KR100756889B1

KR100756889B1 - 아그로박테리움 라이조제네스를 이용한 선별 마커가 결손된형질전환 감자 모상근

Info

Publication number: KR100756889B1
Application number: KR1020060095480A
Authority: KR
Inventors: 김현순; 염정원; 전재흥; 정혁
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2007-09-07

Abstract

본 발명은 아그로박테리움 라이조제네스를 이용한 선별 마커가 결손된 형질전환 감자 모상근에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이너리 벡터 pBI121를 갖는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 (Agrobacterium rhizogenes A4 )와 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)균주를 감자 식물체로 형질전환 시킨 후 형질전환 효율을 b-glucuronidase (GUS)의 전사체량 검출과 b-glucuronidase (GUS)의 효소 활성을 조사하여 알아본 결과, 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주의 GUS 발현량은 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404균주보다 약 2배 더 높았다. 감자 잎 절편체를 pBI121와 pCAMbar ^- 를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주로 형질전환 시킨 후 항생제가 없는 MS배지에서 모상근을 유도하여 모상근의 재생률과 GUS의 활성을 분광광도계를 이용하여 측정한 결과, 두 바이너리 벡터간의 차이점이 없음을 확인함으로써 형질전환 식물체를 동정하기 위한 항생제나 제조체 저항성 유전자와 같은 선별 마커 유전자의 사용 없이 토양미생물인 아그로박테리움 라이조제네스를 이용한 GUS의 발현으로 형질전환된 감자 식물체의 개발 가능성을 제공한다.

아그로박테리움 라이조제네스, 선별 마커, 형질전환, 감자, 모상근, GUS

Description

아그로박테리움 라이조제네스를 이용한 선별 마커가 결손된 형질전환 감자 모상근{Marker free transgenic potato hairy roots using Agrobacterium rhizogenes}

도 1은 감자 잎 조각에 아그로박테리움 라이조제네스 A4를 감염시킨 후 2주(도1 A), 3주(도1 B), 4주(도1 C)가 지남에 따라 감자 모상근이 유도되는 것을 나타내는 그림이고,

도 2A는 GUS 조직화학적 분석을 나타내는 그림으로 조직 화학적 위치에 따른 GUS 발현 패턴을 비교한 그림이고(a는 비형질전환 감자 식물체, b는 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404를 매개로 pBI121 형질전환 식물체, c는 아그로박테리움 라이조제네스 A4를 매개로 한 pBI121 형질전환 감자 모상근), 도 2B는 GUS 특이적 활성을 정량 분석한 그림이고,

도 3A는 감자의 형질전환에 사용된 바이너리 벡터 pCAMbar ^- 구조를 나타내는 그림이고, 도 3B는 GUS-양성 모상근의 형질전환 효율을 비교하여 나타낸 그림이고, 도3C는 조직화학적 분석에 의한 GUS의 발현 패턴을 비교한 그림이고(a는 바이너리 벡터 pBI121를 포함하는 형질전환된 감자 모상근, b는 항생제 선별 마커가 결손된 pCAMbar ^- 를 포함하는 형질전환 감자 모상근),

도 4A는 선별 마커가 결손된 감자 모상근에서 PCR로 확인한 결과를 나타내는 그림이고, 4B는 선별 마커가 결손된 감자 모상근에서 pCAMbar ^- 유전자의 삽입여부를 서던 블럿 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

유전자 변형 농작물(Living Modified Organism)이 생태계에 미칠 수 있는 잠재적 영향과 리스크에 대하여 현재까지 제기되고 있는 사항들은 다음과 같다.

첫째, 자연생태계의 생물다양성을 교란할 수 있는 가능성이다. 유전자 변형 농작물이 잡초화되어 생태계를 교란할 수 있는 가능성과, 유전자 변형 농작물의 제조체 저항성 유전자나 살충제 저항성 유전자가 인근 잡초들과 수평적으로 전이되어 슈퍼잡초(superweed)가 발생할 가능성이 있다. 이 경우 통제불능의 우려할 만한 사태가 발생할 가능성이 있다.

둘째는 생태계 진화과정의 파괴이다. 유전자 재조합 기술은 생물종간의 유전형질을 인위적으로 삽입하여 발현시키는 것이므로 자연적으로 발생하는 진화과정을 엄청난 속도로 가속화시킬 수 있다. 이러한 생물종 진화의 가속화가 자연적으로 발생하는 생물종의 진화 과정을 파괴할 우려가 있다. 유전자 변형 농작물 및 유전자 변형 농작물로 만들어진 식품을 인간이 섭취했을 때 발생할 수 있는 잠재적인 리스크에 대하여는 다음과 같은 사항들이 지적되고 있다. 첫째, 새로 도입된 유전자 산물이 식품으로 인체에 들어갔을 때 발생할 수 있는 독성과 알레르기 유발가능성이다. 둘 째, 유전자조작에 사용되는 항생제 저항성 유전자로 인한 영향 발생 가능성이다. 즉, 인체의 항생제 저항성이 증가하여 보건의료학적인 측면에서 문제를 야기할 수 있다는 것이다.

유전자변형 농작물을 만드는 데에는 우선 생물로부터 목적하는 유용 유전자를 탐색하고 해당 유전자만을 분리하되, 이 유전자 이외의 다른 유전자가 혼입되지 않도록 조치해야 한다. 그리고 농작물의 종류에 따라 주로 3가지 방법(아그로박테리움 이용법, 유전자총 이용법, 전기충격법)에 의해 농작물의 세포내 핵으로 목적 유전자를 도입한다. 이 단계에서 목적하는 유전자가 도입되었는지 알 수 없으므로 많은 세포를 배양하여 이들 중 목적 유전자가 도입된 것만을 선발하여 증식시키게 된다. 이 때 증식한 세포에서 잎이나 뿌리를 유도하고 식물체를 재생한다. 이렇게 하여 육성된 많은 식물체 중에서 목적하는 유용한 성질이 발현되고 있는 식물체를 선발하여 교배 등에 의해 유전적으로 안정하게 유지시키는 노력이 이어지고 유전자변형농작물이 만들어지는 것이다.

한편, 아그로박테리움을 매개로 한 유전자 전이 방법은 높은 형질전환율을 보이고, 비교적 안정하게 긴 T-DNA를 전이 시키는 장점이 있다. 쌍떡잎 식물의 모상근 질병을 유도하는 아그로박테리움 라이조제네스는 근두암종(crown gall disease)을 야기시키는 아그로박테리움 투마훼시안스와 비교적 밀접한 관계가 있다.

본 발명에서 사용하는 모상근(hairyroot)이란 토양미생물인 아그로박테리움 라이조제네스 (Agrobacterium rhizogenes)가 식물체의 상처부위에 침입하여 미생물의 알아이 플라스미드(Ri plasmid)를 식물체의 염색체에 삽입함으로써 유도되어지는 것으로서, 식물호르몬이 존재하지 않는 배지에서도 성장할 수 있고 캘러스보다 빠른 성장속도를 갖는 특징이 있으며, 굴지성이 없고 측면 가지성장과 유전적으로 안정적인 특성이 있다. 안정적이고 높은 생산성 때문에 모상근 배양은 값비싼 농작물의 생산을 위한 유용성 때문에 수십년간 연구되어 왔다.

본 발명에서는 토양미생물인 아그로박테리움 라이조제네스 A4 (Agrobacterium rhizogenes A4)와 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)의 형질전환 효율을 GUS 발현으로 비교분석하고, pCAMBIA3301 벡터로부터 제초제 저항성 유전자 (bar)를 제거한 pCAMbar ^- 벡터를 아그로박테리움 라이조제네스 A4을 이용하여 감자 잎 조각에 형질전환 후, 유도된 감자 모상근에서 PCR 분석과 서던 블럿 분석을 이용하여 선별마커가 없고, 외래 유전자가 안정적으로 삽입된 것을 확인함으로써 선별 마커가 결손된 형질전환 감자 모상근의 개발이 가능함을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 아그로박테리움 라이조제네스를 이용한 선별 마커가 결손된 형질전환 감자 모상근에 관한 것이다.

본 발명은 선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터를 포함한다.

본 발명은 상기 선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터는 형질전환 감자 식물체를 제조하는데 사용하는 것을 특징으로 하는 벡터를 포함한다.

본 발명은 선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 (Agrobacterium rhizogenes A4)를 포함한다.

본 발명은 선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 (Agrobacterium rhizogenes A4)을 감염시켜 유도된 감자 모상근의 증식방법을 포함한다.

본 발명은 기내 배양된 감자 슈트(Solanum tuberosum)는 3% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 고체 MS(Murashige and Skoog) 배지에서 2-3주 정도 키운 감자 잎절편을 0.5-1.0cm로 절단하는 단계와;

아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주를 OD₆₀₀=0.5-0.7이 될 때까지 25°C, YPM 배지에서 배양시키는 단계와;

선별 마커 유전자가 없는 pCAMbar ^- 벡터를 상기 단계에서 배양한 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주에 freeze-thaw method [13]으로 형질전환 시키는 단계와;

선별 마커 유전자가 없는 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주가 접종된 YPM 액체 배지에 감자 잎 조각을 10분 동안 배양한 다음, 2일 동안 MS 배지에서 공동 배양하는 단계와;

공동 배양 후, 선별 마커 유전자가 없는 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주의 성장을 저해하기 위해 carbenicillin disodium (1000mg/l)가 첨가된 MS배지로 옮기고, 2주에 한번씩 새 배지로 바꾸어 주면서 모상근을 배양하는 단계와;

상기 단계에서 유도된 모상근은 절편으로부터 분리시키고 carbenicillin disodium (500mg/l)이 첨가된 MS배지로 옮긴 후 25°C에서 암배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 감자 모상근의 증식방법을 포함한다.

본 발명은 선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 (Agrobacterium rhizogenes A4)을 감염시켜 유도된 감자 모상근을 포함한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 형질전환 감자 모상근의 유도

상처난 감자 잎조각을 바이너리 벡터 pBI121 또는 pCAMbar ^- 가 형질전환된 아그로박테리움 라이조제네스 A4와 공동배양하고 난 뒤, 호르몬은 없고 1000mg/ml carbenicillin disodium가 첨가된 MS배지에 옮긴다. 배양한 지 일주일이 지나도 가시적인 반응이 없지만(도 1A), 접종 후 10일째에는 감자 잎조각에서 캘러스의 유도가 관찰된다. 접종 후 이주째에 모상근의 유도가 감자 절편에서 관찰된다(도 1B). 유도된 모상근이 4-5주 후에 페트리디쉬에서 왕성히 자라는 것이 관찰된다(도 1C). 재생된 모상근은 배양용기에서 배양하는데 일반 뿌리와는 달리 매우 빠르게 자라는 것을 알 수 있다. 형질전환된 모상근은 잘라내어 500mg/ml carbenicillin disodium가 포함된 기본배지로 옮긴다. 바이너리 벡터를 포함하지 않는 아그로박테리움 라이조제네스 A4과 배양된 잎조각에서 얻어진 비형질전환 모상근은 음성대조구로 사용하였다.

2. 아그로박테리움을 매개체로 이용한 형질전환체의 비교

두 박테리아 균주의 형질전환율을 비교하기 위해 감자 잎조각에 pBI121을 가진 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404와 아그로박테리움 라이조제네스 A4로 접종하였다. GUS(β-glucuronidase) 조직화학적 분석은 8주째에 형질전환체들을 이용하여 분석하였다. 벡터를 포함하지 않는 접종 대조구 식물체의 모상근에서는 GUS 활성을 검출할 수 없었고, 반면에 양성대조구로 사용된 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404 형질전환 식물체와 아그로박테리움 라이조제네스 A4 형질전환 모상근은 GUS 조직화학적 분석에서 암청색 조직을 나타냄으로써 GUS활성을 관찰할 수 있었다. 모든 형질전환 모상근은 형질전환 식물체에 비해 강한 암청색을 보여 강한 GUS 활성을 보였다(도 2A). 또한 형질전환 모상근의 양성대조구로 사용된 식물체의 GUS의 활성을 분광광도계를 이용하여 측정한 결과 형질전환 모상근의 GUS 발현은 대략 두 배가 더 높게 나타남을 알 수 있다(도 2B).

3. 선별 마커 유전자를 제거한 후 형질전환 모상근의 분석

도3A에서 보여지는 바와 같이, 바이너리 벡터 pCAMbar ^- 는 CaMV35S 프로모터의 조절하에 Intron-uidA (Intron-glucuronidase )유전자가 있다. 항생제 선발마커를 제거하였기 때문에 유도된 모상근들이 어느 정도 비율로 GUS 유전자를 포함하고 있는지 여부를 조사하기 위해서, 재생된 모상근의 GUS 염색 분석을 수행하였다. 접종 후 4주가 지나, pBI121이 접종된 66개의 잎조각 절편에서 54개의 모상근이 재생된 절편들을 얻었고(82%), pCAMbar ^- 가 감염된 75개의 잎조각 절편으로부터 63개의 재생 절편을 얻었다(84%). 잎절편에서 유도된 모상근을 한 가닥씩 조사했을 때, 절편에서 유도된 모상근 전체가 GUS 유전자를 발현하는 경우가 있는 반면, 같은 절편에서 재분화 되었어도 GUS유전자가 발현되는 모상근과 그렇지 않은 모상근이 섞여있는 잎절편도 관찰되었다. 모상근 유도의 결과물로써 잎절편에서 유도된 모상근 전체가 GUS 유전자를 발현하는 잎절편은 전체 54개에서 9개로 17%, pCAMbar ^- 벡터는 63개에서 20개로 32%였다. 모상근 개개의 GUS 유전자 발현을 조사한 결과로는 전체가 발현하는 경우와 낱낱의 개체 중 한 개라도 발현하는 경우 평균적으로 pBI121은 62%, pCAMbar ^- 는 61%로 각각 조사되었다. 조직화학적인 염색 패턴은 두 벡터 모두 유사하다(도 3C). 모상근의 GUS 조직화학적 분석은 빠르게도 용액에 담근지 2-4시간이 지나자 검출되었다. 이는 GUS 유전자가 형질전환 모상근에서 활발히 합성된다는 것을 보여준다. 이런 결과 아그로박테리움 투메훼시안스 A4에 의해 도입된 유전자는 감자 모상근내로 원활히 도입이 되며, 항생제 선발마커가 있는 pBI121의 경우 보여지는 형질전환 모상근의 비율과 항생제 선발마커가 결여된 pCAMbar ^- 에서 보여지는 형질전환 모상근의 비율과 비슷함을 알 수 있다. 이는 항생제 선발마커가 없는 경우의 형질전환도 아그로박테리움 투머훼시안스 시스템을 이용하면 원활히 수행할 수 있다.

4. 형질전환 모상근의 확인

형질전환 모상근을 선택한 후 특이 프라이머를 이용한 PCR 분석을 통하여 uidA 유전자의 삽입을 조사하였다. GUS 유전자의 PCR 증폭은 비형질전환 대조구 식물체에서는 나타나지 않았고, 형질전환 식물체에서는 양성 대조구와 같은 위치에서 874bp인 GUS 절편이 확인되었다(도 4A). 형질전환 모상근에서 선별 마커의 절단 여부를 확인하기 위해서, phosphinothricin 유전자 특이 프라이머를 이용한 PCR 분석을 통 하여 수행하였는데, 제초제 저항성 유전자에 해당하는 564bp 크기가 생성되지 않았음을 확인할 수 있었다(자료 미제시). 이것으로 모든 형질전환 모상근들이 원하는 GUS유전자는 도입이 되고 선별 마커는 없는 형질전환체임을 확인하였다.

pCAMbar ^- 벡터로부터 재생된 선별 마커가 없는 세 개의 형질전환체들은 서던 블럿 분석으로 확인한 후 선택하였다. 감자 모상근 식물체로부터 추출한 게노믹 DNA는 적절한 제한 효소 BstEII로 자르고, uidA 프로부로 혼성화하였다. 감자 모상근 유전자 내로 삽입된 uidA 유전자의 카피수는 다양했다. 세 개의 라인을 조사한 결과, 두 개의 모상근 라인(#1 and #2)은 3개 이상의 T-DNA가 삽입되었고, 반면에 하나의 라인(#3)은 하나의 T-DNA가 삽입되었다. 서던 블럿 분석은 형질전환 모상근에 도입된 GUS 유전자가 삽입되었음을 확인 할 수 있게 했다(도 4B). 이런 결과는 형질전환 모상근의 각 라인은 유전자가 선별마커 없이 감자 게놈으로 삽입되었다는 것을 알 수 있게 한다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예1; 식물체와 박테리아 균주>

감자 슈트(Solanum tuberosum L. cv Desiree)는 3% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 고체 MS(Murashige and Skoog)[10] 배지에서 키웠다. 감자 슈트를 2-3주 배양한 뒤 잎절편을 0.5-1.0cm로 절단하여 박테리아와의 공동배양에 사용하였다. 바이너리 벡터 pBI121은 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404와 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주를 사용하였다. 박테리아는 OD₆₀₀=0.5-0.7이 될 때까지 25°C, YPM 배지에서 배양하였다.

<실시예 2; 선별 마커를 제거하기 위한 방법>

564-bp phosphinothricin 유전자(제초제 저항성)를 포함하는 바이너리 플라스미드 pCAMBIA3301은 CaMV 35S 프로모터로 조절된다. uidA 유전자는 코딩 시퀀스의 N-말단 부위에 인트론을 가지고 있다. 선별마커 유전자는 제한 효소 XhoI인 인식 시퀀스로 연결되었다. pCAMBIA3301(www.cambia.org)로부터 phosphinothricin 유전자를 자르기 위해, 플라스미드는 XhoI으로 잘라서 도 3A와 같이 bar 유전자가 결핍된 pCAMbar ^- 벡터를 만들었다. 선별 마커 nptII (neomycin phosphotransferase)을 포함하는 바이너리 벡터 pBI121은 양성 대조구로 사용되었다. 이러한 벡터는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주에 freeze-thaw method [13]으로 형질전환 시켰다.

<실시예3; 접종과 모상근의 재생>

박테리아 부유물이 접종된 YPM 액체 배지에 감자 잎조각을 10분 동안 배양한 다음, 2일 동안 MS기본 배지에서 공동배양한다. 공동배양한 후, 절편은 박테리아의 생장을 저해하기 위해 carbenicillin disodium (1000mg/l)이 첨가된 MS배지로 옮기고 2주에 한번씩 새 배지로 바꾸어 주면서 배양한다. 유도된 모상근은 절편으로부터 분리시키고 carbenicillin disodium (500mg/l)이 첨가된 MS배지로 옮긴다. 배양은 25°C에서 암배양한다.

<실시예4: GUS분석과 조직화학적 염색>

GUS의 활성 분석은 Jefferson et al . [14]에 따라서 식물 추출 원액을 측정하였다. 배양된 잎 조직의 신선한 모상근을 추출용 버퍼(50mM sodium phosphate buffer, pH7.0, 10mM EDTA, 0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (v/v) N-lauroylsarcosine, and 10mM b-mercaptoethanol )로 균등화(homogenized)하고, 4°C, 12,000rpm, 10분 동안 원심분리한다. GUS 활성은 분광광도계(SHIMADZU, UV-160A)로 p-nitrophenyl glucuronide을 측정함으로써 알 수 있다. 시료의 단백질 농도는 Bradford method [15]를 이용했다. GUS 활성(GUS activity)의 조직학적 염색은 Jefferson et al . [16]의 방법을 변경하여 사용하였다. 조직을 GUS 염색 용액(100mM sodium phosphate buffer pH7.0, 0.1% Triton X-100, 10mM EDTA, 1mM x b-gluc)이 포함된 작은 바이알(vials)에 담근다. 이 샘플을 청색으로 변할때까지 37°C에서 암배양한다 (보통 4-24시간정도). 배양이 끝난 후 잎 절편의 클로로필은 70% (v/v) 에탄올로 제거한다.

<실시예5; PCR 분석과 서던 블럿 분석>

게노믹 DNA는 Doyle and Doyle [17]의 변형된 CTAB방법을 적용하여 형질전환 모상근 조직에서 추출한다. 추출된 DNA는 PCR 증폭을 통해 874 bp로 uidA 유전자와 일치하는 것을 확인했다. 프라이머 시퀀스는 다음과 같다. 5'-cgt gaa atc aaa aaa ctc gac ggc-3'(서열목록1), 5'-aag tcc gca tct tca tga cga cca-3'(서열목록2). PCR은 다음과 같은 조건으로 수행하였다; 5 min at 94°C; 30 cycles of 1 min at 94°C, 1 min 57°C, and 1 min 30sec 72°C; and a final extension at 72°C for 7 min.

서던 블럿 분석을 위해 모상근 조직에서 추출한 게노믹 DNA (30ug)는 BstEII로 절단하였고 1% 아가로스 겔로 분리한 후 나일론 멤브래인(Roche Diagnostics, Germany)으로 옮겼다. 혼성화는 DIG Easy Hyb solution (Roche Diagnostics, Germany)을 이용하여 42°C, 6시간 동안 수행하였다. 멤브레인은 2xSSC 0.1% SDS으로, 65°C에서 5분 동안 두 번 씻어주었다. 검출은 alkaline phosphatase와 chemiluminescent substrate, CDP-Star (Roche Diagnostics, Germany)가 연결된 anti-DIG system 으로 수행하였다. 프로브는 uidA 유전자가 검출할 수 있는 특이 프라이머로 PCR DIG labeling Mix (Roche Diagnostics, Germany)으로 제작하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 아그로박테리움 라이조제네스를 이용한 선별 마커가 결손된 형질전환 감자 모상근의 개발 가능성을 제공함으로써 형질전환 식물체를 동정하기 위한 항생제, 제조체 저항성 유전자와 같은 선별 마커 유전자의 사용으로 인한 유전자 변형 농작물 및 유전자 변형 농작물로 만들어진 식품을 인간이 섭취했을 때 발생할 수 있는 잠재적인 리스크와 유전자 변형 농작물이 생태계에 미칠 수 있는 잠재적 영향을 배제시킬 수 있고, 유전적으로 안정하고 생산성이 높은 모상근 배양으로 값비싼 농작물의 생산을 위한 유용한 수단으로 제공될 수 있을 것이다.

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Claims

선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터.
제1항에 있어서, 선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터는 형질전환 감자 식물체를 제조하는데 사용하는 것을 특징으로 하는 벡터.
선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 (Agrobacterium rhizogenes A4).
선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 (Agrobacterium rhizogenes A4)을 감염시켜 유도된 감자 모상근의 증식방법.
제4항에 있어서,

기내 배양된 감자 슈트(Solanum tuberosum)는 3% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 고체 MS(Murashige and Skoog) 배지에서 2-3주 정도 키운 감자 잎절편을 0.5-1.0cm로 절단하는 단계와;

아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주를 OD₆₀₀=0.5-0.7이 될 때까지 25°C, YPM 배지에서 배양시키는 단계와;

선별 마커 유전자가 없는 pCAMbar ^- 벡터를 상기 단계에서 배양한 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주에 freeze-thaw method [13]으로 형질전환 시키는 단계와;

선별 마커 유전자가 없는 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주가 접종된 YPM 액체 배지에 감자 잎 조각을 10분 동안 배양한 다음, 2일 동안 MS 배지에서 공동 배양하는 단계와;

공동 배양 후, 선별 마커 유전자가 없는 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 균주의 성장을 저해하기 위해 carbenicillin disodium (1000mg/l)가 첨가된 MS배지로 옮기고, 2주에 한번씩 새 배지로 바꾸어 주면서 모상근을 배양하는 단계와;

상기 단계에서 유도된 모상근은 절편으로부터 분리시키고 carbenicillin disodium (500mg/l)이 첨가된 MS배지로 옮긴 후 25°C에서 암배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 감자 모상근의 증식방법.
선별 마커가 결손된 식물체 형질전환용 pCAMbar ^- 벡터를 포함하는 아그로박테리움 라이조제네스 A4 (Agrobacterium rhizogenes A4)을 감염시켜 유도된 감자 모상근.