KR20150085846A - Tal-매개 전이 DNA 삽입방법 - Google Patents

Tal-매개 전이 DNA 삽입방법 Download PDF

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후이 두안
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제이.알.심프롯캄패니
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Abstract

본 발명은 식물 게놈 속에 원하는 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합하는 방법에 관한 것이며, 표적 서열을 인식하도록 설계된 TAL 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 벡터로 식물 재료를 형질전환하는 단계; (i) 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않고("프로모터-제거 마커 카세트") 표적 서열에 상동인 서열을 포함하는 마커 유전자; 및 (ii) 원하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 벡터로 식물 재료를 형질전환하는 단계; 및 원하는 폴리뉴클레오티드가 안정하게 통합된 형질전환 식물 재료를 확인하는 단계를 포함한다.

Description

Tal-매개 전이 DNA 삽입방법{Tal-Mediated Transfer DNA Insertion}
본 발명은 식물 생물공학의 분야에 관한 것이며 바람직한 형질을 가진 식물 및 식물 제품의 생산을 위해 표적화된 전이 DNA 삽입 방법을 제공한다.
식물은 DNA 단편을 이의 게놈 속에 삽입하여 변형될 수 있다. 첨가된 DNA는 단백질을 암호화하거나 특정 고유 RNA의 분해를 일으키는 RNA를 생산하도록 재배열된 유전 요소를 포함한다. 종래 기술은 비-표적화된(예측할 수 없고 무작위) 삽입을 초래하는 다양한 부-최적 방법을 교시한다.
바람직한 형질을 가진 유전적으로 가공된 식물 및 식물 제품의 효과적이고 재생가능한 생산을 위한 요구가 존재한다. 유전자이식 형질의 사용과 관련된 어려움은 당황하게 하는데, 특히 중요한 품질 문제가 통상적인 번식을 통해 효과적으로 해결되지 않았기 때문이다.
본 발명의 한 양태는 원하는 폴리뉴클레오티드를 식물 게놈 속에 안정적으로 통합시키는 방법이며, 다음 단계를 포함한다:
(A) 표적 서열을 인식하도록 설계된 TAL 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 벡터로 식물 재료를 형질전환시키는 단계;
(B) (i) 프로모터와 작동가능하게 연결되지 않고 표적 서열과 상동인 서열을 포함하는 마커 유전자("프로모터-제거 마커 카세트"); 및 (ii) 원하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 벡터로 식물 재료를 형질전환시키는 단계; 및
(C) 원하는 폴리뉴클레오티드가 안정적으로 통합된 형질전환 식물 재료를 확인하는 단계.
한 실시태양에서, 형질전환 식물 재료는 형질전환 식물에서 마커 유전자의 존재 또는 부존재를 반영하는 조건에 노출된다. 다른 실시태양에서, 마커 유전자는 제초제 저항 유전자이며 형질전환 식물 재료는 제초제에 노출된다. 한 실시태양에서, 제초제 저항 유전자는 ALS 유전자이다. 다른 실시태양에서, 프로모터-제거 마커 카세트는 식물 게놈 속에 안정적으로 통합된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 식물 속에 외인성 DNA의 표적화된 삽입을 위한 방법을 제공하며 (i) 분리된 식물 세포를 (A) 제 1 바이너리 벡터 및 (B) 제 2 바이너리 벡터로 형질전환하는 단계, 제 1 바이너리 벡터는 (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) Ubi7 인트론 5'-미번역 영역의 부분 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; 및 (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 터미네이터 서열을 포함하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다 및 제 2 바이너리 벡터는 (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 변형 TAL 효과기를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)와 같이, 사이토키닌 생산에 관여된 효소를 암호화하는 서열을 포함하며, 변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계된다 및 (ii) 원하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 식물의 성장을 촉진하는 조건하에서 분리된 식물 세포를 배양하는 단계를 포함하며; 벡터 주쇄 DNA는 식물 게놈에 영구적으로 삽입되지 않는다.
본 발명의 한 바람직한 양태에서, 변형 TAL 효과기는 (a) Fok1 엔도뉴클레아제 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기(repeat variable diresidues)를 포함하는 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) SV40 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서, 원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트이다. 본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, 제 1 바이너리 벡터는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 외인성 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 원하는 외인성 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 내인성 Ubi7 프로모터를 게놈에 포함하는 형질전환 식물을 제공한다. 본 발명의 한 양태에서, 형질전환 식물에서 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현은 하향조절된다. 본 발명의 한 바람직한 양태에서, 식물은 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 발현한다.
한 실시태양에서, 형질전환 식물은 덩이줄기를 지닌 식물이다. 한 바람직한 실시태양에서, 덩이줄기를 지닌 식물은 감자 식물이다. 바람직하게는, 형질전환 식물은 덩이줄기에 잎마름병 저항, 검은 점 상처 내성, 감소된 추위 유도 스위트닝 및 감소된 아스파라긴 수준의 하나 이상을 특징으로 한 표현형을 가진다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 형질전환 식물의 열-처리 제품을 제공한다. 바람직하게는, 열-처리 제품은 프렌치프라이, 칩, 크리스프, 감자, 탈수 감자 또는 구운 감자이다. 본 발명의 한 바람직한 양태에서, 열-처리 제품은 동일한 종의 비-형질전환 식물의 열-처리 제품보다 낮은 수준의 아크릴아마이드를 가진다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함하는 원하는 서열에 결합하도록 설계된 변형 TAL 효과기를 제공한다. 본 발명의 한 바람직한 양태에서, 변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 서열과 결합하도록 설계된다. 이와 같이, 변형 TAL 효과기는 (a) Fok1 엔도뉴클레아제를 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인의 촉매성 도메인; (b) Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기를 포함하는 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) N-말단 영역에 SV40 핵 국소화 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 제 16 항에 따른 변형 TAL 효과기를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)와 같이, 사이토키닌 생산에 관여된 효소를 암호화하는 서열을 포함하는 바이너리 벡터를 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) 부분 Ubi7 인트론 5'-미번역 인트론 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; 및 (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; (e) 터미네이터 서열; 및 (f) 왼쪽 경계를 포함하는 프로모터-레스 카세트(promoter-less cassette)를 포함하는 DNA 구조체를 제공하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다. 본 발명의 한 바람직한 양태에서, DNA 구조체에서 원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트이다. 더욱더 바람직한 양태에서, DNA 구조체는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 (A) 제 1 바이너리 벡터 및 (B) 제 2 바이너리 벡터를 포함하여 식물 속에 외인성 DNA의 표적화된 삽입을 위한 키트를 제공하며 제 1 바이너리 벡터는 (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) Ubi7 인트론 5'-미번역 영역의 부분 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 터미네이터 서열을 포함하는 프로모터-레스 카세트를 포함하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다; 제 2 바이너리 벡터는 (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 변형 TAL 효과기를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)를 암호화하는 서열을 포함한다. 본 발명의 한 바람직한 양태에서, 변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계되며 (a) Fok1 엔도뉴클레아제 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기를 포함하는 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) SV40 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 태양에서, 원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트이다. 본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, 제 1 바이너리 벡터는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함한다.
상기 일반적인 설명 및 다음 상세한 설명은 예시적이고 설명적이며 청구된 본 발명의 추가 설명을 제공하려는 것이다. 다른 목적, 이점 및 새로운 특징은 본 발명의 다음 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
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도 1은 플라스미드 pSIM2168의 전달 DNA 조직화를 예시한다. 바닥 패널에 도시된 서열은 25bp 미강조 오른쪽 경계로부터 시작한다. 옅은 회색 강조 서열은 Ubi7 인트론의 일부이며, 어두운 회색 강조 서열은 Ubi7 모노머이며 잔존하는 미강조 서열은 감자 ALS 유전자 코딩의 일부이다. pSIM2168의 Ubi7In 단편은 TAL에 의해 선택적으로 절단된 내인성 인트론 서열에 상동인 상동성 암(arm)을 포함한다.
도 2는 벡터 pSIM2170에서 포워드(E3) 및 리버스(E4) TAL 효과기 카세트를 예시한다.
도 3은 실시예 9에 기술된 오른쪽 경계 테스팅 카세트를 도시한다.
도 4는 Ubi7::ALS 카세트를 운반하는 플라스미드 pSIM2162의 DNA 조직화를 예시한다.
도 5는 포워드(5a) 및 리버스(5b) 효과기 단백질의 조직화를 도시한다.
도 6은 GUS 리포터 유전자의 출발 코돈으로부터 바로 접하여 하류에 위치된 포워드 및 리버스 인식 위치를 포함하는 표적 서열을 운반하는 플라스미드 pSIM216의 조직화를 예시한다.
도 7은 아그로박테리아 침투 이후 니코티아나 벤타미아나(Nicothiana benthamiana) 잎의 GUS 염색을 도시한다. 왼쪽 패널: 표적 벡터 pSIM2167 단독에 의한 침투. 오른쪽 패널: 표적 벡터 pSIM2167 및 TAL 효과기 벡터 pSIM2170에 의한 침투.
도 8은 TAL 효과기 벡터 pSIM2170에 의한 공동-침투 후 플라스미드 pSIM2167의 PCR-증폭 표적 영역의 서열을 도시한다. 효과기 인식 위치는 회색으로 강조된다. 표적 서열에 대한 변형은 소규모 결실(대부분의 형태) 및 치환(어두운 회색 강조).
도 9는 표적화된 삽입-특이적 PCR에 의한 단편의 서열을 도시한다. 제 1 미-강조 서열 및 제 1 옅은 회색 강조 서열은 감자 게놈 서열이다. 미강조 서열: Uni-7 유사 프로모터; 옅은 회색 강조 서열: Uni-7 유사 인트론. 잔존하는 서열은 pSIM2168 벡터로부터의 것이다. 어두운 회색 서열: Uni-7 인트론의 일부; 미-강조 서열: Uni-7 모노머; 옅은 회색 강조 서열: ALS 암호화 서열의 일부.
도 10은 티멘틴 및 0.0mg/l 이마자목스(왼쪽 패널) 또는 2.0mg/l 이마자목스(오른쪽 패널)를 함유하는 호르몬-제거 배지에서 성장된 마디 사이 이식편을 도시한다. 마디 사이 이식편이 이마자목스를 함유하는 배지에서 성장될 때 완전히 성장된 정상 새싹을 볼 수 없었다.
도 11은 감염 후 7일에, 질병 증상의 진전 위해 P. infestans 잎마름병 균주 US8 BF6로 면역검사된 표적화된 삽입을 위해 pSIM2170 및 pSIM2168 플라스미드로 공동-형질전환된 레인저 러셋 대조군(RR-C) 및 제초제-저항 레인저 러셋 계통을 도시한다.
도 12는 표적화된 삽입을 위해 pSIM2170 및 pSIM2168 플라스미드로 공동-형질전환된 선택된 제초제-저항 레인저 러셋 계통에 대한 서던 블롯 겔을 도시한다. 왼쪽 패널: 전화효소 프로브; 오른쪽 패널: Vnt1 프로모터 프로브. 레인저 러셋 대조군(RR)과 비교된, 형질전환 계통에서 각각의 추가 밴드는 계통 RR-36(36) 및 RR-39(39)에 대한 단일 복사 이식유전자를 나타낸다. 형질전환된 계통 RR-26 및 RR-32는 도시되지 않는다.
도 13은 감자 덩이줄기에서 아스파라긴의 균일한 사일런싱을 도시한다. 스노우덴 계통 2, 15, 55 및 83은 pSIM2168 및 pSIM2170으로 형질전환되었다.
도 14는 감자 덩이줄기에서 폴리페놀 산화효소의 균일한 사일런싱을 도시한다. 스노우덴 계통 2, 15, 55 및 83은 pSIM2168 및 pSIM2170으로 형질전환되었다.
도 15는 감자 덩이줄기에서 아스파라긴의 균일한 사일런싱을 도시한다. 레인저 계통 26, 32, 38 및 39는 pSIM2168 및 pSIM2170으로 형질전환되었다.
도 16은 감자 덩이줄기에서 폴리페놀 산화효소의 균일한 사일런싱을 도시한다. 레인저 계통 26, 32, 38 및 39는 pSIM2168 및 pSIM2170으로 형질전환되었다.
도 17은 형질전환 감자 계통의 수율을 도시한다.
도 18은 pSIM4187에서 FMV-CAS9-OCS 및 35s-gRNA-Nos 카세트를 도시한다. gRNA의 서열이 도시되고 20bp 표적 특이적 서열이 강조된다.
도 19는 아그로박테리아 침투 이후 니코티아나 벤타미아나(Nicothiana benthamiana) 잎의 GUS 염색을 도시한다. pSIM2167: 표적-GUS 벡터; pSIM4187: Cas9 및 gRNA 벡터.
도 20은 pSIM4187에 의한 공동 침투 후 플라스미드 pSIM2167의 PCR 증폭 표적 영역의 서열을 도시한다. gRNA에서 표적 특이적 서열은 어두운 녹색으로 강조된다. 표적 서열에 대한 변형은 소규모 결실 및 치환이다.
본 발명의 한 양태는 원하는 게놈 표적 좌위에 결합하고 결과적으로 절단하여, 특정 표적 좌위에서 원하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 촉진하도록 설계된 전사 활성자-유사 효과기 단백질의 일시적 발현이다. 따라서, 본 발명은 표적 좌위를 인식하고 절단하는 적절한 TAL 다이머를 형성하는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 하나 이상의 원하는 발현 카세트를 포함하는 제 2 벡터에 의한 식물 재료의 형질전환을 포함한다. 이런 원하는 발현 카세트는 특정 단백질 또는 유전자 사일런싱 전사체를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 제 2 벡터는 (i) 원하는 표현형을 암호화하는 마커 유전자 또는 유전자 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 경우 그 마커 유전자의 적절한 발현을 촉진할 수 있는 적절한 다른 조절 요소; 및 (ii) 내인성 표적 좌위 위치 목적지에 상동인 뉴클레오티드 영역을 포함하는 "프로모터-제거" 카세트로서 불리는 카세트를 포함할 수 있다. 이런 상동성 뉴클레오티드 영역은, 예를 들어, 내인성 표적 좌위의 상응하는 서열과 100%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 84%, 또는 적어도 83%, 또는 적어도 82%, 또는 적어도 81%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 79%, 또는 적어도 78%, 또는 적어도 77%, 또는 적어도 76%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 74%, 또는 적어도 73%, 또는 적어도 72%, 또는 적어도 71%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 69%, 또는 적어도 68%, 또는 적어도 67%, 또는 적어도 66%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 64%, 또는 적어도 63%, 또는 적어도 62%, 또는 적어도 61%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 59%, 또는 적어도 58%, 또는 적어도 57%, 또는 적어도 56%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 54%, 또는 적어도 53%, 또는 적어도 52%, 또는 적어도 51%, 또는 적어도 50% 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유하는 10-20, 20-50 또는 20-100 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
따라서, 한 실시태양에서, 제 2 벡터는 적어도 (i) 원하는 폴리뉴클레오티드(단백질 또는 번역할 수 없는 RAN 전사체를 암호화하는 발현 카세트, 이런 RNA 전사체는 하향조절될 표적 유전자의 서열의 센스, 안티센스 및/또는 역방향 반복체를 포함할 수 있다)를 암호화하는 발현 카세트 및 (ii) 상동성 표적 위치 영역과 함께, 터미네이터 또는 3-미번역 영역과 같은 조절 요소에 작동가능하게 연결된 마커 유전자를 포함하는 프로모터-제거 마커 카세트를 포함한다.
제 2 벡터의 프로모터-제거 마커 카세트 및 발현 카세트(들)는 이상적으로 함께 이동하여 둘 다 TAL-매개 활성(다른, TAL-암호화, 벡터에 의해 발생)의 결과로서 표적 좌위 속에 통합된다. 이상적으로, 프로모터-제거 마커 카세트 및 발현 카세트(들)는 하나 이상의 기능성 내인성 프로모터 또는 내인성 조절 요소의 적절하게는 표적 좌위 근처, 예를 들어, 경우에 따라 하류 또는 상류에 원하는 위치 속에 통합되어, 내인성 프로모터 또는 조절 요소는 제 2 벡터에서 프로모터-제거 마커 카세트의 마커 유전자를 발현한다. 인핸서 요소와 같은 유전자 발현을 개시하는 내인성 유전자 프로모터 또는 조절 요소의 표적 서열 하류 또는 상류를 인식하는 TAL 서열의 적절한 설계는 발현 카세트(들) 및 프로모터-제거 마커 카세트는 특별히 선택된 게놈 위치 시간에 통합되고 다시 다른 형질전환 사건들 사이에 통합되는 것을 보장하는 것을 돕는데 중요하다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 개시되고 다른 곳에 기술된 카세트들의 하나와 같은 원하는 폴리뉴클레오티드의 위치-특이적 삽입을 허용하며, 이것이 다른 형질전환 사건 사이에 특정 표적 유전자의 발현 또는 하향조절 수준에 일관성을 보장한다. 예를 들어, 원하는 폴리뉴클레오티드의 위치-특이적 삽입은 표적 유전자를 새롭게(de novo) 발현하거나 과다발현하도록 작용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 표적 유전자의 새로운 발현 또는 과다발현의 수준은 다른 형질전환 사건 사이에서 200% 이하, 또는 100% 이하 또는 50% 이하, 또는 30% 이하로 변할 수 있다. 선택적으로, 원하는 폴리뉴클레오티드의 위치-특이적 삽입은 표적 유전자를 하향조절하는 RNA 전사체를 생산하도록 작용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 표적 유전자의 하향조절의 수준은 다른 형질전환 사건 사이에서 200% 이하, 또는 100% 이하 또는 50% 이하, 또는 30% 이하로 변할 수 있다.
마커 유전자는 중요한데 이는 프로모터-제거 마커 카세트가 적절하게 삽입되는 경우, 마커 유전자는 내인성 조절 요소에 의해 발현될 것이며 마커의 형태에 따라 (a) 성공적인 형질전환체를 효과적으로 확인할 것이고 (b) 원하는 표적 위치에서 공동 결합된 발현 카세트의 사전 확인을 제공할 것이다. 따라서, 마커 유전자가 제초제 저항 유전자인 경우, 형질전환 식물 세포는 관련 제조체 상에서 배양될 수 있고 살아남은 세포는 기능성 내인성 프로모터 근처 원하는 표적 좌위에 제초제 저항 유전자로 형질전환된 세포라는 것을 나타낸다.
따라서, 다른 형질전환 사건 사이에 동일한 게놈 좌위에 발현 카세트를 일상적으로 삽입하는 능력은 매우 바람직하며 유리하며 비용 효율적인데 이는 이것이 다른 게놈 환경에서 무작위로 일어날 수 있는 통합 사건을 확인하는데 필요한 스크린의 규모를 감소시키기 때문이다. 예를 들어, 실시예 14 참조. 무작위 통합 좌위에서 이런 차이는 주로 국소 게놈 환경을 해롭게 붕괴할 수 있고, 필수 유전자를 낙아웃하거나 통합 DNA를 발현하는데 실패한 좌위에 원하는 발현 카세트를 위치시킬 수 있다.
따라서, 제 2 벡터의 프로모터-제거 마커 카세트에 존재하는 상동성 표적 위치는 제 1 벡터의 TAL 단백질 다이머는 또한 인식되고, 결합되고 절단되도록 설계되는 내인성 표적 위치 서열과 일치하도록 특별히 설계된다. 제 2 벡터는 삽입될 폴리뉴클레오티드 서열의 하나의 상동성 표적 위치 영역 상류 또는 하류 또는 삽입될 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹(flanking)하는 2개의 상동성 표적 위치 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 프로모터-제거 마커 카세트 및 TAL 발현 카세트는 내인성 게놈 표적 좌위에 독특한 서열을 함유하여, 프로모터-제거 마커 카세트 및 이의 공동 결합된 원하는 발현 카세트는 TAL에 의해 절단된 정확한 표적 좌위 속에 삽입된다.
본 발명은 게놈 좌위 또는 내인성 프로모터 또는 조절 요소 근처 속에 프로모터-제거 마커 캇트 및 발현 카세트의 삽입에 제한되지 않는다. 오히려, 본 발명은 사전 형질전환 사건으로부터 폴리뉴클레오티드 서열을 인식하는 TAL 서열 및 상동성 영역의 설계를 기초로 모듈 방식으로 카세트를 적층하는 본 발명의 방법을 사용을 포함한다. 즉, 한 실시태양에서, 식물은 TAL를 사용하거나 사용하지 않고, 식물 게놈에서 특정 또는 무작위 위치에 유전자 X를 발현하는 발현 카세트 A로 안정하게 형질전환될 수 있다. 본 발명의 TAL-매개 통합 방법은 발현 카세트 A에서 유전자 X의 하류인 서열을 인식하는 TAL 서열의 설계를 가능하게 하여, TAL 다이머는 유전자 X 위치에서 식물 게놈을 효과적으로 절단한다. 프로모터-제거 마커 카세트 또는 임의의 발현 카세트가 유전자 X 위치에 상동인 영역을 포함하는 경우, 카세트를 유전자 X의 하류에 바로 인접하게 제공하는 것이 가능하다. 상기한 대로, 모든 경우에 본 발명은 프로모터-제거 마커 시스템을 사용해야 하는 것이 필수적이지 않은데 이는 사전-형질전환 유전자 X 식물의 관심 유전자 통합 하류는 본질적이고 자연스럽게 탐지가능하고 원하는 형질을 생산하는 경우일 수 있기 때문이다. 또한, 추가 발현 카세트는 자체 프로모터를 함유할 수 있거나 프로모터-제거일 수 있어서 관심 유전자는 발현 카세트 A의 프로모터 또는 조절 요소로부터 발현된다.
따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 성공적이고 적절한 형질전환체를 확인하도록 설계된 프로모터-제거 마커를 사용하여 표적 좌위 속에 원하는 발현 카세트를 새롭게 삽입하는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 이전 통합 사건의 프로모터-제거 마커 카세트, 하류 또는 상류를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 하나 이상의 추가 발현 카세트의 연속 삽입을 포함한다. 따라서, 후자 접근에서, 본 발명은 다른 발현 카세트를 함께 효과적으로 연결함으로써 식물 게놈 내에 정확하고 한정된 위치에 유전자를 적층하는 능력을 허용하는데 비록 이것은 본 발명에 기술된 TAL-매개 위치-특이적 삽입 기술을 사용하여, 다른 형질전환을 통해 실행된다.
한 실시태양에서, TAL 단백질을 단지 일시적으로 발현하여 식물 게놈 속에 안정하게 통합된 DNA만이 사용되는 경우 원하는 발현 카세트(들) 및 프로모터-제거 마커 카세트에 속하게 되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 (1) 식물의 게놈에서 원하는 표적 좌위 서열을 확인하는 단계; (2) 표적 좌위 서열을 특이적으로 인식하는 상응하는 TAL 서열을 설계하는 단계; 및 선택적으로, (3) 예를 들어, 형성될 때 상응하는 TAL 다이머가 적절하게 절단되는 지를 테스트하기 위해 침투 분석법에서 설계된 TAL 서열을 분석하는 단계를 포함한다. 작동하는 TAL은 도 2에 도시된 대로, 일시적 발현 형질전환 벡터 속에 서브클론될 수 있다(subclone). 이런 단계는 본 발명에 상세하게 기술된다. 예를 들어 실시예 10 및 11 참조.
그런 후에 제 2 벡터는 프로모터-제거 마커 카세트와 함께 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 설계될 수 있고 TAL 벡터 및 제 2 벡터는 아그로박테리아의 하나 또는 두 개의 균주 속에 뒤이어 형질전환될 수 있다.
이식편, 유합조직(calli), 세포, 잎 또는 줄기와 같은 식물 재료는 이런 아그로박테리아를 사용하여 형질전환될 수 있다. 한 실시태양에서, 형질전환 식물 재료는 임의의 선택 구성요소를 함유하지 않는 배지에서 유합조직 속에 성장될 수 있다. 즉, 설명의 편의를 위해, 제 2 벡터가 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않은 제초제 저항 마카 유전자를 포함하는 경우, 형질전환 식물 재료는 특정 기간 동안 제초제를 함유하지 않는 배지에서 최초로 배양될 수 있다. 그 기간 이후, 식물 재료는 제초제를 함유하는 유합조직에 놓일 수 있다. 생존하는 이런 재료는 새싹이 성장하여 일정 기간 동안 생존할 때까지 동일한 제초제를 함유하는 새싹 유도 배지에 놓일 수 있다. 제초제 배지에서 성장된 새싹은 실제 원하는 발현 카세트와 함께 게놈에 안정하게 통합된 제초제 저항 유전자를 함유한다. 이런 제조체-저항 새싹 또는 이런 새싹으로부터 성장된 잎은 PCR 및 다른 분자 분석을 거쳐 이들이 정확하고 예측된 게놈 표적 위치에 마커 및 원하는 발현 카세트(들)를 함유하는지를 측정한다. 이런 방법은 본 발명에 상세하게 기술되며, 예를 들어, 실시예 4 참조. ALS 유전자가 프로모터-제거 배열에 마커 유전자로 사용되었을 때, 본 발명에서 논의한 대로, 분석된 형질전환 새싹/잎의 80%는 원하는 게놈 좌위에 안정적으로 통합된 원하는 삽입체를 함유하였다.
한 실시태양에서, 제 2 벡터는 pSIM2168에 도시된 대로(도 1), 잎마름병을 위한 유전자 발현 카세트 및 프로모터-제거 ALS 제초체 마커 유전자 이외에, PPO, ASN1 및 전화효소를 사일런싱하기 위한 유전자 사일런싱 카세트를 포함한다. 이런 경우에, ALS 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않으나 터미네이터에게 작동가능하게 연결되며 내인성 식물 Ubi7 유전자 인트론 및 Ubi7 엑손 #1의 일부의 영역에 상동인 서열인 상류를 포함한다. 도 2는 Ubi7 유전자 인트론 내의 자연 발생 서열을 인식하도록 설계된 E4Rep 및 E3 반복체 TAL 서열을 발현하는 상응하는 벡터(pSIM2170)를 도시한다. pSIM2168 및 pSIM2170은 감자 줄기 이식편 속에 형질전환되고 상기되고 본 발명에 제공된 실시예에서 방법적 세부내용에 기술된 방법을 거친다. 결과는 내인성 Ubi7 유전자 인트론에 원하는 정확한 표적 위치 속에 pSIM2168의 카세트를 안정적으로 통합하기 위해 TAL-매개 통합을 사용하는데 성공적이라는 것을 나타낸다.
본 발명의 방법은 전이-DNA 또는 아그로박테리움을 사용하는 이런 벡터의 주입에 제한되지 않는다. 예를 들어, 임의의 아그로박테리움 또는 T-DNA 구성요소 없이 입자 충돌을 사용하는 것이 가능하다. 한 실시태양에서, 예들 들어, 입자 충돌 입자를 원하는 발현 카세트(들) 및 프로모터-제거 마커 카세트를 암호화하는 DNA로 코팅할 수 있고 동일한 입자를 TAL 단백질 또는 TAL 단백질 다이머로 코팅할 수 있다. 이런 방식으로 입자는 암호화 DNA 및 TAL 단백질을 포함할 수 있고 또는 일부 입자는 암호화 DNA 또는 TAL 단백질로 코팅될 수 있다. 임의의 경우에, 식물 재료는 이런 코팅된 입자에 의해 충돌될 수 있고 그 결과 입자가 식물 세포에 들어갈 때, TAL 단백질은 원한 위치에서 게놈 서열을 절단하고 함께 전달된 DNA를 통합하도록 의도한 대로 작용한다. 예를 들어, 단백질과 DNA를 식물 속에 함께 전달하도록 입자 충돌을 어떻게 사용하는지는 본 발명에 참조로 포함된 Martin-Ortigosa et al., Adv. Funct. Mater. 22, 3576-3582 (2012) 참조.
본 발명에서 사용된, "원하는 폴리뉴클레오티드"는 필수적으로 사용자가 식물 게놈 속에 통합되기 원하는 발현 카세트 또는 유전자 사일런싱 카세트 내의 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 일련의 DNA 서열이다. 따라서, "원하는 폴리뉴클레오티드"는 본 발명에서 "카세트", "발현 카세트" 또는 "사일런싱 카세트"와 교환해서 사용될 수 있다. 임의의 발현 카세트에서 원하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 종류 또는 세기의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고 따라서 이의 발현은 내인성 식물 게놈 프로모터의 발현에 의존하지 않는다.
본 발명의 TAL-매개 통합 기술에 따라 식물 게놈을 안정적으로 형질전환하는 것이 바람직하나, 본 발명의 방법의 다른 실시태양은 임의의 형태 또는 샘플의 핵산 속에 원하는 폴리뉴클레오티드의 통합을 포함한다.
TALs
전사 활성자-유사(TAL) 효과기는 식물 게놈에서 특히 원하는 표적 위치 속에 DNA의 위치 특이적 통합을 촉진하는 모듈 DNA 결합 도메인을 함유하는 식물 병원성 박테리아 단백질이다. 이런 도메인은 표적화된 위치 특이적 통합 방법을 진행하는데 유용한 DNA에서 인접 뉴클레오티드를 개별적으로 명시하는 탠덤, 다형체 아미노산 반복체를 포함한다.
중앙 반복체 도메인은 통상적으로 34 잔기 길이인 1.5 내지 33.5 반복체를 포함할 수 있다. 반복체 서열의 한 예는 다음이다:
LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHG
"반복체 가변성 이중잔기" 또는 RVD로 알려진 12번 및 13번 위치의 잔기는 과가변성일 수 있다. 연속 반복체에서 이런 두 잔기의 정체 및 TAL 효과기 표적 위치에서 연속 DNA 염기 사이에 상관관계가 존재한다. RVD 서열과 표적 DNA 염기 사이의 코드는 다음과 같이 표현될 수 있다:
NI = A
HD = C
NG = T
NN = R (G 또는 A), 및
NS = N (A, C, G, 또는 T).
RVD NK는 G를 표적화할 수 있으나, G를 표적화하기 위해 NN 대신에 NK를 전적으로 사용하는 TAL 효과기 뉴클레아제(TALENs)는 덜 활성적일 수 있다.
TAL 효과기의 표적 위치는 중앙 반복체 도메인의 N-말단 영역에서 이런 T 뉴클레오티드 및 보존성 트립토판 사이의 접촉 때문에 제 1 반복체에 의해 표적화된 5'-염기를 플랭킹하는 T를 포함할 수 있다.
또한 전문이 참조로 본 발명에 포함된 다음 문헌을 참조: Boch J, Bonas U (September 2010). "XanthomonasAvrBs3 Family-Type III Effectors: Discovery and Function". Annual Review of Phytopathology 48: 419-36; Voytas DF, Joung JK (December 2009). "Plant science. DNA binding made easy". Science 326 (5959): 1491-2. Bibcode 2009; Moscou MJ, Bogdanove AJ (December 2009). "A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors". Science 326 (5959): 1501; Boch J, Scholze H, Schornack S et al. (December 2009). "Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors". Science 326 (5959): 1509-12; Morbitzer, R.; Romer, P.; Boch, J.; Lahaye, T. (2010). "Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors". Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (50): 21617-21622; Miller, J. C.; Tan, S.; Qiao, G.; Barlow, K. A.; Wang, J.; Xia, D. F.; Meng, X.; Paschon, D. E. et al. (2010). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing". Nature Biotechnology 29 (2): 14; Huang, P.; Xiao, A.; Zhou, M.; Zhu, Z.; Lin, S.; Zhang, B. (2011). "Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs". Nature Biotechnology 29 (8): 699; and Mak, A. N. -S.; Bradley, P.; Cernadas, R. A.; Bogdanove, A. J.; Stoddard, B. L. (2012). "The Crystal Structure of TAL Effector PthXo1 Bound to Its DNA Target". Science. doi:10.1126/science.1216211.
마커
프로모터-제거 마커 유전자 카세트에서 본 발명에 개시된 대로 사용될 수 있는 마커 유전자의 목록의 예는 제초제 내성, 살충제 내성 곤충 저항, 스트레스 내성, 과일 또는 씨의 강화된 풍미 또는 안정성 또는 유용한 비-식물 단백질, 예를 들어, 의학적으로 귀중한 단백질을 합성하는 능력 또는 식물 단백질의 변형된 농도를 생성하는 능력 및 식물에 대한 관련 충돌, 예를 들어, 2차 식물 대사산물을 포함하는 식물 대사산물의 생산에 촉매작용을 미치는 식물 단백질의 변화된 수준을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 유비퀴틴-7(Ubi7)의 인트론 서열 속에 프로모터-레스 원하는 뉴클레오티드 서열을 삽입함으로써, 식물 속에 원하는 뉴클레오티드 서열의 표적화된 삽입을 위한 방법 및 키트를 제공하며, 식물에서 외인성 뉴클레오티드 서열의 발현은 내인성 Ubi7 프로모터에 의해 이루어진다. 특히, 본 발명자들은 Ubi7 유전자의 인트론 서열 내에 원하는 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 특이적으로 설계된 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제의 일시적 발현을 위한 바이너리 벡터를 생성할 수 있었고, 그 결과 이런 벡터가 표적화된 프로모터-레스 뉴클레오티드 서열을 운반하는 바이너리 벡터와 함께 식물 세포 속에 제공될 때, 원하는 뉴클레오티드 서열은 적절한 배향과 공간으로 Ubi7 유전자의 인트론 서열 속에 삽입되며, 이들의 발현은 내인성 Ubi7 프로모터에 의해 이루어진다. 이렇게 얻은 형질전환 이식편으로부터 재생된 형질전환 식물은 단지 표적화된 서열만 지닌다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 형질전환된 식물뿐만 아니라 일시적 및 영구적 형질전환을 위한 바이너리 벡터를 더 제공한다.
본 발명의 기술적 전략은 표적화된 형질전환에 의해 원하는 형질을 가진 유전 가공된 식물 및 식물 제품을 효과적으로 생산하는 요구를 해결하여, 식물 농작물 및 특히 감자 식물과 같은 덩이줄기를 가진 식물의 영양적 가치 및 농역학적 특성이 개선될 수 있다. 원하는 형질은 충돌 유도 검은 점 상처에 대한 높은 내성, 아크릴아마이드 전구체 아스파라긴의 감소된 형성, 환원 당의 감소된 축적 및 아크릴아마이드를 포함하는 독성 마이야르 생성물의 감소된 축적을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 검은 점 상처의 원인인 폴리페놀 산화효소(PPO) 및 아크릴아마이드 형성에서 전구체인 아스파라긴의 축적의 원인인 아스파라긴 합성효소-1(Asn-1)와 같은 효소의 발현을 감소시키고 잎마름병 저항 유전자 Vnt1의 발현을 증가시킴으로써 식물 게놈 속에 이런 원하는 형질의 표적화된 삽입을 가능하게 한다.
본 발명은 당업자에게 주지된 용어 및 문장을 사용한다. 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 발명에 사용된 명명법 및 본 발명에 기술된 세포 배양, 분자 유전학, 및 핵산 화학과 잡종화에서 실험 절차는 주지되고 당업계에 일반적으로 사용된 것이다. 표준 기술이 재조합 핵산 방법, 폴리뉴클레오티드 합성, 미생물 배양, 세포 배양, 조직 배양, 형질전환, 형질감염, 형질유도, 분석 화학, 유기 합성 화학, 화학 합성, 화학 분석 및 의약 제제화 및 전달에 사용된다. 일반적으로, 효소 반응 및 정제 및/또는 분리 단계는 제조사의 세부내용에 따라 실행된다. 기술과 절차는 통상적인 방법에 따라 일반적으로 실행된다(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, edited by Sambrook & Russel Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).
아그로박테리움 또는 박테리아 형질전환: 기술분야에서 주지된 대로, 식물 세포를 형질전환하는데 사용된 아그로박테리아는 주로 아그로박테리움 투메페이시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스의 온화한 및 악성 유도체이다. 식물, 외식편, 세포 또는 원형질체의 감염시, TAL 효과기 카세트를 포함하는 바이너리 벡터 및 관심 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 함유하는 단일 아그로박테리움 균주 또는 하나는 TAL 효과기 카세트를 포함하는 바이너리 벡터를 함유하며, 다른 하나는 관심 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 함유하는 것인 2개의 개별 아그로박테리움 균주는 플라스미드 벡터로부터 식물 세포 핵으로 원하는 DNA를 전달한다. 벡터는 통상적으로 T-DNA의 경계 사이에 위치한 원하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 그러나, 리조비움 트라이폴리, 리조비움 레구미노사럼, 필로박테리움 미르시나세럼, 시노리조비움 멜리로티 및 메소리조비움 로티와 같이 식물 세포를 형질전환시킬 수 있는 임의의 박테리아가 사용될 수 있다. 본 발명은 박테리아 형질전환 시스템의 사용에 제한되지 않는다. 그러나 적절한 세포 장치 및 단백질을 함유하는 임의의 유기체가 식물 세포 형질전환을 실행한다.
속씨식물: 씨방에 둘러싸인 씨를 가진 관다발 식물. 속씨식물은 과일이 열리는 꽃을 생산하는 씨 식물이다. 속씨식물은 쌍떡잎식물과 외떡잎식물과 나뉜다.
항생제 저항: 항생제의 존재하에서 생존하는 세포의 능력. 본 발명에 사용된 항생제 저항은 숙주 세포에서 항생제 저항 유전자의 발현으로부터 기인한다. 세포는 임의의 항생제에 대한 저항을 가질 수 있다. 일반적으로 사용된 항생제의 예는 카나마이신 및 하이그로마이신을 포함한다.
쌍떡잎식물( dicot ): 씨눈이 2개의 씨 절반 또는 떡잎, 갈라진 잎맥 및 4개 또는 5개의 여러 요소로 된 꽃 부분을 가진 개화 식물. 쌍떡잎식물의 예는 감자, 사탕무, 브로콜리, 카사바, 고구마, 고추, 홍성초, 콩, 자주개자리, 콩 및 아보카도를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
내인성: 형질전환된 식물 또는 식물 종의 게놈으로부터 분리되거나 형질전환될 식물 종과 유성적으로 혼용가능하거나 서로 교배되는, 즉, 식물 종에 대해 "천연적인" 즉 고유한 식물 또는 종으로부터 분리된 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, mRNA 또는 cDNA 분자.
발현 카세트: 5'로부터 3'까지, (a) 제 1 프로모터, (b) (i) 유전자 또는 유전자 단편의 적어도 하나의 복사체 또는 (ii) 유전자의 프로모터의 단편의 적어도 하나의 복사체를 포함하는 서열 및 (c) 제 1 프로모터와 반대 배향으로 위치된 터미네이터 또는 제 2 프로모터를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
외래: 핵산과 관련하여 "외래"는 핵산이 비-식물 또는 유기체로부터 유래되거나 형질전환될 식물과 동일한 종이 아닌 식물로부터 유래되거나 형질전환될 식물과 서로 교배되지 않는 식물로부터 유래되지 않으며, 표적 식물의 종에 속하지 않는 것을 의미한다. 본 발명에 따라, 외래 DNA 또는 RNA는 곰팡이, 박테리아, 바이러스, 포유류, 물고기 또는 새에서 자연적으로 발생하나 형질전환될 식물에서 자연적으로 발생하지 않는 핵산을 나타낸다. 따라서, 외래 핵산은, 예를 들어, 형질전환 식물에 의해 자연적으로 생산되지 않는 폴리펩타이드를 암호화하는 것이다. 외래 핵산은 단백질 생성물을 암호화할 필요가 없다.
유전자: 유전자는 암호화 및 비-암호화 서열을 포함하는 생성물, 폴리펩타이드 사슬 또는 RAN 분자의 합성에 필요한 모든 정보를 함유하는 DNA 분자의 단편이다. 유전자는 또한 여러 서열을 나타낼 수 있고, 각각은 독립적으로 발현될 수 있고 동일한 기능 활성을 나타내는 약간 다른 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 아라파라긴 합성효소 1 및 2 유전자는 함께 유전자로 불릴 수 있다.
유전 요소: "유전 요소"는 프로모터, 유전자, 터미네이터, 인트론, 인핸서, 스페이서, 5'-미번역 영역, 3'-미번역 영역 또는 재조합 인식 위치와 같은 임의의 구별된 뉴클레오티드 서열이나 이에 제한되지 않는다.
유전 변형: 분자 및 세포 생물학에서 방법을 사용하여 특정 유기체의 게놈 속으로 DNA의 안정한 주입.
겉씨식물: 본 발명에 사용된 대로, 씨눈 없이 씨를 지닌 씨 식물을 의미한다. 겉씨식물의 예는 침엽수, 소철, 은행나무 및 마황을 포함한다.
주입: 본 발명에 사용된 대로, 감염, 형질감염, 형질전환 또는 형질유도를 포함하는 방법에 의해 세포 속에 핵산 서열의 삽입을 의미한다.
외떡잎식물( monocot ): 하나의 떡잎 또는 씨 잎, 평행한 잎맥 및 3개의 여러 요소로 된 꽃 부분을 가진 씨눈을 가진 개화 식물. 외떡잎식물의 예는 옥수수, 쌀, 귀리, 밀, 보리 및 수수를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
천연적: 형질전환된 식물 또는 식물 종의 게놈으로부터 분리되거나 형질전환될 식물 종과 유성적으로 혼용가능하거나 서로 교배되는, 즉, 식물 종에 대해 "천연적인" 즉 고유한 식물 또는 종으로부터 분리된 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, mRNA 또는 cDNA 분자.
천연 DNA: 형질전환된 식물 또는 식물 종의 게놈으로부터 분리되거나 형질전환될 식물 종과 유성적으로 혼용가능하거나 서로 교배되는, 즉, 식물 종에 대해 "천연적인" 즉 고유한 식물 또는 종으로부터 분리된 임의의 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, mRNA 또는 cDNA 분자. 다시 말하면, 천연적 유전자 요소는 전통적인 식물 교배를 통해 식물의 개선을 위한 식물 번식자에 접근가능한 모든 유전 재료를 나타낸다. 천연 핵산의 임의의 변형체는 본 발명에 따라 "천연적인" 것으로 생각된다. 예를 들어, 천연 DNA는 점 돌연변이가 자연적으로 나타내기 때문에 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 제한 위치를 사용하여 2개의 다른 천연 DNA를 연결하는 것이 가능한데 이런 위치는 식물 게놈에 편재하기 때문이다.
천연 핵산 구조체: 적어도 하나의 천연 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
작동가능하게 연결: 조합하여 둘 이상의 분자가 식물 세포에서 적절하게 작용하는 방식으로 결합. 예를 들어, 프로모터가 구조 유전자의 전사를 제어할 때 프로모터는 구조 유전자에 작동가능하게 연결된다.
과다발현: 대조군 식물에서의 수준보다 높은 수준으로의 유전자의 발현.
P-DNA: 본 발명의 식물-유래 전이-DNA("P-DNA") 경계 서열은 임의의 공지된 박테리아-유래 T-DNA 경계 서열과 뉴클레오티드 서열이 동일하지 않으나, 필수적으로 동일한 목적을 위해 작용한다. 즉, P-DNA는 하나의 폴리뉴클레오티드를 다른 하나 속에 전이하고 통합하는데 사용될 수 있다. P-DNA는 통상적인 T-DNA 대신에 아그로박테리움로부터의 Ti-플라스미드와 같은 종양 유도 플라스미드 속에 삽입될 수 있고 통상적인 형질전환 플라스미드와 같이 박테리아 균주에 유지될 수 있다. P-DNA는 박테리아-매개 식물 형질전환을 통해 식물 게놈 속에 통합되기 위한 원하는 폴리펩타이드를 함유하도록 조작될 수 있다. P-DNA는 적어도 하나의 경계 서열을 포함한다. 참조로 본 발명에 포함된 Rommens et al. 2005 Plant Physiology 139: 1338-1349 참조. 본 발명의 특정 실시태양에서, T-DNA는 P-DNA으로 대체된다.
표현형: 표현형은 식물의 구별가능한 형태 또는 특징이며, 하나 이상의 "원하는 폴리뉴클레오티드" 및/또는 선별가능한/선택가능한 마커를 형질전환 식물의 적어도 하나의 식물 세포의 게놈 속에 통합시킴으로써 본 발명에 따라 변형될 수 있다. "원하는 폴리뉴클레오티드(들)" 및/또는 마커는 형질전환 식물 세포 또는 전체로서 식물의 여러 유전, 분자, 생화학, 생리학, 형태학 또는 농경학 특징 또는 특성의 임의의 하나를 변형시킴으로써 형질전환 식물의 표현형에 변화를 줄 수 있다.
식물 조직: "식물"은 씨눈을 특징적으로 생산하고, 엽록체를 함유하고 셀룰로오스 세포벽을 가지는 식물계의 다양한 광합성, 진핵, 다세포 유기체의 임의의 것이다. 식물의 일부, 즉 "세포 조직"은 유전자이식 식물을 생산하기 위해 본 발명의 방법에 따라 처리될 수 있다. 여러 적절한 식물 조직은 본 발명에 따라 형질전환될 수 있고 체세포 배, 꽃가루, 잎, 줄기, 유합조직, 포복지, 미세덩이줄기 및 새싹을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 밀, 옥수수, 쌀, 보리, 밀, 사탕무, 감자, 토마토, 자주개자리, 카사바, 고구마 및 콩과 같은 속씨식물 및 겉씨식물의 형질전환을 고려한다. 본 발명에 따라, "식물 조직"은 또한 식물 세포를 포함한다. 식물 세포는 현탁 배양액, 유합조직, 씨눈, 분열 영역, 유합조직, 잎, 뿌리, 새싹, 배우체, 홀씨체, 꽃가루, 씨 및 소포자를 포함한다. 식물 조직은 다양한 성숙 단계에 있을 수 있고 액체 또는 고체 배양액 또는 토양 또는 단지 속 적절한 배지, 온실 또는 재배지에서 재배될 수 있다. 식물 조직은 유성적으로 또는 무성적으로 생성된 식물, 씨, 자손, 번식체의 임의의 클론 및 벤 농작물 또는 씨와 같은 이들의 임의의 자손을 의미한다.
식물 형질전환 및 세포 배양액: 식물 세포가 유전적으로 변형되고 관리, 추가 성장, 및/또는 추가 개발을 위한 적절한 식물 배지에 전달되는 방법을 넓게 의미한다. 이런 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
가공: 적어도 120℃로의 가열을 포함하는 (1) 예를 들어, 밀, 옥수수, 커피 식물 또는 코코아 나무의 씨, (2) 예를 들어, 감자의 덩이줄기 또는 (3) 예를 들어, 감자 및 얌의 뿌리에 의한 식품을 생산하는 공정. 처리된 식품의 예는 빵, 아침 시리얼, 파이, 케이크, 토스트, 비스켓, 쿠키, 피자, 프레첼, 토르티야, 프렌치프라이, 오븐에 구운 프라이, 감자 칩, 해쉬 브라운, 로스트 커피 및 코코아를 포함한다.
자손: 유전자이식 식물의 자손과 같은 본 발명의 "자손"은 식물 또는 유전자이식 식물로부터 태어나고, 낳아지고 또는 유래된 것이다. 따라서, "자손" 식물, 즉 "F1" 세대 식물은 본 발명의 방법에 의해 생산된 유전자이식 식물의 자손 또는 후손이다. 유전자이식 식물의 자손은 세포 게놈, 본 발명에 기술된 방법에 의해 부모 유전자이식 식물의 세포 속에 통합된 원하는 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나, 일부 또는 전부에 함유될 수 있다. 따라서, 원하는 폴리뉴클레오티드는 자손 식물에 의해 "전달" 또는 "유전"된다. 자손 식물에 유전된 원하는 폴리뉴클레오티드는 부모로부터 자손 식물에 의해 유전되는 T-DNA 또는 P-DNA 구조체 내에 잔류할 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "자손"은 또한 식물의 그룹의 자손 또는 후손인 것으로 생각될 수 있다.
프로모터: 프로모터는 핵산, 바람직하게는 RNA 중합효소 및/또는 다른 전사 조절 요소와 결합하는 DNA를 의미한다. 프로모터는 프로모터가 결합하는 유전자가 전사될 수 있게 하는 핵산 서열이다. 조절 영역은 전사의 개시를 지배 및/또는 촉진하는 핵산 서열을 의미한다. 프로모터는 통상적으로 인핸서 또는 인듀서 요소와 같은 조절 영역을 포함하는 것으로 생각된다.
진핵생물 프로모터는 통상적으로 유전자의 상류에 놓이며 여기에 대부분 즉시 결합된다. 비록 전사 복합체에 의한 특정 3차 구조 형성은 DNA가 접히게 할 수 있어서, 이것이 이런 조절 요소를 전사의 실제 위치에 더 가깝게 가져오지만, 프로모터는 전사 시작 위치로부터 여러 킬로베이스 떨어져 위치된 조절 요소를 가질 수 있다. 여러 진핵생물 프로모터는 통상적으로 뉴클레오티드 서열, TATAAA로 표시된 "TATA 박스" 서열을 함유한다. 이런 요소는 RNA 중합효소 전사 복합체의 형성을 돕는 TATA 결합 단백질에 결합한다. TATA 박스는 통상적으로 전사 시작 위치의 50 베이스 내에 놓인다.
진핵생물 프로모터는 또한 전사 복합체의 형성에 관여된 전사 인자와 결합하는 특정 조절 서열의 존재를 특징으로 한다. 한 예는 염기성-나선-루프-나선-패밀리에서 전사 인자와 결합하는 서열 CACGTG로 표시된 E-박스이다. 또한 GC 뉴클레오티드 함유량이 높은 영역이 존재한다.
폴리뉴클레오티드는 프로모터에 대해 2개의 다른 배향으로 연결될 수 있다. 한 배향에서, 예를 들어, "센스", 최종 RNA 전사체의 적어도 5'-부분은 적어도 하나의 표적 전사체의 적어도 일부와 서열 동일성을 공유할 것이다. "안티센스"로 표시된 다른 배향에서, 예측된 전사체의 적어도 5'-부분은 적어도 하나의 표적 전사체의 역방향 보체의 적어도 일부와 동일하거나 상동일 것이다.
식물 프로모터는 이의 기원이 식물 세포이건 아니건 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 예시적 식물 프로모터는 식물, 식물 바이러스 및 식물 세포에서 발현된 유전자를 포함하는 아그로박테리움 또는 리조비움과 같은 박테리아로부터 얻은 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 성장 제어하에 있는 프로모터의 예들은 목질부, 잎, 뿌리 또는 씨와 같은 특정 조직에서 우선적으로 전사를 개시하는 프로모터를 포함한다. 이런 프로모터는 조직-우선 프로모터로 불린다. 특징 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 조직-특이적 프로모터로 불린다. 세포 형태-특이적 프로모터는 주로 하나 이상의 기관, 예를 들어, 뿌리 또는 잎에서 관다발 세포에서 특정 세포 형태로 발현을 일으킨다. 유도성 또는 억제성 프로모터는 환경 제어하에 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터에 의해 전사에 영향을 미칠 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 또는 빛의 존재를 포함한다. 조직 특이적, 조직 우선, 세포 형태 특이적 및 유도성 프로모터는 비-구조성 프로모터의 종류를 구성한다. 구조성 프로모터는 대부분의 환경 조건 및 대부분의 식물 부분에서 활성인 프로모터이다.
폴리뉴클레오티드는 유전자 암호화 서열 또는 이의 단편(적어도 15개 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 30개 연속 뉴클레오티드 및 더욱 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드 포함), 프로모터, 인트론, 인핸서 영역, 폴리아데닐화 위치, 전사 개시 위치, 5' 또는 3' 미번역영역, 리포터 유전자, 선택가능한 마커 등을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형 염기 또는 변형 주쇄를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 게놈, RNA 전사체(mRNA와 같은) 또는 처리된 뉴클레오티드 서열(cDNA와 같은)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 배향의 서열을 포함할 수 있다.
분리된 폴리뉴클레오티드는 천연 상태가 아닌 폴리뉴클레오티드 서열이며, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 천연에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열로 구성되거나 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 가깝게 위치하는 뉴클레오티드 서열로부터 분리되거나 통상적으로 가깝게 위치하지 않는 뉴클레오티드 서열 다음이다.
씨: "씨"는 씨눈을 함유하는 익은 식물 배주 및 덩이줄기 또는 홀씨로서 식물의 전파 부분으로 생각될 수 있다. 씨는, 예를 들어, 발아를 촉진하기 위해, 아그로박테리움-매개 형질전환 이전에, 어둠 속에서 배양될 수 있다. 씨는 또한 표백에 의한 간단한 처리에 의해, 배양 전에 살균될 수 있다. 최종 묘목은 아그로박테리움의 원하는 균주에 노출될 수 있다.
선택가능한/선별가능한 마커 : 식물 또는 식물 조직에서 발현되는 경우, 이 식물 또는 식물 조직을 유전자를 발현하지 않는 다른 식물 또는 식물 조직으로부터 구별될 수 있게 하는 유전자. 선별 절차는 선별가능한 마커 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현을 위한 분석법을 필요로 할 수 있다. 선택가능한 마커의 예는 아세토락테이트 합성효소(ALS)와 같은 제초제 저항 유전자, 카나마이신 및 제네티신 저항을 암호화하는 네오마이신 포스포트랜스페라제(NptII) 유전자, 하이그로마이신에 대한 내성을 암호화하는 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HptII) 유전자 또는 당업계에 공지된 다른 유사 유전자를 포함한다.
감각 특징: 전문적으로 훈련받은 개인들의 패널은 외관, 풍미, 향기 및 질감과 같은 감각 특징에 대한 식품을 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명은 덩이줄기 생산 수율을 조직하도록 본 발명에 따라 변형된 식물로부터 얻은 식물 제품의 감각 특징을 개선하는 것을 고려한다.
서열 동일성: 본 발명에 사용된 대로, 2개의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 내용에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정 영역 위에서 최대 일치로 배열될 때 동일한 2개의 서열에서 잔기에 대한 참조를 포함한다. 따라서 본 발명에 사용된 상동 영역 또는 서열은 표적 게놈 좌위를 가진 서열 동일성의 어느 정도를 공유하는 서열을 기술한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용될 때, 동일하지 않은 다른 잔기 위치는 주로 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기에 대해 치환되는 보존성 아미노산 치환에 의해 다르며 따라서 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다고 생각된다. 서열이 보존성 치환에서 다른 경우, 백분율 서열 동일성은 치환의 보존성 특성에 대해 수정하도록 상향 조절될 수 있다. 이런 보존성 치환에 의해 다른 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 말한다. 이런 조절을 하는 수단은 당업자에게 주지되어 있다. 통상적으로 이것은 전체 불일치보다 부분 불일치로서 보존성 치환에 점수를 매기는 것을 필요로 하여, 백분율 서열 동일성을 증가시킨다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1점이 제공되고 비 보존성 치환에 0점이 제공될 때, 보존성 치환에 0과 1 사이의 점수가 제공된다. 보존성 치환의 점수는, 예를 들어, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA)에서 실행된 대로, Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11 17 (1988)의 알고리즘에 따라 계산된다.
본 발명에 사용된, 서열 동일성의 백분율은 비교 창 위에서 2개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 측정된 값을 의미하며, 비교 창에서 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 배열을 위한 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하여 일치된 위치의 수를 생성하는 위치의 수를 측정하고, 비교 창에서 위치의 전체 수로 일치된 위치의 수를 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 생성하여 계산된다.
"서열 동일성"은 기술분야 인식 의미를 가지며 공개된 기술을 사용하여 계산될 수 있다. COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988), BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, ed. (Academic Press, 1993), COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin & Griffin, eds., (Humana Press, 1994), SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed., Academic Press (1987), SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov & Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991), 및 Carillo & Lipton, SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988) 참조. 두 서열 사이에 동일성 또는 유사성을 측정하는데 일반적으로 사용된 방법은 GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Bishop, ed., (Academic Press, 1994) and Carillo & Lipton, supra에 개시된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 동일성과 유사성을 측정하는 방법은 컴퓨터 프로그램에서 집대성된다. 두 서열 사이에 동일성 또는 유사성을 측정하는데 바람직한 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지(Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)), 및 FASTDB (Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990))를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
사일런싱 : 포로모터로부터 터미네이터까지 유전자 또는 유전자 단편의 단일방향이고 교란되지 않은 전사는 표적 유전자의 전사 후 사일런싱을 일으킬 수 있다. 단일 유전자 단편으로 구성된 식물에서 전사 후 유전자 사일런싱을 위한 최초 발현 카세트는 전사 개시와 종결을 위한 조절 서열 사이에 안티센스(McCormick et al., 미국특허 6617496; Shewmaker et al., 미국특허 5107065) 또는 센스(van der Krol et al., Plant Cell 2:291-299, 1990) 배향에 위치되었다. 애기장대에서, RNA-의존성 RNA 중합효소에 의한 최종 전사체의 인식은 이중 가닥(ds) RNA의 생산을 유도한다. Dcl4와 같은 다이서-유사(Dcl) 단백질에 의한 이런 dsRNA의 절단은 21-뉴클레오티드(nt) 소형 간섭 RNAs(siRNAs)를 생산한다. 이런 siRNA는 아거노트(Ago) 패밀리의 일원을 포함하는 단백질과 복합체를 형성하여 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISCs)를 생산한다. RISC는 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 위한 상동 RNA를 표적화한다.
더욱 효과적인 사일런싱 구조체는 센스 및 안티센스 구성요소를 함유하며, 헤어핀 구조 속에 다시 접히는 RNA 분자를 생산한다(Waterhouse et al., Proc Natl Acad Sci U S A 95: 13959-13964, 1998). 역방향 반복체 이식유전자의 발현에 의해 생산된 높은 dsRNA 수준은 여러 Dcl의 활성을 증진하는 것으로 가정하였다. 애기장대에서 재조합 Dcl 낙아웃의 분석이 이런 생각을 입증하였고 RNA 절단에 관여한 단백질들 중 하나로서 Dcl4를 확인하였다.
통상적인 센스,안티센스 및 이중-가닥(ds) RNA-염기 유전자 사일런싱 구조체의 한 구성요소는 전사 종결자이다. 전문이 참조로 본 발명에 포함된 WO 2006/036739는 이런 조절 요소는 유전자 단편이 2개의 반대로 배향되고 기능적으로 활성인 프로모터 사이에 위치될 때 퇴행된다는 것을 도시한다. 최종 수렴성 전사는 단일방향 '프로모터-대-터미네이터' 전사와 적어도 동일하게 효과적인 유전자 사일런싱을 일으킨다. 짧은 가변성 크기 및 비-폴리아데닐화 RNA 이외에, 터미네이터-제거 카세트는 플랭킹 프로모터 속에 도달하는 매우 긴 전사체를 생산하였다. 프로모터-유래 서열에 의한 유전자 단편의 대체는 유전자 사일런싱의 정도를 더 증가시켰다.
TAL 효과기(TALE)는 특이적 뉴클레오티드 인식과 강한 상관관계를 나타내는 매우 가변성 12번째 및 13번째 아미노산을 제외하고, 반복된 매우 보존된 33-34 아미노산 서열을 함유하는 DNA 결합 도메인의 존재를 특징으로 하는 잔토모나스 박테리아에 의해 분비된 단백질이다. 이런 단백질은 숙주 식물에서 프로모터 서열에 결합하고 식물 유전자의 발현을 활성화한다. 본 출원은 식물 속에 원하는 유전자의 표적화된 삽입을 위한 FokI 엔도뉴클레아제의 절단 도메인에 융합되는 가공된 TAL 효과기를 사용한다.
조직: 식품을 생산하는데 사용된 식물의 임의의 부분. 조직은 감자의 덩이줄기, 고구마의 뿌리 또는 옥수수 식물의 씨일 수 있다.
전사 종결자: 본 발명의 발현 DNA 구조체는 통상적으로 전사 개시 조절 영역으로부터 반대 말단에 전사 종결 영역을 가진다. 전사 종결 영역은 발현을 향상하는 mRNA의 안정성 및/또는 유전자 전사 생성물에 첨가된 폴리아데닐화 꼬리의 첨가를 위해 선택될 수 있다. 발생기 폴리펩타이드의 번역은 3개의 사슬-종결 코돈의 임의의 것이 리보솜 상의 A 위치에 들어갈 때 종결을 진행한다. 번역 종결 코돈은 UAA, UAG 및 UGA이다. 본 발명에서, 전사 종결자는 유전자 또는 더욱 바람직하게는 유전자를 나타내지 않으나 유전자간 DNA를 나타내는 서열로부터 유래된다. 예를 들어, 감자 유비퀴틴 유전자로부터의 종결자 서열이 사용될 수 있다.
전이 DNA(T-DNA): 전이 DNA는 각각 T-DNA 또는 P-DNA를 형성하기 위해 T-DNA 경계 또는 P-DNA 경계에 의해 윤곽이 나타난 DNA 단편이다. T-DNA는 경계 내에 함유된 뉴클레오티드 서열을 다른 게놈 속에 통합할 수 있는 요소로서 주지되어 있는 유전 요소이다. 이와 관련하여, T-DNA는 통상적으로 2개의 "경계" 서열에 의해 측면을 접한다. 본 발명의 원하는 폴리뉴클레오티드 및 선택가능한 마커는 T-DNA의 왼쪽 경계-유사 서열 및 오른쪽 경계-유사 서열 사이에 위치될 수 있다. T-DNA 내에 함유된 원하는 폴리뉴클레오티드 및 선택가능한 마커는 발현 즉, 원하는 폴리뉴클레오티드 또는 선택가능한 마커에 의해 암호화된 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 촉진하는 프로모터 및 터미네이터 조절 요소와 같은 다양한 다른 식물-특이적(즉, 천연) 또는 외래 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다.
식물 세포의 형질전환: 핵산이 식물 세포의 게놈 속에 안정하게 삽입되는 공정. 형질전환은 당업계에 주지된 다양한 방법을 사용하여 천연 또는 인공 조건하에서 일어날 수 있다. 형질전환은'정제 형질전환' 또는 '정확한 교배'와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환 프로토콜, 바이러스 감염, 휘스커(whisker), 전기천공, 미세주사, 폴리에틸렌 글리콜-처리, 열 충격, 리포펙션 및 입자 충돌을 포함하는 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포 속에 핵산 서열의 삽입을 위한 임의의 공지된 방법을 의존할 수 있다.
유전자이식 식물: 본 발명의 유전자이식 식물은 외인성 핵산이 안정하게 통합된 적어도 하나의 세포 게놈을 포함하는 것이다. 본 발명에 따라, 유전자이식 식물은 단지 하나의 유전적으로 변형된 세포 및 세포 게놈을 포함하는 식물이거나 일부 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 식물이거나 세포의 전부가 유전적으로 변형된 식물이다. 본 발명의 유전자이식 식물은 원하는 폴리뉴클레오티드, 즉 식물의 단지 특정 부분에서 외인성 핵산의 발현을 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 유전자이식 식물은 이의 구조의 특정 부분에서 유일한 유전적으로 변형된 세포를 함유할 수 있다.
변형체 : 본 발명에 사용된 "변형체"는 표준 또는 제공된 뉴클레오티드 또는 특정 유전자 또는 단백질의 아미노산 서열로부터 벗어난 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 용어 "아이소폼", "아이소타입" 및 "유사체"는 또한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 "변형체" 형태를 의미한다. 하나 이상의 아미노산의 첨가, 제거 또는 치환 또는 뉴클레오티드 서열의 변화에 의해 변형된 아미노산 서열은 "변형체" 서열로 생각될 수 있다. 변형체는, 예를 들어, 아이소루신에 의한 루신의 대체인 "보존성" 변화를 가질 수 있고, 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 가진다. 변형체는 예를 들어, 트립토판에 의한 글리신의 대체인 "비보존성" 변화를 가질 수 있다. 유사한 작은 변형은 아미노산 결실 또는 삽입 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 어느 아미노산 잔기가 치환, 십입 또는 결실될 수 있는지를 측정하는데 본보기는 Vector NTI Suite(InforMax, MD) 소프트웨어와 같이 당업계에 주지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 발견되었다. "변형체"는 막시젠-양도 특허에 기술된 것과 "셔플링된 유전자(shuffled gene)"를 의미할 수 있다.
비록 본 출원은 주로 표적화된 전이 DNA 삽입 기술을 예시하기 위해 TAL를 사용하지만, 메가뉴클레아제(meganuclease)(Epinat et al., Nucleic Acids Res. 31(11):2952-2962 (2003)), 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc finger nuclease (ZFN)) (Porteus et al., Science 300(5620):763 (2003); Bogdanove et al., Science 333(6051):1843-6 (2011)), 및 CRISPR-결합(Cas) 엔도뉴클레아제(Jinek et al., Science 337(6096):816-21 (2012); Mussolino et al., Nat. Methods 8(9):725-6 (2013)) 포함하는 다른 엔도뉴클레아제 기반 게놈 편집 효소가 또한 사용될 수 있다는 것이 이해된다. 이와 관련하여, 실시예 15는 본 발명에 기술된 표적화된 전이 DNA 삽입을 위한 Cas9의 성공적인 사용을 예시한다.
본 발명은 변할 수 있기 때문에 본 발명에 기술된 특정 방법, 프로토콜, 벡터 및 시약 등에 제한되지 않는다는 것을 이해한다. 또한 본 발명에 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 기술할 목적으로 사용되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다고 이해해야 한다. 본 발명과 청구항에서 사용된 대로, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 내용이 명확하게 달리 나타내지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 유전자"에 대한 언급은 하나 이상의 유전자에 대한 언급이며 당업자에게 공지된 이의 등가물 등을 포함한다. 사실은, 당업자는 식물 숙주 시스템에서 (여기 또는 이하에서 공지된) 임의의 천연 유전자를 표현하기 위해 본 발명에 기술된 방법을 사용할 수 있다.
다음 실시예들은 본 발명의 특이적이고 바람직한 실시태양의 대표로서 제공된다. 이런 실시예들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 본 발명의 취지와 범위 내에서 있으면서 여러 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다.
추가 실시태양
실시태양 1 - 다음 단계를 포함하여 원하는 폴리뉴클레오티드를 식물 게놈 속에 안정적으로 통합시키는 방법:
(A) 표적 서열을 인식하도록 설계된 TAL 또는 CRISPR 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 벡터로 식물 재료를 형질전환시키는 단계;
(B) (i) 프로모터와 작동가능하게 연결되지 않고 표적 서열과 상동인 서열을 포함하는 마커 유전자("프로모터-제거 마커 카세트"); 및 (ii) 원하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 벡터로 식물 재료를 형질전환시키는 단계; 및
(C) 원하는 폴리뉴클레오티드가 안정적으로 통합된 형질전환 식물 재료를 확인하는 단계.
실시태양 2 - 실시태양 1의 방법, 형질전환 식물 재료는 형질전환 식물에서 마커 유전자의 존재 또는 부존재를 반영하는 조건에 노출된다.
실시태양 3 - 실시태양 1-2 중 어느 하나의 방법, 마커 유전자는 제초제 저항 유전자이며 형질전환 식물 재료는 제초제에 노출된다.
실시태양 4 - 실시태양 1-3 중 어느 하나의 방법, 제초제 저항 유전자는 ALS 유전자이다.
실시태양 5 - 실시태양 1-4 중 어느 하나의 방법, 프로모터-제거 마커 카세트는 식물 게놈 속에 안정적으로 통합된다.
실시태양 6 - 다음 단계를 포함하여 식물 속에 외인성 DNA의 표적화된 삽입을 위한 방법:
(i) 분리된 식물 세포를
(A) 제 1 바이너리 벡터; 및
(B) 제 2 바이너리 벡터로 형질전환하는 단계,
제 1 바이너리 벡터는 (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) Ubi7 인트론 5'-미번역 영역의 부분 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; 및 (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 터미네이터 서열을 포함하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다; 및
제 2 바이너리 벡터는 (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 변형 TAL 효과기 또는 Cas9를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)를 암호화하는 서열을 포함하며, 변형 TAL 효과기 또는 Cas9는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계된다; 및
(ii) 원하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 식물의 성장을 촉진하는 조건하에서 분리된 식물 세포를 배양하는 단계; 벡터 주쇄 DNA는 식물 게놈에 영구적으로 삽입되지 않는다.
실시태양 7 - 실시태양 6의 방법, 변형 TAL 효과기는 (a) Fok1 엔도뉴클레아제 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기(repeat variable diresidues)를 포함하는 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) SV40 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함한다.
실시태양 8 - 실시태양 6-7 중 어느 하나의 방법, 원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트이다.
실시태양 9 - 실시태양 6-8 중 어느 하나의 방법, 제 1 바이너리 벡터는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함한다.
실시태양 10 - 외인성 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 원하는 외인성 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 내인성 Ubi7 프로모터를 게놈에 포함하는 형질전환 식물.
실시태양 11 - 실시태양 10의 형질전환 식물, 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현은 하향조절된다.
실시태양 12 - 실시태양 10-11 중 어느 하나의 형질전환 식물, 식물은 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 발현한다.
실시태양 13 - 실시태양 10-12 중 어느 하나의 형질전환 식물, 식물은 덩이줄기를 지닌 식물이다.
실시태양 14 - 실시태양 10-13 중 어느 하나의 형질전환 식물, 덩이줄기를 지닌 식물은 감자 식물이다.
실시태양 15 - 실시태양 10-14 중 어느 하나의 형질전환 식물, 식물은 덩이줄기에 잎마름병 저항, 검은 점 상처 내성, 감소된 추위 유도 스위트닝 및 감소된 아스파라긴 수준의 하나 이상을 특징으로 한 표현형을 가진다.
실시태양 16 - 실시태양 10-15 중 어느 하나의 형질전환 식물의 열-처리 제품.
실시태양 17 - 실시태양 16의 열-처리 제품, 제품은 프렌치프라이, 칩, 크리스프, 감자, 탈수 감자 또는 구운 감자이다.
실시태양 18 - 실시태양 16 또는 17의 열-처리 제품, 열-처리 제품은 동일한 종의 비-형질전환 식물의 열-처리 제품보다 낮은 수준의 아크릴아마이드를 가진다.
실시태양 19 - (a) 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함하는 원하는 서열에 결합하도록 설계된 변형 TAL 효과기.
실시태양 20 - 실시태양 19의 변형 TAL 효과기, 변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 서열과 결합하도록 설계된다.
실시태양 21 - 실시태양 19 또는 20의 변형 TAL 효과기, (a) C-말단 활성화 도메인의 촉매성 도메인은 Fok1 엔도뉴클레아제를 포함한다; (b) 표적 서열 결합 도메인은 Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기를 포함한다; 및 (c) N-말단 영역에서 핵 국소화 서열은 SV40 핵 국소화 서열이다.
실시태양 22 - (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 실시태양 19-21 중 어느 하나에 따른 변형 TAL 효과기를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)를 암호화하는 서열을 포함하는 바이너리 벡터.
실시태양 23 - (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) 부분 Ubi7 인트론 5'-미번역 인트론 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; 및 (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; (e) 터미네이터 서열; 및 (f) 왼쪽 경계를 포함하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는 프로모터-레스 카세트(promoter-less cas)를 포함하는 DNA 구조체.
실시태양 24 - 실시태양 23의 DNA 구조체, 원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트이다.
실시태양 25 - 실시태양 23 또는 24의 DNA 구조체, DNA 구조체는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함한다.
실시태양 26 - (A) 제 1 바이너리 벡터; 및 (B) 제 2 바이너리 벡터를 포함하는 식물 속에 외인성 DNA의 표적화된 삽입을 위한 키트로서,
제 1 바이너리 벡터는 (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) Ubi7 인트론 5'-미번역 영역의 부분 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; 및 (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 터미네이터 서열을 포함하는 프로모터-레스 카세트를 포함하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다; 및
제 2 바이너리 벡터는 (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 변형 TAL 효과기를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)를 암호화하는 서열을 포함하며, 변형 TAL 효과기 또는 Cas9는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계되는 키트.
실시태양 27 - 실시태양 26의 키트, 변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계되며 (a) Fok1 엔도뉴클레아제 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기를 포함하는 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) SV40 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함한다.
실시태양 28 - 실시태양 26 또는 27의 키트, 원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트이다.
실시태양 29 - 실시태양 26-28 중 어느 하나의 키트, 제 1 바이너리 벡터는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함한다.
실시태양 30 - 다음 단계를 포함하여 식물 게놈 속에 전이 DNA의 표적화된 삽입을 위한 방법:
식물 게놈의 표적화된 유전자 좌위의 5' 미번역 인트론 서열 내에 이중-가닥 DNA 손상을 선택적으로 제공하는 엔도뉴클레아제-기반 효소를 암호화하는 제 1 유전자 카세트, 및
(a) 프로모터를 포함하지 않고, (b) 원하는 유전자 서열을 포함하며, (c) 엔도뉴클레아제-기반 효소에 의해 제공된 이중-가닥 DNA 손상의 상동성 재조합-기반 회복을 매개하는 상동성 서열을 포함하는 제 2 유전자 카세트를 포함하는 하나 이상의 벡터로 식물 재료를 형질전환하는 단계,
형질전환 식물 재료는 표적화된 유전자 좌위에 선택적으로 삽입되고 5' 미번역 인트론 서열에 결합된 프로모터에 작동가능하게 연결된 원하는 유전자를 포함한다.
실시태양 31 - 실시태양 30의 방법, 엔도뉴클레아제-기반 효소는 TAL 효과기인 방법.
실시태양 32 - 실시태양 30의 방법, 엔도뉴클레아제-기반 효소는 Cas9인 방법.
실시태양 33 - 실시태양 30-32 중 어느 하나의 방법, 표적화된 유전자 좌위는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자이다.
실시태양 34 - 실시태양 30-33 중 어느 하나의 방법, 표적화된 유전자 좌위에 삽입된 원하는 유전자 서열의 발현에 의해 제공된 표현형을 기초로 형질전환 식물을 선택하는 단계를 더 포함한다.
실시태양 35 - 5'로부터 3'로, 외인성 터미네이터에 작동가능하게 연결된 외인성 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 내인성 프로모터를 포함하는 변형 식물 게놈을 포함하는 실시태양 30-34 중 어느 하나의 방법에 의해 얻은 형질전환 식물.
실시태양 36 - 프로모터-레스 유전 카세트에 연결된 오른쪽 경계 서열을 포함하는 전이 DNA를 암호화하는 실시태양 30-34 중 어느 하나의 방법에 적합한 벡터, 프로모터-레스 유전 카세트는 표적화된 유전자에 삽입되고 5' 미번역 인트론 서열과 결합된 프로모터에 작동가능하게 연결될 때 단백질 또는 RNA 전사체를 발현한다.
실시예
실시예 1: 표적화된 삽입을 위한 방법
유전자 삽입을 위한 바람직한 표적 위치는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 미번역된 5'-리더 영역에 위치된 인트론 내에 있다. 감자는 4배체이며 이런 유전자의 4개 복제물을 함유한다; 복제물은 동일하거나 거의 동일하다. Ubi7 유전자는 거의 구조성 방식에서 높은 수준으로 발현되며, 이는 Ubi7 유전자가 전사활성을 증가시키는 영역에 위치한다는 것을 암시한다. 따라서 전이 DNA 내에 위치된 서열은 효과적으로 발현될 것으로 예측된다. 또한, Ubi7 유전자의 하나의 삽입 불활성화는 어떠한 품질 또는 농격학적 문제를 일으키는 것으로 예측되지 않는데 이는 감자는 여전히 유전자의 3개 기능적으로 활성인 복제물을 함유하기 때문이다.
DNA 단편을 다음 단계에 따라 유비퀴틴-7 유전자의 인트론 서열 속에 삽입하였다:
(1) TAL 효과기는 (a) 가지 위치(일치 = CU(A/G)A(C/U)), 피리미딘-풍부(=AT-풍부) 서열, 및 인트론/엑손 접합부(일치=CAGG)를 포함하는 영역으로부터 약 25-bp 이상 상류 및 (b) 엑손/인트론 접합부(일치 = AGGT)에서 스플라이스 도너 위치로부터 약 50-bp 이상 하류인 인트론 내의 서열에 결합하도록 설계되었다.
(2) 바이너리 벡터는 식물 세포에서 TAL 효과기의 일시적 발현을 위해 생성되었다. 이런 벡터는 (a) 왼쪽 경계가 없는 단일 오른쪽 경계; (b) 강한 구조성 프로모터에 작동가능하게 연결된 2개의 TAL 효과기 유전자; 및 (c) 사이토카인 생산에 관여된 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)유전자를 위한 발현 카세트를 함유한다. 안정한 형질전환은 불리하게 선택될 수 있는데 이는 이것이 전체 벡터의 통합을 초래할 수 있고, 결과적으로 사이토카인을 과다발현하는 발육이 방해된 새싹을 생산하고 뿌리를 생산하기에 불안정하기 때문이다.
(3) 제 2 바이너리 벡터는 경계: (a) 오른쪽 경계; (b) 표적화된 TAL 결합 위치 사이의 서열로부터 시작하는, Ubi7 프로모터의 인트론의 일부; (c) Ubi7 모노머-암호화 서열; (d) 설폰일우레아, 이미다졸리논, 트라이아졸로피리미딘, 피리미딘일 옥시벤조에이트 및 설폰일아미노 카본일 트라이아졸리논; (e) 유비퀴닌-3 유전자의 터미네이터; (f) 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트; (g) 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1; 및 (h) 왼쪽 경계에 의해 윤곽이 그려진 감자로부터의 유전 요소를 포함하는 전이 DNA로 안정한 형질전환을 위해 생성하였다. 벡터 주쇄는 E. coli 및 A. tumefaciens에서 유지 및 선택에 필요한 서열과 별개로, ipt 유전자를 위한 발현 카세트를 함유한다.
(4) 2개의 바이너리 벡터를 A. tumefaciens AGL-1 균주 속에 개별적으로 주입하였다.
(5) 감자 줄기 이식편을 단계(4)로부터의 두 균주로 공동 감염시킨 후 2일 동안 공동 배양하였다.
(6) 이식편을 아그로박테리움을 죽이는 선택 물질을 함유하는 배지에 옮겼다.
(7) 형질전환 2주 후, 이식편을 ALS 억제제를 함유하는 배지에 다시 옮겼다.
(8) 다음 3달 내에 이식편으로부터 발생하는 제초제 내성 새싹을 뿌리-유도 배지에 옮기고 Ubi7 프로모터 및 변형 ALS 유전자 사이의 접합부의 존재에 대해 PCR로 분석하였다. 재생 식물의 적어도 80%는 이런 접합부를 함유하였다.
(9) PCR-양성 식물을 재생하고, 전파하고 잎마름병 저항, 덩이줄기에서 감소된 아스파라긴, 검은 점 상처 내성 및 감소된 추위 유도 스위트닝에 대해 평가하였다.
다음 실시예는 상기 방법의 양태를 기술한다.
실시예 2: 이마자목스 죽이기-곡선 논평
형질전환되지 않은 감자 세포를 죽이는데 필요한 농도를 측정하기 위해서, 레인저 러셋 마디 사이 줄기 이식편을 바이너리 벡터 pSIM1331로 형질전환하였다. 이 벡터는 (a) 경계 사이에 삽입된 선택가능한 마커 유전자 nptII에 대한 발현 카세트 및 (b) 주쇄에 ipt 유전자에 대한 발현 카세트를 함유한다. 형질전환을 매개하는데 사용된 균주는 0.2의 OD600으로 성장된 아그로박테리움 균주 LBA4404이었다. 10분 접종 기간 후, 이식편을 공동 배지에 옮기고 48시간 동안 필터 광 하에서 24℃에서 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다. 마디 사이 이식편을 항생제 티멘틴을 함유하난 이마자목스가 없는 호르몬-제거 배지(HFM)에 옮겼다. 페트리 접시를 24℃ 및 16h 광주기로 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다.
2주 후에, 마리 사리 이식편을 티멘틴과 5회 처리 농도(0, 0.5, 1.0, 1.5 & 2.0mg/l)의 식물 선택 제조체 이마자목스를 함유하는 HFM에 옮겼다. 각 처리는 3개의 복제물로 이루어지며 각 복제물은 페트리 접시 당 ~ 20 마디 사이 이식편을 함유한다. 페트리 접시를 24℃ 및 16h 광주기로 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다. 마디 사이 이식편을 2주마다 이마자목스의 개개의 처리 농도를 함유하는 새로운 HFM에 계대배양하여 새싹의 임의의 재생을 촉진하고 임의의 아그로박테리움 과다성장을 감소시켰다.
결과는 모든 이마자목스 처리 농도에서 작은 수의 마디 사이 이식편은 일부 Ipt 분열 유합조직 성장 및 1차 새싹 형성을 나타낸다는 것을 알려준다. 그러나, 와전히 성장된 정상 새싹은 이마자목스 처리 농도의 임의의 것에서 생기지 않았다. 이런 결과를 기초로, 2.0mg/l 이마자목스는 인비트로 선택을 위한 최적 농도라는 것이 측정되었다. 최적 농도는 세포 성장을 어느 정도 허용하나 완전히 성장된 새싹의 재생을 허용하지 않는 선택 물질의 농도로 정의된다.
공동-배지는 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.) 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 0.444g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 포함하였고 pH 5.7을 가졌다.
호르몬-제거 배지(HFM)는 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 300mg/l 티멘틴 및 2.0g/l 겔잔(G023; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 포함하였고 pH 5.7을 가졌다.
실시예 3: 줄기 이식편에 의한 감자 식물의 형질전환 및 재생
단일 균주 방법
(1) pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 15g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.) 및 2.0g/l 겔잔(G023; Caisson)을 가진 2.22g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 포함하는 원료 배지 상에서 성장하는 3-4주 된 인 비트로 레인저 러셋 감자 식물을 사용하였다.
(2) 잎과 마디 부분을 제거하고 마디 사이 줄기 부분을 분리하였다. 마디 사이 줄기 부분을 3-5mm 이식편 부분으로 절단하고 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories) 및 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.) 및 2.0g/l 겔잔(G023; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하는 15ml의 MS 액체 배지에 놓았다.
(3) 바이너리 벡터 TAL 효과기 카세트 및 바이너리 벡터 관심 유전자 카세트를 함유하는 단일 콜로니로부터 유래된 아그로박테리움(LBA4404)을 흔들리는 배양기에서 28℃로 루리아 브로스에 밤새 성장시켰다. 다음날 박테리아 용액을 작은 공으로 만들어 MS 액체 배지에서 0.2 OD600으로 재현탁하였다.
(4) 줄기 이식편을 실온에서 10분 동안 박테리아 용액에 배양하고 살균 여과지에 액체를 빨아들여 건조하여 과량의 박테리아를 제거하였다.
(5) 접종된 줄기 이식편을 필터광 하에서 48h 동안 퍼시벌 성장 챔버에서 선택 없이 공동 배지에 놓았다. 공동 배지는 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.) 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 0.444g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다.
(6) 줄기 이식편을 항생제(티멘틴)를 함유하고 식물 선택 없는 유합조직 유도 호르몬 배지(CIHM) 또는 호르몬-제거 배지(HFM)에 전달하였다. 페트리 접시를 24℃ 및 16h 광주기로 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다. CIHM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 2.5mg/l 제아틴 리보사이드, 0.1mg/l NAA, 300mg/l 티멘틴 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다. HFM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 300mg/l 티멘틴 및 2.0g/l 겔잔(G024; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다.
(7) 2주 후, 줄기 이식편을 항생제(티멘틴) 및 식물 선택을 함유하는 유합조직 유도 호르몬 배지(CIHM) 또는 호르몬-제거 배지(HFM)에 전달하였다. 페트리 접시를 24℃ 및 16h 광주기로 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다. CIHM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 2.5mg/l 제아틴 리보사이드, 0.1mg/l NAA, 300mg/l 티멘틴 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다. HFM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 300mg/l 티멘틴, 2.0mg/l 이마자목스 및 2.0g/l 겔잔(G024; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다.
(8) 형질전환 4주 후, 줄기 이식편을 항상제(티멘틴) 및 식물 선택을 함유하는 새싹 유도 호르몬 배지(SIHM) 또는 호르몬-제거 배지(HFM)에 전달하였다. 페트리 접시를 24℃ 및 16h 광주기로 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다. 줄기 이식편을 새로운 SIHM 또는 HFM에 2-4주마다 계대배양하여 새싹의 전체 재생을 촉진하였다. SIHM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 2.5mg/l 제아틴 리보사이드, 0.3mg/l GA3, 300mg/l 티멘틴, 2.0mg/l 이마자목스 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다. HFM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 300mg/l 티멘틴, 2.0mg/l 이마자목스 및 2.0g/l 겔잔(G024; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다.
(9) 완전히 성장된 새싹을 향후 테스팅 및 분석을 위해 증식시켰다.
실시예 4: 줄기 이식편에 의한 감자 식물의 형질 전환 및 재생
이중 균주 방법
(1) pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 15g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.) 및 2.0g/l 겔잔(G023; Caisson)을 가진 2.22g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 포함하는 원료 배지 상에서 성장하는 3-4주 된 인 비트로 레인저 러셋 감자 식물을 사용하였다.
(2) 잎과 마디 부분을 제거하고 마디 사이 줄기 부분을 분리하였다. 마디 사이 줄기 부분을 3-5mm 이식편 부분으로 절단하고 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories) 및 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.) 및 2.0g/l 겔잔(G023; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하는 15ml의 MS 액체 배지에 놓았다.
(3) 하나는 TAL 효과기 카세트를 포함하는 바이너리 벡터를 함유하고 다른 하나는 관심 유전자 카세트를 포함하는 바이너리 벡터를 함유하는 단일 콜로니로부터 각각 유래된 2개의 개별 아그로박테리움(LBA4404)을 흔들리는 배양기에서 28℃로 루리아 브로스에 밤새 성장시켰다. 다음날 박테리아 용액을 작은 공으로 만들어 MS 액체 배지에서 0.2 OD600으로 재현탁하였다.
(4) 줄기 이식편을 각 개별 박테리아 용액(공동-형질전환)으로부터 동일한 부피로 이루어진 단일 혼합 박테리아 용액에 실온에서 10분 동안 배양하고 살균 여과지에 액체를 빨아들여 건조하여 과량의 박테리아를 제거하였다.
(5) 접종된 줄기 이식편을 필터광 하에서 48h 동안 퍼시벌 성장 챔버에서 선택 없이 공동 배지에 놓았다. 공동 배지는 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.) 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 0.444g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다.
(6) 줄기 이식편을 항생제(티멘틴)를 함유하고 식물 선택 없는 유합조직 유도 호르몬 배지(CIHM) 또는 호르몬-제거 배지(HFM)에 전달하였다. 페트리 접시를 24℃ 및 16h 광주기로 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다. CIHM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 2.5mg/l 제아틴 리보사이드, 0.1mg/l NAA, 300mg/l 티멘틴 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다. HFM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 300mg/l 티멘틴 및 2.0g/l 겔잔(G024; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다.
(7) 2주 후, 줄기 이식편을 항생제(티멘틴) 및 식물 선택을 함유하는 유합조직 유도 호르몬 배지(CIHM) 또는 호르몬-제거 배지(HFM)에 전달하였다. 페트리 접시를 24℃ 및 16h 광주기로 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다. CIHM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 2.5mg/l 제아틴 리보사이드, 0.1mg/l NAA, 300mg/l 티멘틴 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다. HFM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 300mg/l 티멘틴, 2.0mg/l 이마자목스 및 2.0g/l 겔잔(G024; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다.
(8) 형질전환 4주 후, 줄기 이식편을 항상제(티멘틴) 및 식물 선택을 함유하는 새싹 유도 호르몬 배지(SIHM) 또는 호르몬-제거 배지(HFM)에 전달하였다. 페트리 접시를 24℃ 및 16h 광주기로 퍼시벌 성장 챔버에 놓았다. 줄기 이식편을 새로운 SIHM 또는 HFM에 2-4주마다 계대배양하여 새싹의 전체 재생을 촉진하였다. SIHM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 2.5mg/l 제아틴 리보사이드, 0.3mg/l GA3, 300mg/l 티멘틴, 2.0mg/l 이마자목스 및 6.0g/l 한천(S20400; Research Products International Corp.)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다. HFM은 pH 5.7의 감보그 비타민(M404; PhytoTechnology Laboratories), 30g/l 수크로오스(S24060; Research Products International Corp.), 300mg/l 티멘틴, 2.0mg/l 이마자목스 및 2.0g/l 겔잔(G024; Caisson)을 가진 4.44g/l Murashige & Skoog 변형 기본 배지를 함유하였다.
(9) 완전히 성장된 새싹을 향후 테스팅 및 분석을 위해 증식시켰다.
실시예 5: 감자 레인저, 버뱅크 및 아틀란틱 재배변종에서 표적 위치 서열
표적 영역(Ubi7 프로모터 인트론의 5' 영역)이 다른 감자 재배변종에 걸쳐 보존되는 지를 측정하기 위해서, 프라이머 쌍 HD175F1 및 HD175R1 (SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2)을 설계하고 감자 변종 레인저, 버뱅크 및 아틀란틱으로부터의 표적 영역을 증대하는데 사용하였다. 증대된 단편을 pGEMT-간편 벡터 속에 복제하고 서열로 나타내었다. 서열 결과는 표적 영역은 테스트된 모든 변종에 대해 동일하다는 것을 나타내었다. ubi7 프로모터 인트론 서열은 SEQ ID NO: 3으로 나타내어진다.
실시예 6: TAL 효과기의 설계
한 쌍의 TAL 효과기를 선택된 영역을 표적화하도록 설계하였다. 포워드 및 리버스 TALE 인식 위치는 각각 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 나열된다. TALE 스캐폴드는 Brassicaceae 병원균 X. campestris pv. Armoraciae 균주 5에서 확인된 AvrBs3 패밀리의 일원, Hax3이었다. 이런 스캐폴드에 가해진 변형은 다음을 포함하였다: (a) 원래 Hax3의 C-말단 활성화 도메인을 절단하였다; SV40 바이러스로부터의 핵 국소화 서열을 절단된 Hax3 단백질의 N 말단에 첨가하였다; (c) 코돈 최적화를 원래 Hax3 DNA 서열상에서 실행하였다; (d) 원래 11.5 반복체 가변 이중잔기(RVD)를 표적 위치에 상응하는 16.5 RVD로 대체하였다; (e) Fok1 뉴클레아제의 촉매성 도메인을 변형 Hax3 스캐폴드의 C-말단에 첨가하였다.
효과기 단백질의 조직은 도 5에 도시된다. 최종 포워드 및 리버스 TALE의 DNA 및 단백질 서열은 SEQ ID NOS: 6, 7, 8 및 9로 나열된다.
실시예 7: DNA 전이를 위한 벡터
전이 DNA는 감자-유래 유전 요소로 이루어졌고 T-DNA-유사 경계에 의해 윤곽이 그려졌다. 전이 DNA는 왼쪽 경계로부터 오른쪽 경께로 3개의 카세트를 포함하였다: (a) 잎마름병 저항 카세트; (b) 3개의 유전자: 아스파라긴 형성에 관여한 ASN1 유전자; 수크로오스의 가수분해와 관련된 산성 전화효소(INV) 유전자; 및 충격 상처시에 효소 산화 폴리페놀을 암호화하는 폴리페놀 산화효소(PPO) 유전자를 표적화하는 덩이줄기-특이적 사일런싱 카세트; 및 (c) 과다발현될 때 ALS 억제 제초제에 저항을 제공하도록 가설된 프로모터-레스 돌연변이 감자 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자(W563L AND S642I 치환을 가짐).
전이 DNA는 감자의 4개 Ubi7 유전자의 하나의 리더 내에 위치된 인트론 영역 속에 삽입되도록 설계되어서, 관련 Ubi7 프로모터는 ALS 유전자의 발현을 일으켜서 ALS 억제제-형태 제초제에 대한 저항을 제공할 수 있다.
Ubi7 모노머는 단백질 안정화에 중요한 역할을 하기 때문에, 인트론의 일부가 앞에 오는 암호화 서열은 ALS 유전자에 인 프레임 융합되었다. 바이너리 벡터 속으로 전이 DNA의 삽입이 플라스미드 pSIM2168을 생성하였다. 전이 DNA의 조직은 도 1에 예시된다. 야생형 및 돌연변이 ALS의 DNA 및 단백질 서열은 SEQ ID NOS: 10, 11, 12 및 13으로 나타내어진다. pSIM2168에서 전체 전이 DNA 서열은 SEQ ID NO: 14로 나타내어진다.
실시예 8: TAL 효과기에 대한 벡터
포워드 또는 리버스인 각 TAL 효과기는 구조성(35s 또는 FMV) 프로모터에 의해 움직여지고 터미네이터(Nos 또는 Ocs)가 이어져서 2개의 개별 식물 발현 카세트를 형성하였다. 2개의 카세트를 바이너리 벡터 속에 복제하여 도 2에 도시된 대로 pSIM2170을 형성하였다. 이런 바이너리 벡터는 단지 하나의 경계를 가지며 ipt 유전자 발현 카세트를 함유하여 효과기 유전자의 안정한 통합에 대해 선택하는 것이 가능하였다.
실시예 9: 오른쪽 경계 상류 Ubi7 인트론 5' 영역은 DNA 전이를 지원한다
주요 절단 위치로서 경계의 효과는 부분적으로 플랭킹 DNA 서열에 의존하기 때문에, 오른쪽 경계 상류 Ubi7 인트론 5' 영역을 DNA 전이를 지원하는 능력에 대해 테스트하였다. 이를 위해서, Ubi7 모노머 및 변형 ALS로부터 오른쪽 경계/인트론 서열 상류를 포함하는 DNA 단편을 바이너리 벡터 pSIM123-F 속에 복제하여 pSIM2164를 형성하였다. 벡터 pSIM123-F는 선택가능한 마커 유전자 nptII를 위한 발현 마커를 함유하나 이런 카세트를 식물 세포 속에 전이하는데 필요한 경계가 없다(도 3 참조). 그럼에도 불구하고, pSIM2164를 운반하는 아그로박테리움 균주에 의한 이식편의 감염이 양성 대조군으로서 이식편 당 동일한 수의 카나마이신 저항 새싹을 생성하였다(T-DNA 경계 내에 위치한 nptII 유전자를 운반하는 균주에 의한 감염).
감자에 이마자목스 저항을 제공하는데 돌연변이 ALS 유전자의 효과를 테스트하기 위해서, Ubi7::ALS 카세트를 운반하는 벡터(pSIM2162, 도 4 참조)를 생성하였다. 이런 벡터에 의한 형질전환이 PCR에 의해 Ubi7::ALS 카세트를 함유하는 것으로 확인된 제초제 저항 식물을 생산하였다.
실시예 10: N. benthamiana 에서 일시적 형질전환을 위한 벡터 설계
특이적으로 설계된 TALEs의 효과를 인 비보 테스트하기 위해, 표적 서열(Ubi7 인트론의 일부)을 가진 벡터를 설계하였다. 이런 벡터 pSIM2167을 효과기를 N. benthamiana속에 운반하는 벡터로 공동 형질전환하였다. 도 6에 도시된 대로, 표적 서열은 GUS 리포터 유전자의 시작 코돈으로부터 바로 하류에 위치된 포워드 및 리버스 인식 위치를 함유하였다. 두 인식 서열 사이의 정지 코돈 및 GUS 암호화 서열을 가진 인 프레임이 GUS 암호화 서열을 불활성화시켰다. TALE가 설계된 인식 위치와 결합하고 중간 서열에서 절단되는 경우, 후속 회복은 리딩 프레임을 변화시키지 않고 정지 코돈을 때때로 제거하는 것으로 예상되어, GUS 기능을 회복하였다. 이런 사건은 침투 약 4일 후, N. benthamiana 잎을 조직화학적으로 염색함으로써 시각화될 수 있다.
표적 서열 영역은 또한 TALE 매개 돌연변이를 확인하도록 PCR 증폭되고 서열로 나타낼 수 있다. 그러나, 가능한 낮은 효과의 형질전환 때문에 표적 서열의 직접 PCR 및 복제는 변형되지 않은 표적 서열을 생산할 수 있다. 따라서, 분리된 DN를 A1uI 효소로 먼저 분해하고, 2개의 TALE 인식 위치 사이에 위치된 AGCT 제한 위치를 절단한다. 증폭 후, PCR 생성물을 다시 AluI로 분해하여 하류 클로닝 및 시퀀싱 분석을 위해 돌연변이 표적 서열을 추가로 풍부하게 하였다. FMV-표적-GUS-Nos 카세트의 전체 서열은 SEQ ID NO:15로 나타내어진다. 표적 서열을 증대하는데 사용된 PCR 프라이머는 SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO: 17로 나타내어진다.
실시예 11: 아그로박테리움 형질전환 및 N. benthamiana 침투
설계된 벡터를 아그로박테리움 균주 AGL1 속에 형질전환시키고 벡터 안정성에 대해 테스트하였다. 침투 4 내지 6일 후, 침투된 조직으로부터의 잎 원반상 조직을 GUS 염색 분석법과 DNA 분리를 위해 수집하였다. 분리된 DNA를 AluI 효소로 분해하고 표적 영역 증대 및 추가 클로닝과 시퀀싱을 위한 주형으로 사용하였다. 도 7에 도시된 대로, GUS 염색은 공동 침투 조직에서 관찰되었으나(오른쪽 패널) 표적 벡터 단독에 의해 침투된 조직에서는 관찰되지 않았다(왼쪽 패널). 도 8에 도시된 추가 서열 분석은 표적 서열이 TALE에 의해 변형되었다는 것을 확인시켰다.
실시예 12: 안정한 형질변형체의 지노타이핑
프라이머 쌍 HD208 F1 및 R1을 제초제 저항 형질전환체의 유전자형을 결정하도록 설계하였다. 포워드 프라이머는 Ubi7 유전자의 프로모터 영역에 위치하고 리버스 프라이머는 ALS 암호화 영역에 위치된다. 프라이머 쌍은 표적화된 삽입 특잊거 프라이머인데 이는 단지 전이 DNA가 지정된 위치에 삽입되는 경우, 프라이머 쌍은 단편을 증대시킬 것이기 때문이다. pSIM2170 및 pSIM2168의 공동 형질전환에 의한 독립적 제초제 저항 계통의 PCR 분석은 단편을 증대하였다. 이런 단편은 복제되고 서열로 나타내었다. 도 9에 도시된 대로, 한 계통에서, TALE1, 단편은 감자 게놈 서열에 의해 플랭킹 된 부분 Ubi7 인트론, Ubi7 모노머 및 ALS 암호화 영역을 포함하는 전이 DNA 카세트의 일부를 함유하였다. 서열 블라스트는 플랭킹 된 감자 게놈은 설계된 TALE의 매우 유사한 인식 위치를 함유하는 염색체 7에 위치된 Ubi7 유사 유전자의 프로모터 영역이다. 다른 두 계통, TALE2 및 TALE3에서, 전이 DNA 카세트는 전이 DNA 카세트의 인트론 부분이 크게 결실되었다는 것을 제외하고 TALE1에서와 동일한 게놈 좌위 속에 삽입되었다. TALE2 및 TALE3 계통은 TALE2에서 Ubi7 모노머에서 9bp 결실이 있었다는 것을 제외하고 매우 유사하였다.
실시예 13: 표적화된 삽입을 위한 안정한 형질전환 계통의 특징묘사
상기한 데이터 및 결과는 의도된 DNA 단편의 표적화된 삽입이 성공적이었다는 것을 나타내었다. pSIM2170 및 pSIM2168의 공동-형질전환에 의한 제초제 저항 레인저 레셋(RR) 계통을 증가시키고 다음 테스트/분석을 위해 토양에 옮겼다. 구체적으로, 효소 폴리페놀 산화효소의 활성을 측정하고 사일런싱 및 Vnt1 카세트 모두의 복제물 수를 위해 서든 분석을 진행함으로써, 형질전환 계통을 잎마름병 면역성 검사에 대한 저항에 대해 테스트하였다. 질병 분석을 위해, 3주 동안 토양의 작은 식물을 질환 증상의 성장을 위해 P. infestans 잎마름병 균주 US8 BF6로 접종시켰다. 서든 블럿 분석을 위해, 잎 조직으로부터 분리된 3㎍ DNA를 HindIII제한 효소로 분해하고, 0.7% 아가로스 겔에 흘리고, 양으로 하전된 나일론 막에 옮기고 사일런싱 카세트에서 전화효소 단편 또는 Vnt1 발현 카세트에서 Vnt1 프로모터를 위한 Dig 표지 프로브로 잡종화하였다. 4개 계통을 확인하고 아래 표 1에 요약하였다. 이런 계통은 잎마름병 저항이었고(도 11 참조) 두 카세트에 대해 단일 복제물을 가졌다(도 12 참조). RR 대조군 계통과 비교한 대로, 계통 RR-36 및 RR-39에서 각각의 추가 밴드는 이식유전자의 단일 복제물의 존재를 나타내었다(계통 RR-26 및 RR-32에 대한 데이터는 도시되지 않는다).
표적화된 삽입을 위한 계통 특징 묘사
계통 번호 잎마름병 전화효소 복제물 No. Vnt1 복제품 No.
레인저 대조군 취약 0 0
RR-26 내성 1 1
RR-32 내성 1 1
RR-36 내성 1 1
RR-38 내성 1 1
실시예 14: 표적화된 삽입을 위한 형질전환 계통의 필드 시험 평가
pSIM2170 및 pSIM2168로 공동-형질전환된 레인저 러셋(RR) 및 스노우덴(SN)의 어린 식물을 복제된 필드 시험으로 심었다. 식물 계통을 형질 효과 및 수율에 대해 평가하였다. 스노우덴 계통 2, 15, 55 & 83(도 13 참조)뿐만 아니라 레인저 계통 26, 32, 38 & 39(도 15 참조)는 감자 덩이줄기에서 아스파라긴의 사일런싱에 대해 매우 균일하였다. 또한, 동일한 SN 계통(도 14 참조) 및 RR 계통(도 16 참조)은 폴리페놀 산화효소(PPO)의 매우 균일한 사일런싱을 가졌다. 이런 결과는 표적 위치가 사일런싱 카세트의 균일하고 높은 발현을 허용한다는 것을 나타내다. 상기 SN 및 RR 계통(도 17 참조)에 의한 수율은 야생형(WT) 및 빈 벡터 대조군(2162, 2370)과 비교할 때 현저하게 다르지 않았다. 이런 결과는 표적화된 삽입 위치는 수율 잠재력에 대해 부정적 영향을 미치지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 15: CAS9 -매개 표적화된 전이 DNA 삽입
전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 이외에, 표적 DNA 서열에 DSB를 주입할 수 있는 메가뉴클레아제(meganuclease)(Epinat et al., Nucleic Acids Res. 31(11):2952-2962 (2003)), 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc finger nuclease (ZFN)) (Porteus et al., Science 300(5620):763 (2003); Bogdanove et al., Science 333(6051):1843-6 (2011)), 및 CRISPR-결합(Cas) 엔도뉴클레아제(Jinek et al., Science 337(6096):816-21 (2012); Mussolino et al., Nat. Methods 8(9):725-6 (2013))와 같은 다른 엔도뉴클레아제 기반 게놈 편집 효소가 존재한다. 일단 DSB가 생성되면, 식물 DNA 회복 장치는 유전자 낙 아웃을 성취하기 위해 부정확하고 돌연변이를 생성하는 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 경로 또는 유전자 표적화(유전자 대체 또는 삽입)(Symington and Gautier 2011)를 성취하기 위해 상동성 재조합(HR) 경로를 통해 손상을 회복할 것이다. 따라서, TALEN 기반 DNA에서 사용된 유사한 전략은 다른 뉴클레아제 기반 게놈 편집 도구로 변형가능하다. 한 예로서, 본 발명자는 가공된 CAS9 엔도뉴클레아제는 Ubi7 인트론 DNA 표적 상에서 변형될 수 있다는 것을 입증한다.
Cas9 게놈 편집 기술은 20bp 표적 특이적 서열 및 표적을 절단하기 위해 Cas9 뉴클레아제를 안내하는 소형 RNA 스캐폴드를 함유하는 소형 키메릭 RNA를 사용한다. 구조체 pSIM4187은 2개의 발현 카세트를 함유하도록 설계되었다(도 18). 첫 번째는 CAS9 뉴클레아제 발현 카세트이다. 식물 코돈-최적화 Cas9는 구조성 FMV 프로모터에 의해 움직이며 SV40 바이러스로부터의 핵 국소화 서열은 단백질의 N 말단에 첨가되었다. 가공된 Cas9의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 SEQ ID No:18 및 SEQ ID No:19로 나열된다. 제 2 카세트는 구조성 35S 프로모터의 제어하에서 식물 세포에서 전사 후 가이드 RNA를 생산한다. 가이드 RNA의 서열은 SEQ ID No:20으로 나열된다. 설계된 벡터 pSIM4187은 아그로박테리움 균주 AGL1으로 형질전환되며 벡터 안정성에 대해 확인하였다. 그런 후에 pSIM4187을 함유하는 아그로박테리아를 사용하여 이전 실시예에서 기술된 Ubi7 인트론 표적을 함유하는 구조체인 플라스미드 pSIM2167을 함유하는 아그로박테리아로 N. Benthamina를 공동 침투시켰다. 침투 4 내지 6일 후, 침투된 조직으로부터의 잎 원반상 조직을 GUS 염색 분석법과 DNA 분리를 위해 수집하였다. 분리된 DNA를 AluI 효소로 분해하고 표적 영역 증대 및 추가 클로닝과 시퀀싱을 위한 주형으로 사용하였다. 도 19에 도시된 대로, GUS 염색은 공동 침투 조직에서 관찰되었으나(오른쪽 패널) 표적 벡터 단독에 의해 침투된 조직에서는 관찰되지 않았다(왼쪽 패널). 도 20에 도시된 추가 서열 분석은 표적 서열이 Cas9에 의해 변형되었다는 것을 확인시켰다. 변형은 설계된 TALEN에 의해 유도된 것과 매우 유사하다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
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Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> J.R. SIMPLOT COMPANY <120> TAL-MEDIATED TRANSFER DNA INSERTION <130> 058951-0440 <140> PCT/US2013/070815 <141> 2013-11-19 <150> 61/790,434 <151> 2013-03-15 <150> 61/728,466 <151> 2012-11-20 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 1 tcctaatttt ccccaccaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 2 aacagccgga gaaactcaaa 20 <210> 3 <211> 568 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <400> 3 gttagaaatc ttctctattt ttggtttttg tctgtttaga ttctcgaatt agctaatcag 60 gtgctgttat agcccttaat tttgagtttt ttttcggttg tcttgatgga aaaggcctaa 120 aatttgagtt tttttacgtt ggtttgatgg aaaaggccta caattggagt tttccccgtt 180 gttttgatga aaaagcccct agtttgagat tttttttctg tcgattcgat tctaaaggtt 240 taaaattaga gtttttacat ttgtttgatg aaaaaggcct taaatttgag tttttccggt 300 tgatttgatg aaaaagccct agaatttgtg ttttttcgtc ggtttgattc tgaaggccta 360 aaatttgagt ttctccggct gttttgatga aaaagcccta aatttgagtt tctccggctg 420 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285 Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala 290 295 300 Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 305 310 315 320 Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 325 330 335 Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 340 345 350 Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 355 360 365 Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile 370 375 380 Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 385 390 395 400 Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val 405 410 415 Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 420 425 430 Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln 435 440 445 Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 450 455 460 Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 465 470 475 480 Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu 485 490 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tctaatttcg ttttacgcgt agtactgcct 840 gaattttctg actttcaacg tttgttattc atgcttgaaa acgaaatacc agctaacaaa 900 agatgaatta ttgtgtttac aagacttggg ccgttgactc ttactttccc ttcctcatcc 960 tcacatttag aaaaaagaaa tttaacgaaa aattaaagga gatggctgaa attcttctca 1020 cagcagtcat caataaatca atagaaatag ctggaaatgt actctttcaa gaaggtacgc 1080 gtttatattg gttgaaagag gacatcgatt ggctccagag agaaatgaga cacattcgat 1140 catatgtaga caatgcaaag gcaaaggaag ttggaggcga ttcaagggtg aaaaacttat 1200 taaaagatat tcaacaactg gcaggtgatg tggaggatct attagatgag tttcttccaa 1260 aaattcaaca atccaataag ttcatttgtt gccttaagac ggtttctttt gccgatgagt 1320 ttgctatgga gattgagaag ataaaaagaa gagttgctga tattgaccgt gtaaggacaa 1380 cttacagcat cacagataca agtaacaata atgatgattg cattccattg gaccggagaa 1440 gattgttcct tcatgctgat gaaacagagg tcatcggtct ggaagatgac ttcaatacac 1500 tacaagccaa attacttgat catgatttgc cttatggagt tgtttcaata gttggcatgc 1560 ccggtttggg aaaaacaact cttgccaaga aactttatag gcatgtctgt catcaatttg 1620 agtgttcggg actggtctat gtttcacaac 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Leu Asp Phe Leu Lys Ser 690 695 700 Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser 705 710 715 720 Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly 725 730 735 Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile 740 745 750 Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys 755 760 765 Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg 770 775 780 Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met 785 790 795 800 Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys 805 810 815 Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu 820 825 830 Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp 835 840 845 Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser 850 855 860 Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp 865 870 875 880 Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys 885 890 895 Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr 900 905 910 Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser 915 920 925 Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg 930 935 940 Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr 945 950 955 960 Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr 965 970 975 Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr 980 985 990 Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu 995 1000 1005 Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu 1010 1015 1020 Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg 1025 1030 1035 Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala 1040 1045 1050 Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu 1055 1060 1065 Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu 1070 1075 1080 Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp 1085 1090 1095 Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile 1100 1105 1110 Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser 1115 1120 1125 Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys 1130 1135 1140 Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val 1145 1150 1155 Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser 1160 1165 1170 Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met 1175 1180 1185 Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1190 1195 1200 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro 1205 1210 1215 Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu 1220 1225 1230 Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro 1235 1240 1245 Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val 1265 1270 1275 Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser 1280 1285 1290 Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys 1295 1300 1305 Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu 1310 1315 1320 Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly 1325 1330 1335 Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys 1340 1345 1350 Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His 1355 1360 1365 Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln 1370 1375 1380 Leu Gly Gly Asp 1385 <210> 20 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 20 gattctcgaa ttagctaatc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 103 <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Central repeat domain polypeptide <400> 21 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly <210> 22 <211> 1018 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 22 gtttacagta ccatatatcc tgtcaattct cgaattagct aatcaggtgc tgttatagcc 60 cttaattttg agtttttttt cggttgtctt gatggaaaag gcctaaaatt tgagtttttt 120 tacgttggtt tgatggaaaa ggcctacaat tggagttttc cccgttgttt tgatgaaaaa 180 gcccctagtt tgagattttt tttctgtcga ttcgattcta aaggtttaaa attagagttt 240 ttacatttgt ttgatgaaaa aggccttaaa tttgagtttt tccggttgat ttgatgaaaa 300 agccctagaa tttgtgtttt ttcgtcggtt tgattctgaa ggcctaaaat ttgagtttct 360 ccggctgttt tgatgaaaaa gccctaaatt tgagtttctc cggctgtttt gatgaaaaag 420 ccctaaattt gagttttttc cccgtgtttt agattgtttg gttttaattc tcgaatcagc 480 taatcaggga gtgtgaaaag ccctaaattt gagttttttt cgttgttctg attgttgttt 540 ttatgaattt gcagatgcag atctttgtga aaactctcac cggaaagact atcaccctag 600 aggtggaaag ttctgataca atcgacaacg ttaaggctaa gatccaggat aaggaaggaa 660 ttcccccgga tcagcaaagg cttatcttcg ccggaaagca gttggaggac ggacgtactc 720 tagctgatta caacatccag aaggagtcta ccctccattt ggtgctccgt ctacgtggag 780 gtatggcggc tgctgcctca ccatctccat gtttctccaa aaccctacct ccatcttcct 840 ccaaatcttc caccattctt cctagatcta ccttcccttt ccacaatcac cctcaaaaag 900 cctcacccct tcatctcacc cacacccatc atcatcgtcg tggtttcgcc gtttccaatg 960 tcgtcatatc cactaccacc cataacgacg tttctgaacc tgaaacattc gtttcccg 1018 <210> 23 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 atgttaaggg ctataacagc acctgattag ctaattcgag aatctaaaca gacaaaaacc 60 aaagtc 66 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat tagctaatca ggtgctgtta tagcccttaa 60 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat tagctaatca ggtgctgtta tagcccttaa 60 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat tagttaatca ggtgctgtta tagcccttaa 60 <210> 27 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat aatcaggtgc tgttatagcc cttaa 55 <210> 28 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 tttggttttt gtctgtttag attctcgaaa tcaggtgctg ttatagccct taa 53 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 tttggttttt gtctgtttag attctcgaac tgttatagcc cttaa 45 <210> 30 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat caggtgctgt tatagccctt aa 52 <210> 31 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat taatcaggtg ctgttatagc ccttaa 56 <210> 32 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 tttggttttt gtctgcttag attctcgaat taggtgctgt tatagccctt aa 52 <210> 33 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat tcaggtgctg ttatagccct taa 53 <210> 34 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat tatcaggtgc tgttatagcc cttaa 55 <210> 35 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat taatcaggtg ctgttatagc ccttaa 56 <210> 36 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat tataatcagg tgctgttata gcccttaa 58 <210> 37 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 37 tttggttttt gtctgtttag attctcgaat tagcctaatc aggtgctgtt atagccctta 60 a 61 <210> 38 <211> 1450 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 38 ctgatttcta ttataatttc tattaattgc cttcaaattt ctctttcaag gttagaaatc 60 ttctctattt tttggttttt gtctgtttag attctcgaat tagctaatca ggtgctgtta 120 aagccctaaa atttgagttt tttttccgtc gaattgatgc taaaggctta aaattagagt 180 tttttcgtcg gtttgactct gaaggcctaa aatttggggt tttccgggtg atttgatgat 240 aaagccctag aatttgagtt tttttatttg tcggtttgat gaaaaaggcc ttaaatttaa 300 tttttttccc ggttgatttg atgaaaaagc cctagaattt gtgttttttc gtcggtttga 360 ttctaaaggc ctaaaatttg agtttttccg gttgttttga tgaaaaagcc ctaaaatttg 420 agttttttcc ccgtgtttta gattgtttgg ttttaattct tgaatcagat aatcagggag 480 tgtgaaaagc cctaaaattt gagttttttt cgttgttctg attgttgttt ttatgaattt 540 gattctcgaa ttagctaatc aggtgctgtt atagccctta attttgagtt ttttttcggt 600 tgtcttgatg gaaaaggcct aaaatttgag tttttttacg ttggtttgat ggaaaaggcc 660 tacaattgga gttttccccg ttgttttgat gaaaaagccc ctagtttgag attttttttc 720 tgtcgattcg attctaaagg tttaaaatta gagtttttac atttgtttga tgaaaaaggc 780 cttaaatttg agtttttccg gttgatttga tgaaaaagcc ctagaatttg tgtttttcgt 840 cggtttgatt ctgaaggttt gattctgaag gcctaaaatt tgagtttctc cggctgtttt 900 gatgaaaaag ccctaaattt gagtttctcc ggctgttttg atgaaaaagc cctaaatttg 960 agttttttcc ccgtgtttta gattgtttgg ttttaattct cgaatcagct aatcagggag 1020 tgtgaaaagc cctaaatttg agtttttttc gttgttctga ttgttgtttt tatgaatttg 1080 cagatgcaga tctttgtgaa aactctcacc ggaaagacta tcaccctaga ggtggaaagt 1140 tctgatacaa tcgacaacgt taaggctaag atccaggata aggaaggaat tcccccggat 1200 cagcaaaggc ttatcttcgc cggaaagcag ttggaggacg gacgtactct agctgattac 1260 aacatccaga aggagtctac cctccatttg gtgctccgtc tacgtggagg tatggcggct 1320 gctgcctcac catctccatg tttctccaaa accctacctc catcttcctc caaatcttcc 1380 accattcttc ctagatctac cttccctttc cacaatcacc ctcaaaaagc ctcacccctt 1440 catctcaccc 1450 <210> 39 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 39 ttttcatctt ctatctgatt tctattataa tttctattaa ttgccttcaa atttctcttt 60 caaggttaga aatcttctct attttttggt ttttgtctgt ttagattctc gaattagcta 120 atcaggtgct gttaaagccc taaaatttga gttttttttc cgccgaattg atgctaaagg 180 cttaaaatta gggttttttc gtcggtttga ctctgaaggc ctaaaatttg gggttttccg 240 ggtgatttga tgataaagcc ctagaatttg agttttttta tttgtcggtt tgatgaaaaa 300 ggccttaaat ttaatttttt tcccggttga tttgatgaaa aagccctaga atttgtgttt 360 tttcgtcggt ttgattctaa aggcctaaaa tttgagtttt tccggttgtt ttgatgaaaa 420 agccctaaaa tttgagtttt ttccccgtgt tttagattgt ttggttttaa ttcttgaatc 480 agataatcag ggagtgtgaa aagccctaaa tttgagtttt tttcgttgtt ctgattgttg 540 tttttatgaa tttgcagatg cagatctttg tgaaaactct caccggaaag actatcaccc 600 tagaggtgga aacaatcgac aacgttaagg ctaagatcca ggataaggaa ggaattcccc 660 cggatcagca aaggcttatc ttcgccggaa agcagttgga ggacggacgt actctagctg 720 attacaacat ccagaaggag tctaccctcc atttggtgct ccgtctacgt ggaggtatgg 780 cggctgctgc ctcaccatct ccatgcttct ccaaaaccct acctccatct tcctccaaat 840 cttccaccat tcttcctaga tctaccttcc ctttccacaa tcaccctcaa a 891 <210> 40 <211> 900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 40 ttttcatctt ctatctgatt tctattataa tttctattaa ttgccttcaa atttctcttt 60 caaggttaga aatcttctct attttttggt ttttgtctgt ttagattctc gaattagcta 120 atcaggtgct gttaaagccc taaaatttga gttttttttc cgccgaattg atgctaaagg 180 cttaaaatta gggttttttc gtcggtttga ctctgaaggc ctaaaatttg gggttttccg 240 ggtgatttga tgataaagcc ctagaatttg agttttttta tttgtcggtt tgatgaaaaa 300 ggccttaaat ttaatttttt tcccggttga tttgatgaaa aagccctaga atttgtgttt 360 tttcgtcggt ttgattctaa aggcctaaaa tttgagtttt tccggttgtt ttgatgaaaa 420 agccctaaaa tttgagtttt ttccccgtgt tttagattgt ttggttttaa ttcttgaatc 480 agataatcag ggagtgtgaa aagccctaaa tttgagtttt tttcgttgtt ctgattgttg 540 tttttatgaa tttgcagatg cagatctttg tgaaaactct caccggaaag actatcaccc 600 tagaggtgga aagttctgat acaatcgaca acgttaaggc taagatccag gataaggaag 660 gaattccccc ggatcagcaa aggcttatct tcgccggaaa gcagttggag gacggacgta 720 ctctagctga ttacaacatc cagaaggagt ctaccctcca tttggtgctc cgtctacgtg 780 gaggtatggc ggctgctgcc tcaccatctc catgcttctc caaaacccta cctccatctt 840 cctccaaatc ttccaccatt cttcctagat ctaccttccc tttccacaat caccctcaaa 900 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 41 gattctcgaa ttagctaatc gttttagag 29 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 42 caccgagtcg gtgctttttt t 21 <210> 43 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 43 ttaagggcta taacagcacc tgattagcta attcgagaat ctaaacagac aaaaaccaaa 60 <210> 44 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 44 ttaagggcta taacagcacc tgattaattc gagaatctaa acagacaaaa accaaa 56 <210> 45 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 45 ttaagggcta taacagcacc tgataattcg agaatctaaa cagacaaaaa ccaaa 55 <210> 46 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 46 ttaagggcta taacagcacc tgatttcgag aatctaaaca gacaaaaacc aaa 53 <210> 47 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 47 ttaaggggca caacagcacc tgattcgaga atctaaacag acaaaaacca aa 52 <210> 48 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 48 ttaagggcta taacagcacc tgattcgaga atctaaacag acaaaaacca aa 52 <210> 49 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 49 ttaagggcta taacagcatc gagaatctaa acagacaaaa accaaa 46 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 50 ttaagggcta taacagcacc tgattagata attcgagaat ctaaacagac aaaaaccaaa 60 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 51 ttaagggaaa gaacagcaca gcactagata attcgagaat ctaaacagac aaaaaccaaa 60

Claims (29)

  1. 원하는 폴리뉴클레오티드를 식물 게놈 속에 안정적으로 통합시키는 방법으로서
    (A) 표적 서열을 인식하도록 설계된 TAL 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 벡터로 식물 재료를 형질전환시키는 단계;
    (B) (i) 프로모터와 작동가능하게 연결되지 않고 표적 서열과 상동인 서열을 포함하는 마커 유전자("프로모터-제거 마커 카세트"); 및 (ii) 원하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 벡터로 식물 재료를 형질전환시키는 단계; 및
    (C) 원하는 폴리뉴클레오티드가 안정적으로 통합된 형질전환 식물 재료를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    형질전환 식물 재료는 형질전환 식물에서 마커 유전자의 존재 또는 부존재를 반영하는 조건에 노출되는 것인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    마커 유전자는 제초제 저항 유전자이며 형질전환 식물 재료는 제초제에 노출되는 것인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    제초제 저항 유전자는 ALS 유전자인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    프로모터-제거 마커 카세트는 식물 게놈 속에 안정적으로 통합되는 것인 방법.
  6. 식물 속에 외인성 DNA의 표적화된 삽입을 위한 방법으로서
    (i) 분리된 식물 세포를
    (A) 제 1 바이너리 벡터; 및 (B) 제 2 바이너리 벡터로 형질전환하는 단계;
    제 1 바이너리 벡터는 (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) Ubi7 인트론 5'-미번역 영역의 부분 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; 및 (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 터미네이터 서열을 포함하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다; 및
    제 2 바이너리 벡터는 (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 변형 TAL 효과기를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)를 암호화하는 서열을 포함하며, 변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계된다; 및
    (ii) 원하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 식물의 성장을 촉진하는 조건하에서 분리된 식물 세포를 배양하는 단계; 벡터 주쇄 DNA는 식물 게놈에 영구적으로 삽입되지 않는다
    를 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    변형 TAL 효과기는 (a) Fok1 엔도뉴클레아제 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기(repeat variable diresidues)를 포함하는 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) SV40 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함하는 것인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    제 1 바이너리 벡터는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 외인성 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 원하는 외인성 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 내인성 Ubi7 프로모터를 게놈에 포함하는 형질전환 식물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현은 하향조절되는 것인 형질전환 식물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    식물은 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 발현하는 것인 형질전환 식물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    식물은 덩이줄기를 지닌 식물인 형질전환 식물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    덩이줄기를 지닌 식물은 감자 식물인 형질전환 식물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    식물은 덩이줄기에 잎마름병 저항, 검은 점 상처 내성, 감소된 추위 유도 스위트닝 및 감소된 아스파라긴 수준의 하나 이상을 특징으로 한 표현형을 갖는 것인 형질전환 식물.
  16. 제 15 항의 형질전환 식물의 열-처리 제품.
  17. 제 16 항에 있어서,
    제품은 프렌치프라이, 칩, 크리스프, 감자, 탈수 감자 또는 구운 감자인 열-처리 제품.
  18. 제 17 항에 있어서,
    열-처리 제품은 동일한 종의 비-형질전환 식물의 열-처리 제품보다 낮은 수준의 아크릴아마이드를 갖는 열-처리 제품.
  19. (a) 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함하는 원하는 서열에 결합하도록 설계된 변형 TAL 효과기.
  20. 제 19 항에 있어서,
    변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 서열과 결합하도록 설계되는 것인 변형 TAL 효과기.
  21. 제 20 항에 있어서,
    (a) C-말단 활성화 도메인의 촉매성 도메인은 Fok1 엔도뉴클레아제를 포함한다; (b) 표적 서열 결합 도메인은 Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기를 포함한다; 및 (c) N-말단 영역에서 핵 국소화 서열은 SV40 핵 국소화 서열인 변형 TAL 효과기.
  22. (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 제 16 항에 따른 변형 TAL 효과기를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)를 암호화하는 서열을 포함하는 바이너리 벡터.
  23. (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) 부분 Ubi7 인트론 5'-미번역 인트론 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; 및 (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; (e) 터미네이터 서열; 및 (f) 왼쪽 경계를 포함하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는 프로모터-레스 카세트를 포함하는 DNA 구조체.
  24. 제 23 항에 있어서,
    원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트인 DNA 구조체.
  25. 제 24 항에 있어서,
    DNA 구조체는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함하는 것인 DNA 구조체.
  26. (A) 제 1 바이너리 벡터; 및 (B) 제 2 바이너리 벡터를 포함하는 식물 속에 외인성 DNA의 표적화된 삽입을 위한 키트로서,
    제 1 바이너리 벡터는 (a) (b)에 연결된 오른쪽 경계 서열; (b) Ubi7 인트론 5'-미번역 영역의 부분 서열; (c) 돌연변이 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자에 융합된 Ubi7 모노머-암호화 서열; 및 (d) 원하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 터미네이터 서열을 포함하는 프로모터-레스 카세트를 포함하며, 원하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는다; 및
    제 2 바이너리 벡터는 (a) 오른쪽 경계; (b) 포워드 발현 카세트 및 리버스 발현 카세트, 각각은 강한 구조성 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결된 변형 TAL 효과기를 포함한다; 및 (c) 아이소펜텐일 트랜스페라제(ipt)를 암호화하는 서열을 포함하며, 변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계되는 키트.
  27. 제 26 항에 있어서,
    변형 TAL 효과기는 감자의 유비퀴틴-7(Ubi7) 유전자의 인트론 내에 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계되며 (a) Fok1 엔도뉴클레아제 촉매성 도메인을 포함하는 절단된 C-말단 활성화 도메인; (b) Ubi7 5'-미번역 인트론 서열에 상응하는 16.5 반복체 가변 이중잔기를 포함하는 코돈-최적화 표적 서열 결합 도메인; 및 (c) SV40 핵 국소화 서열을 포함하는 N-말단 영역을 포함하는 것인 키트.
  28. 제 27 항에 있어서,
    원하는 뉴클레오티드 서열은 아스파라긴 합성효소 1(Asn1), 폴리페놀 산화효소(Ppo) 및 공포 전화효소(Inv) 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 표적화하는 사일런싱 카세트인 키트.
  29. 제 28 항에 있어서,
    제 1 바이너리 벡터는 이의 천연 프로모터 및 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 잎마름병 저항 유전자 Vnt1를 더 포함하는 것인 키트.
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