CN1219102A - 繁殖和/或选择植物材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微量繁殖木本植物的枝条,有根枝条或幼苗的方法,该方法包括在通氧的液体培养基中培养枝条,有根枝条或幼苗,该枝条,有根苗或幼苗被浸没在培养基中。它们可自由移动,例如在培养基中翻滚,或其活动可受限制。所得的植物材料可以高产量获得并具有高质量。当遗传修饰的苗,有根苗和幼苗具有可选择的特征,例如,对除草剂或抗生素的抗性时,可经过在含有选择工具,如除草剂或抗生素的通氧液体培养基中浸没培养来选择它们。

Description

繁殖和/或选择植物材料的方法

本发明涉及营养繁殖植物材料和/或选择遗传修饰的植物材料的方法。

体外营养繁殖(微量繁殖(micropropagation))技术广泛用于商业规模的植物生产。这些技术比其它营养繁殖方法(例如，经扦插的繁殖)具有潜在的优势，它可在给定的时间期限内生产大量植物。而且，该技术对于繁殖遗传改造的植物材料有用。对于某些植物基因型，微量繁殖技术可能是用于营养繁殖的唯一可行的方法。然后，尽管在园艺学上广泛使用，但用于木本植物，例如，树的繁殖的微量繁殖技术的商业用途还不广泛。

绝大多数用于木本植物营养繁殖的微量繁殖技术使用胶状生长培养基或使用其它物理工具以支持植物材料位于液体生长培养基中或在其上。(胶状培养基常称为“固体”，不管它们实际上是固体还是半固体。除非另有说明，本文使用的术语“固体培养基”或“半固体培养基”包括胶状培养基的固体及半固体形式)。然而，采用固体培养基或物理支持物的微量繁殖技术的缺陷在于它们一般劳动强度大且较昂贵。另外，用于木本植物的微量繁殖技术常存在的缺陷在于它难以生产均一的产品。其原因在于常常难以诱导现存分生组织，例如，腋芽，均一发育。这可能是由于分生组织处于静止或休眼状态和/或由于一旦开始生长会出现不均一伸展和发育。对于商业生产，产品的均一性极端重要。为生根而栽种的枝条的任何发育不均一性常在随后的植物发育期间被放大。

因而很明显鼓励开发其它的更有效的，花费更低的且能生产更均一产品的用于木本植物的微量繁殖技术。

已有建议使用浸没液体培养基用于微量繁殖，因为相对于固体培养基它有许多潜在的优势，包括更大的自动化能力且因而降低花费。已广泛采用植物组织的浸没培养用于细胞培养，即，单个细胞，小群未分化的细胞和胚发生组织或分生组织的生长。然而，使用液体培养基繁殖枝条和小植株的尝试受许多问题的阻碍，似乎该技术对某些特定植物仅具有非常有限的应用。

枝条的超度含水(Hyperhydricity)是液体微量繁殖系统中经常碰到的问题，例如见，Aitken-Christie等1994和George EF 1993/1996。

超度含水以前称为透明化(vitrification)(渍水)，但这在技术上是不正确的。超度含水指具有异常形态学外观和生理学功能的体外培养材料的条件。对超度含水的敏感性在所有植物中不相同。典型的症状是若干具有较短的节间，脆而卷曲或半透明的叶片，解剖学异常，包括较大的细胞间空隙，维管系统和表面蜡质减小；气孔和叶绿体不发达；生化特征改变，包括木质素和纤维素减少及酶活性改变。

实际上所有体外培养的植物，即使生长于半固态培养基中时，显示出某种程度的与超度含水相关的一些症状。然而，如果症状是轻微的且易于逆转，则视觉症状是不相关的。在这些情况下，轻微症状对植物繁殖可能不会有不利影响。可恢复材料的繁殖，即，繁殖体形成根，和随后的特性及由此产生的价值不受有害影响。

当出现上述特征性症状的极度表达时，超度含水性可在植物繁殖中引起问题。在体外繁殖条件下表现出特征性症状极度表达的超度含水枝条一般变得难以繁殖且尽管仍在培养物中也可能死亡。它们不能正常产生不定根或仅产生很少的根。超度含水枝条从体外环境转移到(例如)温室时难以存活。因此，该枝条一般不适合于生根和/或随后繁殖。

超度含水在木本种类的繁殖中最常出现。在木本植物中，枝条和小植株的超度含水是一个普遍的问题且可能是较严重的。事实上，许多木本植物易于严重超度含水，即使生长于固态或半固态生长培养基上。

严重超度含水在液态微量繁殖系统中是一种极常见的现象。由于这种原因，一般经过使用固态或半固态支持物，例如，胶状培养基避免液体系统。在大多数情况下，如果使用液体系统，要小心谨慎以避免将植物材料完全浸入液体培养基中。

已开发了许多繁殖技术，其中枝条或小植株漂浮于液体培养基上或生长于非浸没(浅的)液体培养基系统或定期用培养基淹没的系统中。Gupta等(植物科学通讯20:195-201,1981)描述了一种使用固态及半浸没液体培养基状态增殖和生根柠檬桉籽苗和成熟克隆的方法。然而，该技术与使用固态或半固态培养基的技术相比仅具有有限的优势。

经过使用诸如paclo-butrazol和嘧啶醇的生生延缓剂已尝试减轻液体培养物的超度含水，该生长延缓剂减缓最易受影响的组织，即叶的生长。然而，生长延缓剂的使用仅对经块茎或球茎在体外繁殖的诸如唐冒蒲属或尼润属的种类取得了成功。

本发明提供了微量繁殖木本植物的枝条，带根枝条或籽苗的方法，它包括在通氧的，例如，通气的液体培养基中培养枝条，带根枝条或籽苗，该枝条，带根枝条或籽苗浸没在液体培养基中。一般搅拌该培养基或使之移动。

可允许枝条，带根枝条或籽苗在液体培养基中移动，例如，可使它们在液体培养基中自由移动。例如，翻滚，如自由翻滚。另外，其移动可受到限制或受阻碍。

本发明的方法本身简便且花费低，减少了劳动消耗且产生适于大规模商业用途的优质材料，如附图中图1所示。

图1显示了4个枝条团：

1．用作接种物的典型的微量繁殖的巨桉枝条。

2．在固态微量繁殖培养基(KM培养基)上培养5周后产生的典型的巨桉枝条团。

3a,3b：在根据本发明的液体KM培养基中浸没于液体培养基中27天后收获的2个典型的巨桉枝条团。

在本发明的方法中，在完全浸没于液体培养基的条件下培养枝条，带根枝条或籽苗。可允许枝条，带根枝条或籽苗在液体培养基中移动，例如，可使它们自由移动。例如，枝条，带根枝条或籽苗可在液体培养基中翻滚，例如，自由翻滚。翻滚可以是剧烈的且可以是基本上连续的。另外，枝条，带根枝条或籽苗的移动可受限制或受阻碍。例如，可限制枝条，带根枝条或籽苗，例如，它们可用带孔的限制工具固定，例如，在带孔的容器中，例如，笼子或袋中，在植物生长容器内或在与液体培养基接触的容器分室中。

培养植物材料的液体培养基必须包含足够的氧气以支持植物材料的代谢。一般必须提供氧气，通常以空气的形式，和/或给该系统照明以便通过光合作用产生氧气。

培养基可用机械方式搅拌，例如，借助于机械装置，如，搅拌浆或搅拌器，如磁力搅拌器，或者可搅动含有培养基的容器，例如，摇动，振动或旋转。用于搅动，例如，摇动或搅拌的工具可以给培养基通氧以便足以支持植物材料的代谢。否则，可提供氧(一般以空气的形式)和/或给系统照明以便经光合作用产生氧。

以光合作用产生的氧可完全或部分提供培养所需的氧。经光合作用产生氧所需的光照一般经过对流引起液体培养基的运动。

液体培养基可同时搅拌并经过将氧或更常用的是空气通过培养基来通氧。空气循环技术，有时称为“气升式”技术，对于在本发明的方法中同时提供氧气和搅拌特别有用。在合适的容器，例如发酵容器，如烧瓶、瓶、罐或柱中的液体培养基可经过用例如，一个进气装置导入空气来循环并通氧。该容器常称为“气升式发酵罐”。当允许自由移动时可较容易地调节气体的体积和导入速率来产生对液体培养基并因而对植物材料的所需搅拌程度。

当允许植物材料自由移动时，经过将空气或另一含氧气体通过培养基引起的对培养基的搅拌作用相对于以机械方式，例如，搅拌引起的搅拌作用是优选的，因为它对植物材料的剪切力较低。然而，经过限制植物材料的运动可减小本发明的摇动或搅拌系统对植物材料的剪切力，例如，如下所进行的更详细的描述。在空气或其它气体通过培养基的系统中，也需要限制植物材料的运动，因此搅拌液体培养基但限制植物材料。

如果气体的通过不足以实现所需搅拌，可提供其它搅拌方式，例如，也可摇动植物生长容器或可搅拌其内容器。可照明容器以便经光合作用提供更多的氧。

应注意在液体培养基中接种后，枝条，带根枝条或籽苗可能不易变湿，因为气泡可结合到其表面。如果这样，枝条，带根枝条或籽苗可能漂浮在培养基表面或靠近其表面。培养基中可包括表面活性剂以帮助变湿。然而，即使没有表面活性剂，枝条，带根枝条或籽苗的表面一般在几天内完全变湿。在气升式系统中，如果充分搅拌且它们不受限制，则它们一般会自由翻滚。

如上所述，根据本发明的浸没液体培养方法繁殖的枝条，带根枝条或籽苗可使其在液体培养基中自由运动或者其运动可受限制或受阻碍。

植物材料可经物理方式限制在植物生长容器内的小容器中，或者该容器可分成多个分室，其中一个或多个分室含有植物材料。限制或分室工具应允许足够的液体培养基通过以允许给植物材料通入足够的氧气。带孔的或网状材料可用于构建限制工具，例如，可使用带孔的金属或塑料材料，线网或织物，例如，平纹细布。另外，含新鲜氧的液体培养基可连续或定期地通过含植物材料的植物生长容器，植物材料可一直被浸没。

可用本发明的任意液体培养系统限制植物材料的移动，包括经过摇动或搅拌液体培养基，经过将空气或另一含氧气体通过液体培养基，经光合作用或经过其任意组合的系统。限制植物材料的移动具有减小对该材料的剪切力的优势。如果搅拌培养物，特别优选限制植物材料，因为如果允许其自由移动，搅拌器可能会损伤该植物材料。

用于繁殖的液体培养基可以是适合于繁殖所选的枝条，带根枝条或籽苗的任意培养基。它一般应该包括碳和氮源，所需的有机及无机盐，合适的植物激素和/或植物生长调节剂。合适的生长培养基是已知的，且可选择用于繁殖特定木本植物的合适培养基。可经过省去胶化或其它固化剂修改已知的固态培养基来产生液体培养基。为了根据本发明的应用也可适当修改已知培养基的一种或多种成分的水平，例如，可使用与相应的固体培养基所用的水平相比植物激素和/或植物生长调节剂减少的水平。可用常规方法测定任何特定组分或组分的组合的最佳水平。

应使用合适的培养条件，例如，温度和光照。可优选照明培养物以提供内源氧形成以补充或在某些情况下，甚至代替外源通氧。如果培养物在光照下进行自养生长，则可省去或减少培养基中的碳水化合物源。在这种情况下，可用二氧化碳补充空气或其它含氧气体的供应。另外，如果提供足够的氧以支持植物材料的代谢，可完全或部分在黑暗中进行培养。

在黑暗中培养产生的枝条，带根枝条和籽苗与在光照下产生的相比可能伸长。伸长对于随后的操作，例如，对于枝条或籽苗的解剖可能具有优势。而且，有些植物，例如，巨桉，及其杂交品种伸长的枝条常常比较短的枝条更容易生根。因此，本发明的液体培养系统使得能够操纵光照条件来控制枝条质量，而枝条质量在商业微量繁殖系统中是重要的。

可继续培养直到实现所需的生物量和增殖速率的增加。可在启动或出现生根之前或之后从液体培养基中取出枝条。然后转移进固态生根培养基中用于根的启动和/或发育。如果需要，所用的生根培养基可含有活性炭。另外，可使用合适的有机和/或无机底物，例如，蛭石，混合肥料，土壤或泥炭在体内进行生根的启动和/或随后的根发育。

用于接种的枝条，带根枝条(小植株)或籽苗可经过微量繁殖，或萌发和/或生长于生长室或生长柜，温室或户外来获得。可从栽培品种，克隆或种子，特别是从遗传学上有价值的栽培品种，克隆或种子、或从遗传学上可操作的植物材料获得枝条，带根枝条或籽苗。用于接种的枝条优选具有一个或多个节，例如，从2个到4个节。枝条顶端(顶端分生组织)可存在或可在接种前去掉。去掉顶端分生组织可产生更均一的产物。

一般来说，微生物污染是液体培养系统中的潜在问题。在这种情况下，当从生长于非无菌条件下，例如，在温室或户外的植物获得起始材料时，即使按常规方法进行表面灭菌或消毒，微生物污染也可能是一个具体问题。即使当在无菌条件下生产起始材料时，也可能从其它来源产生微生物污染。

因此，在本发明的方法中采用的液体培养基优选包含抗生素。例如，安灭菌。然而，枝条，带根枝条或籽苗团完全浸入液体培养基的事实与在固态培养基上的情况相比应导致抗生素更有效地穿透枝条团的组织，因此，如果这样，会减小微生物污染的影响。

这对于使用土壤杆菌属介导的转移获得的经遗传操作的植物材料按本发明的方法进行的微量繁殖特别重要。该材料对于随后的微量繁殖可能存在具体问题，因为不可避免地会被土壤杆菌本身污染。在本发明的方法中该问题可减小到最低程度。

尽管如此，优选采取谨慎的态度以最小化外源性微生物污染的潜力，例如，任何空气或其它用于供氧的气体的供应优选经过滤，幅射，化学或其它方式处理以去掉微生物；优选封闭接头和连接部分、装置优选在用前，例如，经高压灭菌来灭菌。优选使用组织培养级材料，例如，管形材料。

本发明的方法适用于木本植物，即，表现出根和/或气生茎的次生生长(次生加厚)的多年生植物，其中该次生生长的结果是形成木材。木材是次生木质部，它由一个或多个下列部分组成：管胞，导管，纤维和射线。木本植物包括森林乔木，其它乔木，灌木和矮灌木。

可用本发明的方法微量繁殖的木本植物的例子包括但不限于裸子植物和双子叶被子植物，例如，用于木浆，用于燃料或用于木料的植物，例如，桉属，松属，云杉属，金合欢属，杨属，桦木属，柚木属和热带坚硬木材；生产水果或坚果的乔木，灌木和矮灌木，例如，苹果，甘橘属，桃，橄榄，胡桃和杏树，咖啡矮灌木，茶藨子矮灌木，和悬钩子的新枝；从中可获得其它商业上有用的产品的乔木，灌木和矮灌木，例如，橡胶树和产生药物上有用的物质或药物上有用的物质的前体的乔木和灌木，例如，紫松属乔木；观赏乔木和灌木，例如，具有观赏花，叶子或树皮的乔木和灌木。

在本发明的液体培养系统中似乎操作特别好的木本植物是硬叶种类。硬叶的定义是“厚的革质叶”。它包括真叶、如桉树，以及叶状柄，如一些金合欢属。认为是硬叶的种类一般是常绿的，且硬叶特性一般与较差的营养获取力及常与干旱耐受性联系在一起。硬叶属的例子有杜鹃花(Rhododendron)，杜鹃花属(Azalea)和山月桂属(杜鹃花科)；木犀榄属(木犀榄属)；许多澳州金合欢属(蝶形花科)；和桉树(桃金娘科)。

然而，在本发明的液体培养系统中操作较好的不仅是硬叶种类。苹果属(苹果)，梨属，樱桃属和蔷薇属(蔷薇科)，连翘属和丁香花属(木犀榄科)是可使用本发明的液体培养系统繁殖的木本植物属的例子。

如上所述，桉属是可按本发明繁殖的硬叶木本植物的例子。桃金娘总属桉树亚属含有许多商业上有用的种，例如，巨桉，蓝桉，光亮桉，E.dunnii，悉尼蓝桉，赤桉，E.urophvlla和其杂交品种。其它商业上重要的桉属种包括王桉，柠檬桉，E.fraxinoides和其杂交品种。

根据本发明的方法的特别优选的实施方案，枝条，带根枝条或籽苗在浸没的液体培养基中繁殖，该培养基借助于循环空气通氧并搅拌使枝条或植物翻滚、优选自由翻滚。在这种常称为“气升式”系统的系统中，压缩空气(或其它合适的气体)输入含液体培养基和枝条，带根枝条或籽苗的植物生长容器中。供应的空气或其它气体优选在其进入植物生长容器中之前加湿，例如，通过水，特别是蒸馏水。

根据本发明的另一优选的实施方案，枝条，带根枝条或籽苗在摇动或搅拌的容器中繁殖。特别优选限制植物材料的移动，例如，在带孔的容器，例如，如上所述的笼或袋中。在有空气通过液体培养基的本发明的培养系统中，限制植物材料的移动也可能是有优势的。

如上所述，优选确保所有的装置和所用的所有其它材料是无菌的以最小化微生物污染。装置优选在用前经高压灭菌，培养基经高压或过滤灭菌，如果可能，优选使用组织培养级材料。装置中的所有接头应仔细密闭。

如果给植物生长容器供应空气或其它气体，优选在将空气供应给容器的入口和出口处提供滤器以维持容器内的无菌。空气供应可通过滤器，例如，活性炭滤器，以去除空气供应中的气态和/或易挥发的污染物。使用的滤器，特别是抽空滤器优选是疏水的，因为从具有冷凝耗尽的气流之潜力的装置中不可避免地会发生蒸发。为进行长期操作，需要在耗尽的气流中插入一个冷凝器以避免可能在滤器中出现的冷凝的增加和潜在的微生物生长，减小流速和可能引起培养物感染(滤器的“生长穿透”现象)。

植物生长容器可以是适合于浸没液体培养的任意大小和形状。用于“气升式”系统和摇动或搅拌液体培养基的系统的合适的容器是熟知的。该容器可以是，例如，烧瓶，瓶，柱或罐。容器可以是玻璃，金属或甚至是合成聚合物，例如，聚丙烯或聚碳酸酯。如果需要照射植物材料以便进行光合作用，容器应允许合适波长的光通过。

将液体培养基引入容器中，优选达到进行培养的温度，向培养基中加入枝条，带根枝条或籽苗的接种物，装置一般被密封。植物生长容器和其内含物维持在合适的温度。例如，从20到30℃，使用或不使用光照。

如果空气或其它含氧气体通过植物材料自由移动的液体培养基，优选将气体供应调节到最大流速以产生稳定的气泡流，使枝条，带根枝条或籽苗浸没并优选在培养基中进行翻滚，特别是自由翻滚。翻滚可基本上是连续的。如果在摇动或搅拌液体培养基的系统中，摇动或搅拌应足以给培养基供应氧且确保植物材料浸没。

选择用于繁殖木本植物的合适的培养基，例如，KM培养基(无胶凝剂)可用于繁殖巨桉和其杂交种。同样，对于其它植物，可从以前用于繁殖该植物的固态或半固态培养基中省去胶凝剂。

在有些情况下，可能使用的植物激素水平比在固体培养基中常规使用的更低，例如，在根据本发明的巨桉的繁殖中，用25％(或更低的)常规量的BAP(6-苄氨基嘌呤)就可获得较好的结果。

当含有顶端分生组织的木本植物枝条，例如，巨桉，在根据本发明的枝条在液体培养基中自由翻滚的气升式系统中繁殖时，对腋生枝分生组织的相关抑制效应似乎差不多完全消除。从接种时存在的节上产生的所有分枝系统含有第三级分枝。从接种枝条顶端延伸生长产生的年龄较小的节具有复杂性减小的分枝系统。原始茎，第一级分枝和第二级分枝的枝条顶端从两种培养基中均产生充分延伸的枝条顶端，具有厚而粗壮的茎及两个或多个完全隔开的节。如果不考虑收获时来源分枝具有的节数目的话，在收获的枝条间具有显著程度的均一性。几乎所有的第三级分枝由枝条顶端(2片叶和分生组织)组成且没有节。

当枝条在本发明的浸没液体培养系统中繁殖时，如果其运动受到限制，例如，经过固定在植物生长容器内带孔的容器，如笼或袋中，所得的枝条表现出与上面对能自由移动的枝条所述基本上相同的特征。它们表现出高度均一性且具有良好的品质。而且，繁殖率一般与自由移动的枝条一样高。似乎高枝条接种密度可导致高繁殖率。

与预期相反，叶片的超度含水(透明化)症状如果出现，也是轻微的且仅在充分伸展的老叶上较明显。幼年材料(即，在枝条顶端和顶节)不显示任何超度含水的明显症状。已发现如果在使用本发明的液体培养技术期间观察到超度含水的任何症状，该症状一般不明显，且在固体培养基的随后培养期间容易逆转，因此对枝条的随后繁殖或生根具有很小或没有影响。

从植物生长容器收获的枝条生根良好，例如，如果是巨桉，生根效率比利用固体培养基的繁殖方法所得的效率更好。如果是Acaciamangium，所得的枝条可在混合肥料中生根并直接转移到温室中，不需在固体培养基上生根。这是最令人惊奇的优点，它在商业上极其重要。杜鹃花属和桉属枝条的品质及其良好的生根效率表明：它们也可直接在混合肥料中生根并转移到温室中，不需在半固态培养基中的中间生根阶段。事实上，根据本发明的方法获得的材料的良好的质量表明，除了金合欢属和桉属外，其它属也可直接在混合肥料中生根并转移到温室中。

总之，本发明的方法产生绿色丰富，健康，高度均一的，能生根或进一步繁殖的枝条。在许多情况下，枝条充分延长，使它们不需进一步特殊的延长步骤就可直接生根。在有些情况下，枝条甚至可直接在混合肥料中生根并且不需在半固态培养基上的中间生根阶段就转移进温室。

有些植物，例如橄榄，当在胶状培养基上繁殖时出现萎黄病(黄色)。相反，当根据本发明的液体培养系统繁殖时，橄榄枝条为绿色且健康。另一优点是橄榄枝条充分伸长。相反，当在胶状培养基上繁殖时，橄榄枝条在生根前需要充分的延长时间，通常是大约一个月。

使用本发明的液体培养系统繁殖的新枝条的延伸率似乎异常均一。对于商业微量繁殖，产品的均一性极其重要。用于生根的枝条的任何发育不均一性常常在随后的植物发育期间被放大。这种不均一性在木本植物中是常见的，导致需要对产品分级且可能中断供应。

在杜鹃花的商业生产中说明了这一问题。在用于杜鹃花生产的所有胶状系统中，在繁殖枝条的基部可形成大量愈伤组织。从该愈伤组织经器官形成常常产生不定枝。这些不定枝由于体细胞克隆变异现象通常不忠实于模式(即，是异常的)。(这一现象常与染色体数目的改变或染色体重排相联系)。通常，商业杜鹃花生产商为了避免愈伤组织和不定枝形成以确保他们所繁殖的植物忠实于模式而不得不牺牲繁殖率。本发明的液体系统避免了这一问题，因为所得的枝条的均一性极好且远优于使用胶体繁殖系统所获得的均一性。具体地说，不产生不定枝，所有新生长从腋芽的发育产生。而且，如上所述，金合欢属枝条可在混合肥料中生根且直接转移到温室中，不需在固体培养基上生根。这一令人惊奇的优势在商业上是极其重要的。

与使用固态培养基的繁殖系统相比，还具有主要的花费优势，包括手工劳动(或使用固态培养基的自动方法的高资本花费)，一次性使用和时间上的节省。例如，为了使用典型的固体培养基方法从单个起始枝条生产50株巨桉枝条需要3步传代培养步骤(和相关的培养基制备及一次性培养皿的使用相联系)且花费3个月。这可与使用本发明的系统的单个培养步骤和一个月相比。

根据本发明繁殖金合欢属和巨桉属时发现了其它的优势。金合欢属枝条形成成簇的植物，可解剖出单个生根的枝条。由分枝的茎组成但没有枝顶的剩余植物簇可再导入根据本发明的方法的液体培养基中，在其中枝条进一步发育。该方法可至少重复几次而对产品的质量或数量没有有害影响。

至于桉树，可从根据本发明的液体系统收获枝条，从枝条簇中解剖出枝条并立即再接种入含新鲜培养基的植物生长容器中。该方法至少可重复几个循环，而对枝条繁殖率无任何明显的影响且在连续循环中产生的枝条的质量无任何损害。据认为在本发明的方法中繁殖材料的再循环具有普遍应用性，可用于除金合欢属和桉属之外的其它属。

再循环繁殖材料产生相当节约和均一的产品，因此在商业上特别有吸引力。

因此，本发明的系统在商业上有很高的吸引力。获得的产量一般比用胶凝系统获得的更高，且通常植株也更高。产品在一般健康状况和其显著的均一性方面的高质量具有特别的商业吸引力。对于有些种类，还有其它具体优势，如上所述。

本发明的另一方面涉及选择经过稳定插入一个或多个感兴趣的DNA序列、特别是经转化方法遗传修饰的，具有可选择性特征，特性或贡献，一般是一个可选择性标记的枝条，带根枝条或籽苗。

为实现所需的遗传修饰将感兴趣的DNA序列导入和稳定掺入植物材料的方法是熟知的，且包括土壤杆菌介导的转移和将DNA直接导入细胞的方法，例如，原生质体的电穿孔，用DNA覆盖的颗粒轰击胚和聚乙二醇介导的基因传递。

由于一些原因，一般优选土壤杆菌介导的遗传转化方法来指导DNA的转化。该方法相当快而简单，相当有效且在劳力，材料或设备方面不昂贵。另外，使用土壤杆菌介导的转化产生的大多数转化植物含有一个或少数完整的DNA插入片段，且插入片段常常稳定地表达。如上面所述的那些直接DNA转化方法通常在植物细胞中产生多个拷贝的DNA插入片段，且由于重排该插入片段常常不完整。多拷贝的插入DNA与导入的(异源性)基因表达的不稳定性相联系。因此，与采用直接DNA转化的方法相比，土壤杆菌介导的方法的优势使得通常仅在植物种类不能进行土壤杆菌介导的转化，例如，由于能再生成完整植物的那些植物细胞不能进行土壤杆菌介导的转化时，使用直接DNA转化方法。

选择标记是熟知的，且包括，例如，提供对选择剂，例如抗生素或除草剂，或对其它选择剂的抗性基因。一般经过将已进行转化的材料在含选择剂，例如，抗生素，除草剂或其它选择剂的培养基上生长进行选择。

选择在因态培养基，即固态或半固态胶状培养基上进行。该方法一般缓慢且费力。对某些植物种类和/或当使用某些选择标记基因和合适的选择剂时，该方法极缓慢，劳动强度大且昂贵。

选择方法包含在含合适的选择剂的培养基上培养以前已使用土壤杆菌介导的或直接转化技术转化的且其中部分细胞含导入的基因的外植体。一般选择条件及选择剂的浓度使得未转化的细胞和组织的生长和/或发育受抑制。含有包含合适选择标记基因之DNA插入片段的细胞继续生长和/或发育且可以因此而被鉴定。另外，当与选择剂接触时，根据不同的表型区分转化和未转化的细胞，例如，根据色素产生的量或生长速率的改变来区分。

最理想的是，条件和选择剂浓度的选择应使得培养较短的一段时间后可区分转化的和未转化的细胞和组织。然而，实际上，足以区分转化的和未转化的细胞和组织的选择剂浓度的存在与在非选择条件下的生长和发育相比也会延缓或延迟转化细胞和组织的生长和/或发育。这可能由于一种或多种因素引起，包括产生对选择剂的最佳水平下的抗性或耐受性的选择标记基因，或由于间接影响。

间接影响包括影响转化的细胞或组织周围的未转化的细胞或组织的生长和发育的选择剂。未转化的细胞或组织的正常生长或发育对于这些周围细胞组织而言是必须的，它能帮助转化的组织正常生长和以育(护士效应)。间接效应也可能是由于从未转化的细胞或组织释放毒性或抑制物质，然后该物质对转化的细胞和组织具有有害影响。

例如，当在10-25mgl^-1 G418遗传霉素上选择时，在用含植物表达的NPTⅡ基因的无毒土壤杆菌菌株转化后，需花费6个月的时间从在固体培养基上的野外生长克隆产生的叶外植体生产转基因巨桉(或其杂种)的枝条。相反，在缺少G418的相似培养基上生产未转化枝条所花的时间是6周。因此，尽管选择剂的存在使得可产生转基因枝条而抑制非转基因枝条的产生，但是选择剂的存在明显延缓产生转基因枝条的过程。

除了延迟转基因枝条的产生外，还已知减少转基因枝条的产量。例如，在用含植物表达的NPTⅡ基因的无毒土壤杆菌菌株转化后从固态培养基上的叶外植体生产转基因巨桉(或其杂种)枝条的方法中，在10-25mgl^-1 G418遗传霉素上选择时转基因植物的产量比在缺乏选择剂的相似培养基上生产转基因植物时明显更低。

而且，在延长培养期后在组织培养物中生产的植物的质量也较差，特别是如果其生产需要延长愈伤组织的培养期时。在文献中有许多例子表明该生长期的延长会因为体细胞克隆变异现象(可遗传的异常，且可能是所生产的植物细胞内的遗传元件的数目或结构改变的结果)。因此，在组织培养中花费的时间期限的任何减少将会减少产生异常转基因植物的危险。

作为举例，按上面所述用于选择转化的材料并生产适于戒烟的野外产生(克隆)的巨桉(或其杂种)各遗传修饰的品系(即，所有来自单个转化细胞的植物)带根枝条并在温室或野外进一步生长的方法生产100株枝条需花费大约11个月。

作为使用选择标记基因和选择剂的另一种选择，可使用以检测导入的DNA序列(转基因)为基础的方法从未选择的群体中检测转基因植物。该方法包括使用PCR检测转基因本身，和检测转基因产物。然而，这类方法(如PCR)本身极费时，劳动强度大且昂贵。这些缺陷是结合在一起的，因为产生转基因植物的转化和再生事件相当稀少，因此为了检测到那些已被转化的植物必须筛选枝条或植物的大量群体。

本发明提供了选择含有一个或多个稳定掺入的感兴趣的DNA序列并具有可选择的特征，特性或贡献的遗传学修饰的枝条，带根枝条或籽苗的方法，其中，枝条，带根枝条或籽苗浸没在通氧的，例如通入空气的液体培养基中培养，该培养基含有选择遗传操作的枝条，带根枝条或籽苗的工具。一般对该培养基进行搅拌或移动。

可允许该枝条，带根枝条或籽苗在液体培养基中移动，例如，可使它们自由移动，如在液体培养基中翻滚，如自由翻滚。另外，可限制或阻碍其移动。

枝条，带根枝条或籽苗完全浸没在选择剂的溶液中导致选择剂更有效和更广泛地穿透进植物组织，因此能够有效地选择遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗。

附图中的图2列出了使用在固态(胶状)培养基上进行G-418选择和使用本发明方法生产遗传修饰的巨桉克隆(或其杂种)所需的典型的步骤和时间等级。使用固态培养基生产大约100株枝条需花费大约47周；使用本发明的方法在21周内生产出超过100株枝条。

附图中的图3是本文鉴定为pSCV1的质粒的图谱，它用于生产质粒pSCV1.6。图4是显示本文鉴定为pSCV1.6的质粒的T-DNA的图谱。质粒pSCV1.6用于使用土壤杆菌介导的转移将感兴趣的DNA序列导入桉属。

经过将氧气或，更常用的是空气通过培养基来同时搅拌液体培养基及给其通氧。空气循环技术，有时称为“气升式”技术对于在本发明的方法中同时提供氧和搅拌特别有用。在合适的容器中，例如，发酵容器，如烧瓶、瓶、罐或柱中的液体培养基可循环并通过，例如一个进气装置导入空气来通氧。该容器常称为“气升式发酵罐”。可容易地调节空气的体积和导入的速率以对液体培养基且当允许植物材料自由移动时从而对植物材料产生所需程度的搅拌作用。

当允许植物材料自由移动时，将空气或另一含氧气体通过培养基对培养基的搅拌作用相对于以机械方式，如搅动，进行的搅拌作用是优选的，因为它对植物材料的剪切力较低。然而，在本发明的摇动或搅动系统中对植物材料的剪切力可经过限制植物材料的移动，例如，如下面所进行的更详细的描述来降低。在空气或另一气体通过培养基的系统中，也可能需要限制植物材料的移动，因此搅拌液体培养基但植物材料受限制。

如果气体的通过不足以实现所需的搅拌作用，可提供另外的搅拌方式，例如，也可摇动植物生长容器或搅动内含物。可照明容器以经过光合作用提供更多的氧。

本发明的选择方法具有普遍应用性，即，可应用于选择任何植物的遗传操作的枝条，带根枝条和籽苗。例如，植物可以是一年生、二年生或多年生植物；它们可以是单子叶或双子叶植物；它们可以是草本或木本植物，例如，如上所述的木本植物。

在本发明的液体培养系统中似乎实施得特别好的木本植物是硬叶种类。硬叶的定义是“厚的草质叶”。它包括真叶，如桉属，和叶状柄，如一些金合欢属。被认为是硬叶的种类一般是常绿的，且硬叶特征一般与较差的营养获取力和常与耐旱性相联系。硬叶属的例子有杜鹃花属，杜鹃花属(Azalea)和山月桂属(杜鹃花科)；木犀榄属(木犀榄科)；许多澳大利亚金合欢属(蝶形花科)；和桉属(桃金娘科)。

然而，在本发明的液体培养系统中实施得较好的不仅是硬叶种类。苹果属(苹果)，梨属，樱桃属和蔷薇属(蔷薇科)、连翘属和丁香花属(木犀榄科)是可使用本发明的液体培养系统繁殖的木本植物属的其它例子。

如上所述，桉属是可根据本发明选择的硬叶木本植物的一个例子。桃金娘总属桉亚属含有许多商业上有用的种类，例如，巨桉，蓝桉，光亮桉，E.dunnii，悉尼蓝桉，赤桉，E.urophylla和其杂种。其它商业上重要的桉属种类包括王桉，柠檬桉，E.fraxinoides及其杂种。

根据本发明的选择方法，含有一个或多个稳定掺入的感兴趣的DNA序列且具有可选择的特征，特性或贡献的遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗浸没在含有用于选择遗传操作的枝条，带根枝条或籽苗的工具的通氧的液体培养基中培养。

感兴趣的DNA序列对受体植物而言可以是异源的，或可以是同源的。它们必须在受体植物中具有功能。在植物的遗传修饰中感兴趣的DNA序列的许多例子是已知的。例如，该DNA具有赋予受体植物表型特征，如对诸如草甘膦的除草剂的抗生的功能，具有改良植物品质或化学成分的功能，具有改进营养繁殖体，如插条生根能力的功能，或具有赋予生殖不育性的功能。

能将感兴趣的DNA序列导入并稳定掺入植物材料以实现所需遗传修饰的方法是熟知的且包括土壤杆菌介导的转移和将DNA直接导入细胞的方法，例如，原生质体的电穿孔，用DNA覆盖的颗粒轰击胚及聚乙二醇介导的基因传递。由于上面给出的原因，土壤杆菌介导的转移是一般选择的方法。

如上所述，一般使用合适的特征，特性或贡献作标记，特别是选择标记基因测定细胞或组织、如枝条的成功转化。用于固态培养系统的选择标记基因和相应的选择剂是熟知的且在，例如，本领域的文献中进行了描述。在根据本发明的浸没液体培养选择方法中可使用任何这类选择标记基因和相应的选择剂。

例如，NPTⅡ基因可用作标记基因，该基因提供对植物毒性选择剂的抗性，例如，对巴龙霉素，G-418(也称为遗传霉素)，新霉素或卡那霉素的抗性，该抗性用作选择转化细胞或组织的特征。提供相同或相似抗性的任何其它DNA序列可用作选择标记。

枝条，带根枝条或籽苗完全浸入选择剂溶液中导致选择剂更有效且更广泛地穿透植物组织，因此能有效选择遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗。

选择剂，例如，除草剂或抗生素，如巴龙霉素，G-418或新霉素应以能有效选择转化的枝条和籽苗的浓度和方式在液体培养基中使用。本文给出了合适的浓度和方案的实施例。可较容易地测定任何选定系统的最佳条件。

用于植物培养的合适的固体培养基和条件是已知的。用于任何特定植物起始材料的最佳液体培养基和培养条件如果不是已知的，则可用常规方法测定。例如，用于特定植物的液体培养基的配方可以已知用于该植物的固态培养基的配方为基础。

根据本发明，在含有选择剂，例如，抗生素，除草剂或其它选择剂的通氧的液体培养基中在浸没条件下培养遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗。优选如上所述在通氧的液体培养基中进行遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗的培养以用于微量繁殖枝条，带根枝条和籽苗。根据本发明的方法选择后，遗传操作的植物可按所需进一步繁殖，生根或培养。

特别具有优势的是，选择的材料已经是生根的或容易生根的枝条形式或作为籽苗的形式，而不是常规选择方法中的原基团形式。

另一优势在于，在通氧的液体培养基中选择所得的枝条，带根枝条或籽苗具有高品质，表现出特别均一的生长。如上面对根据本发明微量繁殖的产品所述。这对于进一步培养选择的植物材料特别有用。

相对于传统选择方法最显著的优势是选择遗传修饰的植物材料的速度加快，以及包括劳力和物质花费的减小。

如上所述，本发明的选择方法具有普遍应用性，即，可用于选择任何植物的遗传操作的枝条，带根枝条和籽苗。例如，植物可以是一年生，两年生或多年生植物，它们可以是单子叶或双子叶植物，它们可以是草本或木本植物，例如，硬叶及其它上面具体描述的木本植物。一般具有优势的是使用遗传上均一的植物细胞或组织作为遗传操作的起始材料，例如，使用来自均一的种子或克隆材料的细胞或组织，该克隆材料直接或间接从已对有益的特征进行了选择的或可进行选择的植物营养组织经营养繁殖产生。

然而，在有些情况下，例如，对于木本植物，特别是乔木、如桉属，所需的特征只有在成熟植物中才能评价，但从成熟植物获得的克隆材料常常难以经遗传修饰和/或不容易进行枝条诱导。在木本植物，特别是乔木，如桉属中特别会出现这种情况。

本发明的具体实施方案能够使经营养繁殖产生的细胞和组织，即克隆材料，特别是来自表现出优良表型特征的植物的克隆材料快速并高产地经遗传修饰，选择并再生成活的植物。

在该实施方案中，对植物细胞或组织进行一个或多个感兴趣的DNA序列的土壤杆菌介导的转移，在能在该植物中诱导枝条形成的试剂存在的条件下，在所得的具有可选择的特征，特性或贡献的转化细胞或组织中诱导枝条形成，在含有用于选择遗传修饰的枝条之工具的通氧的液体培养基中选择所得的枝条，其中枝条浸没于液体培养基中。然后将选择的转化枝条再生成活植物。

枝条诱导剂应能优选以高频率诱导可进一步发育的芽的形成。该试剂一般是细胞分裂素。具体试剂对任何具体植物起始材料的适合性及选定试剂的合适浓度和其使用方案可用常规方法确定。该试剂掺入用于枝条诱导的培养基中，也优选掺入用于转化枝条选择的液体培养基中。可使用两种或多种试剂。

细胞分裂素BAP是用于许多植物，例如，苹果和杨树的合适的枝条诱导剂。根据本发明使用的枝条诱导剂的另一例子是取代的苯脲，N-(2-氯-4-吡啶基)-N′-苯基-脲，常称为4-PU或CPPU。已发现CPPU在桉属和其它植物中以高频率诱导芽形成，与一些其它的植物激素和植物生长因子不一样，其另一效应是产生的芽能进一步发育成枝条。可使用其它取代的苯脲代替CPPU或与CPPU同时使用以选择植物材料，如：桉属，只要它们能优选以高频率诱导能进一步发育的芽的形成。

本发明的该实施方案具有普遍应用性，即，它可应用于任何植物。如上所述，它对于遗传操作及随后选择从不易进行转化和/或枝条诱导的植物，例如木本植物，如乔木，获得的克隆材料特别有用。其例子是硬叶及上述其它木本种类，例如，桉属。

细胞或组织材料，特别是经营养繁殖产生的细胞和组织，即克隆材料，特别是来自表现出优良表型特征的植物的克隆材料可直接从在野外或温室中生长的植物中获得。可以非无菌的形式使用，即，不使用间插微量繁殖步骤，以导入异源(或同源)基因。另外，细胞或组织可间接来自选定的植物，即，在遗传操作前对取自选择的植物的细胞或组织进行微量繁殖。

如果是克隆材料，可从任何感兴趣的植物获得起始材料。该植物可以是成熟的乔木，例如，桉属。对于桉属，例如，可从桃金娘总属桉亚属的成员中获得，例如，从巨桉，E.dunnii，悉尼蓝桉，赤桉，E.urophylla，王桉，柠檬桉或E.fraxinoides，或从其变种，栽培品种或杂交种中获得。

根据本发明用作遗传修饰的起始材料的细胞或组织可来自籽苗，特别是幼年籽苗。本发明的方法对于从桃金娘总属桉亚属内的籽苗，例如蓝桉，光亮桉和E.dunnii籽苗获得的细胞和组织进行遗传修饰特别有用。

可使用任何合适的土壤杆菌栽体介导植物材料的遗传修饰，例如，根癌土壤杆菌或发根病土壤杆菌。用于转化实施例所述的巨桉克隆，巨桉/赤桉杂种克隆和悉尼蓝桉/细叶桉杂种克隆的根癌土壤杆菌菌株是含双重Ti质粒pSCV1.6的无毒菌株EHA101A。附图中的图3和4是涉及质粒pSCV1.6的图谱。菌株EHA101A可用于转化其它桉属及任何其它植物。例如，双重土壤杆菌-Ti质粒载体系统的例子在EP-A-0120516中进行了充分的描述。

如上所述，枝条诱导剂或该试剂的混合物应优选以高频率诱导能发育成枝条的芽的形成。对于特别难以进行枝条诱导的桉属，特别优选CPPU或相当的取代苯脲。

用于诱导枝条形成的培养基可含有谷氨酸和/或抗坏血酸，以促进枝条以高效率再生。起始pH可以是5.0-5.6。一般经过在固态培养基上培养或使用另一静止培养基进行枝条形成的诱导。本文给出了适于在本发明的用于诱导枝条形成，用于选择转化细胞和组织及用于遗传修饰的桉属的繁殖和诱导根形成的方法中使用的培养基的例子。许多其它植物的合适的培养基是已知的或可用常规方法测定。

选择以及如果需要，对转化枝条的培养按上面所述进行，优选使用如上所述用于枝条，带根枝条和籽苗的微量繁殖的装置和条件。

附图中的图2以非限制性举例的方式说明了使用在固态(胶状)培养基上选择和使用根据本发明的浸没的“气升式”培养在允许植物材料自由移动的液体培养基中进行选择来生产带根的遗传修饰的植物的典型方法中所涉及的步骤。两种方法的时标(time scale)和所用的培养基以生产遗传修饰的巨桉杂交植物为例在下面描述。可预料的是使用图2中所列的方案时，时标和培养基的选择取决于待遗传修饰的植物材料的性质。而且，可按不同的顺序进行所列的步骤，可省去一些步骤和/或加入其它步骤。可用本发明的任意其它的液体系统取代“气升式”系统，并产生相似的结果。

在两种方法共有的步骤1中，外植体，如巨桉杂交种的外植体使用土壤杆菌介导的转化用感兴趣的DNA序列转化以使转化的材料也含有选择标记基因，如NTPⅡ基因。

在也是两种方法共有的步骤2中，所得的转化的外植体和土壤杆菌菌株在固态(胶状)培养基，例如，含枝条诱导剂的克隆共同培养基上共同培养2天。对于桉属，使用CPPU诱导枝条形成特别具有优势。

在步骤3中，以前用土壤杆菌菌株攻击所得的外植体再生以便在含枝条诱导剂的固态(胶状)培养基上生产枝条。对于桉属，在固态培养基中包含CPPU以诱导枝条形成也具有优势。固态培养基还含有合适的选择剂。固态培养基优选含有抗生素以防止土壤杆菌的生长，例如，含安灭菌。为了选择含NTPⅡ基因的转化体，选择剂是，例如，巴龙霉素、G418、卡那霉素或新霉素。对于桉属，固态培养基是，例如，含有CPPU和安灭菌且还含G418，如25mg/l G418的克隆共同培养基。对于桉属，每隔3周进行传代培养直至出现枝条。使用含CPPU，安灭菌，和G418的培养基时该步骤需大约21周。

根据本发明的步骤3包含无需选择的枝条诱导。以前用土壤杆菌菌株攻击的，从步骤2产生的外植体在含枝条诱导剂的固态(胶状)培养基上培养。对于桉属，使用CPPU诱导枝条形成特别有优势。培养基优选还含有抗生素，例如，安灭菌以防止土壤杆菌的生长。与常规方法所用的一样，每隔3周进行传代培养直至出现枝条。然而，在这种情况下，4-5周后出现枝条且使其继续发育，达到共计大约9周，而不是常规方法中的21周。这节约12周和4个传代培养步骤，相应地节约了劳力和材料。

步骤4涉及选择的枝条在固态(胶状)培养基，例如，克隆枝条延长培养基上的延长，约需大约6周。在本发明方法中，使用如上所述的允许枝条自由移动的“气升式”系统在浸没的液体培养基中同时进行步骤4的转化体的选择和枝条的延长。液体培养基含有合适的选择剂，例如，用于NPTⅡ基因的巴龙霉素，优选还含有一种抗生素，例如，安灭菌在这种情况中，选择和枝条延长需要不超过16天。未转化的材料迅速变成棕色，例如，第一次在4至8天内显示出症状。相反，完全转化的枝条健康且呈绿色，枝条迅速延长。由转化和未转化的组织组成的枝条(嵌合枝条)以存在棕色扇形面或以在枝条整个表面的部分褐变很容易从完全由转化细胞组成的枝条中区分开。完全转化的枝条高度均一且具有极好的品质。10天后，可得到微量繁殖的高质量的转化体。在根据本发明方法的浸没液体培养基中，与固体培养基相比，选择剂能更有效且更广泛地穿透植物组织。

在步骤5中进行已形成枝条的转化体的量微繁殖。使用固态(胶状)培养基，例如，固态KM培养基时，需要花费大约16周才能获得大约100株各遗传修饰的枝条系，即来自单个转化事件的巨桉枝条。使用允许枝条自由移动的根据本发明的浸没的“气升式”液体培养基，例如，使用液体KM培养基时，在大约6周内获得超过100株的枝条。如上所述，这导致节约了劳力和材料以及时间。

最后一步，步骤6是两种方法中共有的。它涉及枝条在固态(胶状)培养基，例如，含IBA的KM培养基上生根。在两种情况下需大约4周。

本发明减少了以6个月生产100株带根的转化桉属植物群体所需的时间，依次节约了8步手工操作(传代培养)步骤，导致大量节约了劳力，培养基和诸如植物生长容器的一次性工具的花费。本发明的方法还明显降低了花费，因为在无菌条件下处理培养物和在控制的环境条件下培养培养物所需的设备量明显减少。

与使用固态培养基的选择相比，不仅在较短时间内以较低的花费获得了更多的枝条，而且所得的枝条具有高得多的品质。具体地说，如上面对根据本发明的微量繁殖所述，枝条充分伸长，具有厚而强壮的茎和两个或多个充分隔开的节。而且，枝条具有显著的均一性，这对商业用途特别重要。

如果需要，可在方案中并入本发明的选择方法，即在液体培养基中选择，其中，在液体培养基中选择之前和/或之后进行在固态(胶状)培养基上的选择步骤。在这种情况下，在固态培养基上选择可能不如固态选择步骤是唯一的选择步骤时所需的严格。严格性降低减小了严格选择条件可能引起的对生长和发育的有害影响。

因此，本发明提供了一种用于选择含有一个或多个稳定掺入的感兴趣的DNA序列且具有可选择的特征，特性或贡献的遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗的方法，其中，枝条，带根枝条或籽苗在固态，即胶状的含有用于选择遗传操作的枝条、带根枝条或籽苗之工具的培养基上培养之前和/或之后，将枝条，带根枝条或籽苗浸没在含有用于选择遗传操作的枝条，带根枝条或籽苗之工具的通氧的液体培养基中培养。

根据本发明的方法选择的遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗可按照本发明的微量繁殖方法进一步微量繁殖。

本发明还提供了从根据本发明的方法选择并任选，进一步微量繁殖的枝条，带根枝条或籽苗获得的遗传修饰的植物。该植物本身可以根据本发明的微量繁殖方法进行微量繁殖。如上所述，这对于成熟乔木，例如，桉树的克隆繁殖特别有用。

一般来说微生物污染是组织培养系统中潜在的问题。当起始材料从在非无菌条件下，例如在温室或户外生长的植物获得时，这可能尤其成问题，即使按照常规方法进行了表面灭菌或消毒。即使当起始材料在无菌条件下生产时，也可能从其它来源产生微生物污染。还可能与使用土壤杆菌介导的转移获得的遗传操作的植物材料相联系而引起。这些材料对于随后的繁殖，特别是微量繁殖特别成问题，因为它们不可避免地被土壤杆菌本身污染。由于调控因素，被土壤杆菌污染的植物也可能不适合于商业化。

本发明提供了减少枝条，带根枝条或籽苗的微生物污染的方法，它包括在含有抗生素的通氧的液体培养基中培养枝条，带根枝条或籽苗，该枝条，带根枝条或籽苗浸没在液体培养基中。

本发明还提供了在含有抗生素的通氧的液体培养基中培养枝条，带根枝条或籽苗的应用，其中枝条，带根枝条或籽苗浸没在液体培养基中，用于减少枝条，带根枝条或籽苗的微生物污染。

采用的液体培养基含有抗生素，例如，安灭菌。枝条，带根枝条或籽苗簇完全浸没于液体培养基中的事实导致抗生素比在固态培养基上更有效地穿透枝条簇的组织，因此，能以简单且有效的方式减少或甚至消除微生物污染。

优选如上所述在通氧的液体培养基中培养枝条，带根枝条或籽苗用于微量繁殖枝条，带根枝条和籽苗。

枝条或带根枝条可从在非无菌条件，例如，在温室或户外生长的植物获得并可按常规方法对其进行表面灭菌或消毒。同样，籽苗可在非无菌条件，例如，在温室或户外生长，并对其进行表面灭菌或消毒。枝条，带根枝条或籽苗可从使用土壤杆菌介导的转移获得的遗传操作的植物材料获得。

用于减少微生物污染的本发明的方法具有普遍应用性，即，可用于选择遗传操作的任何植物的枝条，带根枝条和籽苗。例如，该植物可以是一年生的，两年生的或多年生的植物；它们可以是裸子植物，单子叶或双子叶植物，可以是草本或木本植物，例如上面具体描述的硬叶的和其它木本植物。该植物可以是在农业，园艺学，林学中有用的植物或作为农场庄稼。该植物可以是观赏植物或可产生有用的庄稼或产品。

以本文所述的任何本发明的方法获得的枝条，带根枝条或籽苗可在合适的条件下，例如在温室或户外生长成植物，例如，成熟植物。具有优势的是，在许多情况下，根据本发明的方法获得的枝条可直接在混合肥料中生根并在温室中成长，而不需要在半固态培养基上生根的中间阶段。

如上所述，根据本发明的实施方案，该植物可以是，例如，一年生的，两年生的或多年生的植物；它们可以是裸子植物，单子叶或双子叶植物；它们可以是草本或木本植物，例如，上面具体描述的硬叶的及其它木本植物。植物可是是农业，园艺学，林学中有用的植物或作为农场庄稼。植物可以是观赏植物或产生有用庄稼或产品。植物的例子及其用途在上文提供。

以本发明的任一方法获得的枝条，带根枝条或籽苗产生的植物本身是本发明的一部分，从该植物获得的产品也是如此。该植物可根据本发明的微量繁殖方法进行微量繁殖。由于上面所列的原因，它对于繁殖成熟植物，例如，成熟的桉树特别有用。

下面的非限制性实施例解释了本发明。实施例1至10：

巨桉和巨桉杂交种的繁殖

除非另有说明，在下面实施例1至10中使用下述培养基，植物材料，温度，气流和光照条件：培养基

用于微量繁殖巨桉和巨桉杂交种的固态KM培养基：

植物胶(phytagel)                3g/l

蔗糖                            10g/l

10×常量营养物溶液¹            100ml/l

MgSO₄·7H₂O                   0.925g/l

NH₄NO₃                        0.825g/l

Murashige和Skoog(1962)²基础盐  50ml/l

微量营养物贮液(Sigma M0529)

1000×Murashige和Skoog(1962)    0.5ml/l

维生素溶液(Sigma M03900)

BAP(6-苄氨基嘌呤)               0.04mg/l

用KOH调pH5.6，在121℃高压灭菌20分钟。

¹10×常量营养物溶液含2.2g/lCaCl₂·2H₂O,0.85g/l KH₂PO₄和1.9g/lKNO₃。

²Murashige T；Skoog F:(1962)，用于迅速生长的改良培养基以及用烟草组织培养物的测定。植物生理学，15,473-497。

用于微量繁殖巨桉和巨桉杂交品种的液体KM培养基

成分：与固态KM培养基一样，除了：

(ⅰ)省去植物胶；

(ⅱ)用0.01mg/l BAP代替在固态培养基中所用的0.04mg/l BAP。

用于生根巨桉和巨桉杂交种的枝条的半强度KM培养基。

该培养基含有基础固态KM培养基的一半常量营养物，微量营养物，MgSO₄·7H₂O和NH₄NO₃含量。省去BAP且用0.2mg/l IBA(吲哚基-3-丁酸)代替。将pH调到pH5.6，且按上面对全强度基础KM培养基所述对培养基在121℃高压灭菌。

如果可应用，在灭菌前加入1.0g/l活性炭。温度，气流和光照条件

以16小时的光周期(50-70μmol m^-2s^-1，由荧光灯提供)在22℃下进行液态微量繁殖，在半固态培养基上的微量繁殖和生根。除非另有说明，气流速率范围为每升液体培养基每分钟0.3-0.7升。用于接种的植物材料

用于接种的所有植物材料在半固态培养基上微量繁殖。E.urophylla x巨桉杂交克隆18.50和18.52从国家林学研究中心，B.P.764,Pointe Noire,Republique Du Congo获得。

巨桉克隆5064和5048从Prof D.L.Rockwood,Dept.Forestry,Univ.Florida,Gainesville,Florida 32611-0303 USA获得。

巨桉x赤桉杂交克隆11/25由南非林学研究所，PO Box 727,Pretoria 0001，南非提供给Shell South Africa。

微量繁殖的巨桉籽苗品系T14 L10从南非共和国，P.O.Box 375,Pietermaritzberg 3200,Natal大学，商业林学研究所提供的巨桉种子(种子批号，38064)产生。用于接种的枝条的制备：

具有顶端分生组织的巨桉或巨桉杂交种的微量繁殖的枝条用作起始材料。各枝条具有2-4个节及一个枝条顶端。枝条已预先在含0.04mg/lBAP的基础固态KM培养基上经系列传代培养。该培养物已自发生根，从中收获枝条顶端。产生枝条的植物材料已在含抗生素(安灭菌)的培养基上培养了足够的时间且已知不含微生物污染物。枝条的繁殖率：

除非另有说明，在实施例中给出的繁殖率是适于直接在混合肥料上或经半固体培养基间接生根的枝条的繁殖率。实施例1

使用枝条能自由移动的气升式系统繁殖巨桉枝条。

使用的培养基，温度，气流和照明条件在上文列出。装置

该装置由一个组合的压力调节器和表组成一个加压的气体供应输入。当压力达到大约10p.s.i(大约67,000Pa)时激活的压力释放阀(NUPRO SS-6C-MM-10)连接到调节器下游的管线上。气流通过活性炭气体滤器(Whatman Carbon Cap75)并使用气体输入装置(Pyrex no.2)和2 l锥形瓶通过蒸馏水加湿。除臭和加湿的气流用于供应气升式发酵罐。气流在输入气升式发酵罐前通过气体滤器(Whatman Hepa-Vent 0.3μm孔径)灭菌。气升式发酵罐由安有带5个19mm孔的盖子(Quickfit MAF2/2)的5l培养容器(Quickfit FV)组成。气流使用6mm直径的不锈钢管和盖适配器(Quickfit)通过中央孔。进气管(Pyrex no.2)附着于不锈钢输入口上使进气装置离组装的培养容器底部大约0.5cm。排气管由不锈钢管组成，使用螺旋连接适配器(Quickfit)插入孔中并经气体滤器(Whatman HepaVent)通向大气。

在活性炭滤器下游的装置使用聚硅氧烷管(组织培养级，Merck)。可使用塑料(组织培养级)瓶，例如，组织培养级聚丙烯或聚碳酸酯瓶代替玻璃培养容器，它们相当便宜。装置的制备：

用4.5l上述液态KM培养基装满气升式发酵罐。使用硅脂以保证凸缘的良好密封，且使用弹簧钳(Quickfit JC 100F)夹紧盖。两个剩下的孔完全塞住。进气，排气孔及两个塞住的孔用箔包裹，并用胶布密封，作为防止它们变成污染的潜在途径的额外安全保证。剩下的孔以较松的方式塞住且在箔和胶布中较松地包裹使灭菌期间蒸汽通过且使得能够随后接种枝条。使用30分钟预热/-60分钟全压(121℃)循环将发酵罐和进气/排气滤器作为组装单位进行高压灭菌。使发酵罐冷却到室温(过夜)后关紧接种孔，且从高压灭菌器中取出发酵罐。将发酵罐放入22℃水浴中，与供气装置连接并在接种前平衡1小时(气体流速大约为1.8升/分)。枝条的微量繁殖：

在第一天，用从籽苗品系T14 L10获得的10株微量繁殖的巨桉枝条接种发酵罐。接种物总重量为493mg。发酵罐与供气装置重新连接。将气流调到产生稳定气泡流的最大流速，大约为1.8l/分钟。将发酵罐用安全屏进行屏蔽，在评价繁殖率和生物量增加前操作27天。

经过取出3株枝条簇，在滤纸上吸干并称重来评价生物量增加。经过在60℃真空炉中干燥72小时至恒重来估测水份含量。微量繁殖的枝条水份含量百分数相似于用相同方法估测的用于接种的那些枝条的含量百分数。经过将每个发酵罐的3株枝条簇解剖成节和枝条顶端外植体束评价繁殖率。将节外植体和一些枝条顶端外植体传代到两种固态基础繁殖培养基(含0.04mg/l BAP的固态KM培养基和/或含0.04mg/l BAP和1％w/v活性炭的固态KM培养基)上。经过转移到两种生根培养基(含0.2mg/l IBA的固态半强度KM培养基和含0.2mg/l IBA和1％活性炭的固态KM培养基)上估测枝条顶端外植体的生根效率。5天后，最初转移到含活性炭的生根培养基上的一些枝条顶端传代到不含炭的生根培养基上。结果：

开始接种后，枝条表面不容易变温。气泡结合到漂浮在培养基表面且不能以较大程度翻滚的枝条上。几天后，枝条表面变湿且枝条开始充分翻滚。

接种9天后，枝条在接种时存在并已开始生长的顶部和大多数腋芽处显示高速的伸长生长。在接种时存在的一些较大的叶片显示出超度含水(透明化)，坏死和脱落症状。

接种16天后，培养基开始变混浊。老叶的一些超度含水，坏死和脱落症状变得明显。侧枝继续伸长。由顶部和第一级分枝的伸长生长产生的新的腋芽开始生长。所有这些新的生长都是健康的，没有明显的异常发育出现。6株枝条簇从枝条簇的基部发育出根。

接种24天后，培养基的混浊度增加且在培养基水平上容器的内侧形成浮垢样沉积物。老叶的超度含水，坏死和脱落症状更显著且在第一级分枝的较大叶片上发生。取培养基样品并显微镜检查以确定混浊的原因。培养基含完整及破碎的植物细胞且也含大量细胞碎片，但没有微生物污染的证据。总体上看，枝条簇紧凑，绿色且显示出较少的超度含水症状。一些新的第一级和第二级分枝从主枝条簇上脱落下来。

接种27天后从发酵罐收获枝条簇。图1显示了来自发酵罐的典型枝条簇的外观与用作接种物的典型枝条及在固态培养基上培养的典型枝条簇的比较：图1中的枝条簇1是用作接种物的典型的微量繁殖的枝条。枝条簇2是在固态微量繁殖培养基(KM培养基)上培养5周后产生的典型枝条簇。枝条簇3a和3b是在液态KM培养基中浸入液体培养27天后收获的两个典型的枝条簇。

从发酵罐收获的枝条在湿重、干生物量和水份含量上增加的估测值在下面表1中显示。

                          表1湿重，干生物量和水份含量

-接种物湿重(10株枝条)                     493mg

-估测的接种物干重(水份含量为91.8％)       40.4mg

-从发酵罐收获的3株典型的枝条簇湿重        15.466g

-估测的湿重增加(以10株枝条簇的总产量校正) 104.5倍

-从发酵罐收获的3株典型的枝条簇的干重      1.671g

-估测的干重增加(以10株枝条簇的总产量校正) 137.9倍

总繁殖率及枝条顶端的繁殖率的估测在下面表2中表示。在该表中，繁殖率的估测值表示为判断适合于直接栽培生根的枝条顶端外植体以及表示为适合于进一步在固态培养基上微量繁殖的总外植体。

                          表2繁殖率3个枝条簇中每一个适合于生根的枝条顶端外植体数：                     59,46,56平均                                     543个枝条簇中每一个适合于进一步微量繁殖的外植体估测数：                 111,102,121平均                                     111

在所得的枝条中，对腋生枝条分生组织的相关抑制效应似乎差不多完全被消除。在接种时存在的节产生的所有分枝系统含三级分枝。从接种的枝条顶端延伸生长产生的年幼节具有复杂性减小的分枝系统。

三级分枝从第二级分枝的腋芽开始形成。主茎充分生长且枝条团平均具有10个节(在解剖的3个枝条中为9-11个节的范围)。原始外植体的茎基部直径大约变粗2mm。第一，第二和第三分枝在其分枝点的茎直径逐级减少。原始茎，第一级分枝和第二级分枝的枝条顶端从两种培养基中均产生充分伸长的枝条顶端，具有厚而粗壮的茎及两个或多个充分伸展的节。在枝条的单一分枝级内，收获的枝条间有显著程度的均一性，而不管来源分枝具有的节数目多少。几乎所有的三级分枝由枝条顶端(两片叶和分生组织)组成且没有节。单一分枝级枝条间的最大区别在于第三级枝条的伸长程度。仅收获充分伸长的第三级枝条用于随后转移到固态培养基上。仅从大多数接种的枝条中7株的基部观察到根形成。

叶片的超度含水症状如果可观察到，则仅在充分伸展的老叶上较明显，从发酵罐操作时进行的观察结果预期不会更严重。幼年材料(即、在枝条顶端和顶节)不显示出任何明显的超度含水症状。枝条簇的解剖表明，老茎相当易碎，表明超度含水。

从在液体KM培养基中产生的枝条团收获后，接着转移到固态KM微量繁殖培养基中，枝条顶端外植体和节外植体外观健康。转移4天后，在转移到含有或不含活性炭的KM微量繁殖培养基上的外植体间检测不到区别。外植体比同样处理的以前在不含活性炭的固态KM微量繁殖培养基上培养的枝条顶端和节的外植体看起来更健康。转移28天后，顶端分生组织的生长(如果存在的话)，新腋分生组织生长的开始和随后腋生枝条的伸长生长在从液体KM培养基中产生的枝条团收获的外植体中或在以前在无活性炭的固态KM微量繁殖培养基上培养的外植体中似乎是相似的。

从在液态KM培养基中产生的枝条团或从以前在无活性炭的固态KM微量繁殖培养基上培养的枝条收获的枝条顶端外植体的生根效率在表3中显示。

表3

转移到生根培养基中28天后枝条顶端外植体的生根效率

        枝条顶端外植体的生根百分数生根处理    从在液态KM培养基    从在无活性炭的固态

        中产生的枝条团收获  KM培养基上产生的枝

        的枝条顶端外植体    条培养物收获的枝条

                            顶端外植体半强度KM生根培养基    86             66半强度KM生根培养基加活性炭                52             41半强度KM生根培养基：含活性炭5天，不含活性 84             53炭23天

在试验的3种条件下，从液态KM培养基产生的枝条簇收获的枝条顶端外植体的生根效率比从以前在无活性炭的固态KM微量繁殖培养基上培养的枝条收获的枝条顶端外植体的生根效率更高。转移到固态生根培养基上10天后首先观察到发酵罐收获的枝条顶端外植体生根，比从以前在无活性炭的固态KM微量繁殖培养基上培养的枝条收获的枝条顶端早2天。

上述巨桉的微量繁殖具有高繁殖率且产生丰富的随后生根的枝条。用于生根的枝条每月增加大约50倍，可用于任意随后微量繁殖步骤的外植体总数每月增加100倍。生物量的增加反映了繁殖的高水平。

如上所述，从在液态培养基中产生的枝条团收获的枝条品质较高，且具有很少的超度含水的明显症状。观察到的超度含水症状局限于老的组织。从发酵罐收获的枝条比从直接在固态培养基上繁殖的培养物收获的对照枝条似乎更易于在含IBA的固态培养基上生根。该枝条的品质使得它们适合于直接在温室的混合肥料中生根，如在下面实施例11中所述的Acacia mangium枝条。实施例2

巨桉杂交克隆和巨桉籽苗的繁殖

使用实施例1所述的气升式方法微量繁殖许多不同巨桉杂交克隆和微量繁殖的巨桉籽苗品系T14 L10，除了使用商业上可获得的容量为大约2.5升的聚碳酸酯容器(“2升”容器，Nalgene,Nalge,Co.Box 20365,Rochester,NY 14602-00365,USA；目录号2015-2000)和含有进气和排气孔的聚丙烯螺盖(Nalgene目录号2162-0531)代替玻璃容器。

使用实施例1所述的预制(进气)孔装配通氧/通气系统。将如上所述的2.0升液态KM微量繁殖培养基放入各容器中，且对容器进行高压灭菌(10分钟预热，20分钟全压(121℃)循环)。一旦冷却，将各容器与气体供应相联，平衡1小时，之后，用一个所示克隆或籽苗品系的20株枝条接种，克隆和籽苗已预先在固态KM培养基上繁殖。22天后终止容器的操作，因为一些容器已充满繁殖的枝条团。

检测各容器的5个典型的枝条团以评价所得的繁殖率。表4显示了从所用的5个克隆和1个籽苗品系获得的繁殖率。

表4

在气升式发酵罐中不同巨桉基因型和杂交种的繁殖率枝条基因型                      繁殖率(22天后，5个

                            枝条的平均值)籽苗品系T14 L10                     24.4巨桉X赤桉克隆11/25                  24.7E.urophylla x巨桉克隆18.50          31.3E.urophylla x巨桉克隆18.52          30.7巨桉克隆5046                        11.7巨桉克隆5048                        3.1

在所用的6个基因型中有5个的繁殖率比使用半固态(胶状)培养基系统可得的显著更高。在6个基因型中有4个繁殖率比使用半固态(胶状)培养基系统可得的高8到10倍。实施例3

使用枝条受限制的气升式系统繁殖桉属枝条

经过将接种的枝条限制在带孔的125cm³不锈钢笼中使培养基自由通过枝条而枝条不能在液体培养基中自由移动来修改实施例1和2所用的气升式系统。重复进行一份枝条不受限制的实验。

所用的方法在实施例2中描述，除了使用250ml聚碳酸酯容器(Nalgene cat.No.2127-0250)和带进气和排气孔的聚丙烯螺旋盖(Nalgene cat.no.2162-0531)代替以前描述的容器外。所用的培养基体积是每容器150ml。容器的制备和操作按前面实施例所述。

各容器用5株巨桉×赤桉克隆11/25或用5株微量繁殖的巨桉籽苗品系T14 L10接种，该枝条以前已在固态KM培养基上繁殖。在一套容器中，使枝条自由移动。在另一套容器中，枝条可按上述限制在笼中。将枝条培养21天，然后解剖以测定所得的繁殖率，在下面表5中显示：

                            表5枝条基因型                  繁殖率(21天后) (5株枝条的平均值)

                            未限制           限制巨桉×赤桉克隆11/25               8              10巨桉籽苗品系T14L10                17.7           16.8

所得的繁殖率表明，枝条的自由移动对获得高繁殖率不是必需的。实施例4

桉属枝条在摇瓶系统中的繁殖。

使用的方法如实施例3所述，除了在装置中不存在进气装置管。使用如前所述将单个滤器附着到进气/排气孔上将容器与大气接通。在Infors CH 1043摇床上以125r.p.m摇动容器22天。使用的枝条来自微量繁殖的籽苗品系T14L10。容器以一式二套进行实验。在一套容器中，枝条不受限制，在另一套中，将它们限制在如实施例3所述的笼中。

对于未受限制的枝条，所得的繁殖率为2，对于受限制的枝条为4.2。该结果证实在植物材料完全浸没的摇瓶中会出现繁殖。实施例5

使用搅拌系统繁殖桉属

进行实施例4所述的程序，除了使用2.5cm磁力搅拌棒搅拌容器内容物来代替摇动。将容器放在磁力搅拌器上，调到磁力棒产生大约250r.p.m的转动速率。每个容器用5株巨桉×赤桉克隆11/25的枝条或5株微量繁殖的巨桉籽苗品系T14 L10枝条接种。容器以一式二套进行实验；在一套中，枝条限制在实施例3所述的笼中，在另一套中，使枝条自由移动。结果在下面表6中给出。

                        表6枝条基因型             繁殖率(21天后) (5株枝条的平均值)

                      未限制           限制巨桉×赤桉克隆11/25        浸软              8巨桉籽苗品系T14 L10        浸软              3.2

由于磁力搅拌棒引起的枝条的机械损伤，从含未限制的枝条的容器中回收不到可使用的枝条。实施例6

在光照和黑暗中繁殖桉属枝条

重复实施例2所述的方法，即使用气升式系统，除了使用250ml容器，且枝条来自微量繁殖的巨桉籽苗品系T14 L10。光照条件按本部分开始所述，即16小时光周期光照(50-70μmolm^-2s^-1，由荧光灯提供)。进行一份重复实验，但用连续的黑暗代替连续光照。

对于在光照中培养的容器22天培养后获得的繁殖率为24.4，在黑暗中培养的容器为21.2。这表明只要通氧足够，光照对于获得高枝条繁殖率不是必需的。

在黑暗中培养的枝条比在光照中产生的枝条更伸展，这表明可使用光照条件的操作来控制枝条品质，这在商业微量繁殖系统中是重要的。例如，更伸展的巨桉和相关杂种的枝条常常比不太伸展的枝条更高效地生根。实施例7

经光合作用供氧繁殖桉属

进行实施例6所述的程序，即在光照和黑暗中培养，除了从该装置中省去进气装置管。在该系统中没有经气流和/或进气的搅拌，且没有主动的，即外部使用的供氧。枝条来自微量繁殖的巨桉籽苗品系T14 L10。

在光照下培养的容器中22天后获得的枝条繁殖率为6.2，在黑暗中为1(无繁殖)。结果表明光合作用可至少补偿部分主动供氧，即外部应用的供氧的缺乏。实施例8

在供氧和光照条件下繁殖巨桉

使用连续光照条件重复实施例6中所述的方法，除了用纯氮代替通过液体培养基产生的空气。使用巨桉×赤桉克隆11/25的枝条。

使用氮气获得4倍的繁殖率，相比之下，使用空气时繁殖率为10(见实施例6)。这表明经主动，即外部供氧和/或经光合作用提供足够的氧气对支持枝条的繁殖是必需的。实施例9

使用不同接种量大小繁殖桉属

进行实施例2所述的方法，除了用5,20或40株巨桉×赤桉克隆11/25接种容器。培养23天后，获得的繁殖率分别为8,24.7和36.4。这表明使用高接种密度具有优势。实施例10

经过再循环枝条材料繁殖桉属

使用实施例2所述的程序，将巨桉×赤桉克隆11/25和微量繁殖的籽苗品系T14 L10接种进培养容器中并在23天后收获。从枝条团解剖出20株枝条并立即接种进含新鲜液体培养基的容器中并再培养23天。将该方法重复一个以上的循环，产生总共3个繁殖循环。

枝条繁殖率在各循环间无明显的区别，且在连续循环后产生的枝条的品质无不利变化。这证实了枝条材料可通过连续轮的液体微量繁殖再循环，这具有明显的商业优势。实施例11

Acacia mangium的繁殖

(ⅰ)从HDRC,Ryton on Dunsmore,Covertry CV8 3LG UK获得的种子(Seedlot 945)建立Acacia mangium的微量繁殖培养物。

(ⅱ)微量繁殖的Acacia mangium枝条以前在含有补充了2.2μMBAP的完全MS盐培养基(Murashige和Skoog,1962)的半固态培养基上产生，将该枝条接种进组成相同但缺乏胶凝剂的液态培养基中。该方法和装置如实施例2所述。

该枝条未显示超度含水(透明化)的症状且繁殖较好(繁殖率为12-15倍/月)。枝条簇从基部形成根。使用以前在半固态培养基上所述的方法的来自籽苗的材料的枝条繁殖率不到3倍/月。

(ⅲ)收获使用上面(ⅱ)部分所述的液态微量繁殖产生的10-20mm长的枝条，浸入生根粉(Seradix No.2生根粉，Hortichem Ltd.Salisbury,Wilts SP27NU,UK)中并在遮蔽的日光下(最大值250μmolm^-2s^-1)25℃在雾室(96％的相对湿度)中的混合肥料中生根。在该方法中产生的材料所得的生根效率大于70％，相比之下，使用相同的生根程序在半固态培养基上产生的枝条的生根不足60％。

(ⅳ)使用上面(ⅱ)部分中所述的方法测定Acacia mangium枝条材料通过连续轮的液态微量繁殖重复循环的效力。在上面(ⅱ)部分所述的气升式发酵罐系统中经过一个月繁殖的起始循环后收获枝条，收获并再接种进含新鲜培养基的容器中并再培养1个月。将该方法重复1个以上的循环，产生总共3个繁殖循环。枝条繁殖率在循环间无明显的区别，重复循环后产生的枝条品质无显著的不利变化。再循环起始材料的能力具有相当大的商业优势。实施例12

橄榄的繁殖

按Rugini等(Sci Hortic(Amst),24(2),1984,123-134)所述预先在半固态培养基上产生的Olea europaea栽培品种Dolce Agogia的微量繁殖的枝条接种进组成相同但含有植物激素调节成4.9μM玉米素和2.9μMGA₃(赤霉酸)及无胶凝剂的液体培养基中。方法和装置如实施例2中所述。

获得了非常健康的材料。繁殖率比任何公开的胶状培养基系统略高(在液态系统中的7倍/月而该基因型在胶状培养基系统中最大值为6倍/月)，且液态系统相对于胶状系统还有两个重要的优势：1)所得的枝条更健康；胶状系统均报道有缺绿症(黄化)，而液态系统产生暗绿色健康的枝条。2)在液态系统上产生的枝条更伸长，因此在生根前不需要额外的伸长步骤。在胶状培养基系统中产生的枝条在生根前需要一个长期(超过1个月)的伸长步骤。实施例13

杜鹃花属的繁殖

按Lloyd和McCowan(国际植物培育家协会综合会议录30,1980,421-437)所述预先在半固态培养基中生产的Rhododendronyakushimanum栽培品种Dopey的微量繁殖的枝条接种进组成相同但植物激素调到2.5μM2ip(N⁶-(2-异戊基腺嘌呤)且无胶凝剂的液体培养基中。该方法和装置如实施例2所述。

在4周后获得了6倍的繁殖率，与此相比，在胶状培养基中在6周后得到2-3倍的繁殖率。

根据液态培养系统获得的枝条的均一性极好且远优于使用胶状繁殖系统获得的均一性。液态系统的一个主要优势在于不产生不定枝且所有的新枝条均从腋芽产生。在所有的胶状系统中，在繁殖枝条的基部可形成大量的愈伤组织。不定枝常从这种愈伤组织经器官发生产生。这些不定枝有时由于体细胞克隆变异的现象(这种现象常常与染色体数目的变化或染色体重排相关)而不忠实于原型(即是异常的)。通常，商业杜鹃花属生产商不得不牺牲繁殖率以避免愈伤组织形成及不定枝的形成以确保他们繁殖的植物忠实于原型。本发明的液态系统避免了这一问题。

在生物反应器中产生的枝条按上文所述经过在半固态培养基上培养2-3周进行伸长，之后使用对Acacia mangium所述的方法在混合肥料中生根。获得的生根效率超过90％，相当于使用相同的生根程序按以前所述在半固态培养基上产生的枝条的生根效率。在生物反应器中控制生长条件将有利于产生更伸长的适合于在从液体培养物中收获后立即进行生根的枝条。实施例14

Malus domestica的繁殖

将预先在含有补充了5μM BAP,0.5μM IBA和3μM GA₃的完全MS盐培养基(Murashige和Skoog,1962)的半固态培养基中产生的微量繁殖的Mulus domestica栽培品种Greensleeves枝条接种进组成相同但不含胶凝剂和植物生长调节剂的液体培养基中，方法和装置按实施例2所述。

获得的枝条繁殖率为3/月，与上面所述在半固态培养基中获得的繁殖率相同。然而，液体系统比半固态系统需要较少的处理步骤，因此具有商业优势。获得的枝条显示出一定的超度含水症状，但当从容器中收获的枝条转移到如上所述的半固态培养基中时，所有的新生长均无该症状。实施例15

连翘属的繁殖

将预先在补充了3％蔗糖和10μM BAP的半固态培养基LS培养基(Linsmaier ES和Scoog S，植物生理学(1965)18:100-127)中产生的15株连翘属x intermedia栽培品种Lynwood的微量繁殖枝条接种进具有相同组成但无胶凝剂的液态培养基中，方法和装置按实施例2所述。4周后收获该枝条。

收获的枝条生长良好。对于生长在半固态培养基上的枝条而言，没有超度含水症状，且枝条外观，特别是在质地和颜色方面相似。然而，在半固态培养基中，一簇许多短的枝条可以发育，但其中只有2-3株枝条正常伸长。在液态培养基中，所有的枝条均伸长，表明总的繁殖率比在半固态培养基中要高得多。从液态培养基中收获的枝条似乎适合于在带雾的温室中直接在混合肥料中生根。实施例16

丁香花属的繁殖

将补充了3％蔗糖和30μM BAP或补充了3％蔗糖和10μM玉米素的半固态LS培养基(Linsmaier ES和Scoog S，植物生理学(1965)18,100-127)用于微量繁殖Syringia vulgaris栽培品种Madame Lamoine的枝条。补充了BAP的培养基产生较好的繁殖但伸长较差，而补充了玉米素的培养基枝条繁殖较差。将在BAP培养基上产生的枝条簇转移到玉米素培养基中用于伸长。对于液态培养，将无胶凝剂的BAP培养基用作液态培养基。

将15株微量繁殖的枝条接种进液态培养基中，方法和装置如实施例2所述。4周后收获枝条。原始外植体叶变成棕色但新生长的为暗绿色且很少表现出超度含水症状。枝条似乎适合于在带雾的温室中直接在混合肥料中生根。实施例17

巨桉克隆，巨桉/赤桉杂种克隆和悉尼蓝桉/细叶桉杂种克隆的转化，选择和繁殖

a)无毒的(disarmed)土壤杆菌菌株

根癌土壤杆菌菌株EHA 101的构建在Hood等，1986中描述。该菌株由胭脂氨酸根癌土壤杆菌菌株C58的衍生物组成，其中去除了天然Ti质粒并用无毒的Ti质粒pEHA101代替，在pEHA101中从Ti质粒中缺失了野生型T-DNA(即冠瘿氨基酸合成和植物激素基因)且用细菌表达的卡那霉素/新霉素抗性基因代替。无毒的质粒pEHA101是从根癌土壤杆菌菌株Bo542(AT4)分离的野生型Ti质粒pTiBo542的衍生物，菌株Bo542(AT4)是生产L,L-succinamopine的菌株(Hood等，1986)。菌株EHA101A是由Olszwelski等，1988分离的菌株EHA101的氯霉素抗性突变体。

b)双重载体构建

转化所用的菌株也含有双重Ti质粒pSCV1.6，它是pSCV1的衍生物。涉及这些质粒的遗传操作使用标准技术(Sambrook等，1989)进行。pSCV1的组成部分来自下列(革兰氏-阴性)质粒：使用来自章鱼氨酸Ti质粒pTiA₆的TL右侧边界的序列信息合成用于右侧DNA边界和超驱动序列的序列(Peralta等，1986)。使用来自相同Ti-质粒的TL(Simpson等，1982)的序列信息合成左侧边界，且相同于章鱼氨酸质粒pTiACH5的TL左侧边界(Holsters等，1983)。使用章鱼氨酸型边界序列，因为当与高致病性的菌株EHA101结合使用时已显示出促进更有效的肿瘤形成(Hood等，1986)。含有将基因克隆进T-DNA的限制性酶切位点97bp多接头来自pUC19(Yannish-Perron等，1985)。在大肠杆菌细胞中有活性但在土壤杆菌细胞中无活性的高拷贝数的复制起点来自pUC19(Yannish-Perron等，1985)。pUC19的复制起点本身最初来自质粒ColE1，该质粒从大肠杆菌中分离出。所用的实际pUC序列已大量缺失去掉了某些非功能性(不必要的)DNA序列。在大肠杆菌细胞和土壤杆菌细胞中均具有活性的低拷贝数的复制起点来自广谱宿主范围的Inc P质粒RK2。所用的起点是最小的4.3kb起点，它经过缺失最初存在于野生型RK2质粒的大多数非功能性序列(Thomas等，1980)来构建。因此最小的起点仅含有两个基因(trfA和trfB)且与细菌中复制所需的非编码序列相关。细菌表达的庆大霉素/卡那霉素抗性基因来自于质粒pSa(Edwards,1988)且很可能是氨基葡糖苷乙酰基转移酶(Valantine和Kato,1989)。它与新霉素磷酸转移酶Ⅱ编码区没有明显的同源性(Edwards,1988)。细菌表达的氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性( β-内酰胺酶，bla)基因从pUC19克隆(Yannish-Perron等，1985)。pSCV1的遗传学和限制性图谱在图3中显示。

在图3中Amp^R和Gm/Km^R指在细菌中进行质粒选择的抗生素抗性基因。trfA,trfB,RK2和ColE1起点指细菌复制功能。OD指超驱动(T-DNA转移增强子)序列。Bam H1,Bcl 1,Cla1等指限制性核酸内切酶识别序列。图谱单位以核苷酸序列的千碱基对给出。

pSCV1.6是pSCV1的衍生物，其中在T-DNA边界间克隆进了植物表达的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和植物表达的卡那霉素抗性基因。CaMV-NPTⅡ来自Fromm等，1986的构建体。然而，已报道了在植物遗传操作中所用的一些最常见的NPTⅡ基因编码解毒卡那霉素的能力降低的突变酶(Yenofsky等，1990)。该突变涉及单个碱基变化，导致新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)(最初从细菌转座子Tn5中分离出)活性位点的谷氨酸残基被天冬氨酸取代。尽管mRNA和蛋白质的稳定性似乎不受突变的影响，但对卡那霉素的酶活性明显减少。经过检查NPTⅡ编码序列中限制性核酸内切酶XhoⅡ的位点丧失可鉴定基因中突变的存在。发现该突变存在于Fromm等，1986的CaMV-NPTⅡ基因中且以下列方式修复。质粒pSUP2021(Simon等，1983)大小大约为10kb，且包括转座子Tn5的完全拷贝。用Pst1和SmaⅠ消化该质粒产生788bp的片段，该片段在Tn5内从位置1730延伸到2518(Beck等，1982)。分离该片段并用Sph1(产生352和436bp的片段)或XhoⅡ(产生120,246,394和28bp的片段)限制性消化，因此对于在位置2096处突变是“野生型”。将Pst1/Sma1片段亚克隆进Pst1/SmaⅠ切割的pUC19以产生pTn5sub。然后用Sma1消化它并与8聚体磷酸化的BamH1接头连接。然后用Sph1和BamH1消化Sma1位点已转变成BamH1位点(pTn5subA)的克隆且分离436bp的片段(从位置2082到2518)。将它用于与来自pCaMVNeo的542bp BamH1/SphⅠ片段(位置1540至2082)和BamH1消化的pUC19进行三联连接。重组体用BamH1和Sph1限制性消化以保证它们含有436和542 Bam H1/Sph1片段，且用XhoⅡ限制性消化以证实位置2096的位点已被恢复。该构建体具有Bam H1片段，它含有NPTⅡ基因编码序列，基本上相同于Fromm等，(1986)用于制备pCaMVNeo的Bam H1片段，除了已修正了突变。该构建体命名为pneoNeo。然后分离含有NPTⅡ编码序列的pneoNeo的Bam H1插入片段且与从BamH1限制性消化的pCaMVNeo分离的大(大约3kb)片段再连接，其中该大片段含载体加CaMV启动子和胭脂氨酸合成酶基因3′终止序列。使用PvuⅡ(2个位点)或EcoR1/Sph1(均是单一的)相对于pCaMVNeo检查重组体的正确取向，得到pCaMVneoNeo。再检查其XhoⅡ位点的正确数目。

将来自pCaMVneoNeo，含有恢复的植物表达的卡那霉素抗性基因的HindⅢ片段克隆进pSCV1的HindⅢ位点以产生质粒pSCV1.2。用HindⅢ部分消化pSCV1.2且分离线型10.2kb产物。用小牛肠碱性磷酸酶对其脱磷酸化并与从Vancanneyt等，1990所述的质粒pGUS INT中分离的含有植物表达的β-葡糖醛酸糖苷酶基因(CaMV-GUS INT基因)的2.8kb HindⅢ DNA片段连接。

在所得的构建体(pSCV1.6)中的T-DNA图谱在图4中显示，表明了基因的取向和用于转移进植物的DNA区域。

在图4中，图谱中给出的缩写具有下列意义：B=BamH1；Bg=BglⅡ；C=Cla1；E=Eco R1；EV=Eco RV；H=HindⅢ；K=Kpn 1；P=Pst 1；S=Sac 1；Sm=Sma 1；Sp=Sph 1；X=Xba 1；Xh=Xho 1；OD=超驱动(T-DNA转移增强子)。

c)将双重质粒载体pSCV1.6导入无毒的根癌土壤杆菌菌株中

如Wen-jun和Forde(1989)所述使用Biorad基因脉冲仪经电穿孔转化根癌土壤杆菌菌株EHA101A的细胞。

d)土壤杆菌接种物的制备

含有双重质粒pSCV1.6的根癌土壤杆菌菌株EHA101A的过夜液体培养物在含有50mgl^-1氯霉素，25mg^-1新霉素和15mgl^-1庆大霉素的YEB培养基(胰胨5gl^-1，酵母提取物1gl^-1，牛肉膏5gl^-1，硫酸镁0.46gl^-1，pH7.2，高压灭菌后加蔗糖5gl^-1)中28℃剧烈摇动生长。取10μl新鲜的过夜液态培养物接种进25ml新鲜培养基中并生长24小时。经过以6000g离心10分钟收获细胞，重悬于2mM MgSO₄中并再沉淀。将细胞在2mM MgSO₄中再次洗涤，并在液态克隆共同培养基(见下文)中洗涤一次。将细胞最后重悬于液态克隆共同培养基中并稀释至密度为10⁹细胞ml^-1，便于与外植体共同培养。

e)植物材料

巨桉克隆91/4和巨桉/赤桉杂交克隆11/25由南非林学研究所，POBox 727,Pretoria 0001，南非共和国(现在是FORESTEK,Private BagX11227,Nelspruit 1200，南非)提供。悉尼蓝桉/细叶桉杂种2.32从Centre de Development Forestier,B.P.764,Pointe Noire,RepubliqueDu Congo获得。经过采伐成熟树并收获从树桩嫩芽新生长产生的插条获得母株。插条使用常规造林技术生根并随后盆栽进10升盆中，作为树篱母株在温室中维持。如果需要，可经过从母株收获有节的茎外植体并浸入含0.1％v/v Tween 20的20％v/v Milton溶液中轻轻搅动10分钟消毒从这些母株开始体外微量繁殖的枝条培养。然后在无菌蒸馏水中简单地漂洗带节的茎外植体3次并在枝条繁殖培养基(190mgl^-1KNO₃,825mgl^-1 NH₄NO₃,220mgl^-1 CaCl₂·H₂O,925mgl^-1 MgSO₄,85mgl^-1KH₂PO₄,半强度的Murashige和Skoog基础盐微量营养物溶液)(目录号M0529),Morel和Wetmore所述的维生素(1951),10gl^-1蔗糖，0.04mgl^-1 BAP,300mgl^-1安灭菌，用KOH调pH至5.6,2gl^-1植物凝胶)中培养。使用16小时日光照射方案(50-70μmolm^-2S^-1)在23℃繁殖培养物。分割繁殖的枝条并以4周的间隔传代培养到新鲜克隆枝条繁殖培养基中。

f)用于转化的外植体的制备

直接从无菌微量繁殖的枝条培养物或未消毒的带根的微量繁殖的枝条(用于微量繁殖及随后生根枝条的方案在下文给出)制备来自克隆的叶，叶柄或茎外植体。或者，从在温室或在野外生长的无性系分株(经微量繁殖或经插条产生)制备叶，叶柄或茎外植体并在与根癌土壤杆菌共同培养前消毒。在这种情况下，从高度不超过1.5米的健壮植物树冠上部收获长度不超过3cm的带健康叶片的年幼接穗，并浸入含0.1％v/vTween 20的20％v/v Milton溶液中并轻轻搅拌10分钟消毒。解剖前将接穗在无菌蒸馏水中漂洗3次。从接穗制备3-5mm直径的叶外植体或2-4mm长茎或叶柄切片并放入液体克隆共同培养基(见下文)中直到满足与根癌土壤杆菌菌株共同培养的需要。

g)用土壤杆菌接种外植体并再生推断的转基因枝条

将上文所述克隆的叶、叶柄或茎外植体与按上文所述制备的土壤杆菌悬液在无菌9cm培养皿中共同培养15分钟。将培养皿放在有轨摇床上并在23℃下在培养期间轻轻摇动。培养后，经过用滤纸吸印从外植体中去掉过多的细菌悬液并将下胚轴外植体转移到固态克隆共同培养基(750mgl^-1KNO₃,250mgl^-1MgSO₄·7H₂O,250mgl^-1NH₄H₂PO₄,100mgl^-1CaCl₂·2H₂O,20gl^-1蔗糖，600mgl^-12-〔N-吗啉代〕乙烷磺酸(MES)，半强度Murashige和Skoog基础盐微量营养物溶液(Sigma目录号M0529),Morel和Wetmore(1951)所述的维生素，0.1到1(例如1)mgl^-1CPPU,0.465mgl^-1NAA，用KOH调pH至pH5.5,3gl^-1植物凝胶)中。外植体与土壤杆菌菌株在黑暗中23℃下共同培养48小时。培养后，经过用滤纸吸印从外植体去掉过多的细菌悬液，然后将外植体在含400mgl^-1安灭菌的液态克隆共同培养基中23℃下轻轻摇动洗涤两次(每次洗涤3小时)。然后，将外植体转移到克隆枝条诱导培养基(与克隆共同培养基一样，但含有500mgl^-1谷氨酰胺，50mgl^-1抗坏血酸和300mgl^-1安灭菌)中。外植体在黑暗中23℃下培养4周，且2周后在黑暗培养期间结束时传代培养进新鲜培养基。然后将培养物转移进连续光照(40μmol m^-2S^-1)中并在23℃培养。然后每隔2周将培养物传代培养进新鲜的克隆枝条诱导培养基中直到可见大量数目的枝条原基。将外植体传代培养到克隆枝条延长培养基(同克隆枝条诱导培养基，但省去了CPPU，将NAA浓度调到0.112mgl^-1且含有1.16mgl^-1BAP)中并在连续光照(40μmolm^-2S^-1)下在23℃下培养。

h)推断的遗传修饰的枝条的选择，繁殖和生根

当在外植体上存在适当数目的超过大约1mm长的再生枝条时，将外植体转移进含上述液态KM微量繁殖培养基，300mgl^-1安灭菌和30-120mgl^-1巴龙霉素，一般为50-60mgl^-1的气升式发酵罐中。合适期间后，根据所用的巴龙霉素的浓度一般为5-20天后，以其健康的绿色外观和迅速的生长和伸长鉴定推断的遗传修饰的枝条，相比之下，大多数非GM枝条变成棕色且坏死。然后将推断的遗传修饰的枝条转移进新鲜的液态KM微量繁殖培养基(含有或不含巴龙霉素)中并再繁殖1个月，各单独的起始枝条现在形成大量分枝的枝条。然后经过将这些枝条转移到生根培养基(同克隆枝条繁殖培养基，即固态KM培养基，但省去了BAP且含0.2mgl^-1IBA)中并使用50-70μmolm^-1s^-1的16小时光照方案在23℃下培养24小时生根。在枝条生根前可按需要在液态培养基中或在固态培养基上进行额外的繁殖步骤。生根-诱导步骤后，将形成根的枝条转移进在Magenta盆(Sigma)中的无菌泥炭丸(JiffyProducts(UK)Limited,14/16 Commercial Road,March，剑桥，英国)中以便根形成。

当可见活跃生长的根生长通过泥炭丸时，将植物转移进装满椰子-泥炭的大约7.5cm(3英寸)面积的植物盆中。将植物放在带雾的繁殖器中并经过一周时期减小湿度使其缓慢变硬。3到4周后，将植物转移进大约17.5cm(7英寸)盆中并放在温室中。植物在自然日光下生长且每天浇水。

ⅰ)在实施例1中对用液态微量繁殖系统生产的植物所观察到的有益结果也在本例子中从选择并使用气升式发酵罐微量繁殖的遗传修饰的植物上观察到。

另外，与在固态(胶状)培养基上选择和繁殖的常规方法相比，极大地节约了时间，劳力和材料，其中共同培养对于常规方法和本发明的方法是共有的。

在土壤杆菌介导的转化中起始步骤对两种方法是相同的。然后，常规方法将枝条诱导步骤与使用固态培养基的选择步骤结合。如上所述，选择剂的存在常常延缓了转化的细胞和组织的生长和/或发育。在本例子中证明了这一点，其中使用G-418作为选择剂在固态培养基上选择遗传修饰的桉属克隆需大约21周。随后在固态培养基上对选择的遗传修饰的枝条进行枝条伸长步骤需大约6周，获得适于微量繁殖的材料共需大约27周。

相反，在本实施例中，推断的遗传修饰的材料最初在固态培养基上不经选择培养大约9周。然后在浸没的液态培养基中进行选择。在10天内可将转化的材料与未转化的材料区分开。因此选择步骤的总时间刚刚超过10周，与此相比，使用常规方法选择需要27周。不仅时间显著减少，极大地节约了劳力和材料，而且选择的材料具有特别高的品质，具有实施例1中对未进行转化的微量繁殖的枝条所述的特性和特征。枝条呈绿色且健康，具有充分伸长的枝条顶端，具有厚而粗壮的茎及充分隔开的节。枝条明显是均一的，这在商业上特别重要。

转化的桉属枝条随后的微量繁殖以使用固态培养基的常规方法需要大约16周。使用浸没液体选择步骤后获得的高质量的材料，使用浸没的液体培养方法进行微量繁殖需大约6周，这进一步节约了时间(大约10周)且也产生了如上文和实施例1中所述的特别高品质的材料。以浸没的液态培养获得的枝条似乎比常规固态培养获得的枝条更容易生根。

总之，在该实施例中所述的方法导致节约了时间，劳力和材料且产生了比常规方法所得质量更高的更大量的转化材料。遗传修饰的桉属植物的生化和遗传分析

ⅰ)组织化学β-葡糖醛酸糖苷酶(HGS)测定

按Draper等(1988)所述对推断的遗传修饰的桉属克隆和籽苗产生的材料的叶片进行组织化学GUS测定。将叶外植体转移到含固定溶液(100ml双蒸水，含750μl40％甲醛、2ml0.5MMES和5.46gl^-1甘露醇)的培养皿中。将培养皿放入真空干燥器中，对容器抽真空几次，直到所有的外植体浸入固定溶液中。将外植体在室温下培养45分钟，然后在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中洗涤两次。然后将外植体转移进在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中制备的2mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸(X-GLUC)溶液中，将X-GLUC溶液真空渗入外植体几次，用Nescofilm密封培养皿，然后在37℃培养过夜，经过将外植体转移进70％乙醇中终止反应。以不溶性蓝色染料的存在检测GUS活性。

ⅱ)以Southern印迹分析和杂交检测转移到转基因桉属植物中的基因

按Keil和Griffin(1994)所述进行DNA提取。在合适的限制缓冲液中用Kpn1和Xba 1消化10微克从转化的桉属植物分离的DNA。为了帮助DNA消化，以0.1mg/ml的终浓度向限制性混合物中加入酪蛋白(Drayer和Schulte-Holthausen,1991)。在37℃进行限制性消化过夜。样品的电泳、Southern印迹分析和杂交按Sambrook等(1989)所述进行。用EcoRV消化质粒pJIT 65(Guerineau,1990)并用Bam H1消化质粒pCaMV。经过在1.5％琼脂糖凝胶上电泳分离所得的限制性片段(Sambrook等，1989)。含部分GUS基因编码序列和花椰菜花叶病毒35S基因终止区的2kb(大约)的DNA片段和含NPT2编码序列的1.0kb(大约)的DNA片段以Heery等(1990)的方法从凝胶中洗脱出。以Feinberg和Vogelstein(1983)的方法，使用Boehringer Manheim提供的随机引物标记试剂盒对洗脱的片段进行放射性标记并用作杂交探针。

ⅲ)结果

在上文列出的a)至h)部分所述的本发明的方法使得能够即使从来自以前在野外生长的成熟植物(克隆)且未证实可对其生产转化植物的外植体也能有效地且在较短的时期内生产转化的桉属植物。这些方法的效率使得能从任一桉属种类或转化的杂种生产分别来自独立的转化事件的大量植物群体。在所有的例子中，经过从遗传修饰的愈伤组织进行器官发生获得遗传修饰的枝条。在有些情况下，特别是如果在再生培养基中的培养期间持续时间延长时，在有些培养物中可观察到混合的器官发生和体细胞胚发生。在所有所述的方法中，回收可见的植物，当在温室条件下生长时它们表现出正常表型。以组织化学染色测定时发现大部分(超过70％)来自任一桉属种类或转化的杂种的遗传修饰的植物表达β-葡糖醛酸糖苷酶基因。同样，发现至少80％的再生枝条含有来自在整合进桉属种类或杂种基因组的pSCV1.6的T-DNA中的至少一个基因。

使用聚合酶链反应(PCR)分析遗传改造的桉属植物存在T-DNA且不存在其生产方法中所用的根癌土壤杆菌菌株

使用Perkin-Elmer Cetus DNA热循环仪(Perkin-Elmer,Beaconsfield,Bucks,UK)进行PCR反应。反应液由1x反应缓冲液(10mM Tris-HCl,50mM KCl,1.5mM MgCl₂,0.01％w/v明胶)，各200μM dNTP,1.0μM各引物，2.5单位的Amplitaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)和从上述遗传改造的枝条分离的0.5μg基因组DNA组成。也进行含有来自已知无根癌土壤杆菌的植物的基因组DNA或含有从根癌土壤杆菌EHA101A〔pEHA101,pSCV1.6〕分离的大约10ngDNA的对照反应。所用的反应条件是94℃1分钟，退火1分钟及72℃1分钟进行29个循环，及94℃1分钟，退火1分钟和72℃2分钟的一个循环。各反应的样品在2％琼脂糖凝胶上电泳并在紫外灯下观察。用于检测下列基因序列的引物及在反应中使用的退火温度如下所述：

NPTⅡ基因(使用Beck等，(1982)基因19,327-336所述的TN5标号系统)。

引物1:5′(24)CGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGG(50)3′

引物2:5′(277)AGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAG(253)3′退火温度为50℃。

Ti双重载体的氨苄青霉素(bla)抗性基因(使用Yannish-Perron等，(1985)所述的pUC19标号系统)。

引物1:5′(1681)TCCATAGTTGCCTGACTCCCCG(1702)3′

引物2:5′(2000)TGGGAACCGGAGCTCAATGA(1981)3′退火温度为60℃

根据土壤杆菌染色体的ros基因(使用Cooley等，(1991)，细菌学杂志，173,2608-2616的标号系统)；Matzk和Schiemann的引物(Poster No.S7-23，第8届国际植物组织和细胞培养会议，Firenze，意大利，1994年6月12-17日)。

引物1:5′(142)CGCGGGCTACAAGTTGAATC(161)3′

引物2:5′(714)GACCGAGACCCATTTCCTTG(695)3′退火温度为60℃。

根癌土壤杆菌Ti质粒侵入性基因的Vir G基因(使用Chen等，(1991)，分子普通遗传学230,302-309的标记系统)；Matzk和Schiemann设计的引物(Poster No.S7-23，第8届国际植物组织和细胞会议，Firenze，意大利，1994年6月12-17日)。

引物1:5′(370)GCCGACAGCACCCAGTTCAC(389)

引物2:5′(749)GCCGTAAGTTTCACCTCACC(730)退火温度为60℃。

对于NPTⅡ基因序列为特征性的带充当反应物，其中该产物应在遗传修饰的植物中和在用于其生产的用根癌土壤杆菌菌株(EHA101A〔pEHA101,pSCV1.6〕)感染的植物中可检测到。对于存在bla基因为特征性的带是由于在左侧边界区错误加工而将其它DNA从Ti双重载体转移进植物或存在含双重Ti质粒(pSCV1.6)的土壤杆菌细胞的指征。存在对于ros和virG基因为特征性的带是植物仍被在其生产中所用的土壤杆菌菌株(EHA101A〔pEHA101,pSCV1.6〕)感染的指征。

使用微生物学测定检测在遗传操作的植物中的污染物

方法：

在无菌研缽中匀浆遗传改造的植物，所得的匀浆产物无菌转移到含有无抗生素的无菌YEB培养基(如前所述)的摇瓶中。摇瓶在29℃，伴随着剧烈摇动培养最少5天。无微生物生长表明遗传改造的植物不含土壤杆菌。

PCR和微生物学分析的结果

使用PCR方法和微生物学方法，在使用上述方案生产的遗传改造的植物中检测不到土壤杆菌细胞。

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Claims (66)

1．微量繁殖木本植物枝条，带根枝条或籽苗的方法，包含在通氧的液态培养基中培养枝条，带根枝条或籽苗，其中枝条，带根枝条或籽苗浸没在液态培养基中。

2．权利要求1所要求的方法，其中经过将空气或氧气通过培养基，经过机械搅拌方式，借助于摇动培养基，借助于照明培养基，或以任何两种或多种所说的方式提供氧气。

3．权利要求1所要求的方法，其中搅拌液态培养基。

4．权利要求3所要求的方法，其中搅拌培养基且经过向培养基中通氧或空气提供氧。

5．权利要求1至4中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗在液态培养基中自由移动。

6．权利要求5所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗在液态培养基中翻滚。

7．权利要求1至4中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗的移动受限制或受阻碍。

8．权利要求7所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗限制于含液态培养基的容器内的带孔容器中或限制于与液体分离但在液体中与液态培养基接触的容器分室内。

9．权利要求1至8中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗从栽培品种，克隆或种子获得。

10．权利要求1至9中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗以高接种密度存在。

11．权利要求1-10中任一项所要求的方法，其中培养基含有抗生素。

12．权利要求11中所要求的方法，其中木本植物的枝条，带根枝条或籽苗从在非无菌条件下生长的植物中获得。

13．权利要求12所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗从使用土壤杆菌介导的转移系统转化的遗传改造的植物材料获得。

14．权利要求1至13中任一项所要求的方法，其中木本植物是用作木浆，燃料或木材的裸子植物或双子叶被子植物；生产水果或坚果的乔木，灌木或小灌木；从中获得非水果或坚果的商业上有用的产品的乔木或灌木，或观赏乔木或灌木。

15．权利要求1至13中任一项所要求的方法，其中木本植物是硬叶种类。

16．权利要求15中所要求的方法，其中木本植物是杜鹃花属，杜鹃花属(Azalea)或山月桂属(杜鹃花科)；木犀榄属(木犀榄科)；或澳大利亚金合欢属。

17．权利要求14中所要求的方法，其中木本植物是苹果属(苹果)；梨属，樱桃属或蔷薇属(蔷薇科)，连翘属或丁香花属(木犀榄科)。

18．权利要求14中所要求的方法，其中木本植物是桉属。

19．权利要求18中所要求的方法，其中木本植物是桃金娘总属桉亚属的桉树。

20．权利要求19中所要求的方法，其中桉树是巨桉、蓝桉、光亮桉，E.dunnii，悉尼蓝桉，赤桉，E.urophylla或其杂种，或王桉，柠檬桉，E.fraxinodes或其杂种。

21．权利要求1至20中任一项所要求的方法，其中在气升式发酵罐中进行培养。

22．权利要求1至21中任一项所要求的方法，其中枝条的培养持续到开始生根或出现生根。

23．权利要求1至22中任一项所要求的方法，其中以权利要求1至22中任一项所要求的方法进一步微量繁殖所得的枝条，带根枝条或籽苗。

24．选择具有可选择的特性，特征或贡献的遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗的方法，其中在含有选择遗传改造的枝条，带根枝条或籽苗之工具的通氧的液态培养基中浸没培养枝条，带根枝条或籽苗。

25．权利要求24中所要求的方法，其中选择特性是对抗生素，除草剂或其它选择剂的抗性。

26．权利要求24或权利要求25中所要求的方法，其中经过将空气或氧气通过培养基，经过机械搅拌方式，借助于摇动培养基，借助于照明培养基，或经过任意两种或多种所说的方式提供氧。

27．权利要求24或权利要求25所要求的方法，其中搅拌液体培养基。

28．权利要求24中所要求的方法，其中搅拌培养基并经过向培养基通氧或空气提供氧。

29．权利要求24至28中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗在液态培养基中自由移动。

30．权利要求29中所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗在液态培养基中翻滚。

31．权利要求24至28中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗的移动受限制或受妨碍。

32．权利要求31中所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗限制于含液态培养基的容器内的带孔容器中或限制于与液体分离但在液体中与液态培养基接触的容器分室内。

33．权利要求24至32中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗从栽培品种，克隆或种子获得。

34．权利要求24至33中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗以高接种密种存在。

35．权利要求24至34中任一项所要求的方法，其中该培养基含有抗生素。

36．权利要求35中所要求的方法，其中木本植物的枝条，带根枝条或籽苗从在非无菌条件下生长的植物获得。

37．权利要求36中所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗从使用土壤杆菌介导的转移系统转化的遗传改造的植物材料获得。

38．权利要求37中所要求的方法，其中在N-(2-氯-4-吡啶基)-N′-苯脲或另一种苯脲存在的条件下在土壤杆菌转化的细胞或组织中诱导枝条形成。

39．权利要求24至38中任一项所要求的方法，其中遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗来自一年生，两年生或多年生植物。

40．权利要求24至39中任一项所要求的方法，其中遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗来自单子叶或双子叶植物。

41．权利要求24至40中任一项所要求的方法，其中遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗来自草本植物。

42．权利要求24至40中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗是木本植物。

43．权利要求42中所要求的方法，其中木本植物是用于木浆，燃料或木材的裸子植物或双子叶被子植物，生产水果或坚果的乔木，灌木或矮灌木；获得非水果或坚果的商业上有用的产品的乔木或灌木；或观赏乔木或灌木。

44．权利要求42中所要求的方法，其中木本植物是硬叶种类。

45．权利要求44中所要求的方法，其中木本植物是杜鹃花属，杜鹃花属(Azalea)和山月桂属(杜鹃花科)；木犀榄属(木犀榄科)；或澳大利亚金合欢属。

46．权利要求42中所要求的方法，其中木本植物是苹果属(苹果)，梨属，樱桃属或蔷薇属(蔷薇科)；连翘属或丁香花属(木犀榄科)。

47．权利要求42中所要求的方法，其中木本植物是桉树。

48．权利要求47中所要求的方法，其中木本植物是桃金娘总属桉亚属的桉树。

49．权利要求48中所要求的方法，其中桉树是巨桉，蓝桉，光亮桉，E.dunnii，悉尼蓝桉，赤桉，E.urophvlla_或其杂种，或王桉，柠檬桉，E.fraxinoides或其杂种。

50．权利要求24至41中任一项所要求的方法，其中该植物是非木本植物。

51．权利要求24至50中任一项所要求的方法，其中在气升式发酵罐中进行培养。

52．生产遗传修饰的枝条的方法，包括对植物的细胞或组织进行一种或多种感兴趣的DNA序列的土壤杆菌介导的转移，在一种能诱导枝条形成的试剂存在的条件下，在具有可选择的特征，特性或贡献的所得的转化细胞或组织中诱导枝条形成以及在含有选择遗传修饰的枝条的工具的通氧的液态培养基中选择所得的枝条，其中该枝条浸没在液态培养基中。

53．权利要求52所要求的方法，其中枝条诱导剂是细胞激动素。

54．权利要求53所要求的方法，其中枝条诱导剂是BAP,N-(2-氯-4-吡啶基)-N′-苯脲或另一种苯脲。

55．权利要求52至54中任一项所要求的方法，其中枝条诱导剂也存在于液态培养基中。

56．权利要求52至55中任一项所要求的方法，按权利要求24至51任一项所限定进行。

57．权利要求24至56中任一项所要求的方法，其中在液态培养基中的选择在含有选择遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗之工具的固态(胶状)培养基中选择之前和/或之后进行。

58．微量繁殖遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗的方法，其中根据权利要求24至57中任一项所要求的方法选择或生产的遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗根据权利要求1至23中任一项所要求的方法进行微量繁殖。

59．减少枝条，带根枝条或籽苗微生物污染的方法，包括在含有抗生素的通氧的液态培养基中培养枝条，带根枝条或籽苗，其中枝条，带根枝条或籽苗浸没在液态培养基中。

60．按权利要求1至13中任一项的限定进行的权利要求59中所要求的方法。

61．权利要求59或权利要求60中所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗是权利要求39至50中任一项所限定的植物的。

62．枝条，带根枝条或籽苗在含抗生素的通氧的液态培养基中的培养应用于减少枝条，带根枝长或籽苗的微生物污染，其中枝条，带根枝条或籽苗浸没于液态培养基中。

63．从以权利要求1至22中任一项所要求的方法获得的枝条，带根枝条或籽苗或从按权利要求24至58中任一项所要求的方法选择的遗传修饰的枝条，带根枝条或籽苗或从按权利要求59至62中任一项所要求的方法获得的减少了微生物污染的枝条，带根枝条或籽苗获得的植物。

64．权利要求1至23中任一项所要求的方法，其中枝条，带根枝条或籽苗从权利要求63所要求的植物获得。

65．权利要求64所要求的方法，其中植物是成熟的桉树。

66．从权利要求63中所要求的植物获得的产品。

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