KR102000471B1 - 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents
국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102000471B1 KR102000471B1 KR1020180070436A KR20180070436A KR102000471B1 KR 102000471 B1 KR102000471 B1 KR 102000471B1 KR 1020180070436 A KR1020180070436 A KR 1020180070436A KR 20180070436 A KR20180070436 A KR 20180070436A KR 102000471 B1 KR102000471 B1 KR 102000471B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- promoter
- chrysanthemum
- plant
- ethylene
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
본 발명은 국화(chrysanthemum) 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 목적유전자를 식물체 전 조직에서 발현을 유도하는 국화 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다.
대표적인 쌍떡잎식물용 전신-발현 유도 프로모터인 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터를 대체하여, 본 발명에 따른 국화(chrysanthemum) 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 국화 등의 쌍떡잎 작물에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 프로모터를 이용하여, 목적유전자를 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현시켜 식물체를 생명공학적 방법으로 개량시키고자 할 때 유용하게 이용할 수 있다.
대표적인 쌍떡잎식물용 전신-발현 유도 프로모터인 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터를 대체하여, 본 발명에 따른 국화(chrysanthemum) 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 국화 등의 쌍떡잎 작물에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 프로모터를 이용하여, 목적유전자를 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현시켜 식물체를 생명공학적 방법으로 개량시키고자 할 때 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 국화(chrysanthemum) 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 목적유전자를 식물체 전 조직에서 발현을 유도하는 국화 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다.
식물에서 외래 유전자를 전신-발현 또는 조직 특이적인 발현을 할 수 있는 형질전환 목적을 달성하는 데 사용되는 공지된 프로모터들은 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.
첫째, 전신-발현을 유도하는 프로모터를 들 수 있다. 이러한 식물 전신-발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있다. 또한 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 유전자 프로모터 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근에는 벼 시토크롬 C 유전자(OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용되고 있다(한국등록특허 제10-0429335호). 이들은 주로 식물형질전환 기본 운반체 내에서 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 내재된다. 따라서 연구적인 측면에서는 목적 유전자의 식물체 내의 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.
둘째, 종자에 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이 종자 특이적 프로모터로는 벼의 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들이 대표적인 예이며 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 데 많이 사용되고 있다. 또한 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도하여 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에서 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 등의 사례를 들 수 있고, 특히 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도는 이미 특허출원(한국등록특허 제10-0685520호)된 바 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용된다.
셋째, 뿌리에 특이적으로 발현하는 프로모터를 들 수 있다. 이 뿌리 특이적 프로모터는 아직 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적인 발현이 확인된 바 있으며, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하는 것이 보고되었다. 이외에도 이들 프로모터는 당근과 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도하는 것이 확인되어 특허 등록(한국등록특허 제10-0604186호, 제10-0604191호)된 바도 있었다. 이들 프로모터는 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용이 기대될 수 있다.
넷째, 잎 등의 기타 조직에 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이 조직 특이 프로모터에는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래의 괴경 특이 발현 유도 파타틴(patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터, 그리고 배추꽃에서 화분 특이적 발현이 확인된 배추 유래 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 포함된다.
이와 같이 다양한 목적에 따라 다양한 식물 유래의 프로모터들이 식물체의 각 조직에서 발견되어 보고되어 왔으며, 현재까지도 계속 개발이 진행되고 있는 중이다. 그러나 이미 상용화 되었거나 식물 연구자들 사이에 범용되는 프로모터의 종류는 대부분 상기에서 언급된 사례에 속하며, 개발자의 의도에 따라서 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 목적 유전자를 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터, 구체적으로 담배 및 국화와 같은 식물체의 전 조직에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 국화에서 목적 유전자를 식물체 전 조직에서 발현시킬 수 있는 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 분리함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 식물체의 전 조직에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법 및 상기 프로모터와 벡터를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물체의 전 조직에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법 및 상기 프로모터와 벡터를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.
대표적인 쌍떡잎식물용 전신-발현 유도 프로모터인 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터를 대체하여, 본 발명에 따른 국화(chrysanthemum) 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 국화 등의 쌍떡잎 작물에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 프로모터를 이용하여, 목적유전자를 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현시켜 식물체를 생명공학적 방법으로 개량시키고자 할 때 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 상시 발현성 유전자인 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 국화 기관별 발현 양상을 나타낸 전기영동 사진이다.
도 2는 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터 염기서열(2,059 bp)을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터 영역의 시스-작용 조절 요소(cis-acting elements)를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 포함하는 식물 형질전환용 발현 벡터를 모식적으로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터가 삽입된 형질전환 담배의 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터가 삽입된 형질전환 국화의 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터 염기서열(2,059 bp)을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터 영역의 시스-작용 조절 요소(cis-acting elements)를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 포함하는 식물 형질전환용 발현 벡터를 모식적으로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터가 삽입된 형질전환 담배의 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터가 삽입된 형질전환 국화의 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 국화(chrysanthemum) 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적유전자를 식물체 전 조직에서 발현을 유도하는 국화 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 국화(chrysanthemum) 유래의 전신 발현(constitutive expression) 프로모터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프로모터"란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.
본 발명의 프로모터는 식물체 내에서 전신적으로 발현을 유도하는 프로모터로, 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 있어 "상동성"이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 발명의 전신 발현 프로모터는 식물체의 전 조직에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 종자 등을 포함하는 전 조직 또는 기관에서 균등하게 목적 단백질을 발현시킬 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 담배 또는 국화를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질이 담배의 잎을 비롯하여 국화의 잎, 줄기를 포함하는 식물체 전 조직에서 강하게 발현됨을 확인할 수 있었다(도 5 및 도 6).
본 발명의 전신 발현 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "재조합 발현 벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 본 발명의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결(operably linked)되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는, 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 전신 발현 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드일 수 있고, 식물 바이러스 벡터일 수 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수도 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 내에서 전신적으로 발현되기를 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현되는 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 목적 단백질은 항생제 저항성 단백질, 제초제 저항성 단백질, 바이러스 저항성 단백질, 해충 저항성 단백질, 대사 관련 단백질, 발광 단백질, GFP(green fluorescence protein), GUS(β-glucuronidase), GAL(β-galactosidase) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택할 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당될 수 있다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, G418, 카나마이신(kanamycin), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(cholramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 Gus가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 Gus 유전자의 상류 부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 pCAMBIA1390-Cmethylene-responsive transcription factor 1-like promoter를 제조하였다(실시예 2-1 및 도 4).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 프로모터 도입에 의해 목적 유전자가 식물체 내에서 전신적으로(constitutively), 구체적으로 잎, 줄기, 뿌리, 종자 등을 포함하는 식물체의 전 조직 또는 기관에서 균등하게 발현되는 것을 의미한다.
본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "형질전환체"란 본 발명의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 의미한다.
상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 사용하였다(실시예 2-1).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환된 식물체를 제공한다.
상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물체는 이 기술분야의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 이 기술분야에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물체를 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물체는 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 미생물 형질전환체인, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 담배 또는 국화에 접종하여 형질전환 담배 또는 형질전환 국화 식물체를 제작하였다(실시예 2).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현시키는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 형질전환 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 국화, 콩, 감자, 팥, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 장미, 거베라, 카네이션 또는 레드클로버일 수 있으며, 보다 바람직하게는 국화일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터가 삽입된 담배 또는 국화의 전 조직을 채취하여 GUS 염색법으로 분석한 결과, 담배의 잎을 비롯하여 국화의 잎, 줄기를 포함하는 식물체 전 조직에서 GUS 발현이 강하게 유도되었으므로, 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터가 식물체 전 조직에서 목적 단백질을 상시 발현시킬 수 있음을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 식물체 전 조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 식물체의 전 조직에서의 목적 단백질 전신 발현용 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene) 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 종자 등을 포함하는 전 조직 또는 기관에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 목적 단백질은 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다.
본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 전 부위, 예를 들면 종자, 잎, 뿌리 또는 줄기 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 전 조직에서 발현시킴으로써 종자, 잎 또는 줄기와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 국화 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(
Cm
ethylene
-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터 분리 및 염기서열 분석
화훼작물에서 유전자의 안정적인 발현을 유도하기 위하여, 국화 유래의 프로모터를 이용하고자 국화로부터 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(TBIU198821, Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 분리하였다.
먼저, 스탠다드 국화(standard chrysanthemum) 및 스프레이 국화(spray chrysanthemum) 품종으로부터 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 기관별 발현 양상을 조사한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 잎(leaf), 버드 믹스(bud mix), 뿌리(root), 잎자루(petiole), 줄기(stem)에서 상시 발현하고 있음을 확인하였다.
이후, 상기 상시 발현성 유전자인 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자의 프로모터를 분리하였다. 구체적으로, 국화의 게놈 DNA(genomic DNA)를 기본으로 하여 GenomeWalker™ DNA walking kit(clontech)를 이용하여 분리하였다. 국화의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene) 염기서열은 국립농업과학원 유전체과 국화 전사체 데이터베이스(database, DB)에서 찾은 유전자의 서열(TBIU198821)을 참고하여 하기 표 1의 GSP(gene specific primer)를 제작하였고 분리한 프로모터 부위는 pGEM®-T Easy Vector Systems(Promega)에 삽입하여 전체 염기서열 및 시스-작용 조절 요소(cis-acting elements)를 확인하였다(도 2 및 도 3).
상기 확인한 국화 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터 염기서열은 서열번호 1로 표시하였다(도 2).
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 프라이머 방향 | 서열(5'→3') |
| 2 | cmethylene-responsive transcription factor 1-like-F | 정방향 | 5'-AGCACCCTTGTTCCATGTTTATCA-3' |
| 3 | cmethylene-responsive transcription factor 1-like-R | 역방향 | 5'-ATTTTTAGCCGGGTCCCTTATTTC-3' |
실시예
2: 식물체 형질전환용 벡터(vector) 및 형질전환체 제작
실시예
2-1: 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(
Cm
ethylene
-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터를 포함하는 벡터 제작 및 아그로박테리움(
Agrobacterium
tumefaciens
) 형질전환체 제작
상기 실시예 1에서 분리한 국화 유래의 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene)의 프로모터 염기서열의 제한효소 부위를 이용하여, 변경한(modified) pCAMBIA1390 T-DNA 벡터와 연결하여 리포터(repoter) 유전자 GUS가 융합된 재조합 발현 벡터를 구축하였다(도 4). 이후 상기 재조합 발현 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 형질전환하여 사용하였다.
실시예 2-2: 담배 형질전환체 제작
담배 형질전환은 Horsh 등(A Simple and general method for transferring genes into plants, 1985)의 방법을 변형한 리프 디스크(leaf disk) 방법으로, 상기 실시예 2-1의 아그로박테리움 균주 LBA4404를 이용하여, 담배(Nicotiana tabacum, Xanthi)로의 형질전환을 실시하였다.
구체적으로, 기내에서 키운 담배잎을 약 5㎜정도 사각형이 되게 자른 후 암조건하에서 전배양(preculture) 배지에서 2일간 배양하였다.
한편, 상기 실시예 2-1에서 제작한 벡터를 포함한 아그로박테리움을 액체 배지에서 2~3일간 전배양 한 다음 약 1.5㎖ 정도를 100 ㎖의 배지에 다시 접종하여 OD600 값이 1.0 정도가 되게 배양하여 수확하였다. 원심분리로 침전시킨 펠렛(pellet)을 공동배양배지에 희석한 후 전배양한 식물체에 약 10분간 침지한 다음 물기를 제거하고 캘러스 유기배지에서 이틀간 암배양하였다. 이틀 후 공동배양한 잎조각을 항생제 배지로 옮겨 7일간 아그로박테리움을 제거하고 슈트(shoot) 선발 배지로 옮겨 형질전환 슈트를 선발하였다. 전 과정에 걸쳐 배지에 사용한 호르몬은 NAA 2㎎/ℓ, BA 0.5㎎/ℓ로 사용하였으며, 선발 항생제는 카나마이신(kanamycin) 50㎎/ℓ, 세포탁심(cefotaxime)은 250㎎/ℓ로 사용하였다. 선발한 슈트는 뿌리(root) 배지에 옳겨 발근 시킨 뒤 3~4장의 잎을 채취하여 Exgene Plant SV mini kit(GeneAll)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였고 PCR premix(iMOD)로 PCR을 수행하여 유전자 삽입 담배 형질전환체를 선발하였다.
실시예 2-3: 국화 형질전환체 제작
국화 형질전환 방법은 상기 실시예 2-2의 담배 형질전환체 제작과 거의 유사한 방법을 따라서 수행하였다. 상기 실시예 2-1의 아그로박테리움 균주 LBA4404를 이용하여, 국화(화이트윙, WW)로의 형질전환을 실시하였다.
구체적으로, 배지 조성은 전 과정에 걸쳐 IAA 0.5㎎/ℓ, BA 0.5㎎/ℓ로 사용하였으며 공동배양 이후 세포탁심(cefotaxime)은 400㎎/ℓ로 사용하였고 슈트(shoot) 선발에 사용한 카나마이신(kanamycin)은 15㎎/ℓ로 하였다. 국화 형질전환에서는 슈트 선발 후 뿌리(root) 배지에서 2차 선발을 수행하였다. 이때, 사용한 항생제 농도는 20㎎/ℓ로 하였다. 발근한 슈트를 우선으로 잎 3~4매를 가지고 상기 실시예 2-2의 담배 형질전환체 제작에서의 방법과 동일하게 게놈 DNA를 추출하고 PCR을 수행하여 국화 형질전환체를 선발하였다.
실시예
3: 형질전환 담배 및 형질전환 국화에서 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(
Cm
ethylene
-responsive transcription factor 1-like gene) 프로모터의 GUS 염색에 의한 발현 분석
국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene) 프로모터의 조직 발현 검정을 위해, 상기 실시예 2-2에서 제작한 형질전환 담배의 경우 T0에서 종자를 받은 후 T1 종자를 항생제 포함 배지에서 선발 후 재증식하여 각각 5개 식물체 전체를 GUS 용액에 담가서 GUS 발현을 확인하였다.
한편, 상기 실시예 2-3에서 제작한 형질전환 국화의 경우는 형질전환체로 확인된 개체들을 기내 증식용으로 증식 후 남은 부분, 구체적으로 잎, 줄기, 마디 뿌리 부분을 GUS 용액에 담가서 GUS 발현을 확인하였다.
상기 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene) 프로모터의 발현을 형질전환 담배 및 형질전환 국화에서 분석한 결과, 하기 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 형질전환 담배의 잎을 비롯하여 형질전환 국화의 잎, 줄기를 포함하는 식물체 전 조직에서 강한 GUS 발현이 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 국화 유래 에틸렌-반응성 전사인자 1-유사 유전자(Cmethylene-responsive transcription factor 1-like gene) 프로모터가 전신 발현 프로모터임을 확인할 수 있었다.
<110> Republic of Korea
<120> Constitutive promoter derived from chrysanthemum and use thereof
<130> P18R12C0605
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2059
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cmethylene-responsive transcription factor 1-like promoter
<400> 1
gggctggtgt gctatagttt tgatacatta accacgtgaa ataacttcta ttttctatga 60
taacttttct tttgcctttt gtttttctct tcaagttgac cacttgcaag ttgcaacccc 120
cagccaacga agcttccatc agaggcccta catcattttt acatcaaagt ccctaaactt 180
tggttgtttt cttgattgtg cttttaattt gggttatttg gtacaaatga accttcactt 240
aaatatcgtt tcttaatttg tcattgcaag tcgaaccgtt tagatctaaa tattgtaaac 300
ataaaccaaa agtaaacccg aactctcaca tttcaccacg aacttgactt ggtgccttgc 360
ctcatcaatg atgtatctag gggtatcagg tttatcgagt cgggttgaat cgggtttttt 420
attatgaaaa aatgacccac aacccgaccc gataagtaat caggttcggg ttgtgttatg 480
tcggattggg tgattagggt taatcgtgtt gcttagtctt ttgtacccat ataagataca 540
atatgtttaa tgttaaatga tatggttgaa ctagattttc tggccggttt acaagtctcc 600
caattgggaa tgccattact atgacgagta acttggacaa cttacttggt gttacctatt 660
tatctggttt tggttggagt gtgggtactc ataatgcaat tgtacatgac gaaatcacat 720
gtatagacta tagttaatca cttcatcaat cattagaacc agttcttact ccgtgttaat 780
cactttaaca atttggttca tcaagttgca acacattaac tagtggaata tgttatatta 840
tcaatgaagc ttagctagga agtgatatcg attaaaggat aaaagtaaat cgtttagatt 900
ggttataact tatactaggt attttataaa ctagaagtag aaaaacatat gtattttata 960
gcttatactg agtgtataga cagtatatca atttcaaatt acaattatat acgtttaaac 1020
aaagaacaga tttcatagat tagtaataat ttttcaaaaa tcttgtatta agttaatggc 1080
gctaacaatt tacatgagtc ttctgtccca acagtatatg taagatgctt aacaactaag 1140
ttgttatggg atgtagtaat tgtaaacaat attaggctta taaaacttta gggaaaggat 1200
ttccggaaaa taaatttaga gtcttatcgg gttgacctga tgaaaaaaat aattcaacta 1260
taacccgact cgataattat gtcaggttat cgggttcagg tcacacaacc caataagttt 1320
tttaaactcg attcgaccca acctgttaag ccttatcagg ttcgggttcg ggttgacccg 1380
accctactga cacccctaga tgtatcacat cggccaagtg actatttcaa aacataaatg 1440
atccctgaat atgatagata atatgcctaa acactaacat aatgaccgat ctcaatactt 1500
agtgttttgg taattcgtat tcttaactta ttcgagccgg acctgatagt gtctaaaacc 1560
ataagtctgt gggtacttta aaatatttaa gcttcaaatt tgtcgattcc acttatcgat 1620
tgttaaaatc atctaataca agtgaataaa acccttttct cgcaaatttc gccttcctcc 1680
tgaccttatc taagacagta atgaaaaaac aaaataaaac atcaaccaaa acagataatg 1740
actacaaact taaggaccat atgtgttaac ggaaacaatg agaagatcaa aatgtccata 1800
tatacatttg ttgaggacta atagtttatt taatcattaa attaccgtat gaccccacga 1860
gctcataacc tcacaccact atataaaccc ctccattatc ctcttccaaa tattcgtctt 1920
tcacagtctt ctctcattac ctcattttct ctcaaatatt tcaaactagt aagttttaaa 1980
aatcctcaaa agccacttaa aatgatgcaa acagagtttt ttccaacatt ttctcaagca 2040
ctagctttag tagccttgt 2059
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cmethylene-responsive transcription factor 1-like-F
<400> 2
agcacccttg ttccatgttt atca 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cmethylene-responsive transcription factor 1-like-R
<400> 3
atttttagcc gggtccctta tttc 24
Claims (9)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 국화(chrysanthemum) 유래의 전신 발현(constitutive expression) 프로모터.
- 제1항의 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제2항의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
- 제3항에 있어서, 상기 형질전환체는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것인 형질전환체.
- 제2항에 따른 벡터 또는 제3항에 따른 형질전환체로 형질전환된 형질전환 식물체.
- 제5항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 쌍자엽 식물체인 것인 형질전환 식물체.
- 제6항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물체는 국화인 것인 형질전환 식물체.
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현시키는 형질전환 식물체의 제조 방법.
- 제2항의 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물체 전 조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180070436A KR102000471B1 (ko) | 2018-06-19 | 2018-06-19 | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180070436A KR102000471B1 (ko) | 2018-06-19 | 2018-06-19 | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102000471B1 true KR102000471B1 (ko) | 2019-07-16 |
Family
ID=67474346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180070436A KR102000471B1 (ko) | 2018-06-19 | 2018-06-19 | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102000471B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210142400A (ko) * | 2020-05-18 | 2021-11-25 | 대한민국(농촌진흥청장) | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100429335B1 (ko) | 2001-10-08 | 2004-04-29 | 주식회사 그린진 바이오텍 | 단자엽 식물의 형질전환을 위한 프로모터 |
| KR100604186B1 (ko) | 2004-08-25 | 2006-07-25 | 고려대학교 산학협력단 | 고구마 유래 식물 저장뿌리용 고효율 발현 프로모터염기서열, 이를 포함하는 식물체 고효율 일시적 발현벡터및 상기 발현벡터를 이용하여 식물의 저장뿌리에일시적으로 발현시키는 방법 |
| KR100604191B1 (ko) | 2004-09-06 | 2006-07-25 | 고려대학교 산학협력단 | 고구마 유래 식물체 당 유도성 프로모터 염기서열 및 이를포함하는 식물체 당 유도성 발현 벡터 |
| KR100685520B1 (ko) | 2006-01-04 | 2007-03-09 | 대한민국 | 종자 특이적 프로모터, 이의 증폭용 프라이머, 이를포함하는 발현벡터 및 형질전환세포 |
| KR101557043B1 (ko) * | 2014-06-24 | 2015-10-12 | 대한민국 | 국화 유래의 항시 발현용 프로모터 |
-
2018
- 2018-06-19 KR KR1020180070436A patent/KR102000471B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100429335B1 (ko) | 2001-10-08 | 2004-04-29 | 주식회사 그린진 바이오텍 | 단자엽 식물의 형질전환을 위한 프로모터 |
| KR100604186B1 (ko) | 2004-08-25 | 2006-07-25 | 고려대학교 산학협력단 | 고구마 유래 식물 저장뿌리용 고효율 발현 프로모터염기서열, 이를 포함하는 식물체 고효율 일시적 발현벡터및 상기 발현벡터를 이용하여 식물의 저장뿌리에일시적으로 발현시키는 방법 |
| KR100604191B1 (ko) | 2004-09-06 | 2006-07-25 | 고려대학교 산학협력단 | 고구마 유래 식물체 당 유도성 프로모터 염기서열 및 이를포함하는 식물체 당 유도성 발현 벡터 |
| KR100685520B1 (ko) | 2006-01-04 | 2007-03-09 | 대한민국 | 종자 특이적 프로모터, 이의 증폭용 프라이머, 이를포함하는 발현벡터 및 형질전환세포 |
| KR101557043B1 (ko) * | 2014-06-24 | 2015-10-12 | 대한민국 | 국화 유래의 항시 발현용 프로모터 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210142400A (ko) * | 2020-05-18 | 2021-11-25 | 대한민국(농촌진흥청장) | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 |
| KR102390866B1 (ko) | 2020-05-18 | 2022-04-26 | 대한민국 | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20150085846A (ko) | Tal-매개 전이 DNA 삽입방법 | |
| WO2008112044A1 (en) | Tranformation of immature soybean seeds through organogenesis | |
| CA2253292A1 (en) | Transgenic plants with enhanced sulfur amino acid content | |
| WO2009011725A1 (en) | Method for transforming soybean (glycine max) | |
| JP2002518055A (ja) | 植物選択マーカーおよび植物形質転換方法 | |
| KR102000471B1 (ko) | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR101922429B1 (ko) | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR101557043B1 (ko) | 국화 유래의 항시 발현용 프로모터 | |
| US5723757A (en) | Plant promoters specific for sink organ expression of genes | |
| KR20110092148A (ko) | 식물의 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｈｇ１ 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 | |
| WO2009064118A2 (en) | Polypeptide inducing dwarfism of plants, polynucleotide coding the polypeptide, and those use | |
| KR102390866B1 (ko) | 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR102265780B1 (ko) | 식물체의 개화기 조절 efg1 유전자 및 이의 용도 | |
| KR102145626B1 (ko) | 식물 종자의 배 특이적 ＯｓＮＦＹ１６ 프로모터 및 이의 용도 | |
| EP1432808B1 (en) | Regulation of translation of heterologously expressed genes | |
| KR101677067B1 (ko) | 벼 유래 종자 특이적 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR20100107263A (ko) | 환경 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR100859988B1 (ko) | 지상부 특이적 프로모터 및 이를 이용한 목적 단백질의지상부 특이적 발현 방법 | |
| KR101437606B1 (ko) | 배추 유래 프로모터 및 상기 프로모터로 형질 전환된 식물 | |
| KR101494191B1 (ko) | 공변세포 특이적 발현 프로모터 | |
| KR102081963B1 (ko) | 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR102396572B1 (ko) | 벼 유래 OsRP2 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR101825960B1 (ko) | 벼 유래 뿌리 특이적 프로모터 및 이의 용도 | |
| CN111448206B (zh) | 源自番薯的IbOr-R96H变异体及其用途 | |
| KR101680279B1 (ko) | 뿌리 특이적 ＢｒＣＬＰ２８ 프로모터 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GRNT | Written decision to grant |