状态，也就是说，它们尚未分化。在这个实施例中，“能育新月型”区域被优先应用。

为了使组织最大限度地接触到再生培养基（在变性过程中则与使用的外源DNA接触），组织要被浸解。这里所说的浸解是作为弄伤整个细胞组织的一个过程，以便使损伤的组织与放置该组织的培养基的接触面最大，还为细胞保护了组织环境。损伤不可太重以致于破坏分离出来的单个细胞，但又要足以保证组织的每一个细胞同培养基接触。最好将组织压入或使其穿过一个网眼来完成浸解，这种网可以是任何适宜的无毒材料，如不锈钢和尼龙，最好用不锈钢。网眼最好很细，以便将组织分割成细小的、可见的碎片，约四分之一平方毫米（1/4mm²）或者更小，例如网眼尺寸约500微米（第35号网眼）。

最好在体组织浸解以后，可以通过任何公知的方法使其变得含有外源DNA，最为理想的是通过用含有所希望的外源DNA的根瘤土壤杆菌（Agrobacterium    tumefaciens）来感染组织。而变性了的组织通过培养形成体胚胎，这些体胚胎被再生成能育的全植物。所谓“外源DNA”是指任何在宿主基因组中于它的新位置处不能自然出现的DNA。它可以包括DNA或者具有自己的启动子的基因或从大豆属（Glycine）或其他生物衍生出来的嵌合基因。外源DNA最好是在再生宿主植物上具有可识别的表现型和/或具有它的后代，借助于外源DNA，再生植物就可以同自然界出现的植物区别开来。这个由外源DNA构成的表现型，包括在实验室试验的结果，如南方的、北方的、西方的斑点试验。借助于本发明的方法，获得了变性的大豆属全植株、尤其是大豆（Glycine    max）。这些变性植物可以使包含在其中的外源DNA表达出来，例如，外启动子和强化因子都可以表达出来，从而，使之显示和/或强化其他基因的作用，而且，外基因可以表达出来，产生RNA和/或蛋白质。

在变性过程中，组织的浸解最好是在与外DNA接触之前进行，以保证细胞与DNA的最大接触。

在要变性的组织与外源DNA接触之后，紧接着是把组织放在选择的培养基中培养，这些都是公知技术。适宜选择的培养基包含有公知技术中的抗菌素如卡那霉素、G418或者潮霉素。已经通过相应的抵抗基因使变性细胞具有对它们的抗性。

在一个最佳实施例中，变性以后没有使用选择介质。当与模型系统如烟草相比时，这种处置对于再生效率低的大豆来说特别有用。因为选择介质比如卡那霉素甚至对于变性的大豆组织也会抑制其生长，而且还因为抵抗基因对植物有损害，因此，最好取消使用这样的选择介质。对于不同选择就允许变性而言，本发明所提供的胚胎发生和变性的高效率是非常重要的。这个效率是对未成熟子叶组织的特定胚胎发生区域、尤其是：能育新月型”区域进行鉴别和选择的结果;也是浸解处理的结果，因为浸解处理使组织的所有细胞与外DNA最大限度地接触;还是应用NAA的结果，因为NAA使单个细胞（而不是细胞群）高效率产生胚胎，这就能保证得到完全变性的再生体。变性再生体的高百分率就这样产生了，而且，通过识别由外DNA给与的表现型，则特殊植物的变性就能确认出来。比如在南方点上发现外源DNA的存在。

变性最好通过用土壤杆菌（Agrobacteria）传染的手段来实现，这种细菌含有无害的Ti-媒介，也可含有可选择的标记物。用来感染植物的土壤杆菌的用量应当尽量小，以防超组织生长并杀死组织。同样，在变性出现以后，所用的任何选择培养基和破坏土壤杆菌的抗菌素，其浓度应使它们足以完成任务，但这个浓度要足够低，以免杀死敏感的大豆属组织。这对大豆来说特别重要。应用破坏土壤杆菌的抗菌素是公知技术，包括cefoxitin，cefotaxime和羧苄青霉素。

变性组织形成体胚胎之后，用公知技术转移到合适的培养基中再生成完整的、能育的变性植株，这些植株含有并能表达出已经使它们变了性的外源DNA。这样的变性植株和它们的后代也包括外源DNA并且能表达出来。它们是表现型的，可与自然存在的植物区别开来。这些再生植物包括在本发明所属范围之内，而且，由本发明的步骤生产出来的所有再生植物以及它们的后代（不管它们是否有与自然存在的植物相区别的特征）均被认为与这些能区别的植物是等同的。

最佳实施例的详细描述：

申请人已经用了好几个胚胎诱导方案去诱导体胚胎而且得到了再生的大豆属植物。一种诱导胚胎发生很有用的方案是P.A.Lazzeri等人给出的方案（1985），在这里列为参考。如无专门说明，该方案所规定的条件在下面的描述中仍然适用。

当希望再生出野生的大豆属物种时，这里所使用的体组织可以是茎切片、叶切片、未成熟的花芽的营养组织、下胚轴或者其他在培养时能够保存的组织。采用公知的任何合适的再生培养基。在再生培养基中，很多有用的基础培养基也是公知的，如SL、B5、L2培养基及MS培养基，最好是采用MS培养基。基础培养基应当含有一种生长素，比如来自NAA族或2，4-D族的一种生长素。为了实施在这里所主张的发明，与NAA具有相同效能和相同操作特点的生长素归于NAA族，而且被视为与NAA等同，同样，与2，4-D具有相同效能和相同操作特点的生长素被归于2，4-D族并视为与2，4-D等同。

当对大豆（Glycine    max）或者野大豆（Glycine    soja）进行再生时，所用的体组织最好是来自未成熟胚胎的子叶。含有未成熟大豆胚胎的种子，长度应在约2.0-8.5毫米之间，最好是在3.0-5.0毫米之间。在成熟度相同的情况下，G.soja的种子更小。最好将胚胎轴从子叶上除去和/或把子叶另外弄伤。除去胚胎轴保证了体组织的特性。试验结果表明，除去胚胎轴以后，胚胎发生频率更高。把子叶切成几个小片，最好二等分或四等分，也能提高胚胎发生频率。将组织浸解能大大提高效率。

在变性的方案中，最有用的是从单个细胞而不是从细胞群形成体胚胎。这将确保，从单个胚胎细胞、包括生殖细胞再生的植物的组织中含有外源DNA。

由于这个原因，子叶最能生胚的区域被识别出来，如图1所示。如例17中所描述的那样，为了在NAA培养基上获得最大量的正常胚胎，包含有“能育新月型”的子叶的周边区域将被应用，并且，组织将远轴地放置在培养基中。当使用2，4-D时，将应用子叶的含有“能育卵型”的区域，而且，组织将远轴地放置到培养基中。但是为了获得更多的正常胚胎，组织应当近轴地放置在2，4-D培养基中，而且应当应用“能育新月型”区域。由于NAA提供了更多的“单个细胞活动”，亦即从单个细胞而不是从细胞群产生的胚胎，而且提供了更正常的再生植物形态，因此，优先使用这种生长素，同时，选择子叶的“能育新月型”区域。在确定的“能育”区域里的生胚细胞尚在主动分裂，而且还没有分化，因此，它们的表现象子叶细胞而不象胚胎细胞。培养这些细胞时，对于体胚胎的生产来说，就不需要用生长素了。在本发明的一个实施例中，大豆属、尤其是大豆（Glycine    max）植物再生出来了，办法是通过培养子叶的能育区域，尤其是“能育新月型”区域，培养基是公知的，如不加生长素的MS培养基。

为了确保子叶的生胚区域与培养基接触并提高再生效率，最好是从子叶上切下含有生胚区域的组织来培养。所用的子叶组织，不管是全子叶还是切下的生胚区域，要压入或穿过一个网眼来完成浸解。网眼最好很小，比如约500微米（No.35），这样，最大为1/4平方毫米的子叶片被生产出来。从完全分离的单个细胞再生出全植株，如果不是办不到，也是困难的，因为对从单个细胞生成胚胎来说，与组织的周围相接触显得非常必要。同时，网眼越细越能提供伤口，以便保证细胞与培养基最大接触。

最好是把一些子叶或者它们的生胚区域放置在一个常规尺寸的网上，比如二平方厘米的网上，每平方厘米容纳约20个子叶。尽管尼龙和其他合适的无毒材料也可使用，但最好使用不锈钢网，因为能提供更高的生胚频率。青铜网对组织有毒性，因此不宜使用。子叶可以部分或全部推过网眼，尽管不是非如此不可，但把它们部分地推过网眼并卡在网眼中一起移到培养基中较为适宜。为了进一步提高生胚效率，当使用导电的（例如不锈钢）网时，可让一个微弱的电流、如2微安（μA）左右的电流在网上流动。

体组织可以先放在一个能进行一定程度分化的培养基中培养。这种培养基也是已知的，比如上面提到的J.P.Ranch等人（1985）的一个例子中所描述的。但是，最好将组织直接放置在生胚（胚胎诱导）培养基中。象下面描述的那样，当“能育新月型”或“能育卵型”区域被包含在组织之中，并且使用了浸解处理时，分化就不必要了。

本发明所用的再生大豆和野大豆（G.soja）的胚胎诱导培养基是公知的基础培养基，含有生长素。基础培养基最好是MS培养基，并加上维生素B5、一种碳水化合物源、最好是糖比如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、果糖或木糖;还加有琼脂比如植物琼脂（Phytoagar）（Gibco公司的一种商标）或者介尔雷特（Gelrite）（加利福尼亚，San    Diego，Merck    &    Co.公司的一种商标）。生长素优先选用NAA族的，最好是NAA。在本发明的一个实施例中，所用的NAA浓度在约15毫克/升和至少30毫克/升-50毫克/升之间。当使用这样高浓度的生长素时，碳水化合物的浓度也可约为3%-6%。鉴于以前用NAA使大豆体胚胎发生的努力，一般都不成功，现在意外地发现，在这么高的浓度下，NAA比最佳量的2，4-D产生的正常胚胎的效率更高，在现有技术中，生长素的应用是最成功的。（申请人还发现，在5-10毫克/升时，2，4-D产生高的胚胎效率，超过10毫克/升左右，则出现一个高含量的、不合乎要求的、柔软的、脆弱的愈合组织）。

在本发明的另一个实施例中，NAA以较低的浓度（约10毫克/升或更低）与低于2%、尤其是1.5%左右的碳水化合物混合协同使用，也是有效的。已经发现，NAA以最多高达50毫克/升的浓度使用时，能以高效率生产正常胚胎。还发现，NAA以较低的浓度（约10毫克/升）与低量的碳水化合物协同应用，能比2，4-D从单个细胞（而不是从细胞群）生产更多的胚胎。

当使用低浓度的生长素时，碳水化合物的浓度在2%左右为宜，甚至在1.5%左右更好。最好的是碳水化合物浓度约为1%，在0.5%时也起作用。还令人惊奇地发现，当碳水化合物的浓度增加时，正常胚胎的生产效率下降，而且，在低浓度的生长素和低浓度的碳水化合物之间有一种叠加效应。当使用低量的碳水化合物时，比如大约0.5%的蔗糖时，则在生长素的所有试验过的不同浓度上（50毫克/升以下），均能获得最正常的胚胎，但是，甚至在生长素浓度较低时（6.25和12.5毫克/升），生产效率也是高的，而且，在生长素的每一个浓度上，当碳水化合物量上升时，正常胚胎的生产率一般却都下降。正常胚胎的最高效率是在6.25毫克/升NAA和1.0%蔗糖时产生的。生长素浓度至少是5毫克/升，而碳水化合物浓度则低于2%较为适宜。

在培养基中，介尔雷特（Gelrite）的推荐使用量是0.2%。较为理想的是，培养基的pH值介于5.0-7.0之间，如果培养基未经缓冲，则pH值最好是5.8。

胚胎的培养最好是在低强度光照的环境中进行，理想的是，光强低于80microEm^-2s^-1（即每平方米每秒百万分之80爱因斯坦，凡以后再出现此单位时，均用microEm^-2s^-1表示），最好是不超过10microEm^-2s^-1。培养时，可以生长在恒定光下，也可在黑暗中发生胚胎，但是，最好采用16小时光周期。采用在蓝光（430-490nm）波段和红光（630-680nm）波段具有较高辐射的灯、如Grolux（Sylvania公司的商标）比用冷白日光灯要好。

组织可以再次培养，但这并不必要。胚胎一旦形成，例如约15-30天以后，即可把它们转移到分离的成熟培养基中，但最好继续让它们在胚胎发生培养基中直至成熟，即在大约30天时或者至少2.5毫米长时再转移。上面提到的P.A.Lazzeri等人（1985）的工序也可以遵循。

一种公知的含有细胞动素的抽枝培养基被用来培养成熟的胚胎。细胞动素的例子有ADE（腺嘌呤硫酸盐）、KIN（6-呋喃基氨基嘌呤）、BA（6-苯基氨基嘌呤）也称“BAP”和“6-BA”、玉米素和激动素。这种抽枝培养基可以是：

（1）含有0.15毫克/升NAA以及BA、激动素和玉米素各0.033毫克/升的MS培养基;

（2）如果过了一个月未能成枝，则用仅含0.05毫克/升NAA的同样的培养基;或者

（3）BA、激动素和玉米素各0.017毫克/升与0.05毫克/升的NAA组成的培养基。尤其是，最后一种培养基适用于所有的成熟胚胎，尤其适用于具有轮廓分明的尖的胚胎被选择出来转移。一旦带有初级叶子的小植株被再生出来，即可将它们转移到生根培养基中。（通常，如果没有另外规定的话，在这里所使用的术语和一般现有技术中使用的一致，术语“小植株”是指已经产生叶子但无根。）

任何公知的生根培养基均可应用。一种可让小植株移进来的有用的培养基是1/2MS2S培养基（×1/2份大粒盐×1份微粒盐、维生素B5、2%蔗糖、0.65%植物琼脂），补充以0.005毫克/升IBA。最好是，该培养基含有HPN盐和约0.25克/升酵母提取液，溶解于自来水中，在高压消毒和用0.15%介尔雷特或0.65克/升琼脂（Difco    Bacto-agar）凝结之前，将pH值调整到5.9。其他HPN培养基为不容易生根的基因型而补充以5毫克/升香豆素或者0.005毫克/升IBA。其他合适的生根培养基是：

水栽营养盐溶液（《科学杂志》第222卷621-623页）、维生素B5、2%蔗糖、1μM    Ni、1毫克/升IAA、9毫克/升香豆素、0.2%介尔雷特凝胶或0.65%植物琼脂、pH5.9（高压消毒前）;或者

怀特（White）培养基-变更的怀特盐溶液、维生素B5、2%蔗糖、0.2%的介尔雷特或0.6%的植物琼脂、1毫克/升IAA、9毫克/升香豆素、pH5.9（高压消毒前）。

在23小时日长的环境下（光强为100microEm^-2s^-1，20℃、湿度60%），生长槽中生根情况最佳。最好是，植株生长在隔离的、装有100毫升生根培养基的容器中比如“Magenta”盒子（Magenta公司的产品商标）。光照条件是公知技术，但最好用23小时光周期、光强为50-100microEm^-2s^-1的“Grolux”或冷白日光灯。

当植株具有发育良好的根系以后，最好将它们移植到装有例如经过高压或微波消毒的盆栽混合物的盆中。这种盆栽混合物包括2份土壤、2份普劳梅克斯（Promix）和1份混合沙子（普劳梅克斯是纽约州新罗塞尔市Premier    Brand有限公司的产品商标）。在它们凝固期间，最好将它们覆盖以减少蒸发，并加入植物养料比如Peters（20∶20∶20）（Peters是宾夕法尼亚州Fogelsville，Peters化肥公司的产品商标）。在短期内，最好在自然光之外补充以13小时的光照（最好是高压钠灯）。螨和白娥感染以及发霉，可以用市售的专用制剂来控制。见上面提到过的P.A.Lazzeri等人（1985）的文章。

将外源基因引入植物组织的变性方法是众所周知的，例如，在S.H.Mentell等人的文章中就叙述到了，（《植物生物技术原理》“植物遗传工程理论”（1985），特别是34-157页），在这里列作参考。下面的论述描述了最佳实施例，并不是全面描述能使大豆属物种变性的所有手段。

野生物种比如G.clandestina和G.canescens的变性可以用茎、叶、花、下胚轴或其他合适的外植体来完成。将外植体洗涤并杀菌，最好用70%的异丙醇处理一分钟，然后用10%的Chlorox加一滴Liquinox处理10-15分钟。最好将外植体再用无菌水漂洗5分钟左右，而且这个流程要重复进行。组织应当切成适当尺寸的片，茎片约1厘米，叶片约1×0.5平方厘米，而对于花芽来说，大的花芽最好分成单个小片，但未成熟的花芽最好分成约3-芽簇。

应当把组织用盘子放到再生培养基中、比如上面描述过的胚胎发生培养基，或者器官发生（Organogenesis）培养基。较为理想的器官发生培养基是：

（1）MS盐、维生素B5、3%的蔗糖、500毫克/升的酪蛋白水解液或500毫克/升谷氨酰胺、0.5毫克/升NAA、2.0毫克/升BA（6-苯基氨基嘌呤）、1.0毫克/升激动素、0.6%的植物琼脂，高压蒸气消毒前pH值为5.9;或者

（2）MS盐、维生素B5、3%的蔗糖、500毫克/升酪蛋白水解液、0.15毫克/升NAA、0.33毫克/升6-BA、0.33毫克/升激动素、0.33毫克/升玉米素0.6%的植物琼脂，高压蒸气消毒前pH值为5.9。最好每盘上放置约20-30个组织切片，然后使这些物质最好经过1-2天的预先培养。每一个外植体被接种上土壤杆菌属悬浮液，这种悬浮液有足够的浓度，能有效地感染组织而又不会杀死它，正如下面所描述的，最好用0.5-1.0微生的土壤杆菌的隔夜悬浮培养液。如果使用浓度较高的土壤杆菌或者外植体被浸入细菌溶液，则土壤杆菌将长得过快并杀死外植体。允许外植体在有土壤杆菌的环境中生长几天，例如约1-3天，然后转移到上面曾描述过的再生培养基中，这种培养基也含有抗菌素，最好是浓度为每毫升500毫克的Mefoxin，以便杀掉土壤杆菌。然后，将估计已变性的物质转移到上面所描述的再生培养基中，培养基也可以含有选择介质，这种选择介质与在组织变性时用的可选择标记物相对应。选择介质最好是卡那霉素或者其他类似物，比如G418，选用G418是针对那些带有卡那霉素抵抗（新霉素磷酸转移酶Ⅱ）基因的变性组织。最好是，卡那霉素或者G418所用量足够选择变性组织但不会杀死它，卡那霉素最好每毫升约50-300微克;G418最好每毫升10-50微克。

变性后的外植体然后象上面所描述的那样被允许再生。它们最好以每二周一次的间隔在含有抗菌素和选择介质的再生培养基中再培养，直至嫩枝尖形成，然后转移到适当的抽枝、生根和土壤培养基中。

大豆（Glycine    max）和野大豆（Glycine    soja）的变性可象上面描述的那样来进行。但是，象上面关于体胚胎发生的叙述中所说的，如果使用未成熟的子叶组织，情况则不同。在用土壤杆菌感染之前，子叶组织所具有的胚胎轴以摘除为好，而组织、象上面所描述的那样被浸解就更好了，而且要使用组织的适当的胚胎发生区域。在这些理想的条件下，感染之前就不必在分化培养基上培养组织以便生成愈合组织。子叶最好以每100毫米10个的比例成对的放置在盘子中，并且最好立即同土壤杆菌接种，如果需要的话，接种可以推迟几天，这取决于被变性的基因型，见例21。

用来放置子叶进行变性的胚胎发生培养基，可以是任何公知的胚胎发生培养基，例如，象上面叙述的含有高浓度的生长素（尤其是用NAA族的生长素）或者低量的碳水化合物与低浓度的生长素的协同混合物的培养基。当子叶组织已经被允许在有细菌的情况下在胚胎发生培养基中生长足够长的时间来实现变性以后，应当把它们转移到含有抗菌素的新鲜的胚胎发生培养基中，以杀掉细菌，较好的是用200-500毫克/升、最好是约500毫克/升的Mefoxi（cefoxitin）Claforan    cefotaxime或者羧苄青霉素。也可以用选择介质如卡那霉素或其类似物如G418，或者潮霉素来选择变性的体胚胎。为了选择，在琼脂中G418的用量为10毫克/升左右，而卡那霉素的用量为50毫克/升左右。若应用潮霉素，则最好是2毫克/升左右。但是，介尔雷特是一种较好的培养基，因为看来它对组织产生的应力小些。组织同土壤杆菌共同培养足够的时间，以确保最大数量的细胞变性，但也不能长到引起组织过度死亡的程度，以1-2天为宜，最好是1天。

由于选择介质对大豆组织可能产生有害作用和/或可选择的标记基因如NPTII对变性的大豆植物可能产生有害作用，在变性的过程中，最好不用选择介质。由于G.max的再生性能比模型体系如烟草的低，大豆再生体在数量上不占压倒优势。由于浸解作业（如上面所述），保证了几乎所有的胚胎发生细胞与外源DNA的接触，因此，比较而言，产生的未变性胚胎寥寥无几。还由于应用了DNA和子叶的“能育新月型”区域，这就意味着大多数胚胎来自单个细胞，在实践中，本发明使人们能完成有效的变性过程而不用经过选择阶段。再生之后，变性体可以因其特点而被鉴别出它们的表现型性状，这些特点是外DNA给予织组或者再生植物的。鉴别方法包括报导基因如β-半乳糖苷酶的活化或南方斑点试验等。

培养过程中最好进行中间培养，大约28-30天进行一次，在胚胎发生培养基里加抗菌素（用或者不用选择介质），直至体胚胎形成，然后转移到抽枝培养基、生根培养基和盆栽混合物中，如上面所述的那样。培养应当坚持用抗菌素，而且，如果应用了选择介质，它们就应当续继使用。

含有将外源基因引入植物组织中的媒介的土壤杆菌，可以用公知的方法来培养。土壤杆菌最好生长在一个有适当培养基的盘子上，最好是YEP培养基（10.0克/升酵母提取液、10.0克/升的胨、5.0克/升NaCl、15克/升琼脂、pH7.0），培养基中含有选择介质。培养温度为28℃左右。媒介上用的标记物可用卡那霉素抵抗基因，因此，选择介质将是卡那霉素或G418。标记物可以是任何公知的标记物，而培养基将被相应地调整到仅选择带有媒介的土壤杆菌。

土壤杆菌属菌落从培养基上被刮落下来并被悬浮在适当的培养基中，比如YEP肉汤或者基本培养基中。最好每1.5毫升培养基悬放约25-50个菌落。经隔夜悬浮之后，使物质的结在合适的培养基上，例如含有合适的抗菌素的YEP培养基上，划出线条以便产生单个的菌落。单个菌落被接种到约25毫升的适当的肉汤培养基上，最好也是用含有适当抗菌素的YEP在约28℃的温度下隔夜培养生长，最好在摇动的水槽中进行。然后将培养物高速旋转，以便收集细胞，再悬浮置于肉汤或基本培养基中。大约0.5-1.0微升这样的悬浮隔夜培养物被用来接种要变性的植物组织（如上所述）。用于接种植物组织的培养液应当含有较低浓度的土壤杆菌，每毫升不超过10⁴-10⁸个土壤杆菌/毫升，最好不超过10⁶个土壤杆菌/毫升。

变性土壤杆菌及相关的媒介的使用方法在很多参考文献中都有详细地描述，例如，上面提到过的S.H.Mantell等人的文章（1985），特别是其中的第4章及其所提到的参考文献。用来使植物组织变性的媒介在本发明中不一定是土壤杆菌属媒介，但最好是土壤杆菌属媒介。媒介中最好包含有标记基因，以便于变性体的选择，而且，这种标记基因最好是卡那霉素抵抗基因，很多这样的媒介是市场上可以买到的，或者是根据一些文章的描述可以复制的，且可以用来使大豆或其他大豆属物种变性。媒介最好也含有所希望的特性、例如对“glyphoste”之类除草剂有抗性的基因密码。见D.M.Shah等人的文章（1986）“工程除草剂在基因转移植物上的耐受性”《科学》233：478-481页。大豆属组织可以用公知的能够变性这种植物组织的任何媒介来变性，而且，如按这里所述的也是公知技术提供了合适的标记物和选择程序时，选择的变性了的组织可以用本发明的方法再生出能育的全植物。

在一个最佳实施例中，所用的媒介是pH5pZ3D，在β-菜豆碱促进剂的控制下含有玉米朊基因，所有这些在L.Hoffman的文章（1987）中都有描述，这篇文章题为“在基因转移烟草种子中玉米15kd玉米朊多肽的高阶合成”《细胞》正在印刷中，这里列作参考。为在上述刊物上发表提出的条件是，作者可以根据要求提供该媒介。媒介被放置到根瘤土壤杆菌菌种LBA4404中，这在Hoekema等人的文章（1983）中描述过，《自然杂志》303：179。这是一种可广泛获得的菌种，也可以从作者处获得。

大豆属植物-尤其是大豆的再生方法已经描述过了。用这些方法可以有效地分析再生体的体克隆变化，而且为变性了的组织再生成完整的、能育的植物提供了必要的效率，再生出的全植物本身以及它们的后代包含着并能再产生外源DNA。

现已结合具体实施例对本发明作了描述，应当理解为本发明尚可改进。本申请的意图在于，凡一般说来乃根据本发明的原理又包括了与本发明所公布的内容有别之处的任何变动、使用或调整均属于与本发明有关的技术范围内的公知的和通常之举。

例子

注意：由于所有的“控制”处理不一定都相同，所以只能在实验本身而不是在实验之间对处理的情况进行比较。

例1：各种荷尔蒙对胚胎发生所起的作用

植物生长、胚胎分离：

关于授体植物的生长、荚的杀菌以及胚胎分离的方法，前面已经描述〔P.A.Lazzeri，D.F.Hil-debrand和G.B.Collins《植物分子生物学报告》第3期（1985）160页〕。简单地说，使植物在温室里的盆中生长，冬季期间，用自然光补充以13小时的人造光（高压钠灯）照射。把含有长度为4.0±1.0毫米种子的荚浸入70%的异丙醇中约30秒钟，以进行表面消毒，紧接着浸入25%的“Chlorox”中10分钟以进行漂白，然后在无菌水中漂洗二次。荚开了口胚胎就从未成熟种子中分离出来。

培养基，培养环境条件：

基础培养基由MS盐（T.Murashige和F.Skoog《植物生理学》（1962）15卷第473页）、维生素B₅（O.L.Gamborg，R.A.Miller和K.Ojima《细胞研究经验》（1968）50，第151页）、3%蔗糖和0.65%植物琼脂（Gibco公司的产品商标）组成，高压蒸气消毒前pH值为5.9。高压蒸气消毒前将荷尔蒙加入培养基中，唯有ABA除外，它要经过滤消毒。将胚胎（或子叶对）以每30毫升10个的比率放置在20×100毫米的塑料盘上培养，温度25±3℃，以16小时光周期的冷白日光灯照射（光强每平方米秒百万分之20爱因斯坦）。

培养的评价：

培养被记录了30天。应用了六个参数来评定胚胎的应答：Ⅰ.胚胎发生频率即胚胎发生的培养物数量/初始的全部培养物数量;Ⅱ.平均胚胎数-即每个胚胎发生的培养物的体胚胎（正常的和非正常的都算）的平均数;Ⅲ.效率-即胚胎发生频率×平均胚胎数;Ⅳ.正常胚胎频率-即带有正常胚胎的培养物数/全部的胚胎发生的培养物数：Ⅴ.生根频率-即带有根的培养物的百分率;Ⅵ.产生愈合组织的频率-即培养物发展成愈合组织的百分率。

为了进行评价，凡具有明显的根和嫩枝尖而且至少有一个明显的子叶的胚胎均看作“正常”胚胎;而没有明显的嫩枝尖，没有子叶或带有融合的子叶的胚胎均属“非正常”胚胎。如果没有明显的嫩枝轴出现，则融合在母体子叶组织上的两极结构将不计算，在这种情况下可把它们列入非正常胚胎。

每次处理至少培养60个胚胎，而通常一个处理要多于或等于100个胚胎。

荷尔蒙对体胚胎发生效率所起的作用被检测出来，如表1所示。用如下17个大豆（G.max）遗传型进行了实验，将结果汇集起来：成熟组00栽培品种Acme、Ada、Agate、Altona、Crest、Flambeau、Hidatsa、Manitoba    Brown、McCall、Morsoy、Norman、Ogemaw、Pagoda、Pando、Portage、Sioux以及第Ⅳ组遗传型PI408.294A。全进行了胚胎培养。

体胚胎的发生取决于培养基中的生长素的类型和浓度（在几个实验的过程中，缺乏外源生长素的培养基中从未见有体胚胎出现）。生长素IBA、NAA和2，4-D中，最后一种对体胚胎诱导最有效（见表1），而且，在每一个浓度时都能给出效率的最高数值（效率是每一个培养的合子细胞的体胚胎产量的量度）。对于每一种生长素来说，胚胎发生频率随着生长素的浓度增加。所示的平均胚胎数趋于近似，但不大明显。

对培养物的形态，生长素的类型有明确的作用。由NAA诱导的体胚胎具有最正常的形态，尽管单子叶和多子叶的胚胎是共同的。由2，4-D诱导的胚胎一般是角状的，但以高浓度（5和10毫克/升）生长素培养时，多叶的和簇生的形态变得更常见。由IBA诱导的胚胎，一般发育不完善，特别是在生长素浓度低时。在NAA或IBA培养基上，培养物几乎不产生愈合组织，而在2，4-D培养基上，培养物却总是产生一些愈合组织。根一般在IBA和NAA培养基上形成，但很少在2，4-D培养基上形成。

当实验在含有5毫克/升NAA的混合物中进行时，若用0.01毫克/升BA，则几乎没有作用，而用0.05毫克/升BA时，胚胎发生频率则下降。提高BA浓度也有助于愈合组织的产生。在具有5毫克/升NAA的复合物中，ABA用0.1毫克/升的浓度，与仅含有NAA的培养基比较，则抑制了胚胎发生。

利用McCall遗传型（表2）对5.0和12.5毫克/升之间的四种NAA浓度进行了比较，结果表明：浓度在5毫克/升以上时，胚胎发生的效率增加，但生长素浓度更高时正常胚胎的频率却减小。这里使用的全是胚胎。在相同的实验中，5毫克/升2，4-D能给出比最有效的NAA培养基还高一倍多的效率数值，但却伴随着正常胚胎生产的低频率。在5毫克/升NAA与0.05毫克/升或0.5毫克/升或5.0毫克/升2，4-D的复合物中，2，4-D的两种低浓度对胚胎发生效率具有轻微的下降作用，而高浓度时给出的结果与那些单独使用与5毫克/升2，4-D的情况十分类似（表2）。在体胚胎的形态方面，每一个复合物中，2，4-D生长素都呈“显性”，与不含2，4-D的N5培养基（即5毫克/升NAA）比较，甚至0.05毫克/升2，4-D也能明显的降低正常胚胎生长的频率。以下凡“N”后紧跟着数字就代表毫克/升NAA的数量;“D”后紧跟着数字就代表毫克/升2，4-D的数量。

在与5毫克/升2，4-D的复合时，0.1毫克/升的ABA对胚胎发生效率几乎没有影响，但却增加了正常胚胎的频率，稍微超出了控制数值〔全D5（5毫克/升2，4-D）培养基〕。但是在1.0毫克/升时，ABA将胚胎发生频率减掉一半而且也降低了正常胚胎的生产。ABA对2，4-D诱导的体胚胎形态的临时作用，是使它们的子叶粗壮和象叶子。

表3示出了高浓度的NAA对体胚胎发生所起的作用。用取自J103〔威斯康辛州，杰克魁斯种子公司（Jaaques    Seed    Co.Wisconsin）〕和McCall的分离子叶作实验，给出了相似的结果。表中仅将J103的数值列了出来。

这里的数值示出了在调节大豆体组织发生中外源生长素的重要性。生长素的类型和浓度在效率这方面的过程中具有特殊的和独自的作用（效率这方面指胚胎发生频率和平均胚胎数）。含有2，4-D的培养基能给出最高的胚胎发生效率数值;同等浓度的NAA和IBA的活性是递减的（表1、2和3所示）。这个胚胎诱导的高潜力，其它苯氧基乙酸比如cCpA和2，4，5-T也有。就试验的每一种生长素来说，胚胎发生效率随着浓度的增加而增加。胚胎发生效率随生长素的类型或浓度（以及其它处理方式）变化的情况，一般都能反应出两种基本参数的同样的响应性（表1、2和3）。对NAA来说，试验了1和30毫克/升之间的多种浓度，用30毫克/升时给出的效率最高，表明这也许仍然是次级最佳浓度。对于2，4-D，胚胎发生效率随生长素浓度的增加而增加，但是，与此同时，脆弱的愈合组织的形成随着增加，以及早期体胚胎的分化也随着增加，因此，最佳值处于5毫克/升和10毫克/升之间。这种作用在小胚胎和分离子叶的培养物上更大。在有关大豆体胚胎发生的其他研究中，尽管仅有两项研究用不同的生长素对胚胎发生频率进行了比较〔如上面提到过的B.Lippman等人的文章（1984）;U.B.BarWale等人的文章（1986）〕;但2，4-D是最常用的生长素〔如上面提到的W.D.Beversdorf等人的文章（1977）;G.C.Phillips等人;M.L.Christianson等人;J.P.Ranch等人（1985），B.J.Li等人的文章〕。两方面的试验都发现2，4-D是最活跃的生长素。在所作的2，4-D不同浓度的试验中，发现的最佳值也不同，如上面提到的B.Lippman等人（1984）发现是1毫克/升;J.P.Ranch等人（1985）发现是5毫克/升;本文发现是10毫克/升（见本文的表1）。这些差异可能是因为应用的蔗糖浓度不同或者外植体不同（相对于分离的子叶组织的全胚胎），因为这两个因素都强烈地影响着胚胎发生。同样，本究研提出的最佳NAA浓度（30毫克/升）与其他人研究的最佳浓度也不相同，比如上述的B.Lippman等人（1984）的是0.5毫克/升;U.B.Barwale等人（1986）的是8毫克/升。

体胚胎诱导仅需要生长素作为荷尔蒙源;在处理时，细胞动素（BA）或者ABA也可被补充进来，胚胎发生效率或是不受影响或是降低这取决于加入物的浓度（见表1和表2），细胞动素对大豆体胚胎的发生有抑制作用，这在先前有报道（上述的L.B.Lippman等人（1984）〕，尽管其他胚胎发生记录包括细胞素暴露的周期〔上述的W.D.Beversdorf等人（1977）;M.L.Christianson等人（1983）;B.J.Li等人（1985）〕。ABA看来是在体内调节大豆胚胎发生〔R.C.Ackerson《植物学实验杂志》（J.Exp.Bot.）35期（1984）403页〕。在离体时是促进还是抑制合子胚胎的生长和发展，取决于胚胎的阶段〔R.C.Ackerson《植物学实验杂志》35期（1984）414页〕。但是，我们的数据表明，尽管发现ABA对体胚胎形态有作用，在此作用下2，4-D诱导的胚胎子叶组织变得类似叶子，但总的来说，ABA抑制生长素诱导的体胚胎发生。

大豆体胚胎“质量”或形态的正常性问题，已经被几位研究人员讨论过〔如上述的W.D.Beversdorf等人（1977）;M.L.Christianson等人（1983）;B.Lippman等人（1984）;J.P.Ranch等人（1985）;U.B.Bawale等人（1986）〕，但是，先前的研究没有试图对正常的和非正常的胚胎的频率去定量。但是，这个参数对于胚胎发生系统的应用是最为重要的，因为从胚胎到植物的转变效率是随胚胎的正常性而显著变化的〔如上述的J.P.Ranch等人（1985）;P.A.Lazzeri等人（1965）;U.B.Bawalt等人（1986）〕。尽管其他物理的、化学的和营养的因素也是重要的，但作用于大豆体胚胎形态的最主要因素是生长素的类型和浓度〔上述的B.Lippman等人（1984），J.P.Ranch等人（1985），U.B.Bawale等人（1984）〕。生长素的类型对体胚胎形态的作用，可以从由2，4-D或者其他苯氧基乙酸（PCPA，2，4，5-T）诱导的胚胎与由“非-苯氧基”生长素诱导的胚胎之间的差异看出。由2，4-D诱导的胚胎通常是角状的、多叶的或具有模糊子叶的簇。它们常常没有轮廓分明的根极，而且，在其它“成熟”胚胎中嫩枝轴常常发育不良。相反，NAA诱导的胚胎通常具有清晰的两极，带有清晰的胚根和下胚轴区域，轮廓分明的子叶和从发育的早期阶段可以看到的嫩枝轴。这些在形态上的显著差异反映在这些胚胎“发芽”的自由度上。NAA诱导的胚胎很容易发芽（如上文提到的U.B.Bawale等人（1986）〕，而2，4-D诱导的胚胎则有顽性〔上面所述的W.D.Beversdorf等人（1977），B.Lippman等人的文章（1984）〕，而且，为了发芽常常需要延长诱导期〔见上述P.A.Lazzeri等人（1985）的文章〕或者使培养操作复杂化〔见上述J.P.Ranch等人（1985）的文章〕。其它研究的意见不约而同地支持了这些结论〔见W.D.Beversdof等人（1977），J.P.Ranch（1985）等人，M.L.Christianson等人（1983），B.Libbman等人（1984），U.B.Bawale等人（1986）的文章〕，所不同的是，其他工作人员一直未能在NAA和2，4-D两种培养基上生产有生存能力的胚胎〔上述B.Lippman等人（1984），U.B.Bawale等人（1986）的文章〕，因此，本研究是唯一的一个在相同的实验条件在这方面进行了比较的研究。

在本研究中，NAA的高浓度能给出正常的胚胎的最高产量，而高浓度的2，4-D却给出很低的正常胚胎产量。相反，上述的Ranch等人（1985）发现，胚胎的正常率在2，4-D高浓度时增大。两种研究的不同在于前者的观测是以原始培养物为基础，而后者的观察是在第二代培养物上作出的，这些第二代培养物是预先选择的以便在2，4-D中有轶序地生长。在苜蓿上已经表明，在低浓度2，4-D上诱导的体胚胎比在高浓度2，4-D上诱导的体胚胎具有更正常的形态和种子贮藏的蛋白质的轮廓，而且具有转化为小植株的较高频率〔见Stuart，J.Nelson，S.G.Strickland和J.W.Nichocl的文章，题目是“在苜蓿细胞培养中对发育过程有影响的因素”，见：R.R.Henke，K.W.Hughes，M.P.Constanin和A.Holluender（编缉）《林业和农业上的组织培养》，纽约，Plennum    1985，59页〕。

在含有2，4-D和NAA的培养基中，2，4-D对体胚胎的形态具有显性作用（表2）。早先有人使用过NAA和2，4-D的复合物〔见上述的W.D.Beversdorf等人（1977）的文章），据报导，产生的胚胎是非正常的，呈角状。在这里的工作中，ABA改善了由2，4-D诱导的胚胎的形态（表2），使它们的子叶象叶子。

例2.中间培养频率在体胚胎发生上的作用

由于增加NAA的浓度对提高胚胎发生效率能起作用较小（表2），因此，我们对中间培养频率（即非耗尽培养基的补给）作了考察（见表4）。实验用的是McCall遗传型。按照例1中规定的工序进行全胚胎培养。

培养物最初被放到含有5或10毫克/升NAA的培养基上，而且，以5、10或者15天的间隔到同样成分的新鲜培养基中再次培养。全培养期为30天，因此，培养物要被转移五次、二次或者一次，这些培养物是随着具有标准孕育周期的控制培养物一起转移的。

在10毫克/升NAA培养基中（N10），胚胎发生效率表明，在各种处理之同变化甚微，而在N5培养基中，在5天或10天中间培养处理时胚胎发生效率数略有上升。在N5培养基中，正常胚胎的生产始终较低，而在N10培养基中，15天中间培养处理产生的正常胚胎最多。

在这两种NAA培养基（N5和N10）的试验中，中间培养的频率在胚胎发生上几乎没有作用，而且，效率始终比用高NAA浓度（20-30毫克/升）可以获得的效率低。这些数据表明：生长素的消耗不是限制胚胎发生的因素，但是，在培养基和外植体之间最好有一个生长素急剧增减的程度。大豆子叶组织具有高的扩散抗性〔R.M.Gifford和J.H.Thorne（1985）《植物生物学》77∶863页〕，因此，“诱导”生长素浓度也许需要高浓度的外界生长速，以利于在外植体内发展。

在后来的一项研究中，培养物起初放在含有10毫克/升NAA的培养基中，发现，约7天的整个暴露期比30-45天更好。将暴露时间减至一周左右，生产的胚胎数量大约翻一番，而且这些胚胎更健壮且具有较高的呼吸率。

例3：在2，4-D和NAA培养基之间转移对体胚胎

发生所起的作用

在转移到“标准”培养基（10毫克/升NAA）之前，在高浓度的NAA（20或30毫克/升）上初始培养或者按各种周期在5毫克/升2，4-D上培养，我们考察了它们的效果。按照例1中规定的方法，用分离的子叶进行培养，其结果列入表5。对J103和McCall都进行了实验，二者的结果相似，所列数据仅是J103的。

在NAA培养基中，当培养物在2，4-D培养基中预先孕育3天或5天，则体胚胎发生的效率增加，但是，这个胚胎生产上的增加却伴随有正常胚胎频率的减小（用2，4-D处理一天的情况除外）。看来，2，4-D的高产性能和诱导出非正常形态的性能不那么容易分开。

从2，4-D向NAA转移的各种处理当中，胚胎发生的效率随着在2，4-D中暴露的时间从1天到5天而增加，然而在10天时却降低（在这个实验中，胚胎发生频率在D5三十天处理时比通常预料的在这个培养基上从分离的子叶产生的胚胎发生频率低，尽管平均胚胎数是十分典型的）。正常胚胎的频率在D5一天处理时最高，而在D5十天处理时最低。唯一的NAA到2，4-D转移处理给出了最低的效率数值，而且就象D5三十天处理那样，未产生正常体胚胎。在用2，4-D十天的培养期间，根的生产因2，4-D的存在而减小，而愈合组织的产生又与在2，4-D中暴露的时间长短成正比关系。

在第2组“转移”实验中，培养物起始于N10、N20或者N30培养基，过5、10或15天之后，将培养物转移到新鲜的N10培养基中，或者整个30天培养期一直让它们留在原来的培养基中。在所有的处理当中，胚胎发生频率是相似的，但培养物在N20和N30培养基中一直给出较高的平均胚胎数值（N20，平均值4.07，范围为3.87-4.27;N30，平均值为4.77，范围为4.48-5.00），这个平均胚胎数值要比N10培养基的高（N10，平均值3.62，范围为3.05-4.12），而且，N30三十天处理时产生了最多的正常胚胎（40.5%）。转换前的孕育时间在胚胎发生效率上没有固定的影响。三个NAA浓度级之间的差异比实验中概括在表3中的更明确。但是，正常胚胎生产的最高频率又出现在N30培养基中。根和愈和组织的产生都被增加的NAA的浓度级促进。

例4：胚胎尺寸在体胚胎发生中的作用

采用例1的步骤，在两个实验中，我们考察了胚胎尺寸在响应培养方面的作用。在第一个实验中，将取自长1.5-8.5毫米的种子的胚胎进行了比较。发现取自长度在2.5和4毫米之间的种子的培养物，应答性最强，因此对这个范围的详情进行了深入研究。在这个实验中，对4个尺寸级（2.5，3.0，3.5和4.0毫米）未成熟种子的长度接近0.5毫米的胚胎进行了培养，所用培养基是表1的前十二种培养基。使用了17个遗传型，每一个胚胎尺寸级的n值≥240。结果列在表6中。

胚胎尺寸在体胚胎发生中有重要的影响，尽管从长度为1.5-8.5毫米的种子来的胚胎是敏感的，但那些从2.5和4.0毫米长度之间的种子来的胚胎是最有生产力的。在这个尺寸范围内，从4.0±0.5毫米的种子来的胚胎具有最高的胚胎发生频率，而且平均胚胎数值最高。总的看来，小胚胎（种子长度≤2.0毫米）趋于形成柔软的、凝胶状的愈合组织，而大胚胎（种子长度≥6.0毫米）则常常显得没有反应或者在低浓度生长素的环境中趋于发芽。

其他的研究已报导了相似的最佳尺寸范围〔见上文B.Lippmann等人（1984），J.P.Ranch等人（1985），U.B.Bawale等人（1986）的文章〕，但去作直接比较是不可能的，因为所用遗传型和生长环境是不同的。

例5：遗传型在体胚胎发生中的作用

关于遗传型在体胚胎发生中的作用，是在17个成熟组00大豆培养物和一个组-Ⅳ遗传型PI408.294A上进行研究的。按照例1的工序全胚胎进行培养。胚胎培养是在表1所列的前12种培养基上进行的，汇总了所有培养基的数据列入表7。J103的数据与McCall的数据相同，因而未将J103的数据给出。

在进行了比较的17个大豆遗传型中，除培养物“Agate”外，所有的都产生了胚胎发生的培养物（但是，在后来的实验中，Agate也是敏感的）。在这些遗传型当中，胚胎发生频率和平均胚胎数都有相当大的变化，最高产的培养物（Ogemew）所具有的效率数值比最低产的培养物（Acme）高六倍多。虽然在体胚胎生产方面有变化，但对于所有的遗传型来说，这个步骤中产生的主要形态都相同，只是正常体胚胎与非正常体胚胎的比例有些变化。

在这些实验的全过程中，授体植物要尽可能保存在接近于恒定的环境之下。但是，在植物生长和培养应答上，有明显的季节性变化。夏季生植物是最高产的，而且它们的胚胎在培养时显然更敏感（尽管这种作用还没有被深入研究）。夏天和冬天月份间的主要环境变化因素是光照的强度和质量。

在从不同的大豆遗传型获得的胚胎发生效率上虽有差异，但就数据来说，所有试验的品系都有一定程度的胚胎发生，这表明，胚胎发生并不是遗传型的特有性状。这个结论也得到了其他人的支持〔见上述B.Lippmann等人（1984），J.P.Ranch等人（1985），U.B.Bawale等人（1986）的文章〕。尽管其他研究者也报道了遗传型的作用，这种作用可能出自胚胎发生的条件，即亚最佳条件〔见上述W.D.Beversdorf等人（1977），U.B.Bawale等人（1986）的文章）。对于在大豆改良中系统的应用来说，在再生上的一个微不足道的遗传型作用却至关重要〔见上述D.F.Hildebrand等人（1985）的文章〕，因为再生方案应当直接地适合于繁殖优良的大豆品系。

例6：盐成份和含氮的化合物在体胚胎发生中的作用

应用例1的一般步骤，对三种培养基盐成体和三种氮源在十个遗传型培养物上的作用进行了研究。将B5〔上述O.L.Gamborg等人的文章（1986）〕和L2〔G.C.Phillibs和G.B.Collins《作物科学》19卷（1979）59页〕同标准MS盐进行了比较。在B5盐中补充以硝酸铵（1.65克/升或者谷氨酰胺以及甲硫氨酸（8.5克/升和1.5克/升）来进行试验，而酪蛋白水解液（Difco酶水解液0.5克/升）补充于MS盐中进行试验。结果列入表8中。在第二个实验中，考查补充的含氮的化合物的作用，应用McCall和J103两个遗传型，将一定范围的胺基酸和聚胺进行比较。这两个遗传型的实验结果是相同的，表中数据仅McCall的数据。实验结果列入表9。谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸及精氨酸均以20mM（即毫重量克分子浓度，以后再出现时均用mM表示）的量单独添加;谷氨酰胺和甲硫氨酸各以10mM添加到混合物中;聚酯胺、精胺、亚精胺和腐胺以1mM的量单独添加;酪蛋白水解液以0.5克/升的量添加。除了酪蛋白水解之外，所有的化合物均作为过滤杀菌后的溶液来冷却培养基。

当将MS、L2和B5盐进行比较时（见表8），在最后一种成份上，胚胎发生效率明显较低。如果向B5盐添加进额外还原的氮，成了NH₄NO₃或者谷氨酰胺和甲硫氨酸，则胚胎发生效率就可上升到可与MS或L2培养基相比的水平，氨基氮补充物是最活跃的。将氨基酸（如酪蛋白水解液）加入MS盐中，与没有添加剂的培养基相比，增加了平均胚胎数而且提高了胚胎发生效率。关于添加含氮化合物的作用，在表9所示的实验中被进一步研究。在这个研究中，当以20mM的量向N10培养基（MS盐，10毫克/升NAA）中加入四种氨基酸和加入0.5克/升酪蛋白水解液时，则都不同程度地使胚胎发生率降低。在含有聚胺（1mM）的培养基中得到的结果相同。在有添加剂的培养基中，正常胚胎的频率也下降了。在有添加剂的培养基中，胚胎发生的敏感性的差异似乎被扩大了。尤其是两种添加物-聚胺亚精盐和腐胺这两种非常多产的培养物。有时产生出的正常胚胎数为5-15。一些化合物，尤其是脯氨酸，谷氨酰胺和酪蛋白水解液，它们的作用是提高叶绿素级别以及滤除掉黑色化合物，这些化合物在进入培养基时也许已经是酚醛。后一个作用在PI.408.294A上是最显著的。

还原的氮在大豆体胚胎发生中的重要性，还通过MS，L2和B5盐之间的对比来证明（表8）。在含有2.0mM NH⁺ ₄（氨离子）的B5盐中，胚胎发生效率要比分别含12.5和20.6mM NH⁺ ₄的L2和MS盐低一半。无论是无机盐（NH₄NO₃）或有机盐（谷氨酰胺+甲硫铵酸）的还原氮添加物，均能够在有缺陷的B5培养机中，“恢复”胚胎发生的效率，但氨基氮显得更有效。还原的氮促进体胚胎发生这个现象，可以由以前的一个报导来解释：未成熟的子叶具有很小的硝酸盐还原酶活性，尽管这种活性因子叶放在含硝酸盐的培养而受到诱导〔R.C.Ackerson（1985）《作物科学》25卷615页〕。在有关大豆体胚胎发生的其他研究中，一般都用硝酸铵来增加还原氮〔上述W.D.Beversdeorf等人（1977），B.Lippmann等人（1984），J.P.Ranch等人（1985），B.J.Li等人（1985），U.B.Bawale等人（1986）的文章〕，只有一个例外〔上述的M.L.Christianson等人（1983）的文章〕，但是，本申请的数据表明，在适当的条件下，恒定量的生长素和氮将促进完全的胚胎发生。

在第一个实验中（表8）把酪蛋白水解液（0.5克/升）加入MS培养基，胚胎发生效率增加了80%，主要是增加了平均胚胎数。但是，在第二个实验中，所有的添加物（氨基酸、聚胺和酪蛋白水解液）都降低了胚胎发生效率，而且减少了正常胚胎的频率。这些含氮添加物的抑制作用，由可能是特殊的铵离子和所用的添加物的浓度所造成的。关于氨基酸和铵在苜蓿体胚胎发生中的作用的研究〔见D.A.Stuart和S.G.Strickland的文章《植物科学通信》（Plant    Sci.Lett）34期（1984）175页）已经证明，它们的相互作用是复杂的，而且已经表明，任何一种添加物浓度的变化，均会导致促进或者抑制作用。这里试验的几个含氮化合物影响了培养物的胚胎发生密度。谷氨酰胺和酪蛋白水解液产生了深绿色的培养物，而亚精胺和腐胺则偶而产生非常高产的培养物。但是，在我们试验的几种浓度上，没有添加物对体胚胎形态产生显著影响。这个发现与在苜蓿上和胡萝卜出现的情况形成了鲜明的对比，在苜蓿上，几种氨基化合物对体胚胎生产、形态和“质量”均有深刻的影响〔上面所述D.A.Stuart等人（1985）的文章〕，在胡萝卜上，已经证明聚胺新陈代谢对体胚胎发生有干扰〔A.A.Fienberg，J.H.Choi，W.P.Lubich和A.R.Sung《植物》162期（1984）53页〕。

例7：蔗糖和葡萄糖浓度在体胚胎发生中的作用

采用例1中的常规步骤，在两个实验中考察了糖浓度在体胚胎发生中的作用。在第一个实验中，对比了蔗糖和葡萄糖，各以1.5，3.0，60和12.0%的浓度加入N10培养基。结果列入表10。试验了McCall和J103两个遗传型，给出的结果相同，数据仅是J103的。在第二个实验中，试验了蔗糖的三种浓度（2.5，5.0和7.5%），蔗糖按级配入2.5，5.0或7.5毫克/升2，4-D的培养基（用PI408.294A）。结果列入表11。

在N10培养基中，当糖的浓度从1.5%增加到12%时，胚胎胎发生效率显著降低（如表10所示）。培养应答正常胚胎频率、生根频率以及愈合组织频率等其余参数都显示出随着糖浓度的增加而被抑制。在低糖培养基上培养组织的密度小，而且体胚胎趋向于显得透明。自始至终，蔗糖和葡萄糖都给出了类似的结果，只是葡萄糖对根和愈合组织的形成有更强的抑制力。在三种2，4-D培养基的每一种中（D2.5、D5.0、D7.5），当蔗糖浓度从2.5增加到7.5%时，胚胎发生频率都减小（表11）。但是，蔗糖和生长素浓度之间有一种相互作用，即2，4-D的最佳浓度从在2.5%和50%蔗糖条件下的5.0毫克/升变成在7.5%蔗糖条件下的7.5毫克/升。在这个实验中，尽管在高2。4-D和低蔗糖条件下获得了胚胎生产的最大量，但在这种环境下，一些形成的胚胎转为愈合组织而不是继续发育。

在2，4-D和NAA两种培养基中，胚胎发生效率都因糖浓度的降低而增进（表10和11），而且培养应答的其他参数也受到同样的影响。作为碳源，蔗糖和葡萄糖之间几乎没有不同，只是葡萄糖在高浓度（6和12%）时比相同浓度的蔗糖更抑制形态形成。这是因为一定重量/体积的葡萄糖浓度产生的渗透压力比相同浓度的蔗糖高。这些在抑制上的不同，基本上是因为葡萄糖培养基的渗压理想溶液浓度较高，而并非由“毒性”效应所引起。有关大豆体胚发生的大多数研究，都是采用含有2%或3%蔗糖的培养基〔上述W.D.Beversdorf等人（1977），M.L.Christianson等人（1983），J.P.Ranch等人（1985），B.J.Li等人（1985），U.B.BaWale等人（1986）的文章〕，但是仅在一个研究中〔上述B.Lippman等人（1984）的文章〕把蔗糖和葡萄糖的各种浓度与很低浓度的2，4-D一起进行了试验。研究发现，蔗糖比葡萄糖略优，而对两种糖的任意一种来说，在具有1毫克/升2，4-D的培养基中，最佳浓度是0.5%。最近的研究表明，对于生长在玻璃试管中的未成熟大豆种子来说，作为碳源，葡萄糖胜过于蔗糖〔R.C.Akckerson《作物科学》25期（1985）615页〕，尽管以前在未成熟子叶的培养工作中认为蔗糖更优〔J.F.Thompson，J.T.Madison和A-M.E.Muenster《植物学年鉴》（Ann.Bot）41卷（1977）29页〕。在研究中，观察了蔗糖和生长素之间的一种相互作用，即：当蔗糖浓度从2.5%或5.0%增加到7.5%时，则最佳2，4-D的浓度从5.0毫克/升增加到7.5毫克/升（见表1），这种相互关系也许能解释由Lippman等人（1984）发现的最佳2，4-D浓度（0.5-10毫克/升）与本文中前面的例子和其他研究中发现的最佳浓度（5.0-10.0毫克/升）之间的差别〔本文中的例1和上述J.P.Ranch等人（1985）的文章〕，因为以前的研究所用的是含有1%蔗糖的培养基，而后来的研究所用的是具有3%蔗糖的培养基。

例8：pH值在体胚胎发生中的作用

为测定培养基pH值在培养应答中的作用，照例1的常规步骤，准备了五种不同的N10培养基，分别具有5.0，5.5，6.0，6.5和7.0的预培养（高压消毒之后）pH值（初始的实验已经证明，高压消毒前pH值在5.5和pH7.7之间高压消毒后则产生这些pH值。取出的样品证明，所用的培养基pH值与理想的值误差在0.1pH单位之间），除了上面所列的五种不同pH值的培养基之外，对三种缓冲培养基也进行了试验。这三种培养基，每一种都含有10mM的MES〔即2（n-码啉代）乙烷硫酸〕，而且，高压蒸气消毒前分别调整到pH5.0，pH5.5和pH6.0（它们的pH值在高压消毒后不变）。结果列入表12中。

在pH5.0和pH7.0之间变化N10培养基的初始（预培养）pH值，在胚胎发生效率或者生根频率上，产生的固定效应很小。相反，生产的正常胚胎和愈合组织则明显地受到培养基pH的影响。两个参数的最佳pH值都是5.0或5.5，而在pH值更高时则下降。在缓冲培养基中，胚胎发生效率的最佳pH值对McCall来说是6.0，对J103来说是5.5，而5.0的pH值则抑制了生长和发育的所有参数。在以pH5.5缓冲的培养基中，培养物McCall的正常胚胎频率显然是最高的，而在CV.J103上，正常胚胎频率在pH5.5和pH5.0时是相同的，尽管后者的数值是可疑的，因为它来自总共生产出三个胚胎中的一个正常胚胎。在所有的非缓冲培养基中，最终的（培养之后）pH是6.0±0.7，而在缓冲培养基中，最终的pH是在初始值的0.05个单位之内。

其他有关大豆体胚胎发生的研究，应用了非缓冲培养基，这些培养基所具有的“高压消毒前”pH值在5.8和6.0之间，它们产生的“高压消毒后”pH值在5.4和5.6之间〔上述W.D.Beversdorf等人（1977），M.L.Christianson等人（1983），B.Lippman等人（1984），J.P.Ranch等人（1983），B.J.Li等人（1985），U.B.Bawale等人（1986）的文章〕。在分离的子叶培养中，以前发现在干重和蛋白质积聚方面pH6最佳〔J.F.Thompson，J.T.等人（1977）的文章〕。在本研究中，在以不同的pH值开始的培养基中，最终pH值是相同的。在苜蓿上，体胚胎发生已经同高的细胞内pH联系起来〔J.Schaefer（1985）《植物生理学》79期（1985）584页〕，但是，关于外界pH的作用或者在培养基pH变化方面，没有给出数据。

例9：子叶组织的剖解在体胚胎发生中的作用

为考察在胚胎发生中胚胎轴的作用以及组织破坏的各种程度的作用，在放到N10培养基中培养之前，胚胎经受不同的解剖处理。其他方面仍遵循例1中的常规步骤。在第一个试验中，比较了四种处理：1.全胚胎;2.破坏了的子叶-做了两个切口，与胚胎的长轴平行，穿过两个子叶并从末端起延伸出子叶长度的三分之一;3.轴除去-胚胎轴由穿过两个子叶的单一切口除去，切口垂直于胚胎的长轴，从末端起到路经的四分之三处沿着子叶向下（仅培养分离的子叶）;4.平分的胚胎-胚胎被穿过两片子叶的单一切口平分，切口垂直于胚胎的长轴，在路经中点沿着子叶向下（培养两个分离的半子叶以及胚胎轴段）。试验结果列入表13。在第二个剖切试验中，把组织破坏的三程度-全分离子叶，半分离子叶或四分之一分离子叶进行了比较。结果列入表14中。McCall和J103遗传型都用到第二个试验中。由于结果相同，因此，仅将J103的数据列出。在第一个和第二个试验中，数据都是在“每个胚胎”基础上列出的。

两个试验都研究剖切处理的作用，使用N10培养基。第一个试验（表13）表明，胚胎发生效率因胚胎外植体的剖切（破坏）而增加了，效率的两个基本参数都受到了影响。看来，胚胎轴的切除进一步增加了胚胎发生效率（“破坏了的子叶”处理对比“除去了轴”处理）。在“平分胚胎”处理中，在分离子叶区段和系于胚胎轴的子叶节上都形成了体胚胎。在第二个剖切试验中，将“全”分离子叶与二分之一或四分之一分割的子叶进行了对比（表14）。胚胎发生频率随组织破坏程度的增大而增加，但平均胚胎数在半子叶时是最大的。因此，在半子叶和“四分之一子叶”处理时，胚胎发生效率是非常接近的。生根和愈和组织频率随着组织破坏的增大而增加。两个剖切试验之间的重大差别是，在第一个试验中，最高正常胚胎频率出现于最低的组织破坏（“全胚胎”处理），而在第二个试验中，正常胚胎的频率在导致最严重的组织破坏处理时才最高（“四分之一子叶”）。

在N10培养基中，胚胎组织的破坏或剖切处理的确增加了胚胎发生效率。尽管在两个处理中不能确保组织的破坏程度相同，表13中“子叶破坏”和“轴切除”处理之间，胚胎发生的增加意味着胚胎轴可以抑制子叶组织上的胚胎发生。在第一个试验中，正常胚胎频率在“全胚胎”培养时最高（见表13），而在第二个试验中，正常胚胎频率随着组织的破坏程度而增加（表14），这一观测结果难以解释。这可能是特殊遗传型的应答，但这个问题需要进一步探讨。剖切处理在促进胚胎发生，生根和愈合组织方面的作用，与生长素高浓度的作用是相似的，这表明了创伤在子叶组织对生长素敏感性上的作用。这个过程的潜在媒介是乙烯。有关大豆体胚胎发生的大多数研究采用了单一外植体型，而且使用了剖切技术〔由上述W.D.Beversdorf等人（1977），M.L.Christianson等人（1983），B.Lippman等人（1984），B.J.Li等人（1985），U.B.Barwale等人（1986）〕，有一个研究报道，从全胚胎和分离子叶都有胚胎发生〔上述J.B.Ranch等人（1985）〕，但是没有给出比较的数据。

例10：光强和构成在胚胎发生中的作用

为了研究光的强度和构成在胚胎发生中的作用，将培养物放在高光强（大约80microEm^-2s^-1）或低光强（10microEm^-2s^-1）的16小时光周期的光照下培育，光线来自Grolux（Sylvania公司的产品）或者冷白日光灯。第五种处理是持续在黑暗中培育。其他方面仍采用例1的步骤。结果列入表15中。

在光强和光构成的对比中，任何一个光型，在低光强时胚胎发生效率都较高。此外，来自高光强处理的胚胎常常是脱色的，而且显出是受抑发育。Grolux灯光无论光强高低都比冷白光产生更高的胚胎发生效率。黑暗中也有胚胎发生，但比光照环境下的效率低。与胚胎发生的情况相反，高光强对根和愈合组织的生产有促进。

光强和光构成比其他因素如荷尔蒙或糖浓度的作用要小（见上述）。就Grolux和冷白光来说，低光强优于高光强，而在两种灯的光级方面，Grolux光优于白光。Grolux灯在兰光（430-490nm）和红光（630-680nm）波段比冷白灯的辐射更高〔V.A.Helson《加拿大植物科学杂志》（Can.J.Plant    Sci）45期（1965）46页），而且以前的研究中已经证明，在试管中培养时，Grolux灯光对形态发生也是优良的（G.Schlegel和R.Schneider-Maessen，《Gartenbauwissenschaft》46卷（1981）106页〕。在大豆合子胚胎培养中，在黑暗中生长受到限制，因而种子发芽率被降低〔R.C.Ackerson，《作物科学》25卷（1985）615页，R.L.Obendorf，E.E.Timpo，M.C.Byrne，T.V.Toai，G.T.Rytko，《植物学年鉴》53卷（1984）853页〕。

例11：体胚胎再生成小植株

为促使长成植株，由例子1的工序形成的体胚胎长到2.5mm长时，将其从母体培养物中取出并转移到第二期培养物培养基中〔上述P.A.Lazzeri等人（1985）的文章〕。为了检验培养基扶助胚胎发育和“萌芽”的能力，试验了数种培养基。初步的试验表明，低浓荷尔蒙是合宜的，因此，对下列的含有MS盐、维生素B5、3%蔗糖和NAA（N）的集合以及三种细胞动素-BA（B）、激动素（K）、玉米素（Z）的一组培养基进行了比较;No.1、BKZ0.001;N0.1，BKZ0.01;N0.001，BKZ0.01;N0.01，BKZ0.1;N0.001，BKZ0.1和N0.1，BKZ0.01，GA30.1（所有的荷尔蒙浓度以毫克/升计，每一个BKZ量中，单独的细胞动素各为整个细胞动素浓度的三分之一）。这个培养基组给出的生长素：细胞动素的配比范围在100∶1和1∶100之间。

为了生产适合于移植到土壤中去的生根小植株，“发芽”胚胎（具有初级叶子的幼芽）被转移到Magenta（芝加哥，Magenta有限公司产品）盒子中〔上述P.A.Lazzeri等人（1985）的文章〕。为了检验培养基强促进小植株茁壮生长的能力，对数种培养基进行了试验。不同的试验包括不同的盐成份：SGL〔G.B.Collis和G.C.Phillips“在红叶上组织培养和植物再生”E.D.Earle和Y.Demarly编缉“从组织培养再生的植物的可变性”，纽约，Praeger，1982，26页〕，MS〔T.Murashige和F.Skoog《植物生理学》15期（1962）473页〕和1/2MS〔上述P.A.Lazzeri等人（1985）文章〕，B5和1/2B5〔上述O.L.Gamborg等人（1968）文章，Whites′（变型）〔P.A.Lazzeri和T.M.Dunwell《植物学年鉴》54卷（1984）35页〕，HPN〔水栽法的营养素培养基，盐（D.L.Eskw，R.M.Welch和E.A.Cary（1983）《自然科学》（Sciene）222卷621页）与0.25毫克/升NiSO₄·6H₂O〕;一些氮源添加物：酪蛋白水解液（酶的水解液）0.5克/升KNO₃（1.0克/升），NH₄NO₃（0.5克/升）;一些胶凝介质;植物琼脂（Gibco）（6.0克/升），Difco Bactoagar琼脂（6.5克/升），介尔雷特（Kelco）（2.0克/升）;一些生长调节制：IBA（0.05毫克/升），激动素（0.05毫克/升），香豆素（5毫克/升）;一些水源：MilliQ-过滤过的水，自来水，商品泉水（高桥泉牌），酵母提取液（Difco 1.0克/升），Kao维生素（变型）〔K.N.Kao，《Mol.Gen.Genet.》150（1977）225页〕，果糖（20%），活性碳（1%）以及缓冲剂（10mMMes）。

在六种NAA/BKZ培养基试验中，生长素：细胞动素的不同配比对体胚胎的“发芽率几乎没有影响。更重要的因素是体胚胎的内在“成熟度”;那些具有几可见的，轮廓分明的顶尖的胚胎在六种培养基的任何一种上都能快速地“发芽”，而那些没有确定的嫩枝尖的胚胎，在“发芽”之前一般将要呈现20-60天的迟迎期。从对培养物的一般“健康”的进行评价的角度看，适于常规应用的，是一种含有0.05毫克/升NAA和0.1毫克/升BKZ的培养基〔上述P.A.Lazzeri等人（1985）文章〕。

尽管移植到装在Magente盒子中的低盐培养基中时，带有初露子叶的“发了芽的”体胚胎容易生根，产生了三小叶而且在长大，但老叶常常呈现出叶脉间的萎黄病，而且在某些情况下叶子不成熟就衰老。这种萎黄病不会妨碍有效地向土壤转移（萎黄病/衰老反应不仅在体胚胎衍生出的小植株上出现，在秧苗上也可看到）。为改善小植株品质，人们观察了大量的培养基变形。

影响小植株生长的因素是盐成份、水源、凝胶介质和酵母提取液。含有溶解于自来水中的HPN盐和0.25克/升酵母提取液的培养基，在高压蒸气消毒pH值前调整到5.9，并且用0.65克/升Difco    Bafco-琼脂胶凝，能使生长良好。对于那些不容易生根的遗传型，在这种HPN培养基中诱加5毫克/升香豆素或0.005毫克/升IBA。

体胚胎“发芽”的频率和比率与胚胎的“正常性”是密切相关的;非正常胚胎具有低的发芽率而且在嫩枝长出之前有一个较长的滞后期。在苜蓿上，也已报道过相类似的关系〔上述D.A.Stuart等人（1984）文章〕。与在苜蓿上的情况和在其他大豆研究〔上述J.P.Ranch等人（1985）〕上的情况相反，在我们的研究中，无论是将氨基酸加到诱导培养基中还是在发芽培养基中使用荷尔蒙，都没有在胚胎发芽上产生固定的影响。

在再生的小植株上，叶萎黄病和未成熟叶子衰老，是试管培养环摸的特有现象。当小植株移植到土壤中以后，萎黄了的叶子会反青，这种现象意味着培养中有毒性或者不足之处。使用改进了的HPN培养基就大大地改善了植物的健康，这种培养基基础盐份是促进水栽法培养物生长，而不是促进试管培养的组织的生长。在试管中生长出令人满意的大豆小植株，其困难很少有人探讨〔Z.Yang，Z.Chan，Z.Liv和Z.Ahang《自然科学通报》16（1984）1012页〕，但关于生根再生体以及将其栽入土壤问题的研究报告〔上述B.Lippman等人（1984），U.B.Barwale等人（1986），M.L.Christianson等人（1983）文章〕表明，小植株生长状态常常是亚最佳的。

例12.小植株再生全植株

将例11的具有发达的初级子叶的小植株转移到二分之一MS25培养基（×1/2MS大粒盐，×1微粒盐，维生素B5，2%蔗糖，0.65%植物琼脂）中，这种培养基中还添加有0.005毫克/升IBA，将培养基装进深红色（Magenta）盒中。

盒子被置放到光强为50～100microEm^-2s^-1（500-1000勒克司）的16小时光周期的光下，这些光来自Grolux或者冷-白日光灯下。

当根系发育良好的小植株出现以后，即可将它们移植到装有杀过菌的（用高压蒸气或微波）盆栽混合物（土壤∶Promix∶沙的配比为2∶2∶1）的缽中。每周一次向植物补给Peters    20∶20∶20全套植物养料。在锻炼期间，植物应保持覆盖以减少蒸发。用公知手段控制螨和白蛾的干扰〔见上述P.A.Lazzeri等人（1985）的文章〕。

带种子的全植物被再生了出来。

例13;低碳水化合物和低生长素含量在体胚胎发生

中的复合作用

尽管前面的例子表明，2，4-D的最佳浓度在5和10毫克/升之间，而NAA的最佳浓度是至少30毫克/升，但我们仍在各种糖浓度T，对较低浓度生长素的作用进行了试验。其他方面仍按照例1的步骤。结果如表16所示。

在1%或2%蔗糖的情况下，全部体胚胎发生效率被证明一直是最佳的。在最低蔗糖浓度（0.5%）以下，正常胚胎的频率最佳。当1%蔗糖时，正常胚胎产生的效率（正常胚胎的频率×正常胚胎平均数）最佳。蔗糖的浓度对在体胚胎上形成的子叶数也有影响。在生长素每一个浓度下，用0.5%蔗糖产生出最正常的双子叶体胚胎。在每一个生长素浓度（6.25，12.5，25，或50毫克/升）下，正常（双子叶）胚胎的频率因蔗糖浓度的增加而降低。应用低浓度蔗糖，借助于相应的较低浓度生长素（6.25毫克/升NAA）就获得了高效率和胚胎的正常率。

如表16所示，由于初期培养基采用了低浓度蔗糖（0.5%），在用6.25NAA和2%蔗的培养基上做第二期培育期间，培养物的生产率也提高了。

也如表16所示，在用1%或2%蔗糖生产的胚胎胎当中，体胚胎发芽（表头的“%P.LVS”≥5mm（百分率初级叶子≤5mm））情况最好。

例14：大豆属clandestina的变性

预备了含有媒介pH575的根瘤土壤杆菌。这种媒介的构成在美国专利申请No.788，984（申请日1985年10月21日）中详细地描述过，这里结合着作了参考。这种媒介携带着卡那霉素抵抗基因和真蛸合成酶基因。将细菌放在含有卡那霉素的YEP培养基（10克/升酵母提取液，10.0克/升胨，5.0克/升NaCl，15克/升琼脂，pH7.0）的板上培养，温度为28℃。有些土壤杆菌属菌落被刮下并重新悬浮在YEP肉汤或基础培养基中。每1.5毫升培养基约悬浮25-50个菌落。悬浮菌落可通宵生长。

将G.clandestina栽植在温室中去开花。每缽（直径为25厘米）栽植一到两棵，缽中装有杀过菌的混合物，各组分的构成是土壤∶Promix∶砂子＝2∶2∶1，每周补给一次Peters    20∶20∶20全套植物养料。白天短的时候，自然光被补充以13小时的人造（高无钠灯）光。螨的搔扰用Plictran（Dow化工公司的产品商标）或Pentac（Zoecon公司的产品商标）控制。白蛾用Orthene（Chevron公司的产品商标）来控制，而粉状的霉用Benelate（Dupont公司的产品商标）控制。

从植物的未成熟叶子上取出叶切片并把叶片放置到盛有冷水的器皿中以保持组织的湿润。将外植体洗涤并用70%的异丙醇杀菌1分钟，再用加了一滴Liguinox的10%的Chlorox杀菌10-15分钟。然后用无菌水漂洗两次各五分钟。

将植物组织铺放在含有细胞动素的再生培养基上，每板铺放20～30个植物材料的切片，进行一到两天的预培养。

土凝杆菌属的通宵悬浮培养物在含有卡那霉素的YEP培养基上被划出纹状，以便得到单个菌落。将单个菌落精选出来并被用25毫升的含有卡那霉素的YEP肉汤接种。培养物在28℃下在一个摇动的水槽中通宵生长。使培养物在高速下旋转，以便收集重新悬浮在YEP肉汤或基础培养基中的细胞。

经过预培养之后，每一个组织的切片都用0.5-1.0微升的重新悬浮的隔夜培养物接种。这种重新悬浮培养物中每毫升含有约10⁶个微生物。以前的试验表明，当把组织浸入培养液时，土壤杆菌生长过速并杀死了组织。允许生物质在有土壤杆菌的环境中生长两天。然后转移到含有Mefoxin的再生培养基中，Mefoxin的浓度是300到400微克/毫升。

经过二至七天后，将物质转移到含有卡那霉素和Mefoxin的再生培养基中，以便允许选择变性了的组织，卡那霉素的浓度为100-300微克/毫升。

两周一次让物质在含有抗菌素的再生培养基进行中间培养，直到嫩枝形成为止。然后将带有嫩枝的小植株直接转移到生根培养基中。生了根的植株就再生出来了。

例15：大豆（Glycine    max）的变性

将含有媒介pH4-1的根瘤土壤杆菌按例14描述的方法培养，pH4-1具有卡那霉素抵抗标记基因和真蛸合成酶基因。（pH4-1媒介-NRRL登记专利No.B-18009.登记日：1985年10月25日，属美国农业部，农业研究中心，美国中西部地区，北方区研究中心，类似E.colik802媒介（pH4-1））。

G.max植物象例14中描述的那样栽植。用于变性的组织来自3-5毫米长的未成熟的种子的未成熟子叶组织。将荚从植物上取下并贮藏在冷水中，然后用冷水漂洗洗去灰尘或者杂质，并有助于以后切下做真菌感染。将荚对着光线，把长约3-5毫米的种子预选出来，将荚在70%的异丙醇中杀菌一分钟，再在加有一滴Liquinox的25%的Chlorox中杀菌10-15分钟，然后在无菌水中漂洗两次，每次五分钟。将未成熟种子从荚中切开，并将胚胎轴切除，切口穿过两个子叶，从末端直到嫩枝冠区域。在胚胎的另一端加压，直到子叶露出。

将子叶对以每100毫米盘子十个的比率盘置在再生培养基上（每盘30毫升培养基），并预培养两天。

所用的再生培养基是如下的胚胎发生培养基：（1）MS盐、维生素B5，3%蔗糖，500毫克/升谷酰胺，100毫克/升蛋胺酸，10毫克/升NAA，0.6%植物琼脂，高压消毒前pH值为5.9;（2）MS盐，维生素B5，3%蔗糖，500毫克/升谷酰胺，100毫克/升蛋氨酸，10毫克/升2，4-D，0.6%植物琼脂。

预培养的组织被接种以0.5微升再悬浮的土壤杆菌。切不可加太多的土壤杆菌，因为它的生长将超过组织并杀死组织。用来接种的土壤杆菌悬浮液每毫升中约含10⁶个微生物。允许子叶在有细菌的环境中生长两天，然后转移到含有抗菌素和卡那霉素的新鲜的胚胎发生培养基中，抗菌素是200毫克/升Mefoxin或Claforan，用以杀掉土壤杆菌，卡那霉素是100微克/升，用来选择变了性的体胚胎。

子叶每28天返回到加有抗菌素和卡那霉素的胚胎发生培养基中再培养一次，直至体胚胎形成。

所用的嫩枝增殖和生根培养基如例14中所述。遵循例14和上述P.Lazzeri等人（1985）提出的步骤去获得再生的植物，该植物已用含有pH4-1的土壤杆菌变了性。

将植物移植到例12的盆栽土壤混合物中，并使其生长，直到叶组织能为了试验的目的被分出。为了检验卡那霉素抗性，通过在有50和100微克/毫升卡那霉素的情况下愈合组织的形成试验来考验组织，而对于真蛸酶，则通过低电泳来检验。组织在卡那霉素存在的情况下生长而且对真蛸酶试验呈阳性。

植物在继续生长，显得很正常而且长出了几个种子荚。

例16：遗传型胚胎发生潜力的筛分

遗传型筛分的目的，是确定各种遗传型的胚胎发生潜力以及它们对根瘤土壤杆菌属菌株A281的敏感性，菌株A281又称EHA101，在E.Hood等人（1985）文章（《细菌杂志》168：1291-1301页）中已有描述。根据需要，可以从作者处获取这种菌株。用于这项筛选的培养基，由含维生素B5的MS盐、1.5%蔗糖、10毫克/升NAA和0.2%介尔雷特组成。将子叶从长度为3-5毫米的未成熟胚胎上取下，并除去胚胎轴。将子叶背轴的一面朝上放置在培养基上。结果列入表17中。“应答百分率”是指盘上产生了体胚胎的子叶数量;表头“应答基数”下面的“平均数”，是指有形成体胚胎反应的子叶所产生出的体胚胎数;表头“总基数”下面的“平均数”是指每盘子叶形成的体胚胎数。“N”是指经过再生鉴定的子叶的数量。土壤杆菌属敏感度通过瘿的形成来测定。

发现了几个优良的再生遗传型，其中包括两个再生性状比以前的标准的J103好得多的遗传型，这就是“Manchu”和“Williams”。还鉴定出几个遗传型，它们在同土壤杆菌属共同培养后，未成熟的子叶产生了瘿。最好的遗传型依次是McCall、J103、Williams和Peking。

例17：特定的胚胎发生区域的鉴定

对于经过NAA或2，4-D诱导后体胚胎的发生和发育情况，我们从组织学上进行了测定。

将培养植物J103的合子胚胎放在含有N10.00或D25.00或D0.50（NAA或2，4-D，单位是毫克/升）的培养基（MS盐、维生素B5、1.5%蔗糖和0.65%琼脂）中培养，而培养物McCall的合子胚胎则在N10培养基中培养，以一或二天的间隔，将它们滞留在3%的gluteralde中，gluteralde在pH6-8的磷酸盐缓冲剂或FAA（甲醛∶乙酸∶醇）中（M.E.McCulley等人（1981）文章，“植物结构的研究、原理和选用的方法”，澳大利亚，墨尔本，6.58-6.92）。

让固定的胚胎穿过TBA组，到石腊中，以便脱水，并装在Tissue    Prep（西各马公司，St.Louis）中。在一个旋转的切片机上将胚胎切成8-10微米厚的薄片。以适当方式将薄片放在如下染色剂中染色：苏木精（J.E.Sass（1985）《植物学的微技术》）、藏红、甲苯胺蓝（上述M.E.McCulley等人（1981））、尼罗红、苯氨蓝（上述J.E.Sass（1985））、碘（W.A.Jensen（1962）《植物学的组织化学》）、高碘酸品红试剂（上述J.E.Sass（1985））。

大豆体胚胎可来自单一细胞，也可来自多细胞。胚胎发生的方式是从球状到串珠状，这与合子胚胎的情况类似。由于体胚胎在含有NAA的培养基上继续形成，因此，下胚轴尤其是基础部位会比合子胚胎更长，而尖会萎缩或不出现。子叶开始时几乎都很正常，但往往在尺寸方面小一些。当2，4-D被用作生长源时，最明显的异常是子叶的产生不良，导致体胚胎呈角状，通常，顶部受抑阻或不出现。

我们观察了两种生长素处理所带来的起动模式方面的差别。对于两种生长素来说，虽然都有间接的和直接的体胚胎发生，但体胚胎直接起始的方式却不同。2，4-D使细胞的外皮层和几个相邻的下层形成分生区域。沿这个区域起始的胚胎有一个特点，即它具有宽阔的胚柄区域。这象征着是从多细胞起始（E.G.Williams等人（1986）《植物学年鉴》57：443-462页）。NAA胚胎常起始于壁厚的细胞，这种细胞被邻近的细胞特别是正在死亡的细胞所包围。我们看到的窄胚柄，象征着是从单细胞开始。

就两种生长素中任何一种而言，子叶阶段的体胚胎同瓦解的细胞区有关，那里的细胞也许已充当了正在发育的胚胎的营养源，或许它们使某些细胞分离出来，进入胚胎发生阶段。

在两种生长素的处理上，都有显示生胚组织性状的细胞的形成，也就是说，细胞小，深色的细胞质，有独立的核仁和众多淀粉颗粒的、大的、深色的细胞核。生胚细胞在相邻细胞之间显出很分明的细胞壁。从这些组织形成的胚胎，其胚柄很窄。在这些组织中，有些细胞是多核的，核有三种不同的大小，这使细胞也明显变大，同megametogenesis期间的细胞不无相似。

此外，从外植体子叶的不同区域产生出体胚胎。在含有NAA的培养基中，胚胎沿外植体子叶未切部位的边缘起始。这个“能育新月型”区域如图1所示。这里，大量的形状正常的体胚胎开始在子叶上产生，这些子叶的背轴表面贴近培养基。当放到加有2，4-D的培养基时，背轴表面贴近培养基的外植体子叶，从外植体子叶的中心近轴区域起始。这个走向似乎阻止了胚胎从“能育新月区”开始发生。这个“能育卵型”区域如图1所示。将子叶近轴面贴近有2，4-D的培养基上，产生的正常胚胎更多，而且是从边缘“能育新月型”区域而不是从中心近轴区域起始。2，4-D产生的细胞总数更多。在这项研究中，通过生长素的处理，所产生的正常胚胎数没有什么不同。但是，从生长素-走向的相互关系角度来考察，使近轴面放到有2，4-D的培养基上，比把背轴面放到培养基上能产生更多的正常胚胎。表18示出了培养基和走向在胚胎发生中的作用。

例18：浸解

将未成熟子叶挤压到无菌的35号网（500μm）上使之浸解，这是为弄伤子叶上有胚胎发生潜力的区域而提出的一种方法。每个2mm²的网片上放20个子叶，浸解后产生一些1/4mm²的碎片。如果组织留在网上，网本身在变性/再生过程中又成了很适用的工具，能便利而有效地将大量子叶从一种培养基转至另一种培养基。

与尼龙网相比，不锈钢网得到的胚胎发生效率更高。钢的优点是易于消毒且能反复使用。用青铜网则一无收获，而且它对整个组织有毒性。存培养基中再生能力弱的遗传型（如McCall、Peking或Manitoba    Brown），尤似用不锈钢网浸解为宜。这些遗传型，浸解后的子叶的确比未浸解的子叶产生更多的体胚胎（见表19）。向不锈钢网输入微弱电流（2μA），则使胚胎发生频率进一步提高。

例19：已变性植物的变性与再生

Peking品种的植物是在温室中生长的。荚经过表面消毒，去掉胚胎轴的未成熟子叶被切成3-5毫米长（上述P.A.Lazzari等人（1985）文章）。并非成熟子叶的所有细胞均能形成体胚胎。同NAA接触后，只有很窄的新月型区域的细胞具有胚胎发生潜力，这个区域靠近倒17中描述的未成熟子叶的末端周边。在这个区域里，细胞直接生胚而形成体胚胎，也就是说，不经历愈合组织阶段。为了弄伤这个区域并使土壤杆菌属与有胚胎发生潜力的细胞直接接触，我们将未成熟子叶压到500μm网上并放在含MS盐、维生素B5、1.5%蔗糖、10毫克/升NAA和0.2%作为凝固介质的介尔雷特的培养基中。浸解后的子叶被接种以LBA4404（pH5pZ3D）的隔夜悬浮液。PH5pZ3D是微小的Ti质粒，含有15kd玉米醇溶蛋白的编码区，排在β-菜豆朊促进剂的后面。这个质粒也含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因，该基因可用作可以选择的标记物。继在20℃下隔夜培养之后，将组织转移到上述的培养基中，该培养基里加有500毫克/升Mefoxin（Cefoxitin）。到30天时，将体胚胎移出并放到上述培养基上，只是生长调节剂换成苄基腺嘌呤、激动素和玉米素各0.17毫克/升以及0.05毫克/升NAA。每隔一月，将胚胎移至这种培养基，直到出芽。发芽的胚胎移至用0.15%介尔雷特固化的HPN盐添加的培养基。再将生了根的植物移植入土并使之在温室中正常生长。该植物成熟后，形态上无异常，还结出了正常的种粒。

从叶组织上提取出DNA并用EcoRI消化，叶组织是从成熟植物的接近顶部的地方采集的。用PH5PZ3D的4.7kb    EcoRI片断做了南方杂交试验。PH5PZ3D含有菜豆朊/玉米醇溶蛋白结构。EcoRI片断与2.7kb取自变性大豆的染色带杂交。起控制作用的未变性大豆的DNA上，未见杂交出现。真硝试验呈阴性。

例20：变性

下面更详细地描述前例中采用的已变性和再生的植物的变性方案。从经过表面消毒的荚上切取近5000个3-5毫米长的未成熟子叶，然后，背轴面朝下，放到不锈钢或尼龙网上挤压。再将网放到N10培养基中（MS盐、维生素B5、10毫克/升α-NAA、1.5%蔗糖和0.2%介尔雷特）。每网片有20个浸解小叶，同50微生隔夜悬浮培养物接种，培养物是土壤杆菌属菌种EHA101（无害型A281），携有PH5PZ3D。在28℃下，将浸解后的组织同土壤杆菌属一起进行通宵培养。

第二天，将培养物移到N10培养基上，并添加10毫克/升G418和500毫克/升Cefoxitin。一个月后，将产生的体胚胎移到BKZN培养基中（MS盐、维生素B5、6-BA、激动素和玉米素各0.017毫克/升、0.05毫克/升α-NAA、2%蔗糖、0.2%介尔雷特），并添加500毫克/升Cefoxitin，以便体胚胎进一步生长和发育。胚胎一直放在BKZN培养基中，每隔一月转移一次，直至出芽。届时，即可将它们转移到有HPN盐的培养基中。

例21：接种的时间

为了确定向外植体子叶加入土壤杆菌的最佳时间，我们将取自植物的子叶（每次处理100个）放到含1.5%蔗糖的MS培养基中，按表20中的时间，在子叶上接种1微克土壤杆菌属的隔夜悬浮液，经过二天共同培养再放到含500毫克/升Mefoxitin的相同培养基中。结果如表20所示。愈合组织按0-5分等级，其中0表示无愈合组织，1表示愈合组织可以辨认，5表示大愈合组织。

例22：共同培养时间

为了鉴定在土壤杆菌中暴露三天（这个时间是Owens和Cress采用的，（1985）文章，《植物生理学》，77：87-94页）是否比暴露时间短些能产生的结果要好，我们将McCall和J103遗传型各一百个胚胎从植物上取下以后立即同土壤杆菌属A281接种，经过1天和3天的共同培养，我们比较了应答频率，结果如下：

McCall一天：子叶中52.78有反应，平均愈合组织率为1.05±0.023。有三个继续进入不含荷尔蒙的培养基。

J103三天共同培养期：子叶中13.89有反应，平均愈合组织率为2.28±0.24。

McCall三天共同培养期：子叶上出现46个“瘿”。它们未能在不含荷尔蒙的培养基中生长，因此，它们起初也许不是瘿。这种处理的结果应当不出现瘿。

一天共同培养显得最好。甚至尽管J103和McCall不象其他遗传型（比如Peking和Century）那样敏感（即对组织破坏的敏感），但随着在土壤杆菌属中暴露时间的延长，组织的死亡也开始增加。

例23：选择介质

我们实验的目的是确定选择介质G418和卡那霉素的最佳级别以及怎样使用琼脂和介尔雷特。

早先的试验数据表明，25毫克/升G418也许太高。在不同的培养基中，应用两个不同的选择介质以各种浓度对胚胎形成的反应作了比较，结果如下：

K50+琼脂：有反应的胚胎为-0/10，颜色：黄中带绿。

K50+介尔雷特：有反应的胚胎为-5/10，颜色：黄中带绿到绿。

K100+琼脂：有反应的胚胎为-1/10，颜色：黄中带绿。

K100+介尔雷特：有反应的胚胎为-3/10，颜色：黄中带白到浅绿。

K200+琼脂：有反应的胚胎为-0/10，颜色：黄-绿。

K200+介尔雷特：有反应的胚胎为-0/10，颜色：黄中带白-黄绿。

K300+琼脂：有反应的胚胎为-0/10，颜色：黄-绿。

K300+介尔雷特：有反应的胚胎为-0/10，颜色：黄-白。

G10+琼脂：有反应的胚胎为-0/5，颜色：4/5标准绿，1/5白色。

G10+介尔雷特：有反应的胚胎为-0/5，颜色：4/5标准绿，1/5白色。

G15+琼脂：有反应的胚胎为-0/10，颜色：全呈标准绿。

※G15+介尔雷特：有反应的胚胎为1/10，9/10标准绿，1/10白色。

G20+琼脂：有反应的胚胎为-1/10。绿中带黄。

G20+介尔雷特：有反应的胚胎为-0/10，9/10绿中带黄，1/10白色。

G25+琼脂：有反应的胚胎为-0/10，5/10绿，5/10黄-绿。

G25+介尔雷特：有反应的胚胎为-0/10，7/10黄-绿，3/10白色。

※G418的传播显得很不均匀。

G418比卡那霉素产生的结果更一致，处在琼脂和介尔雷特之间。卡那霉素在琼脂上比在介尔雷特上的结果更好。G10或K50在琼脂上的用量要足以达到筛选变性组织的程度。

例24：抗菌素的选择

准备了含有媒介PH5PZ3D的根瘤土壤杆菌属菌株EHA101（A281）和LBA4404。这种媒介带有卡那霉素抵抗基因和真硝合成酶基因。将细菌放在LB培养基上培养（5.0克/升酵母提取液、10毫克/升胰胨、5.0克/升NaCl、15克/升琼脂，pH7.5），培养温度为28℃。有些土壤杆菌属菌落被剥落下来，放入LB肉汤里重新悬浮。让悬浮菌落在28℃下隔夜生长。为LBA4404（PH5PZ3D）而在培养基中使用的抗菌素是：链霉素250毫克/升，卡那霉素25毫克/升以及2.8毫克/升四环素;为EHA101（PH5PZ3D）而用的抗菌素是：卡那霉素50毫克/升、萘啶酮酸20毫克/升以及四环素2毫克/升。

对于从几个遗传型的组织中产生的胚胎，经过与含PH5PZ3D的土壤杆菌共同培养后，我们对于选择或不选择都做了测定。每次处理时用一百个子叶对，每个尼龙网片上浸解10个子叶对。所用的全部细菌均含PH5PZ3D。共同培养期仅一天。结果如表21所示。

每次处理所得到的体胚胎数，列在表格的最后一栏。LBA4404似乎在Peking上更有效力，而EHA101似乎对J103最佳。

本实验的目的之一，是鉴定在共同培养期之后是否必须开始选择或最好就开始选择。初步的结果表明，除Peking外，胚胎（局部变性的）将在J103的选择下继续发育。不论那种情况，所获得的胚胎数量都很小，胚胎占压倒多数也不用担心。即使不进行选择，仍可获得变性的细胞。

表1.荷尔蒙在体胚胎发生中的作用（汇集的数据，17个基因型，全胚胎培养）

荷尔蒙浓度    胚胎发生    平均胚胎    效率

（毫克/升） 频率（A） 数（B）^＊（A×B）

IBA1.0    7.0%    1.80±0.58    0.13

IBA2.5    11.3%    1.22±0.19    0.14

IBA5.0    17.4%    1.33±0.14    0.23

IBA10.0    17.1%    1.33±0.19    0.23

NAA1.0    12.5%    1.75±0.31    0.22

NAA2.5    15.4%    1.09±0.09    0.18

NAA5.0    28.3%    1.41±0.19    0.40

NAA10.0    38.7%    1.72±0.21    0.67

2，4-D1.0    20.3%    2.08±0.95    0.42

2，4-D2.5    24.3%    1.82±0.32    0.44

2，4-D5.0    39.1%    2.56±0.54    1.00

2，4-D10.0    46.8%    3.83±0.58    1.80

NAA    5.0，BAP    0.01    23.2%    1.69±0.33    0.39

NAA    5.0，BAP    0.05    10.1%    1.71±0.36    0.17

NAA    5.0，ABA    0.1    11.8%    1.38±0.18    0.16

^＊在这个和以后的表格中，平均胚胎数数据以数值和该数值的标准误差的形式列出。

表6.胚胎尺寸在体胚胎发生中的作用（从17个基因型汇总的数据，在表1的前十二种培养基中进行全胚胎培养）

胚胎尺寸    胚胎发生    平均胚胎    效率

级^＊频率（A） 数（B） （A×B）

2.5mm    16.6%    1.81±0.26    0.30

3.0mm    14.9%    1.92±0.21    0.29

3.5mm    18.9%    1.78±0.22    0.34

4.0mm    27.6%    2.05±0.25    0.57

^＊.未成熟的全种子的长度接近于0.5毫米。

表7.来自十七个大豆基因型的体胚胎发生（汇数的数据来自十二个培养基，全胚胎培养）

胚胎发生    平均胚胎    效率

基因型

频率（A）（排列顺序）    数（B）    （排列顺序）（A×B）

Acme    11.2%    （15）    1.20±0.20    （14）    0.13

Ada    13.4%    （14）    3.44±0.90    （1）    0.46

Agate    0    （17）    0    （17）    0

Altona    22.3%    （6）    1.00±0.99    （15）    0.22

Crest    24.6%    （3）    1.72±0.23    （11）    0.42

Flambeau    14.3%    （13）    1.00±0.68    （16）    0.14

Hidatsa    18.8%    （10）    2.00±0.82    （7）    0.38

Manitoba    22.7%    （5）    3.20±0.86    （2）    0.73

Brown

Morsoy    17.8%    （11）    1.75±0.41    （10）    0.31

Norman    5.8%    （16）    2.33±0.88    （6）    0.14

Ogemaw    28.8%    （1）    2.79±0.86    （3）    0.80

Pagoda    16.4%    （12）    2.36±0.69    （5）    0.39

Pando    21.7%    （7）    1.46±0.24    （13）    0.32

Portage    23.6%    （4）    2.67±1.12    （4）    0.63

Sioux    25.0%    （2）    1.88±0.44    （8）    0.47

McCall    20.3%    （8）    1.65±0.13    （12）    0.33

PI408.294A    19.0%    （9）    1.79±0.25    （9）    0.34

18.0±1.77%    1.90±0.21    0.37±0.05

表8.培养基的盐成份和氮源在体胚胎发生中的作用（汇总数据来自两个培养基N5和D5），全胚胎来自10个培养的基因型。

胚胎发生    平均胚胎    效率

盐成份

频率（A）    数（B）    （A×B）

L2盐    18.1%    1.63±0.23    0.30

MS盐    23.8%    1.45±0.13    0.35

MS+0.5克/升    22.7%    2.76±0.65    0.63

酪蛋白水解液

B5盐    8.8%    1.33±0.24    0.12

B5+1.65克/升    14.8%    2.12±0.71    0.31

硝酸铵

B5×1.5克/升甲    22.2%    1.86±0.24    0.41

硫氨酸和8.5克/升

谷氨酰铵

表11.在三种2，4-D浓度上，蔗糖在体胚胎发生中的作用（PI408.294A，全胚胎培养）

2，4-D浓度    胚胎发生频率

（毫克/升）    蔗糖浓度（%）

2.5    5.0    7.5

2.0    33.3%    16.7%    10.7%

5.0    53.3%    38.2%    3.7%

7.5    50.0%    28.1%    36.7%

表13.剖切在体胚胎发生中的作用Ⅰ^＊（培养植物：McCall，N10培养基）

胚胎发生    平均胚胎    效率    正常胚胎

剖切处理

频率（A）    数（B）    （A×B）    频率

全胚胎    33.9%    1.77±0.14    0.56    46.2%

破坏了的子叶^＊＊83.6% 2.75±0.14 2.30 32.6%

移去了轴^＊＊＊92.4% 3.64±0.18 3.36 33.0%

平分了的胚胎^＊＊＊＊91.6% 3.33±0.19 3.05 35.6%

^＊.所有给出的数据是以“每个胚胎”为基础。

^＊＊.两个切口，子叶长度的三分之一，穿过两个子叶。

^＊＊＊.平铺的，分离出来的子叶对。

^＊＊＊＊.垂直长轴平分，所有部分平铺。

表18    培养基和走向在体胚胎发生中的作用

平均    标准误差

胚胎总数    D25    8.42    1.588

N10    1.92    0.199

远轴    D25    11.13    0.989

N10    2.08    0.119

结合的    4.77    0.364

近轴    D25    5.70    0.855

N10    1.76    0.122

结合的    2.98    0.291

正常胚胎    D25    1.22    0.580

N10    0.35    0.074

非正常胚胎    D25    7.19    1.334

N10    1.56    0.186

远轴-正常    D25    0.52    0.133

N10    0.65    0.072

结合的    0.63

近轴-正常    D25    1.93    0.557

N10    0.04    0.032

结合的    0.61

远轴-不正常    D25    10.61    0.949

N10    1.43    0.100

结合的    4.16

近轴-不正常    D25    3.75    0.679

N10    1.72    0.119

结合的    2.34

表19

尼龙网和不锈钢在胚胎发生中的作用

胚胎/20个子叶

钢/尼龙    增进%

基因型    尼龙    钢

J103    5.00    5.40    0.84

Manchu    0.50    18.10    0.004

McCall    0.22    12.40    0.02

Williams    2.50    2.00    0.73

Heilongjiang    10    1.83    7.75    0.12

Douglas    0.70    2.50    0.092

表20

基因型    McCall    J103

接种时间    愈合的子叶    愈合组    愈合的子叶    愈合组

（%）    织评价    （%）    织评价

0天    53%    1.65±0.08    75.55%    2.30±0.09

1天    45.56%    1.82±0.12

2天 0^＊- 45.56% 1.85±0.13

^＊.两次独立的试验的结果

看来，最佳结果是在子叶从植物上取下时即加入土壤杆菌属。J103比McCall对土壤杆菌更敏感。形成在子叶上的愈合组织被除去并放到不含荷尔蒙的MS培养基中，添加0.5克/升酪蛋白氨基酸（MS-CAS培养基）。

表21

处理    基因型    细菌    开始培养基

添加物 体胚胎^＊

（微克/升）

a    J103    LBA4404    Befoxin    50μg/ml    1

b    J103    EHA101    mefoxin    500μg/ml    29

c    J103    LBA4404    mefoxin    500μg/ml;    0

G418    10μg/ml

d    J103    EHA101    mefoxin    500μg/ml;    36

G418    10μg/ml

e^＊Peking LBA4404 mefoxin 500μg/ml 10

f    Peking    EHA101    mefoxin    500μg/ml    0

g    Peking    LBA4404    mefoxin    500μg/ml;    0

G418    10μg/ml

h    Peking    EHA101    mefoxin    500μg/ml;    0

G418    10μg/ml

^＊见例19说明

Claims (10)

1、大豆属物种植物的体胚胎发生的一种方法，它包括：

a)从上述植物的未成熟胚胎中切取子叶组织；

b)将所说的子叶组织放在含有NAA族生长素的诱导培养基中培养，生长素的浓度至少约为15毫克/升。

2、如权利要求1所述的方法，其特征是生长素包括NAA。

3、如权利要求1所述的方法，其特征是b）阶段的胚胎被继续培养，以再生全植株。

4、如权利要求1所述的方法，其特征是，所说的子叶组织的变性，是靠在体胚胎发生前将外源DNA引入子叶组织的基因组。

5、从大豆属物种植物的体细胞再生全植株的方法，它包括：在含有低于2%（重量/体积，W/V）碳水化合物以及浓度在约5.0毫克/升和约50毫克/升之间的生长素的培养基中培养所述的细胞，以便产生胚胎，并将上述胚胎放入合适的培养基中以便生出全植株。

6、如权利要求5所述的方法，其特征是，所说的体细胞取自子叶组织的能育新月型区域，子叶组织取自未成熟胚胎。

7、如权利要求6所述的方法，其特征是，所说的子叶组织经紧压到网上而被浸解，目的是将所说的组织分成可以看见的细胞群。

8、如权利要求6或权利要求7所述的方法，其特征是，所说的体细胞已经因外源DNA被引入它的基因组而被变性。

9、一种生产含有外源DNA的大豆属物种植物的方法，它包括：

a）浸解取自上述物种的未成熟胚胎的子叶组织，这些物种包含“能育新月型”区域;

b）让上述浸解了的组织同上述外源DNA接触，使所说的DNA被引入所说组织的细胞;

c）将上述浸解了的组织同该组织的胚胎发生培养基接触，以便产生体胚胎;

d）将上述体胚胎转移到合适的培养基中，以便再生出含有来自体胚胎的外源DNA的全植株。

10、如权利要求9所述的方法，其特征是，继b）阶段之后，不使用防止或抑制未变性的组织生长的选择培养基，变性体的辨认和选择是通过对外源DNA的遗传型的鉴别。