CN1535316A

CN1535316A - 获得无标记植物的转化方法及由此获得的植物

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Publication number: CN1535316A
Application number: CNA028149157A
Authority: CN
Inventors: 安娜・玛丽亚・阿格尼丝・沃尔特斯; 安娜·玛丽亚·阿格尼丝·沃尔特斯; ・赫拉尔杜斯・弗朗西斯库斯・菲瑟; 理查德·赫拉尔杜斯·弗朗西斯库斯·菲瑟; 德・玛丽亚・范德梅尔; 英格丽德·玛丽亚·范德梅尔; 赫瑞斯; 保罗·赫瑞斯; 斯・克莱门斯・玛丽亚・亨里克斯・德费腾; 尼古拉斯·克莱门斯·玛丽亚·亨里克斯·德费腾
Original assignee: Cooperative Avebe UA
Current assignee: Cooperative Avebe UA
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2004-10-06
Anticipated expiration: 2022-07-26
Also published as: BR0211508A; WO2003010319A3; AU2002318072B2; AR034911A1; MXPA04000667A; WO2003010319A2; CA2454793A1; CN1535316B; EP1412507A2; EP1279737A1; EP2366788A1; US20050097641A1

Abstract

本发明涉及获得转基因植物的转化方法和用所述方法获得的植物。本发明提供了转化植物细胞的方法，包含提供给植物细胞含有T－DNA构建体并可以转移所述构建体进入植物细胞基因组的重组核酸，所述构建体具有不含编码选择标记的核酸的外源核酸。

Description

获得无标记植物的转化方法及由此获得的植物

自从上世纪70代末和80年代初，发现土壤杆菌spp(agrobacteriumspp)的Ti(肿瘤诱导(tumor inducing))质粒可用作植物遗传工程化中的载体后，使用转化细菌如土壤杆菌spp转化植物来获得可表达感兴趣的异源基因或基因片段的方法已为大家知晓。野生型质粒诱导植物细胞产生肿瘤细胞，但是它可经修饰并携带外源基因构建体进入细胞而无需使受体细胞肿瘤化。在肿瘤诱导过程中，Ti质粒的一个特异性片段，称为T-DNA(转移DNA(transferred DNA))，整合进入宿主植物细胞核DNA。在植物的遗传工程化中，所述T-DNA被修饰并携带可被整合进入植物DNA的外源基因构建体以获得转基因植物。

获得转基因植物的转化步骤通常是用一个含有本来非致瘤性土壤杆菌株的转化细菌感染植物细胞，该细菌具有含T-DNA载体构建体并允许所述构建体转移进植物细胞基因组的重组核酸，所述构建体基本上包含希望在最终的转化植物中表达的所需核酸，基因或基因片段和选择标记核酸或选择基因。这个所需的异源基因和标记通常位于质粒或载体的一段T-DNA上，该DNA侧翼有至少一个，或位于被称为T-DNA边界的两个通常为24个碱基对长的不完全(imperfect)正向重复之间。转移异源基因/选择基因构建体进入植物细胞发生在vir基因(定位于相同或不同的质粒)涉及的调控T-DNA/基因构建体的转移和整合过程中。Vir-蛋白(D1和D2)在精确位点产生边界重复的缺口，T-DNA构建体从质粒的T-DNA边界处被切下并插入植物基因组。

这样处理后的植物细胞在适当的环境中生长，所有的植物都可再生，其中的一些带有所需基因。为了在未经转化的细胞背景中选择所需的转化细胞，编码所述选择基因的DNA及其表达方式通常与允许转化株回收的T-DNA上的感兴趣的基因有物理上的连接。通常认为在T-DNA上存在这样的选择或标记序列是有效回收的一个绝对条件；否则，数以千计到数以万计的假定转化株需要被筛选以证明所需异源基因的存在和功能性插入。或者，假定的转化株总是在选择培养基或选择压力下生长，这适合让选定的选择标记使转化细胞比最初的过剩的非转化细胞具有选择性优势。

历史上，植物选择标记是显性基因，表达后可对抗加入再生培养基的选择性物质，但是它自身非细胞生长所必需。将这样的选择物质例如抗生素、除草剂、氨基酸或氨基酸类似物以毒性浓度加入植物或植物培养基中。在植物转化中使用最广泛的选择标记或选择基因，在EP 131623中提到的对抗选择物质卡那霉素的细菌新霉素磷酸转移酶基因(nptI、nptII和nptIII基因)和在EP 186425中提到的对抗潮霉素的aphIV基因。EP 275957揭示了抗除草剂L-2-氨基-4-(羟基)(甲基)氧膦基丁酸(phosphinotricin)的链霉菌属viridochromogenes乙酰基转移酶基因的应用。在EP 218571中提到了对抗除草剂草甘膦(glyphosate)的植物基因。抵抗力是基于编码与N-磷酸甲基甘氨酸(N-phosphomethylglycine)耐受性相关的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合酶(5-enolshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)基因的表达。某些氨基酸例如赖氨酸、苏氨酸或赖氨酸衍生物氨基乙烷基胱氨酸(AEC)和色氨酸类似物如5-甲基色氨酸，由于高浓度使用时可抑制细胞生长，也可用作选择物质。在这个选择系统中，选择标记基因的表达导致可在选择下生长的转基因细胞的氨基酸生产过剩。

另一类选择标记是那些可以支持转化植物细胞在非转化细胞不能充分生长的状态下生长和增殖的标记，例如，缺乏植物生长激素的状态。一个选择标记基因可编码一个酶，其表达后，将加密(encryptic)碳源转换为支持转化植物细胞在含最低营养物的环境下生长和繁殖的碳源，并且在此环境下碳源被加密碳源或隐藏的碳源所代替，不能被非转化细胞所利用。这样一个选择标记例如是磷酸甘露糖异构酶，其将不能利用的甘露糖-6磷酸转换为可被植物细胞用作碳源的果糖-6-磷酸(US 6143562中提到)或赤色链霉菌的木糖异构酶(Haldrup A.等1998，Plant CellReport 18：76-81)。

然而另一类选择标记基因允许对推测的已转化植物细胞进行筛选，而不是对转化细胞抵抗毒性物质如抗生素的直接遗传选择。为此，它们也常被称为筛选性标记。这些基因称作报道基因，包括例如β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、β-牛乳糖、荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶和绿色荧光蛋白(GFP)。

或者，筛选标记可以提供一些其他可见的活性反应。例如，物质存在时，其产生不表达筛选标记基因的植物或植物细胞相关的独特外观或生长模式，此物质或者直接应用于植物或植物细胞或存在于植物或植物细胞生长培养基中。

通常，包含这样筛选性标记基因的植物或植物细胞具有便于鉴定的独特表型，即，它们可与非转化细胞区别开。特有的表型可鉴定包含该构建体的细胞、细胞群、组织、器官、植物部分或整个植物。形态异常诱导(MAI)标记基因的例子是土壤杆菌的异戊烯转移酶基因(Keller等WO 00/37060)。异戊烯转移酶是一种植物生长激素——细胞分裂素生物合成的一个限速酶。导入了ipt基因的植物细胞产生细胞分裂素，导致含有ipt基因的细胞的增殖和分化混乱，而引起了各种形态异常。

在最终获得的转基因植物中，抗生素抗性基因和其他选择标记序列的存在在大多数情况下认为是不合需要的。虽然，认为这些序列对转化过程是必需的，通常对于最终转化植物的确是无用的，并且事实上由于大量的原因消费者想要减少它。消费者组织对在食物产品中抗性标记的广泛分布表示关切，提出存在转基因选择基因横向转移进入肠道细菌的理论风险。

环境组织关注转基因植物与相关物种之间交叉授粉的风险，它可导致抗性转移到杂草里，危害转基因农作物的长期使用并导致潜在的生态学问题。因此，生产无标记植物将可能减轻公众接受转基因农作物的厌烦情绪。

目前为止，已发展了许多系统促进除去选择标记基因。两个不同构建体的共转化(co-transformation)可产生整合了两个基因的转基因系并且在遗传交叉后，选择标记可与感兴趣的基因隔离开来。WO 95/16031，US 6265638和WO 00/18939提到通过共转化除去选择标记基因。但是，共转化系统要求标记基因定位于非连锁的位置，意味着筛选许多更独立的转化事件。而且，许多交叉授粉和特别是无性繁殖的农作物，尤其是有块茎的农作物如马铃薯和木薯，是高度杂合的，通过遗传隔离除去标记序列将需要许多年才能找到一个具有合适的野生性能的克隆。几个转座元件系统和位点特异重组系统已被用于除去标记(Sugita K，等2000Plant J 22：461-469；Zuo J，等2001 Nature Biotech 19：157-161)。EP 716147描述载体介导一个所需基因进入植物，其包含感兴趣的基因和至少一个放置在可切除的DNA元件即转座元件或位点特异重组系统中的形态异常诱导(MAI)标记基因。转化含有基因构建体MAI的植物可通过肉眼观察枝的异常形态而易于检测。同样地，转座元件转座后或重组系统位点特异切除后，通过观察出现正常形态的枝，很容易检测出MAI基因功能的丢失。不需进行交叉步骤，可生成这样的无标记基因的转基因植物。这些系统要求表达一个转座酶或重组酶，其介导重组或转座酶靶序列之间的相等区域的缺失和随后通过遗传隔离除去标记基因。并且，对于主要为无性繁殖的物种，这些系统是耗费时间的，也是不切实际的。而且，缺失的片段可再插入基因组的其他位置。另一个诱导DNA缺失的方法是构建2个同源序列之间的染色体内同源重组。染色体内同源重组频率对于有效应用这个系统产生转基因区域的缺失而言极低。利用噬菌体λ的attP区可以提高这个重组频率(Zubko E.等2000 Nature Biotech 18：442-445)。但是，这个过程仍然不可预知并且效率太低以至不能产生数百至数千个独立的转化事件来发现适合于农业生产的克隆。不使用选择标记来回收转基因细胞的系统已被描述。在WO 98/51806中揭示了一个通过使用节培养物(nodal culture)和非选择性筛选分析富集转基因部分而不使用选择标记的回收转化细胞的方法。这个方法涉及包含非选择性的可分析的转基因的培养转化植物细胞或组织直到发育了包含分生组织的节点。随后，使用一个非选择性测定分析植物组织，如酶分析或ELISA。用这个方法回收的分析阳性植物是嵌合的并有转化部分。从阳性组织结的外植体富集这些转化部分并培养成枝。再使用非选择性测定分析枝和叶，希望回收了富含转化部分的植物以便于最终经过几轮分析后，获得接近均一的转基因植物。

发明内容

本发明提供了产生转基因植物的方法，所述转基因植物特别是交叉授粉和无性繁殖的农作物，其包含一个所需基因，并且基本上无其他外源或异源辅助核酸如选择标记基因，因此不需经选择物质处理进行筛选。所有上述提及的产生无标记转化株的系统都假设分离不含选择标记的非嵌合转化株实际上是不可行的，至少使用T-DNA构建体或相应的转化细菌的转化方案是不行的。在此提供的方法可以产生包含所需基因的植物，但其基本上没有用于转化植物的载体序列和/或标记序列。令人惊讶的是，本发明提供了转化植物或植物细胞的方法，包括使用转化细菌如土壤杆菌spp，和它的T-DNA来获得表达所需的感兴趣的异源基因的非嵌合转基因植物，其中所述T-DNA具有所需基因或基因片段，但是不包含额外的选择基因或其片段。

为此，本发明提供了含有T-DNA或其功能性等价物的分离或重组核酸，其允许所述T-DNA转移进植物细胞的基因组或核DNA，所述T-DNA具有不含编码选择标记的核酸的核酸，并提供了这样的T-DNA构建体在植物遗传工程化中的应用。因此，此处提供的方法不需要在选择性培养基中或处于选择性压力下生长假定的转化株而使真正的转化植物出现。相反，所需转化株的选择易于通过检验所需异源基因或基因片段或自身构建体的存在而实现，例如，使用熟知的核酸技术，如聚合酶链反应检测或常规Southern印迹实验的互补序列杂交法。很显然对本领域中的技术人员，通过监测基因表达产物的存在或缺失或量的改变可分析所需异源基因或基因片段的存在。例如，一个可用ELISA(酶联免疫吸附测定)检测的表达蛋白，用ELISA分析该蛋白的存在。而且，此处提供的方法可涉及生物鉴定或化学分析方法如气相层析/质谱(GC/MS)。需要对用于转移所述T-DNA构建体进入植物细胞DNA的重组T-DNA构建体，特别是具有所需无编码选择标记核酸的外源核酸的构建体部分的存在或缺失进行检测。本发明优选的核酸包含一个T-DNA构建体，其包含至少一个T-DNA边界，但是为了易于整合，优选的所述外源核酸的两侧有T-DNA边界重复序列或其功能性等价物。土壤杆菌宿主细胞的VirDl和VirD2蛋白识别边界重复序列，并在每个边界重复链末端的第三和第四个碱基之间产生一个单链切口。这些切口决定了分别位于左右边界的T链的启始终止位点。发现左边界对于T-DNA的转移是非必需的，但它帮助定义界定了T-DNA的左末端。右边界对于T-DNA转移似乎极其重要。T-DNA右边界区域缺失的Ti质粒通常不具有毒力(Holsters，M.等Plasmid 3，212-230，1980)。缺失左边界区域对于毒力无影响。重复序列的序列前后关系决定了它们在T-DNA转移时的相对活性。(Wang等Mol.Gen.Genet.210，338-346，1980)。一个典型的pBIN19质粒的边界重复的实例是右边界5’-TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC-3’和左边界5’-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAAC-3’。当然，用本发明的核酸很容易实现本发明，其中所述Ti-DNA来源于土壤杆菌spp的Ti质粒，特别是其中所述土壤杆菌包含一个根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)，所述细菌和专门技术可广泛获得。

在一个实施方式中，提供了本发明的核酸，其中所述外源核酸可以调控所述基因组中靶基因的表达。通过“sense”技术可以实现上调(或过表达)和下调。如果全长拷贝的靶基因插入了基因组，则可获得一系列表型，一些过表达靶基因，一些低表达。筛选用这个方法生产的植物种群并分离各个表型。一个优选的实施例包含一个方法，其中所述调控包含下调。抑制一个靶基因的表达，通常称为“基因沉默”，可通过“反义下调”和“有义下调”(也称为“共抑制(cosuppression)”)实现。在反义下调中，与内源性靶基因的全部或部分互补的DNA片段以反方向插入基因组。虽然还没有完全阐明机制，一个理论是，这样一个反义基因转录产生的mRNA与内源性基因mRNA转录产物在序列上互补。反义mRNA与天然产生的“有义”mRNA结合形成一个抑制天然mRNA翻译成蛋白的双螺旋。反义下调技术为本领域技术人员熟知并在全世界的实验室常规使用。因此，将靶基因编码序列的至少一个片段的拷贝插入靶生物体的基因组实现基因沉默，其拷贝包含或者全部或者部分或截短的序列并为有义或反义方向。此外，使用可能得自于基因组基因序列的内含子序列构建抑制载体。有报道，在生物体中已实现转基因和内源性基因的基因沉默，其中只在启动子区域内序列一致。

在一个更优选的实施方式中，本发明提供了一个T-DNA构建体，其中所述外源核酸包括至少一个部分所述靶基因的聚核苷酸区域的反向重复。虽然，反义和有义下调可导致完全的靶基因沉默，通常效率不是很高。最多有25％的反义转化株呈现完全的沉默，而只有约10％的用有义构建体获得的转化株显示一定水平的沉默(Smith等，2000，Nature 407：319-320；Wolters和Visser，2000，Plant Mol Biol 43：377-386)。最近，观察到当基因沉默载体包括一个靶基因的多聚核苷酸区域的所有或部分反向重复时，对生物体内选择靶基因的抑制是增强的。反向重复序列由一个T-DNA组成，其带有一个操纵有义cDNA拷贝表达的启动子和一个位于相同的cDNA的反义拷贝前面的另一启动子(Chuang和Meyerowitz，2000 Proc Natl Acad Sci USA 97：4985-4990)，或者该T-DNA包含在2个末端侧翼存在启动子的cDNA序列(LaCount等2000 Mol Biochem Parasit111：67-76)，或者该T-DNA包含操纵该cDNA(的部分)的反向重复序列转录的启动子(Hamilton等1998；Smith等2000 Nature 407：319-320；Wang和Waterhouse，2000 Wang MB，Waterhouse PM(2000)Plant Mol Biol43：67-82)，或者被沉默基因的启动子(Mette等2000 EMBO J 19：5194-5201)。据报道在使用一个内含子作为重复序列间的间隔区时，一些反向重复构建体导致了100％的转化株呈现靶基因沉默(Smith等2000Nature 407：319-320)。间隔片段增加了正确反向重复序列的稳定性，但是对于沉默的特异性不是必需的。在本发明核酸的一个特殊优选实施方式中，所述靶基因编码淀粉粒束缚淀粉合酶(granule-bound starch synthase，GBSSI)。此处详细描述了在编码转基因马铃薯淀粉粒束缚淀粉合酶(GBSSI)的靶基因的短重复区域后完全沉默的转化株发生频率有显著增加。

还提供了本发明的核酸，其中所述外源核酸可以在所述植物细胞内表达异源多肽。适当的多肽是多形式的，所需转化非标记进入植物的外源核酸或基因的典型实例是那些编码修饰新陈代谢和分解代谢过程的蛋白和酶。其他实例是可编码增加植物作为食物或农作物时营养价值的蛋白的基因。典型的实例包括可抑制抗营养因子形成的植物蛋白和具有更多所需氨基酸成分(如，较非转基因植物具有更高的赖氨酸含量)的植物蛋白。一个优选的实施方式中，所述核酸或所需基因编码包含酶的多肽。所需基因可编码在食物处理过程中使用的酶，如凝乳酶、奇(异果)甜蛋白和α-牛乳糖。所需基因也可以编码引入或增加病原体抗性的物质。所需基因可编码有利于动物或人类的非天然植物混合物。例如，所需基因可编码药物性活性蛋白或酶如胰岛素、干扰素、人血清白蛋白、人生长因子和凝血因子等任何一个治疗用化合物。在这点上，转化细胞或生物体可制备合意的很易从如块茎中回收的所需混合物。优选地，所需基因是编码具有高营养价值的蛋白或肽、反馈不敏感的氨基酸生物合成酶类如二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)(EC 4.2.1.52，DHPS)、具有抗病性的酶或肽、有义或反义转录如马铃薯块茎储藏蛋白、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、α-淀粉酶、分支酶、淀粉粒束缚淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、蛋白酶或葡聚糖酶的基因。

本发明也提供了包含本发明的核酸的载体或质粒和包含这样载体或核酸的宿主细胞。一个优选的宿主细胞包含土壤杆菌。对操作本发明的转化方法，优选使用充分致命性的土壤杆菌如根癌土壤杆菌，例如代表性的A281株或其来源的菌株或本领域可获得的其他毒性株。这些土壤杆菌株带有一个来源于包含virB、virC和virG基因的Ti质粒pTiBo542的毒力区域的DNA区域。根癌土壤杆菌的毒力基因(vir gene)产物协调T-DNA的处理和它进入植物细胞的转化。Vir基因表达由virA和virG控制，其中通过磷酸化作用，virA在感受到诱导信号后激活virG。VirG依次诱导virB、C、D、E的表达。这些基因编码的蛋白涉及DNA的转化。PTiBo542毒力增强被认为是Ti质粒上的超毒性virG基因引起的(Chen等Mol.Gen.Genet 230：302-309，1991)。但是，除使用感染性土壤杆菌外，当人们希望实施本发明时，存在其他的方法可有效的传递DNA进入受体植物细胞。传递DNA进入植物细胞的合适方法事实上包括DNA导入细胞的任何方法，如PEG介导的转化原生质体的DNA的直接传递(Omirulleh等，1993)，干燥或抑制介导的DNA吸收(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199：183-188，1985)、电穿孔法(U.S.专利号5,384,253)、金刚砂光纤振荡(Kaeppler等，1990；U.S.专利号5,302,523；和U.S.专利号5,464,765)、DNA包被颗粒的加速度法(U.S.专利号5,550,318；U.S.专利号5,538,877；和U.S.专利号5,538,880)。通过应用这些技术，任何植物种类的某些细胞可被稳定地转化，并且这些细胞发育为转基因植物。

在微弹法中，颗粒可被核酸包被并经推动力传递进入细胞。代表性的颗粒包括那些由钨、金、铂和相似物组成的颗粒。预期在一些情况下，DNA沉淀在金属颗粒上对于使用微弹法将DNA传递给受体细胞不是必需的。但是，预期颗粒可能包含DNA而不是被DNA包被。与目前发明相一致的微弹转化法、物理和生物因素都可被优化。物理因素是那些涉及操作DNA/微粒沉淀物或那些影响大的或微小颗粒的射程和速度的因素。生物因素包括涉及轰击之前和之后的操纵细胞的所有步骤，如靶细胞的渗透性调控以有助于减轻轰击相关的损伤，与颗粒弹道相关的靶组织的定向，和转化DNA的性质，如线性化的DNA或完整的超螺旋的质粒。人们认为轰击前的操作对于成功转化是非常重要的。

因此，人们希望在小范围研究调整不同的轰击参数以得到完全优化的条件。人们特别希望调整物理因素可能是DNA浓度、间隙距离、飞行距离、组织距离和氦压力。进一步预期氦的级别可影响转化效率。人们也可通过改变影响受体细胞生理状态并因此影响转化和整合效率的环境来优化损伤减少因素。例如，调整渗透状态、组织水合和次培养期或受体细胞的细胞周期以优化转化。用于微粒转化的转化DNA包含一个表达盒，通常其含有希望导入细胞的cDNA，一个基因或几个基因，并进而包括可操纵连接外源基因的启动子和3’区域。在本发明中描述了最优化的基因构建体。DNA片段额外包括第2、第3、第4、第5、第6或任意附加数目的被放置在单个DNA分子上并被转化进入受体细胞的外源基因。

本发明的一个特殊实施例中，DNA片段不包括转化选择或筛选标记基因。通常，除所需基因外，人们使用选择或筛选标记基因提高鉴别转化株的能力。“标记基因”是赋予表达标记基因的细胞清晰表型的基因，因此可以区别这样的转化细胞与无标记的细胞。这样的基因可以编码选择或筛选标记，取决于是否标记赋予了可通过化学方式进行选择的特性，即，通过使用选择性物质(如除草剂、抗生素、氨基酸类似物或相似物)，或者它是否仅仅是一个通过观测或测试而鉴别的特性，即，通过“筛选”(如R-基因座(R-locus)特性、β-葡萄糖苷酸酶或uidA基因)。为生产无载体DNA序列的转化株，希望传递DNA进入不包含维持细菌宿主内质粒载体所必需的DNA序列的细胞，如E.Coli，例如抗生素抗性基因，包括但不限制于氨卡青霉素、卡那霉素和四环素抗性，及DNA复制的原核起点。在这种情况下，包含转化DNA的DNA片段可在转化前被纯化。例如在琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳实现纯化，随后从琼脂糖凝胶上回收DNA片段。

经去磷酸化或核酸片段平末端化对核酸片段末端进行的修饰可控制引入的转基因拷贝数量和有效地生产低拷贝转化株(WO 99/32642)。本发明用微弹法转化的受体植物细胞可能来源于潜在的任何可转化的单子叶或双子叶植物。本发明使用的优选的单子叶植物细胞来源于大米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、粟、高粱、甘蔗、草坪和玉米。本发明使用的优选的的双子叶植物细胞包括棉花、西红柿、柑橘、烟草、大豆和特殊的马铃薯和木薯。

实现将外源DNA传送进入受体细胞后，通常下一步涉及鉴定转化细胞以便更进一步培养和再生植物。在本发明中，传送了外源DNA后的细胞在支持植物再生的培养基中培养。枝发育后，使用DNA或RNA检测方法检测包含一个或更多转基因的苗。方法包括依据标准方法从苗或一组小苗中分离核酸。(Sambrook等，1989)。本发明提供了使用核酸检测方法决定是否一个转化植物细胞或其子代转化了重组核酸，该方法包含测试所述细胞或所述子代是否存在或缺失所述核酸或其来源的基因产物。核酸可以是基因组DNA、RNA或mRNA。例如，使用这样一个方法测试出现在基因构建体中的特殊基因的存在和重排，即，使用一种质量控制检查是否一个植物细胞已被充分转化。本发明提供了使用mRNA检测方法决定是否转化的植物细胞或其子代的核酸构建体充分整合进入植物基因组并转录为mRNA构建体。使用直接(DNA)或间接(RNA)扩增方法在样品中鉴定了部分转基因的所需特异性核酸。其次，检测已鉴定的产物。在某些应用中，通过可见方法进行检测(如，凝胶的溴化乙锭染色)。或者，检测涉及化学发光、放射标记或荧光标记的放射性闪烁照相或甚至电或热脉冲信号系统来间接鉴定产物。使用一系列不同的测试方法筛选使用本发明的方法产生的转基因植物。这些技术用于检测特殊基因的存在及可能出现在基因构建体里的重排。这些技术包括但是不限于，聚合酶链反应(PCR)、荧光原位杂交(FISH)、直接DNA测序、PFGE分析、Southern或Northern印迹、单链构象分析(SSCA)、RNA酶保护分析、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)、斑点印迹分析、变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)和PCR-SSCP或基于DNA技术的芯片。本发明提供了应用核酸检测方法来决定是否转化的植物细胞或其子代被重组核酸转化，该核酸包含一个整合进入植物细胞基因组的T-DNA构建体或功能性等价核酸构建体。而且，本发明提供了使用核酸测试方法决定是否一个转化植物细胞或其子代被重组核酸转化，包括测试所述细胞或所述子代的非所需载体材料例如载体主链序列的存在或缺失。例如，使用本发明的方法检测是否转化的植物细胞基本上没有辅助的非所需核酸。用核酸测试方法鉴别转化的苗，然后让其发育成植物。再生植物进入茎和根发育阶段后，它们可被移入温室进一步生长和测试。

此外，本发明提供了包含本发明核酸的植物细胞和来源于这样植物细胞的再生植物，或其部分。特别提供的是块茎植物或其部分，其优选的选自马铃薯或木薯植物种群。此处提供的这样的马铃薯或木薯植物包含所谓的无标记的高支链淀粉块茎(例如马铃薯或木薯)，由于编码淀粉粒束缚淀粉合酶基因的下调而基本上缺少直链淀粉。这样的马铃薯或木薯植物含有的直链淀粉容量少于5％，并且基本上不含有任何转化选择标记基因例如抗生素或抗除草剂基因。此外，在优选的这些植物的基因组中没有整合用于转化过程的载体序列，例如全部或部分土壤杆菌Ti质粒，和包含低拷贝数的T-DNA插入，优选一个拷贝。也提供了高赖氨酸植物(优选马铃薯或木薯)，其含有的赖氨酸超过总游离氨基酸含量的20％，或甲硫氨酸超过总游离氨基酸含量的15％，或超过30％的直链淀粉，或超过2％的凝固蛋白质，而基本上不包含转化选择标记基因例如抗生素或抗除草剂基因，在它们的基因组中没有整合用于转化过程的载体序列，例如全部或部分土壤杆菌Ti质粒，并包含低拷贝数的T-DNA插入，优选一个拷贝。

本发明提供了转化植物细胞的方法，包含提供本发明的重组核酸给植物细胞，包含测试所述细胞或至少部分所述细胞子代中所述核酸或其来源的基因产物的存在或缺失，其中所述测试包含核酸检测方法的使用。在一个实施方式中，使用核酸检测方法筛选假定的转化株种群检测其子代来源的植物细胞中外源核酸的存在或缺失，在未转化细胞的背景下鉴别所需的转化细胞。特别地，核酸测试方法，例如PCR方法，用于鉴别转化的块茎植物细胞，其优选的选自马铃薯或木薯植物。在一个实施方式中，本发明提供了不包含选择标记基因的产生和分离显示内源基因沉默或内源基因过表达的转化株的方法。

在此，我们显示使用这个方法甚至可能获得基本上无标记基因、无载体DNA主链的转化株，只有1个T-DNA的插入，其中内源基因沉默或过表达。此外，已经证明这个方法可产生均一的和非嵌合的转化株。在另一个实施例中，提供了表达异源基因的转化株的生产和分离方法，同样地，所述转化株基本上无标记和载体DNA主链。用本发明的方法鉴别的转化细胞可进一步培养并获得带有所需基因的基本上无标记的植物。本发明提供了使用蛋白质测试方法决定是否在转化植物细胞或其子代内的重组核酸构建体充分地整合进入植物基因组并调控植物细胞基因组的靶基因表达。本发明的蛋白质测试方法也可用于确定植物细胞内蛋白质的表达水平，其中基因表达是被调控的，例如，采用基因沉默或下调技术抑制靶基因表达。采用酶分析或免疫测定，例如，ELISA分析、Western印迹、斑点印迹分析或类似实验确定外源核酸转化植物细胞后靶基因的下调程度或基因的过表达水平，进行转化株的选择。本发明的蛋白质测试方法可以检查在植物细胞或其子代的某个发育阶段中是否在植物细胞或植物组织中表达外源核酸。这样的外源核酸可编码异源多肽，例如一个酶。如述，提供了一个方法，其中不需要在选择培养基的选择压力下培养真正的转化细胞以排除非转化细胞，使用本发明方法的转化效率很高以至不再需要选择培养。本发明提供了转化植物细胞的方法，其包含提供含有T-DNA构建体或其功能等价物的重组核酸给植物细胞，其中所述植物细胞为块茎植物细胞，包含测试所述块茎植物细胞或至少其部分子代的所述核酸或其基因产物的存在或缺失，其中所述测试包含使用核酸测试方法。本发明方法的一个方法特别适宜获得无标记块茎植物，因为块茎植物是高度杂合并且通过常规遗传分离基本上不远交异型杂交标记基因。在本发明中，要求测试至少部分所述细胞的子代中本发明的核酸的至少功能性部分的存在或缺失。这样的子代由部分根或枝，或单个细胞组成，因此，为进一步的再生和无性繁殖留下充足的转化材料。优选的通过使用核酸测试方法和/或表型筛选选择转化株如转化的枝。采用Southern杂交、聚合酶链反应程序和其他本领域内可获得的测试方法检测带有所需基因和无辅助核酸的转化株。这样的测试可进一步包含测试至少部分所述细胞的子代中存在或缺失非所需的载体核酸。简言之，这个发明提供了生产包含所需基因和基本上无辅助的非所需核酸的转基因植物的方法。在优选的实施例中，本发明提供了转化植物的最优化的转化步骤，使用(优选有毒力的)土壤杆菌株，优化的有效抑制或过表达基因的基因构建体和生化测试而不是选择压力测试转化株的有效方法，例如，通过Southern印迹杂交、聚合酶链反应(PCR)程序或其他可获得的核酸测试方法。

在另一个优选的实施方式中，本发明提供了转化块茎植物细胞的方法，提供含有无编码选择标记的核酸的T-DNA构建体的重组核酸给所述细胞，所述构建体具有编码淀粉粒束缚淀粉合酶(GBBI)的靶基因，包含测试至少部分所述块茎植物细胞子代中所述靶基因的存在或缺失，其中所述测试包含使用核酸检测方法，例如使用PCR技术。

附图说明

图1.GBSS cDNA反义基因沉默载体图谱

图2.质粒pMTL1.1图谱，该质粒包含用于制备图4、5、6、7、8、13、14和15质粒的GBSS cDNA的1.1 kb的5′末端

图3.质粒pMTL1.3图谱，该质粒包含用于制备图4、5、6、7、8、13、14和15质粒的GBSS cDNA的1.3kb的3′末端。

图4.带有nptII选择标记基因的GBSSI基因沉默载体pKGBA50-IR1.3，其包含被GBSS cDNA的1.1kb的5′末端中断的反向重复构型的GBSS的cDNA的1.3kb的3′末端。

图5.带有nptII选择标记基因的GBSSI基因沉默载体pKGBA50-DR1.3，其包含被GBSS cDNA的1.1kb的5′末端中断的串联重复构型的GBSS cDNA的1.3kb的3′末端。

图6.带有nptII选择标记基因的GBSSI基因沉默载体pKGBA50-IR1.1，其包含被GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中断的反向重复构型的GBSS cDNA的1.1kb的5′末端。

图7.带有nptII选择标记基因的GBSSI基因沉默载体pKGBA50-DR1.1，其包含被GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中断的串联重复构型的GBSS cDNA的1.1kb的5′末端。

图8.无选择标记的GBSSI基因沉默载体pKGBA50mf-IR1.1，其包含被GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中断的反向重复构型的GBSS cDNA的1.1kb的5′末端。

图9.带有4个不同GBSSI基因沉默构建体的马铃薯植物cv.Karnico的转化结果，与传统的GBSSI反义构建体相比，这些构建体包含反向或串联重复构型的GBSSI cDNA。挑选出转化株后，对体外生长的植物加入块茎诱导培养基。2至6周后，多数枝发育出试管薯。切下块茎表面所得的淀粉用碘染色。含有被碘溶液染成兰色的颗粒的转化株是非沉默的(无)，着红色的块茎为沉默的(完全地/强烈地)和着“弱或中等”颜色指示部分沉默的转化株。

图10.包含反馈不敏感的无植物转化选择标记的受GBSSI启动子控制的马铃薯DHDPS cDNA的质粒pAAP105mf的图谱。

图11.来源于不同的独立转化株或对照植物的试管薯的游离赖氨酸浓度(占游离氨基酸总量的％)对体外生长的植物加入块茎诱导培养基诱导块茎。2至6周后，大多数枝发育出试管薯。将组织(0.5-1.0克)在2ml含有1mM二硫苏糖醇的Pi缓冲液中匀浆。加入正亮氨酸作为内在标准。用5ml水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12)提取来部分纯化游离的氨基酸。冻干浓缩到3ml后，取20微升样品用HPLC阳离子交换柱(BIOCHROM 20，Amersham Pharmacia biotech)分析。

图12.质粒pAAP172图谱，其包含1.1kb的反馈不敏感的用于制备图13、14和15质粒的受马铃薯GBSSI启动子控制的马铃薯DHPS*cDNA。

图13.构建GBSSI基因沉默载体pKGBA50mf-R1.1，它包含pAAP105的反馈不敏感的马铃薯DHPS*cDNA。

图14.pDHPS-IR1.1(串联)的T-DNA，其包含GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中断的反向重复构型的GBSS cDNA的1.1kb的5’末端，和无植物转化选择标记的串联方向的反馈不敏感的马铃薯DHPS*cDNA。

图15.pDHPS-IR1.1(串联)的T-DNA，其包含GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中断的反向重复构型的GBSS cDNA的1.1kb的5′末端，和无植物转化选择标记的反向方向的反馈不敏感的马铃薯DHPS*cDNA。

图16.Southern印迹分析分离无标记、无载体和无直链淀粉的马铃薯转化株的DNA。从17个转化株和一个未转化的对照株(Karnico)中分离基因组DNA，使用HindIII消化并用NOS终止子探针探察。

具体实施方式

植物转化的最优化

本发明提到的高通量生产无标记的转化株要求不依赖于基因型的高效转化频率。最优化单和双子叶植物的转化方案是许多研究的课题。对转化块茎植物如马铃薯而言，一些转化方法已经发表。在这些方案的许多方法中，转化效率非常倚赖基因型。不同方案间本质的区别是是否在整个再生周期中存在植物生长素或是否愈伤开始阶段后不存在生长素而存在赤霉素。发表的方案中的培养基组分和生长素和细胞因子类型和水平也存在不同(Hulme等1992 Plant Molec.Biology 31，161-167)。大量的调查显示乙烯堆积可抑制马铃薯植物的再生，这个抑制作用在存在乙烯生物合成或乙烯活性抑制剂时被克服(Perl等1988 Plant Cell Rep.7，403-406)。因此，一些方案在再生培养基中加入硫代硫酸银(STS)。转化方案可进行其他修改以增加转化效率。例如，WO 0034491提到接种土壤杆菌后，降低潮湿条件使外植体重量减轻可提高转化效率。在共培养期间减轻外植体重量的可能方法包括增加培养基的渗透压、添加干燥剂包括氧化钙或硫酸或风干外植体。

但是对于商业性的转化，单一的对于大范围栽培品种有效的方案是便利的。比较大量不同的关于再生一系列马铃薯栽培品种的方案，Hulme等(1992 Plant Molec.Biology 31，161-167)得出结论，与那些迄今为止已发表的大量马铃薯栽培品种方案比较，Hovenkamp Hermelink等(1988Euphytica 39，213-219)的方案较好。在此，我们证明2个关于再生的转化方案对所获得的无标记转化株的数量有重要影响。

转化效率的最优化

优选的用于本发明方法的土壤杆菌株是被修饰包含所需基因，或在转化细胞中表达的核酸。将被转移的核酸掺入T区域并且侧翼存在至少一个T-DNA边界序列。本领域已知多种土壤杆菌种，特别对转化双子叶植物，包括根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌。见，例如，Hooykaas，P.J.1989Plant Mol.Siol.13：327；Smith等1995 Crop Science 35：301；Chilton，M.O.1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3119；19：148；Ishida等1996 NatureBiotechnol.14：745；Komari，T等1996 The Plant Journal 10：165。在Ti质粒中，T区域与负责转移和整合功能的vir区不同。双元载体系统已得到发展，可操纵的带有外源DNA的T-DNA和vir功能存在于分离的质粒上。照此，包含外源DNA(所需的被转移的核酸)的修饰了的T-DNA区域被构建在E.Coli中复制的小质粒内。采用三亲本杂交或电穿孔法或冻溶程序将这个质粒接合转化进包含带有毒力基因的相容质粒的根癌土壤杆菌中。转移T-DNA进入植物基因组in trans提供了Vir功能。剧毒vir区域的存在对转化效率有很大影响。优选的是农杆氨酸的双元的根癌土壤杆菌株。特别优选可公共获得的根癌土壤杆菌株EHA101、AGL0或AGL1。这些菌株包含C58细菌染色体和产生于剧毒的根癌土壤杆菌A281的在文献中称为TiBO542的Ti质粒的disarmed衍生物。[见，例如，Hood E.E.等，(1986)J.Bacteriology 168：1291-1301，Lazo GR.等(1991)Biotechnology9：963-967]。

或者，被使用的土壤杆菌株包含具有增强毒性的质粒。优选的是用超双元载体来实践本发明。已构建了这样的超双元载体，其包含了显示出极高转化效率的根癌土壤杆菌A281内的Ti质粒pTiBo542(Jin等(1987))毒力区域的DNA区域(Hood等(1984)Biotechnol.2：702-709；Hood等(1986)J.Bacterial.168：1283-1290；Komari等(1986)J.Bacteriol.166：88-94；Jin等(1987)J.Bacterial.169：4417-4425；Komari T.(1989)Plant Science 60：223-229；ATCC Accession No.37394)。

超双元载体包括pTOK162(日本专利申请号(Kokai)4222527、EP-A-504,869、EP-A-604,662和美国专利号5,591,616)和pTOK233(Komari，T.(1990)Plant Cell Reports 9：303-306；和Ishida等(1996)NatureBiotechnology 14：745)。超双元载体pTOK162在E.coli和根癌土壤杆菌内复制。另外，载体包含pTiBo542毒性区域的virB、virC和virG基因。经三重杂交，质粒被导入土壤杆菌株(Ditta G等，1980；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7347-7351)。除土壤杆菌株型之外，已知添加酚类化合物如乙酰丁香酮到土壤杆菌悬液可增强转化效率(见Townsend，J.A.等，US5,563,055)。典型的浓度范围在100-200μM范围内。

基因构建体的最优化

抑制靶基因的表达，一般称为“沉默”，可以通过“反义下调”和“有义下调”(也称为“共抑制”)来实现。反义下调中，与全部或部分内源靶基因互补的DNA片段以反方向插入基因组。该机制尚未完全阐明，一个理论是该反义基因的转录产生的mRNA与内源基因转录的mRNA在序列上互补。反义mRNA于是和天然产生的有义mRNA结合形成二聚体抑制天然mRNA翻译为蛋白质。

反义下调技术为本领域所熟知而且在全世界实验室中被经常使用。过表达和下调都可通过“有义”技术实现。如果靶基因的全长拷贝插入基因组则可获得一系列表型，有的过表达靶基因，有的低表达。本方法产生的植物能被筛选和分离个体表型。

因此基因沉默可以通过将靶基因的额外拷贝插入目标生物体的基因组实现，该拷贝编码的序列可以包含全部或部分或是截断了的序列并可以是有义或反义方向。另外，可能从基因组基因序列获得的内含子序列可被用来构建抑制载体。已经有报道在转生物体中实现了转基因和内源基因的基因沉默，其中只在启动子区域存在序列一致性。

尽管反义和有义下调可以导致靶基因的完全沉默，但效率通常不是很高。反义转化株最多25％出现完全沉默，而通过有义构建体获得的转化株只有大约10％出现了一定水平的沉默(Smith等2000 Nature 407：319-320；Wolters和Visser，2000 Plant Mol Biol 43：377-386)。最近，已经观察到当基因沉默载体包括靶基因的多聚核苷酸的所有或部分反向重复序列时，生物体中选定的靶基因抑制提高了(如WO 99/61632、WO98/53083和WO 99/53050所提到的)。

反向重复序列组成可以是具有驱动cDNA有义拷贝表达的启动子和位于相同的cDNA的反义拷贝前面的另一个启动子(Chuang和Meyerowitz，2000 Proc Natl Acad Sci USA 97：4985-4990)的T-DNA或该T-DNA包含两端由启动子衔接的cDNA序列(LaCount等2000 MolBiochem Parasit 111；67-76)，或该T-DNA包含驱动cDNA(部分)反向重复序列转录的启动子(Hamilton等1998；Smith等2000 Nature 407：319-320；Wang和Waterhouse，2000 Wang MB，Waterhouse PM(2000)Plant Mol Biol 43：67-82)或基因的启动子(Mette等2000 EMBO J 19：5194-5201)被沉默了。

在使用内含子作为重复序列间隔时，有些反向重复构建体被报道导致了100％转化株显示靶基因的沉默(Smith等2000 Nature 407：319-320)。间隔片段赋予了正确的反向重复序列的稳定性，但对沉默的特异性不是必需的。

此处我们证明了超过60％的GBSSI转化的马铃薯与野生型比较，表现了充分的或者甚至很强的减弱的GBSSI活性，其中GBSSI反义基因包含它5’区的额外的上游反向拷贝。只有14％的用没有反向重复序列的相似构建体转化的植物具有减弱的GBSSI活性。

尽管本发明工作的机制尚未完全了解，我们相信反向重复序列的存在可以产生双链RNA，其来源于与被沉默的基因同源的DNA序列。反过来，它被认为引起了由要被沉默的基因转录出的内源ssRNA的降解。基于其他人员的研究(Hamilton AJ等(1998)Plant J 15：737-746 Stam，M(1997)Annals of Botany 79：3-12)，我们猜想GBSSI基因表达的抑制主要在转录后。或者，Mette MF等((2000)EMBO J 19：5194-5201)描述了含有驱动要被沉默的基因的启动子(部分)(Mette等2000 EMBOJ 19：5194-5201)的反向重复序列转录的启动子的T-DNA导致了转录后沉默和启动子甲基化。

植物中靶基因的过表达水平可被许多因素影响。一个因素是使用的转录启动子的选择。有很多植物相容的启动子，包括组织特异的和可诱导的启动子。证明很好的组成性启动子包括CaMV 35S启动子和这个启动子的串联排列，如欧洲专利申请No.0342926所提到的。可以操纵表达水平的其它因素是转录修饰因子，例如内含子、多聚腺苷酸化和转录终止位点。在翻译水平，可考虑的因素是核糖体结合位点和基因的编码倾向性。位于启动子和靶基因间的苜蓿花叶病毒被壳蛋白基因的被壳蛋白基因的mRNA的非翻译前导序列衍生的翻译增强子序列可以提高翻译效率，如US 6037527所提到的。本发明的构建体也可以包含一个或多个编码信号蛋白的序列，包括前-、原-或前原-序列。这些通常位于序列前方，所以靶基因和信号蛋白表达为融合体。信号序列可以保证任何成熟的融合体形成所需的翻译后修饰和/或可以特异的指导表达的融合产物到达植物或植物细胞中的部分或细胞器。

而且，已观察到插入基因组中不同的位点的相同的构建体在植物中表达水平不同。相信这个结果至少部分是由于基因在染色体的位置，即，单个种群有不同的表达水平。这个现象，称为“位置效应(position effect)”变化，是在独立的转化株中同一个基因的表达多样性。使用所谓的核基质结合序列或支架结构(scaffold)结合序列的天然产生的DNA序列解决这个问题，已在US专利5773689和WO 94/24293中提出。WO 0032800指出核基质结合序列可以在代表单子叶植物和双子叶植物的植物种类中提高表达。

在优选的实施方式中，控制基因表达的启动子是强的和组织特异的。已知组织特异的启动子的例子包括定向于块茎(tuber-directed)的I型马铃薯块茎储藏蛋白启动子(Bevan等，(1986)Nucleic Acids Res 14：4625-38)、马铃薯块茎GBSSI基因相关联的启动子(Visser等1991 PlantMolec Biol 17，691-699)、大豆的β大豆伴球蛋白启动子(也被称为7S蛋白的启动子，其驱动定向于种子(seed-directed)的转录(Bray 1987 Planta172：364-370))和玉米胚乳的玉米蛋白基因的定向于种子的启动子(Pedersen等，1982 Cell 29：1015-26)。

或者，靶基因置于CaMV 35S启动子的转录控制之下。在这个构建中，通过将代表CaMV 35S启动子部分的DNA片段置于顺行的重复序列串联排列中来提高转录活性。

挑选单拷贝和不含载体DNA的转化株

转化后，T-DNA在宿主植物基因组中以单或多拷贝存在。而且，边沿外的DNA有时也整合到宿主植物的基因组中。该报道的情况是，在20-30％的转基因植物(Martineau，B等The Plant Cell 6，1032-1033，1994)和75％的烟草转化株(Kononov，ME等，The Plant J11，945-957)中是如此。处理转基因植物和/或转基因食品要求的注册当局认为带有选择标记，载体DNA和T-DNA多拷贝/插入的转基因植物应尽量避免。本实施方式中，没有骨架载体DNA的转化株通过PCR或Southern印迹选择。或者通过在T-边界外插入一个编码序列抑制载体DNA向植物的转移，该编码序列编码对植物有毒性的(多)肽，所以存在一个对含有过量载体DNA的植物的负选择(如WO 99/01563所提到的)。

实施例1

有效抑制GBSSI表达的基因构建体的最优化

基因构建体

反义GBSSI构建体pKGBA50(图1)已在Kuipers等(1995)Mol GenGenet 246：745-755中描述。除了选择标记基因NPTII，其包含在GBSSI启动子后面的反义方向的2.4Kb的GBSSI cDNA。两个GBSSI cDNA片段，1.1Kb的5’部分和1.3Kb的3’部分，作为EcoRI片段分别克隆进质粒pWx1.1和pWx1.3(Visser等1991 Mol Gen Genet 225：289-296)。这些EcoRI片段克隆进载体pMTL25(Chambers等1988 Gene 68：139-149)，生成质粒pMTL1.1和pMTL1.3，见图2和3。质粒pMTL1.3用BamHI消化。±1.3Kb的BamHI片段克隆进BamHI消化了的pKGBA50。这产生了两个新的双元载体：pKGBA50-IR1.3(图4)，其具有一个1.3Kb片段的反向重复序列，和pKGBA50-DR1.3(图5)，含有1.3kb片段的正向重复序列。质粒pMTL1.1用SalI消化。±1.2kb的SalI片段克隆进SalI消化了的pKGBA50。这产生了两个额外的双元载体：pKGBA50-IR1.1(图6)，其含有1.1kb片段的反向重复序列，和pKGBA50-DR1.1(图7)，其具有1.1kb片段的正向重复序列。

所有构建体都转化进E.coli DH5 α(GIBCO BRL)。双元载体pKGBA50-IR1.3，pKGBA50-IR1.3，pKGBA50-IR1.1，pKGBA50-DR1.1和pKGBA50-IR1.1通过三亲交配法转化进土壤杆菌LBA4404(pAL4404)(Hoekema等1983 Nature 303：179-180)，在E.coli HB101中使用辅助质粒pRK2013(Figurski和Helinski，1979 Proc Natl Acad Sci USA 76：1648-1652)。

转化马铃薯

马铃薯栽培品种“Karnico”(匿名，1994 Beschrijvende Rassenlijstvoor Landbouwgewassen CPRO-DLO，Wageningen，荷兰，342pp.)已被转化了反义构建体pKGBA50(Kuipers等1995 Mol Gen Genet 246：745-755)。相同的马铃薯栽培品种转化了pKGBA50-IR1.3(构建体A7)，pKGBA50-DR1.3(构建体B 1)，pKGBA50-IR1.1(构建体C2)和pKGBA50-DR1.1(构建体D4)。体外生长的植物，用节间切割通过土壤杆菌共培养进行转化，依据Visser RGF(1991)在K Lindser(ED)植物组织培养手册，Kluwer Academic Publishers，Dorrecht/Boston/London，PP.B5：1-9中描述的方法进行。在含有20g/L蔗糖，100mg/L卡那霉素的MS20培养基(Murashige和Skoog，1962 Physiol Plant 15：473-497)中选择转化株。

体外块茎形成

枝移到含有50ml固化的MS30培养基的罐中。3-4周后，加入20ml液体培养基，其组成为含有325g/L蔗糖和1.75g/L CCC(氯化氯胆碱，或矮状素)的KI培养基(‘knolinducerend’(＝块茎诱导)培养基，Duchefa)。将罐子置于18℃的避光房间内生长。2-6周后，大多数枝上生长了试管薯。

淀粉染色

切割试管薯并用碘酒溶液(1.7％(w/v)碘酒和3.3％(w/v)碘化钾溶液)染色，评估淀粉颗粒中直链淀粉的存在。淀粉颗粒的染色用显微镜观察。

DNA分析

DNA从体外枝中通过CTAB DNA分离方法分离，如Rogers和Bendich(1998)植物分子生物学手册A6 Kluwer Academic Publ，Dordrecht，pp1-10中描述。使用引物NPT3和NPT4(序列号3和4)进行PCR，检测NPTII选择标记基因的存在。随后，用引物NPT1和NPT2，trfA1和trfA2，insB1和insB2(序列号1，2，5，6，7和8；Wolters等1998 MolBreeding 4：343-358)进行PCR，研究转化株中骨架载体DNA的存在。

4μg的转化株DNA用HindIII消化，片段用凝胶电泳分离，及进行Southern印迹实验。印迹和pBI101的NPT3+NPT4 PCR产物(Jefferson等1987 EMBO J 6：3901-3907)组成的NPTII探针杂交，检测T-DNA插入的数量。

沉默的效率

每个构建体转化株的数量，从中获得了试管薯，示于表1。碘酒染色结果在表1和图9中给出。作为参考，还包括了用反义构建体pKGBA50获得的结果。14％用反义构建体pKGBA50获得的转化株显示了完全抑制了GBSSI活性，由用碘酒溶液染成的红色淀粉颗粒表明。与反义构建体相比，正向重复构建体pKGBA50-DR1.3(B1)和pKGBA50-DR1.1(D4)产生了较低百分率(2-6％)完全沉默的转化株。相反，反向重复构建体pKGBA50-IR1.3(A7)和pKGBA50-IR1.1(C2)导致了较高百分率的转化株显示完全抑制GBSSI，与反义构建体相比：对A7是20％和对C2是62％。因此，反向重复构建体pKGBA50-IR1.1(C2)在完全沉默GBSSI活性上比反义构建体pKGBA50有效4.5倍。反向重复构建体C2比构建体A7有效的多：大部分(62％)C2转化株显示了强的或完全的沉默，而大部分A7转化株(47％)显示了中等水平的沉默。这暗示或者是存在于反向重复序列中的编码序列(5’或3’区)的区域是重要的，或者与启动子相关的反向重复序列的方向(反义DNA-间隔序列-有义DNA对有义DNA-间隔序列-反义DNA)是有效的决定因素。相似的，正向重复构建体B1和D4间存在差别；大部分(51％)B1转化株显示了低水平的沉默，而多数D4转化株(85％)显示根本没有沉默。因此，GBSSI cDNA的1.1kb区域在反向重复方向时对沉默是最有效的，而它在正向重复方向时是最无效的。这暗示寻找最适的序列去构造反向重复构建体来产生最大的沉默效果是很重要的。

分子分析

从20个A7转化株中分离DNA。所有都显示了预期的NPTII PCR片段，表明所有都含有至少一个T-DNA插入。20个中有9个显示了存在非T-DNA载体DNA，由NPTIII和trfA基因的PCR决定(表2)。因此，大约一半的转化株不含有骨架载体DNA。

从40个显示了强的完全沉默GBSSI的C2转化株中分离DNA。用NPTII引物，所有都显示了预期的PCR片段。用骨架载体DNA引物的PCR分析证明其中17个转化株含有非T-DNA序列，而23个是阴性的(表3)。HindIII消化的DNA和NPTII探针杂交的Southern印迹分析显示20个转化株中有5个含有单链T-DNA插入。其中4个没有骨架载体DNA。因此，这证明用反向重复构建体pKGBA50-IR1.1可能获得具有单链T-DNA插入和没有骨架载体DNA的完全沉默的转化株。

实施例2

分离没有选择标记基因的GBSSI沉默的转化株

基因构建体

实施例1显示GBSSI cDNA的1.1kb区域在反向重复方向对沉默是最有效的和可能用这个构建体(pKGBA50-IR1.1)获得具有单链T-DNA和没有骨架载体DNA的完全沉默了的转化株。

在以前的实施例中，用存在于构建体pKGBA50-IR1.1上的选择标记基因NPTII在卡那霉素上选择转化株。为分离没有选择标记基因的转化株，双元载体pKGBA50-IR1.1用酶PmeI和ClaI消化(见图1)。PmeI产生平末端。ClaI粘性末端用Klenow聚合酶处理为平末端，然后载体DNA用T4 DNA连接酶通过平末端连接进行环化。这产生了载体pKGBA50mf-IR1.1(没有标记基因)(图8)。这个构建体转化进E.coli DH5α(GIBCO BRL)。双元载体pKGBA50mf-IR1.1通过三亲杂交法转化进土壤杆菌LBA4404(pAL4404)(Hoekema等1983)，在E.coli HB101中使用辅助质粒pRK2013(Figurski和Helinski，1979)和土壤杆菌株Agl-0(Lazo等1991)。已知Agl-0菌株比LBA4404毒性更大。

转化马铃薯和选择转化株

马铃薯栽培品种Karnico的体外生长的植物的节间切割用来通过土壤杆菌共培养进行转化，依照Visser(1991)描述的方法。马铃薯栽培品种Karnico转化了土壤杆菌LBA4404或土壤杆菌Agl-0的pKGBA50mf-IR1.1，依照相同的方法。没有进行选择。4周后，收获第一个枝并连续收获枝3个月。每个茎外植体收获了不超过两个再生体并且枝生长于MS20培养基。1-2周后，收集8个或更多独立的枝的叶或茎物质并且建立成库(库的大小依赖于预期的转化株的频率)。枝的这些库的DNA用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离在96孔酶标板中。使用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自再生体库的DNA进行PCR分析，检测转化株的存在。各个枝的PCR阳性库的叶和/或茎收集在96孔酶标板中并且用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离基因组DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自各个再生体的DNA进行PCR分析，检测转化株的存在。

体外块茎形成

对PCR阳性枝，加入20ml液体培养基，其组成为含有325g/L蔗糖和1.75g/L CCC(氯化氯胆碱，或矮状素)的KI培养基(knolinducerend(＝块茎诱导)培养基，Duchefa)。将罐子置于18℃的避光房间中生长。2至6周后，大部分枝上形成了试管薯。

淀粉染色

切割试管薯并用碘酒溶液染色评估淀粉颗粒中直链淀粉的存在。淀粉颗粒的染色用显微镜观察。

DNA分析

用CTAB DNA分离方法分离体外枝的DNA，如Rogers和Bendich(1998)所描述。用引物NPT1和NPT2，trfA1和trfA2，insB1和insB2(序列号1，2，5，6，7和8；Wolters等1998 Mol Breeding 4：343-358)进行PCR，研究转化株中骨架载体DNA的存在。4μg转化株的DNA用HindIII消化，凝胶电泳分离片段并进行Southern印迹实验。印迹和NOS终止探针杂交，检测T-DNA插入的数量。

生产不定枝(adventitious shoot)

按照Hovenkamp-Hermelink等(1998)，会产生没有标记基因，没有直链淀粉，没有载体DNA和没有基因型的不定枝。每个基因型的10至20个无菌培养的枝的叶子在添加了10mg/l BAP和10mg/l NAA的147mg/lCaCl₂·2H₂O和80mg/l NH₄NO₃的溶液中漂浮。漂浮一晚(16小时)后，叶子切为3-4mm宽的外植体，每个基因型100个外植体并置于含有40g/l甘露醇、10g/l蔗糖、2.25mg/l BAP、0.0175mg/l IAA和8g/1琼脂的胼胝诱导MS培养基中。6天后，外植体转移到添加了15g/l蔗糖、2.25mg/lBAP、5mg/l GA₃和8g/l琼脂的MS培养基中再生。外植体每3周转移至新鲜的再生培养基中。收集不定枝(每个外植体2-4个)，每个基因型至少收集100个枝并且在含20g/l蔗糖的MS培养基的容器中生长。当枝形成了多于4个节时，他们用于如上所述的体外块茎形成和没有直链淀粉的淀粉筛选。

没有标记转化的效率

在5个独立的实验中，大约马铃薯栽培品种Karnico的8000个茎外植体和土壤杆菌LBA4404或者AGL-0的pKGBA50mf-IR1.1孵育。接种后1至4个月后，每个外植体收集1或2个再生的枝并在Murashige和Skoog培养基上生长。1至2周后，收集至少8个独立的枝的叶或茎物质并建库。枝的这些库的DNA分离在96孔酶标板中。用聚合酶链反应(PCR)为基础的方法，我们检测了枝库中的转化株的存在。PCR阳性库中，对分离自各个再生植物的DNA进行了分析，以检测转化株的存在。LBA4404转化后，少于0.2％的收集的枝是PCR阳性的，而AGL-0转化的这个百分率为4.6％(表4)。5个独立的AGL-0转化实验的PCR阳性转化株的频率在1.3和5.6％，而对LBA4404这变化在0到0.8％之间。

为确定显示所需没有直链淀粉表型的PCR阳性枝的频率，枝在体外生长在高蔗糖条件下以诱导块茎。发育了的试管薯用碘酒染色并且淀粉颗粒通过显微镜评估直链淀粉的存在。所分析的220个PCR阳性的转化株中，大约45％显示完全抑制了GBSSI活性，由红色的淀粉颗粒表明。这个百分比仍然比用NptII作为选择标记的pKGBA50mf-IR1.1获得的60％的植物没有直链淀粉的低，这暗示偶然的我们可能用PCR检测系统选择了假阳性。

然而结果有力地表明了不用标记基因选择转化株的可行性并且获得没有标记转化体的效率可通过使用毒性土壤菌株和优化了的基因沉默构建体来提高。

选择单拷贝和没有载体DNA的转化株

因为鉴于DNA整合的所有争论，除了感兴趣的转化株基因，应该也分离了不具有载体DNA和多插入的T-DNA的转化株。DNA整合进边界外的宿主植物的基因组据报道在20到75％的转化的植物中发生。通过使用针对pBIN19载体的5个开放阅读框架的引物的PCR分析了选择的没有标记、没有直链淀粉的马铃薯转化体中骨架载体DNA的存在。99个检测的没有直链淀粉的转化株中39个对5个DNA片段是阴性的。这39个没有载体DNA的转化株进一步通过以NOS终止子作为探针的Southern印迹杂交进行分析(图10)。这些分析显示大多(30)转化株含有3个或更少拷贝数的T-DNA插入。然而，分析的39个转化株中14个含有单链T-DNA插入。

因此，这证明了不用选择标记基因获得没有骨架载体DNA的转化株的可行性，该转化株只含有一个插入的T-DNA，其中内源基因被完全沉默。

嵌合性

为研究是否PCR选择的转化株是来自多个细胞再生的嵌合体，我们用对直链淀粉合成始终抑制的碘酒溶液将切割的块茎的表面染色。每个独立的转化株的一个块茎染色过程中，没有观察到扇形染色。所有块茎或者全红或者全蓝。用碘酒对60个独立的转化株，每个转化株超过20个块茎的染色显示只有一个系具有红色和蓝色扇形的细胞。这些结果表明嵌合发生了，然而，频率非常低。进而，使用不定枝法对28个独立的没有标记、没有直链淀粉和没有载体DNA的转化株进行嵌合体的筛选。每个基因型产生了超过100个的不定枝并且每个枝都用于体外块茎形成和筛选没有直链淀粉的表型。筛选了超过3000个枝后，我们没有发现一个形成了含有直链淀粉的试管薯的不定枝。这证明我们的没有标记的转化方法不或以很低比率产生嵌合植物。

实施例3

转化方法对获得没有标记转化株效率的影响

为决定转化方法对获得没有标记转化株效率的影响，测试了两个转化方法。

马铃薯栽培品种Karnico通过共培养转化了带有含有植物转化载体pKGBA50mf-IR1.1的根癌土壤杆菌AGL0的外植体。转化方法1.1(Visser，1991)

马铃薯栽培品种Karnicode枝尖在pH5.6下培养在含有MS主要和次要盐分、3％蔗糖、0.8％琼脂的培养基中。培养物在21℃，16小时光周期下生长4周。将茎的结间部切成2到5mm长并在共培养前，在放在固体R3B培养基之上的两层滤纸上放置1天。使用的R3B培养基含有MS(4.71g/l)培养基的盐分和维生素，并加入了3％蔗糖，2mg/l NAA，1mg/lBAP和0.8％琼脂，pH5.8。滤纸层覆盖有2ml的pH为6.5的MS(4.71g/l)，2.0g/l酪蛋白水解产物，3％蔗糖，1mg/l2，4D和0.5mg/L细胞分裂素组成的PACM液体培养基。和培养了两天的土壤杆菌共培养5到10分钟，然后外植体印迹到滤纸上以除去多余的细菌。完成印迹后，外植体转移回同样的培养皿并在21℃，16小时光周期下孵育两天。

两天后，外植体转移至4.71g/l MS、2.0％蔗糖、0.8％琼脂、200mg/l头孢噻肟钠、200mg/l万古霉素和1mg/l玉米苷组成的Zcvh培养基中。培养物每两周转移至新鲜的Zcvh培养基。4周后收集第一批枝并转移至含有MS主要和次要盐分、3％蔗糖、0.8％琼脂、pH5.6的培养基中。每个外植体收集不超过2个枝并且收集持续大约3个月。转化方法2(Edwards等Plant Molec Biol 17：89-100，1991)

马铃薯栽培品种Karnico的枝尖培养在含有MS主要和次要盐分、3％蔗糖、0.8％琼脂、pH5.6的培养基中。培养物在21℃，16小时光周期下生长4周。将茎的结间部切成2到5mm长并在共培养前，在放在固体R3B培养基之上的两层滤纸上放置1天。使用的R3B培养基含有MS(4.71g/l)培养基的盐分和维生素，并加入了3％蔗糖、2mg/l NAA、1mg/lBAP和0.8％琼脂，pH5.8。滤纸层覆盖有2ml的pH为5.8的MS(4.71g/l)、2.0g/l酪蛋白水解产物、3％蔗糖、1mg/l 2，4D和0.5mg/L细胞分裂素组成的PACM液体培养基。和培养了两天的土壤杆菌共培养30分钟，然后外植体印迹到滤纸上以除去多余的细菌。完成印迹后，外植体转移至4.71g/l MS、2.0％蔗糖、0.8％琼脂、2mg/l 2，4D和0.5mg/l玉米苷组成的，pH5.8的固体PCM培养基中并在21℃下，黑暗中孵育两天。两天后，外植体转移至含有200mg/l头孢噻肟钠的PCM培养基中，在21℃，16小时光周期下孵育4天。

这样4天后，外植体转移至4.71g/l MS、2.0％蔗糖、0.8％琼脂、2mg/lGA₃、1.0mg/l玉米苷、pH5.8和200mg/l头孢噻肟钠组成的固体PSM培养基中。每三周将培养物转移至含有200mg/l头孢噻肟钠的新鲜PSM培养基中。四周后，收集第一批枝并转移至含有MS主要和次要盐分、3％蔗糖、0.8％琼脂、pH5.6的培养基中。每个外植体收集不超过两个枝而且收集持续大约3个月。

1到2周后，收集8个或更多的独立的枝的叶子或茎物质并建库(库大小依赖于预期转化株的频率)。将枝的这些库中的DNA用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离在96孔酶标板中。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自再生体的库的DNA进行PCR分析，以检测转化株的存在。将各个枝的PCR阳性库的叶子和/或茎物质收集在96孔酶标板中并用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离基因组DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自各个再生体的DNA进行PCR分析，以检测转化株的存在。

结果

使用转化方法1和2对马铃薯栽培品种Karnico的1000茎外植体进行了两个独立的转化。从中收集枝的外植体的频率在两个转化方法间是可比较的。方法1产生了74％有枝的外植体而用方法2有67％的外植体形成了一个或多个枝。可是获得的PCR阳性枝的频率在两种方法中非常不同。用方法20.6％至1.0％收集到的枝是PCR阳性的，而用方法1这个百分比在5.5％到6.0％之间。

因此，使用最优化的转化方法可以产生5到10倍数量的PCR阳性枝并提高没有标记的转化的效率。

实施例4

没有标记地选择高赖氨酸马铃薯转化株

基因构建体

反馈不敏感的马铃薯DHPS通过改变进化保守的134位氨基酸残基(天冬酰胺)为半胱氨酸生成，如EP 99204520所提到的。构建含有突变体DHPS基因的嵌合基因，首先将DHPS cDNA从pTriplex载体(pAAP42)克隆在pCR-Script SK(+)(pAAP55)中再从这个载体将其作为XbaI-EcoRI片段克隆在XbaI-EcoR消化了的pBluescript SK载体中(pAAP57)。5’端，突变的DHPS cDNA融合到了800bp长的GBSSI启动子片段的HindIII-SaII片段。突变DHPS序列的下游，根癌土壤杆菌的胭脂碱合成酶基因的终止信号作为SstI-EcoRI片段插入(Greve，H.D.等(1983)J.Mol.Appl.Genet.1：499-511)。全部的嵌合基因克隆进pBINPLUS的HindIII-EcoRI位点，pBINPLUS已先被ClaI消化及RcaI部分消化和再连接以除去NPTII选择标记(Van Engelen，F.A.等(1995)TransgenicResearch 4：288-290)。这产生了载体pAAP105mf(图10)。所有构建体都转化进E.coli DH5α(GIBCO BRL)。

转化马铃薯植株

双元载体pAAP 105mf用来进行冰冻融化转化根癌土壤杆菌株AGL0(Hofgen，R和Willmitzer，L(1988)Nucl.Acids Res.16：9877)。转化了的AGL0随后用于接种马铃薯(solanum tuberosum，Karnico种类)茎外植体。没有进行选择。四周后，收集第一批枝并且枝的收集持续大约三个月。每个茎外植体收集不超过两个再生体而且枝生长在MS20培养基中。1到2周后，收集8个或更多的独立的枝的叶子或茎物质并建库(库大小依赖于预期转化株的频率)。枝的这些库中的DNA用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离在96孔酶标板中。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自再生体库的DNA进行PCR分析，以检测转化株的存在。各个枝的、PCR阳性库的叶子和/或茎物质收集在96孔酶标板中而且基因组DNA用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自各个再生体的DNA进行PCR分析，以检测转化株的存在。

体外形成块茎

对PCR阳性枝，加入20ml液体培养基，其组成为KI培养基。罐子放在室温下的黑暗的生长室中。2到4周后，大部分枝发育了试管薯。

转基因植物中游离氨基酸含量的分析

用研钵和槌在含有1mM二硫代苏糖醇的2ml的50mM Pi缓冲液(pH7.0)中匀浆组织(0.5-1.0克)。加入正亮氨酸作为内对照。游离氨基酸用5ml水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12，体积比)萃取进行部分纯化。收集水相，有机相再萃取两次。用冻干法浓缩至3ml后，20微升样品使用阳离子交换柱通过HPLC进行分析，用氨基酸的柱后茚三铜衍生法在570nm和440nm检测(BIOCHROM 20，Amersham Pharmaciabiotech)。图11显示了赖氨酸在12个对照没有转化的马铃薯植株的块茎和17个含有突变DHPS基因构建体pAAP105mf的马铃薯植株中占总氨基酸的百分比。赖氨酸水平从对照野生型马铃薯中2-2.5％升高至在转化块茎中最多30个百分比，导致了赖氨酸成为了“大多数”氨基酸而不是“低水平”的必需氨基酸。

实施例5

没有直链淀粉的高赖氨酸马铃薯转化株的无标记选择

基因构建体

合成了含有在5’端HindIII-相容的突出端(overhang)和3’端EcoRI-相容的突出端的连接子

( 5’-AGCTGCATATGAAGCTTTCTAGATCTGAATTCCATATGT-3’和3’-CGTATACTTCGAAAGATCTAGACTTAAGGTATACATTAA-5’)。这个连接子连接到HindIII/EcoRI消化的pUC28质粒上(Benes等1993 Gene130：151-152)，产生了质粒pAAP171。构建体pAAP105，含有突变DHPS基因的双元载体用HindIII和EcoRI消化。含有GBSSI启动子-DHPS基因-NOS终止子的2.2kb的片段克隆进HindIII/EcoRI消化的pAAP171中。这产生了构建体pAAP172(见图12)。

构建体pAAP172用NdeI和ScaI(ScaI位点存在于pUC28骨架中)消化。消化了的DNA用酚/氯仿提取，再用乙醇沉淀。双元载体pKGBA50mf-IR1.1用VspI消化，再用碱性磷酸酶处理，酚/氯仿提取，乙醇沉淀。PAAP172的2.2kb的NdeI片段连接进VspI消化的pKGBA50mf-IR1.1载体(图13)，产生了两个不同的构建体：pDHPS-IR1.1(串联)，其中两个GBSSI启动子指向同一个方向(图14)，和pDHPS-IR1.1(反向)，其中两个GBSSI启动子指向相反方向(图15)。这些构建体从E.coli DH5α转化进根癌土壤杆菌Agl-0。

转化马铃薯和转化株的选择

马铃薯栽培品种Kamico的体外生长植株的节间切割物通过和根癌土壤杆菌共培养进行转化，依照Visser(1991)描述的方法。

马铃薯栽培品种Kamico用相同的方法转化了根癌土壤杆菌Agl-0中的pDHPS-IR1.1(串联)和pDHPS-IR1.1(反向)。没有进行选择。四周后，收集第一批枝并持续收集大约三个月。每个茎外植体收集了不超过两个再生体而且枝生长于MS20培养基中。1到2周后，收集8个或更多独立的枝的叶子或茎物质并建库(库大小依赖于预期转化株的频率)。原则的这些库中的DNA用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离在96孔酶标板中。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自再生体库的DNA进行PCR分析，以检测转化株的存在。收集各个枝的PCR阳性库的叶子和/或茎物质于96孔酶标板中并且用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离基因组DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自各个再生体的DNA进行PCR分析，以检测转化株的存在。

体外形成块茎

对PCR阳性枝，加入20ml液体培养基，其组成为Kl培养基。罐子置于18℃下的黑暗的生长室中。2到4周后，大部分枝发育了试管薯。

淀粉染色

切割试管薯并用碘酒溶液染色以评估淀粉颗粒中直链淀粉的存在。淀粉颗粒的染色用显微镜观察。

转基因植物中游离氨基酸含量的分析

用研钵和槌在含有1mM二硫代苏糖醇的2ml 50mM Pi缓冲液(pH7.0)中匀浆组织(0.5-1.0克)。加入正亮氨酸作为内对照。游离氨基酸用5ml水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12)萃取进行部分纯化。收集水相，剩余的再萃取两次。用冻干法浓缩至3ml后，20微升样品使用阳离子交换柱通过HPLC进行分析，用氨基酸的柱后茚三铜衍生法在570nm和440nm检测(BIOCHROM 20，Amersham Pharmacia biotech)。

实施例6

没有直链淀粉的木薯转化株的无标记选择

以下部分描述了根癌土壤杆菌介导的转化步骤以产生遗传修饰的木薯植株，其淀粉主要组成为支链淀粉，而没有可选择的标记基因如nptII、pat、basta、htp或其它的辅助。

基因构建体

设计PCR引物(序列号12-20)以扩增木薯GBSSI cDNA序列部分：两个嵌套的正向和一个反向引物用于以下三个区域：5’部分(1-800碱基)、中间部分(800-1500碱基)和3’部分(1200-2000碱基)。正向引物含有EcoRI限制位点，而反向引物含有XbaI限制位点。GBSSI cDNA的三个部分的每一个的PCR产物都用EcoRI消化和连接。所得连接产物含有木薯GBSSI cDNA的部分反向重复序列，在两个嵌套的正向引物间的序列作为间隔区。这个序列用XbaI消化并克隆进载体pMTL24(Chambers等1988)。反向重复序列用BamHI消化而从这个载体中除去，随后连接马铃薯GBSSI启动子和BamHI消化了的双元载体pKGBA50mf-IR1.1的NOS终止子(见图8)。这样，获得了无三个标记基因的木薯GBSSI反向重复构建体。这些转化进根癌土壤杆菌菌株Agl-0。

使用的植物材料和组织培养培养基

TMS60444和Adira4植株的培养是每个月将一个节点的切割物亚克隆至补充了Murashige和Skoog(1962，Physiol.Plant.15：473-497)盐和维生素和40g/l蔗糖的培养基中(MS4)。脆弱胚胎发生愈合组织(friableembryogenic callus(FEC))系如下产生：

-从供体植株中分离分裂组织或未成熟叶子

-在补充了6mg/l NAA和6mg/l毒莠定(Picloram)的MS40上培养分裂组织/未成熟叶子

-分离完整的胚胎发生组织并在补充了Gresshoff和Doy(1974，Planta107：161-170)盐和维生素，60g/l蔗糖和10mg/l毒莠定的培养基(GD6)

中培养

-分离FEC(小块聚集的，球形单位)，在GD6培养基中培养。FEC在GD6培养基中每3周进行亚培养来维持。通过转移0.5gFEC到含有50ml补充了Schenk和Hildebrandt(1972，Canadian Journal of Botany 50：199-204)盐和维生素，60g/l蔗糖和10mg/l毒莠定的液体培养基(SH6)的200ml烧瓶产生液体培养物。培养基每周换两次并在2周后每个烧瓶中的内含物分到5个新烧瓶中。烧瓶在摇床(LAB-line InstrumentsInc.Model 3519)上以120rpm培养。

用土壤杆菌感染FEC

100mg的TMS604444的FEC样品作为起始材料。FEC分散在补充了Gresshoff和Doy盐和维生素、60g/l蔗糖、10g/l琼脂和10mg/l毒莠定的培养基中，并加入几滴含有GBSSI反向重复构建体的土壤杆菌菌株Agl-0。两天后，用无菌蒸馏水洗FEC两遍以除去多余的土壤杆菌。次后，FEC转移到含有Schenk和Hildebrandt盐和维生素、60g/l蔗糖、10g/l琼脂和10mg/l毒莠定的液体培养基(SH6)中，其补充了抗生素如头孢噻肟钠以杀死土壤杆菌。一周后更新培养基，两周后FEC仔细的分散在补充了头孢噻肟钠的GD6培养基中。两周后，10个感染样品的50mg FEC使用PCR为基础的选择系统来评价转基因的整和程度。收集小部分FEC物质并用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离细胞的DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对DNA分离物进行PCR分析，以检测转化株的存在。10个样品中有2个是GBSS-0/BINMCS引物阳性的。这些样品培养在补充了头孢噻肟钠的成熟培养基中。成熟培养基组成为Murashige盐和维生素、40g/l蔗糖、10g/l琼脂(MS4)和1mg/l毒莠定。组织每隔两周转移至新鲜的成熟培养基中，总共培养四个月。其间，分离从FEC发育而来的torpedo定形的体细胞胚并培养在补充了0.1mg/l BAP和头孢噻肟钠的MS4培养基中以让其发育成成熟的体细胞胚。成熟的体细胞胚首先在补充了1.0mg/l BAP和头孢噻肟钠的液体MS4中培养一周，然后转移至补充了1.0mg/l BAP的固体MS4培养基中。体细胞胚发育的枝在补充了头孢噻肟钠的MS4中生根。所有生根的植物用于PCR为基础的选择系统。收集8个枝的叶子材料并建库。枝的这些库中的DNA用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离在96孔酶标板中。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自再生体库的DNA进行PCR分析，以检测转化株的存在。收集各个枝的PCR阳性库的叶子和/或茎材料在96孔酶标板中并且用购自Promega的Magnesil基因组DNA分离试剂盒分离基因组DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列号9和10)对分离自各个再生体的DNA进行PCR分析，以检测转化株的存在。总共，从两个种系获得了1264和984个植株，其中分别有5个和38个植株是PCR阳性的。PCR阳性植株生长在温室的小罐中。三个月后从块茎中分离淀粉并分析直链淀粉的含量。在27个植株中基本没有直链淀粉。

表1.由不同构建体获得的转化子的沉默水平

GBSSI的沉默水平

构建体转化子的数量

完全/强中等弱无

C2 133 83(62％) 6(5％) 2(2％) 42(31％)

A7 118 24(20％) 55(47％) 10(8％) 29(25％)

D4 66 4(6％) 2(3％) 4(6％) 56(85％)

B1 77 2(2％) 7(9％) 39(51％) 29(38％)

反义 144 20(14％) 20(14％) 22(15％) 82(57％)

表2.各个A7转化子的分子分析

PCR片段

转化子沉默水平

NPTII NPTIII trfA

A7-1 弱 + - -

A7-3 无 + - -

A7-7 弱 + - -

A7-11 无 + - -

A7-14 强 + + +

A7-22 强 + + +

A7-26 强 + + +

A7-32 强 + - -

A7-41 弱 + - -

A7-42 强 + + +

A7-43 强 + + +

A7-44 强 + - -

A7-48 弱 + - -

A7-53 强 + + +

A7-62 中等 + + +

A7-74 强 + - -

A7-76 弱 + - -

A7-84 强 + + -

A7-95 完全 + + -

A7-98 弱 + - -

表3.各个C2转化子的分子分析

PCR片段

T-DNA

转化子沉默水平

NPTII NPTIII trfA InsB 条带数量

C2-1 强 + + ND ND 4

C2-5 中等 + + - - ND

C2-6 弱 + - - - ND

C2-7 完全 + + ND ND ＞5

C2-8 完全 + + ND ND ＞5

C2-10 强 + + ND ND 3

C2-11 完全 + + + ND ＞5

C2-14 完全 + - - ND 3

C2-15 完全 + - - ND 4

C2-16 中等 + - - ND 2

C2-17 完全 + ？ + ND 3

C2-20 完全 + - - ND 1

C2-25 完全 + + ND ND 2

C2-29 完全 + - - ND 1

C2-30 完全 + + ND ND ＞4

C2-33 强 + - - - ND

C2-38 强 + - - ND 1

C2-41 强 + - - - ND

C2-43 强 + + + - ND

C2-47 完全 + - + - ND

C2-65 完全 + + ND ND ＞4

C2-66 完全 + - - ND 2

C2-70 强 + - - - ND

C2-71 完全 + - - ND 2

C2-75 强 + - - - ND

C2-80 强 + - - - ND

C2-83 强 + + ND ND 1

C2-85 强 + + + + ND

C2-86 中等 + - - - ND

C2-95 强 + - - - ND

C2-112 强 + + + - ND

C2-114 完全 + - - ND 1

C2-116 强 + + ND ND 4

C2-151 强 + - - - ND

C2-152 强 + - - - ND

C2-156 完全 + - - - ND

C2-167 强 + + - + ND

C2-168 强 + - - - ND

C2-170 强 + - - - ND

C2-180 强 + - - - ND

ND＝未测定

表4.土壤杆菌菌株对马铃薯转化效率的影响

	PCR分析	表型分析
	PCR分析	表型分析		PCR阳性枝^a	无直链淀粉转化株^b
Exp.1，LBA4404AGL-0	0/1112(0.0)50/888(5.6)	0/0(0.0)17/40(42.5)		PCR阳性枝^a	无直链淀粉转化株^b
Exp.1，LBA4404AGL-0	0/1112(0.0)50/888(5.6)	0/0(0.0)17/40(42.5)	Exp.2，LBA4404AGL-0	3/632(0.5)10/420(2.4)	1/3(33.3)8/10(80.0)
Exp.3，LBA4404AGL-0	0/440(0.0)31/651(4.8)	0/0(0.0)10/31(32.3)	Exp.2，LBA4404AGL-0	3/632(0.5)10/420(2.4)	1/3(33.3)8/10(80.0)
Exp.3，LBA4404AGL-0	0/440(0.0)31/651(4.8)	0/0(0.0)10/31(32.3)	Exp.4，LBA4404AGL-0	2/240(0.8)9/688(1.3)	2/2(100)2/9(22.2)
Exp.4，AGL-0	128/2370(5.4)	60/125(48.0)	Exp.4，LBA4404AGL-0	2/240(0.8)9/688(1.3)	2/2(100)2/9(22.2)
Exp.4，AGL-0	128/2370(5.4)	60/125(48.0)	LBA4404再生枝的总数量	5/2424(0.2)	3/5(60.0)
AGL-0再生枝的总数量	228/5017(4.6)	97/215(45.1)	LBA4404再生枝的总数量	5/2424(0.2)	3/5(60.0)

a由测试的枝的总数得到的PCR阳性枝的数量(％)

b由测试的转化株的总数得到的无直链淀粉转化株的数量(％)

引物序列

序列号1(NPT1)：

5’-TCC ACC TTA TCG GCA ATG AA-3′

序列号2(NPT2)：

5’-CGG CAG TGA GAG CAG AGA TA-3′

序列号3(NPT3)：

5’-TCG GCT ATG ACT GGG CAC AAC AGA-3′

序列号4(NPT4)：

5’-AAG AAG GCG ATA GAA GGC GAT GCG-3′

序列号5(trfA1)：

5’-TTC TCC TCG TGC TCG TAA AC-3′

序列号6(trfA2)：

5’-GGT CGC TGG TAT TCG TGC-3′

序列号7(insB1)：

5’-GCG CTA TCT CTG CTC TCA CT-3′

序列号8(insB2)：

5’-AAC GGC CTC ACC CCA AAA A-3′

序列号9(BINMCS)：

5’-GCA CCC CAG GCT TTA CAC TT-3’

序列号10(GBSS-0)：

5’-TAC CGC TAC CAC TTG ACA TTC-3’

序列号11：

5’AGCT GCATATGAAGCTTTCTAGATCTGAATTCCATATGT 3’

3’ CGTATACTTCGAAAGATCTAGACTTAAGGTATACATTAA 5’

序列号12：

Primer 5CASGBF1：5’-TAG AAT TCA CCA GCG GAA CCT ATT TT-3’

序列号13：

Primer 5CASGBF2：5’-ATG AAT TCG GAC CCA AAC TAT CAC TC-3’

序列号14：

Primer 5CASGBR1：5’-TGT CTA GAA TGG AAG CAG AGC AGT GT-3’

序列号15：

Primer MCASGBF1：5’-CAG AAT TCA AGC CAT TTA CCA ACC TA-3’

序列号16：

Primer MCASGBF2：5’-ATG AAT TCT ATG AGA AGC CCG TGA AG-3’

序列号17：

Primer MCASGBR1：5’-CAT CTA GAG AAC CAG CAT AAA GTC AG-3’

序列号18：

Primer 3CASGBF1：5’-TAG AAT TCG GCT TCA TTG GTA GAT TA-3’

序列号19：

Primer 3CASGBF2：5’-TAG AAT TCA TTG AGC ATC TGG AGG TT-3’

序列号20：

Primer 3CASGBR1：5’-TAT CTA GAC CAT TCA CCC TTC ACA AA-3’

Claims

1.一种包含T-DNA构建体的重组核酸，其允许所述构建体转移进入植物细胞基因组中，所述构建体具有一种不含编码选择标记的核酸的外源核酸。

2.权利要求1的核酸，其中所述T-DNA构建体包含至少一个T-DNA边界。

3.权利要求1或2的核酸，其中所述外源核酸侧翼存在T-DNA边界重复序列。

4.权利要求1至3中任一项的核酸，其中所述T-DNA来源于土壤杆菌spp的Ti质粒。

5.权利要求4的核酸，其中所述土壤杆菌包含根癌土壤杆菌。

6.权利要求1至5中任一项的核酸，其中所述外源核酸允许在所述基因组中调控靶基因的表达。

7.权利要求6的核酸，其中所述调控包含下调。

8.权利要求7的核酸，其中所述外源核酸包括所述靶基因的至少部分多核苷酸区域的反向重复序列。

9.权利要求6至8中任一项的核酸，其中所述靶基因编码淀粉粒束缚淀粉合酶(GBSSI)。

10.权利要求1至5中任一项的核酸，其中所述外源核酸允许在所述植物细胞中表达异源多肽。

11.权利要求10的核酸，其中所述异源多肽包含一种酶。

12.权利要求11的核酸，其中所述酶包含二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶(DHPS)，优选地为反馈不敏感的二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶。

13.包含权利要求1至12中任一项的核酸的载体或质粒。

14.包含权利要求1至12中任一项的核酸或权利要求13的载体的宿主细胞。

15.权利要求14的宿主细胞，其包含土壤杆菌。

16.权利要求15的宿主细胞，其包含基本上有毒力的土壤杆菌。

17.权利要求15或16的宿主细胞，其中所述土壤杆菌包含根癌土壤杆菌。

18.权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含根癌土壤杆菌A281或由其衍生的细胞。

19.包含权利要求1至12中任一项的核酸的植物细胞。

20.来源于权利要求19的植物细胞的植物或其部分。

21.权利要求20的块茎植物或其部分。

22.权利要求21的植物或其部分，其选自于马铃薯或木薯植物。

23.转化植物细胞的方法，包含将权利要求1至12中任一项的核酸提供给植物细胞。

24.权利要求23的方法，进一步包含在来源于选择培养基的基本上无选择压力条件下培养所述细胞。

25.权利要求23或24的方法，进一步包含测试至少一部分所述细胞子代中是否存在权利要求1至12中任一项的核酸的至少功能性部分。

26.权利要求23至25中任一项的方法，进一步包含测试至少一部分所述细胞子代中是否存在非所需的载体核酸。

27.由权利要求23至26中任一项的方法可获得的植物细胞。

28.来源于权利要求27的植物细胞的植物或其部分。

29.权利要求28的块茎植物或其部分。

30.权利要求29的植物或其部分，其选自于马铃薯或木薯植物。