KR20210142400A - 국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 국화(chrysanthemum) 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 목적 유전자를 식물체 전 조직에서 발현을 유도하는 국화 유래 constitutive promoter(ConP) 10 유전자의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

Description

국화 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도{Constitutive promoter derived from chrysanthemum and use thereof}

본 발명은 국화(chrysanthemum) 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 목적 유전자를 식물체 전 조직에서 발현을 유도하는 국화 유래 constitutive promoter(ConP) 10 유전자의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

식물에서 외래 유전자를 전신-발현(constitutive expression) 또는 조직 특이적인 발현을 할 수 있는 형질전환 목적을 달성하는 데 사용되는 공지된 프로모터들은 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.

첫째, 전신-발현을 유도하는 프로모터를 들 수 있다. 이러한 식물 전신-발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있다. 또한 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 유전자 프로모터 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근에는 벼 시토크롬 C 유전자(OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용되고 있다(한국등록특허 제10-0429335호). 이들은 주로 식물 형질전환 기본 운반체 내에서 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 내재된다. 따라서 연구적인 측면에서는 목적 유전자의 식물체 내의 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

둘째, 종자에 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이 종자 특이적 프로모터로는 벼의 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들이 대표적인 예이며 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 데 많이 사용되고 있다. 또한 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도하여 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에서 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 등의 사례를 들 수 있고, 특히, 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도는 이미 특허출원(한국등록특허 제10-0685520호)된 바 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용된다.

셋째, 뿌리에 특이적으로 발현하는 프로모터를 들 수 있다. 이 뿌리 특이적 프로모터는 아직 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적인 발현이 확인된 바 있으며, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하는 것이 보고되었다. 이외에도 이들 프로모터는 당근과 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도하는 것이 확인되어 특허등록(한국등록특허 제10-0604186호, 제10-0604191호)된 바도 있었다. 이들 프로모터는 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용이 기대될 수 있다.

넷째, 잎 등의 기타 조직에 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이 조직 특이 프로모터에는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래의 괴경 특이 발현 유도 파타틴(patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터, 그리고 배추꽃에서 화분 특이적 발현이 확인된 배추 유래 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 포함된다.

이와 같이 다양한 목적에 따라 다양한 식물 유래의 프로모터들이 식물체의 각 조직에서 발견되어 보고되어 왔으며, 현재까지도 계속 개발이 진행되고 있는 중이다. 그러나 이미 상용화 되었거나 식물 연구자들 사이에 범용되는 프로모터의 종류는 대부분 상기에서 언급된 사례에 속하며, 개발자의 의도에 따라서 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 목적 유전자를 식물체 내에서 전신적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터, 구체적으로 국화와 같은 식물체의 전 조직에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 국화에서 목적 유전자를 식물체 전 조직에서 발현시킬 수 있는 constitutive promoter(ConP) 10 유전자의 프로모터를 분리함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

KR 10-1163051 B1 (2004.04.29. 공고) KR 10-0685520 B1 (2007.03.09. 공고) KR 10-0604186 B1 (2006.07.25. 공고) KR 10-0604191 B1 (2006.07.25. 공고)

본 발명의 목적은 식물체의 전 조직에서 안정적으로 발현하는 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법 및 상기 프로모터와 벡터를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성히기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물체의 전 조직에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법 및 상기 프로모터와 벡터를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.

대표적인 쌍자엽 전신 발현 프로모터로 많이 사용되는 CaMV35S 프로모터를 대체하여, 본 발명에 따른 국화 유래 Constitutiven promoter(ConP) 10 유전자의 프로모터를 국화 등의 쌍떡잎 작물에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 프로모터를 이용하여, 목적 유전자를 식물 체 내에서 전신적으로 발현시켜 식물체를 개량시키고자 할 때 유용하게 이용될 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 전신 발현성 유전자인 ConP 10 유전자의 국화 기관별 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 전신 발현 유전자인 ConP 10 유전자의 프로모터 염기서열(554 bp)을 나타낸 것이다.
도 3 A는 본 발명의 전신 발현 유전자인 ConP 10 유전자의 프로모터를 포함하는 식물 형진전환용 발현 벡터를 모식적으로 나타낸 것이고, 도 3B는 본 발명의 전신 발현 유전자인 ConP 10 유전자의 프로모터를 포함하는 형질전환된 애기장대를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 전신 발현 유전자인 ConP 10 유전자의 프로모터가 삽입된 형질전환 애기장대의 조직별 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 것이다(1~9: ConP10 프로모터가 도입된 애기장대 형질전환체; Col-0: 대조구(비 형질전환) 애기장대; CaMV35S: 전신발현 프로모터가 도입된 애기장대 형질전환체).
도 5는 본 발명의 전신 발현 유전자인 ConP 10 유전자의 프로모터가 삽입된 형질전환 애기장대의 조직별 GUS 유전자 발현 결과를 나타낸 것이다(1~9: ConP10 프로모터가 도입된 애기장대 형질전환체; WT: 대조구(비 형질전환) Col-0 애기장대; GUS: 전신발현 프로모터CaMV35S가 도입된 애기장대 형질전환체).

본 발명은 국화(chrysanthemum) 유래 전신 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적유전자를 식물체 전 조직에서 발현을 유도하는 국화 유래 Constitutive promoter(ConP) 10의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 국화(chrysanthemum) 유래 전신 발현 프로모터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "프로모터"란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉, 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

본 발명의 프로모터는 식물체 내에서 전신적으로 발현을 유도하는 프로모터로, 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

본 발명에 있어 "상동성"이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 발명의 전신 발현 프로모터는 식물체의 전 조직에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 식물체의 잎, 병엽, 줄기, 뿌리, 및 종자(꽃발달시기별) 등을 포함하는 전 조직 또는 기관에서 균등하게 목적 단백질을 발현시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 국화 유래 Constitutive promoter(ConP) 10의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 애기장대를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질이 애기장대 잎을 비롯하여 줄기를 포함하는 식물체의 전 조직에서 강하게 발현됨을 확인할 수 있었다.

본 발명의 전신 발현 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 국화 유래 Constitutive promoter(ConP) 10 유전자의 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "재조합 발현 벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 본 발명의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결(operatively linked)되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는, 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼 레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 전신 발현 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드일 수 있고, 식물 바이러스 벡터일 수 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수도 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 내에서 전신적으로 발현되기를 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현되는 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 목적 단백질은 항생제 저항성 단백질, 제초제 저항성 단백질, 바이러스 저항성 단백질, 해충 저항성 단백질, 대사 관련 단백질, 발광 단백질, GFP(green fluorescence protein), GUS(β-glucuronidase), GAL(β-galactosidase) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택할 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당될 수 있다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, G418, 카나마이신(kanamycin), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(cholramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 Gus가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 국화 유래 ConP10의 프로모터를 Gus 유전자의 상류 부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 pBGWFS7-ConP10를 제조하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 국화 유래 ConP10의 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 프로모터 도입에 의해 목적 유전자가 식물체 내에서 전신적으로, 구체적으로 잎, 줄기, 뿌리, 종자 등을 포함하는 식물체의 전 조직 또는 기관에서 균등하게 발현되는 것을 의미한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "형질전환체"란 본 발명의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 의미한다.

상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움(Agrobacterium) GV3101을 사용하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 국화 유래 ConP10의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환된 식물체를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물체는 이 기술분야의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 이 기술분야에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물체를 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물체는 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 국화 유래 ConP10의 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 미생물 형질전환체인, 아그로박테리움 (Agrobacterium) GV3101을 애기장대에 접종하여 형질전환 애기장대 형질전환 식물체를 제작하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로 발현시키는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 형질전환 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 국화, 콩, 감자, 팥, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 장미, 거베라, 카네이션 또는 레드클로버일 수 있으며, 보다 바람직하게는 국화일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 국화 유래 ConP10의 프로모터가 삽입된 애기장대의 전 조직을 채취하여 GUS 염색법으로 분석한 결과, 애기장대의 잎을 비롯하여 줄기를 포함하는 식물체 전 조직에서 GUS 발현이 강하게 유도되었으므로, 국화 유래 ConP10의 프로모터가 식물체 전 조직에서 목적 단백질을 전신 발현시킬 수 있음을 확인하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 식물체 전 조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 식물체의 전 조직에서의 목적 단백질 전신 발현용 국화 유래 ConP10 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 종자 등을 포함하는 전 조직 또는 기관에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 목적 단백질은 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다.

본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 전 부위, 예를 들면 종자, 잎, 뿌리 또는 줄기 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 전 조직에서 발현시킴으로써 종자, 잎 또는 줄기와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 국화 유래의 ConP10의 프로모터 분리 및 염기서열 분석

화훼작물에서 유전자의 안정적인 발현을 유도하기 위하여, 국화 유래의 프로모터를 이용하고자 국화로부터 ConP10의 프로모터를 분리하였다.

먼저, 스탠다드 국화(standard chrysanthemum) 품종으로부터 ConP10의 기관별 발현 양상을 조사한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 잎, 뿌리, 줄기, 꽃(꽃발달시기별) 에서 전신 발현하고 있음을 확인하였다.

이후, 상기 전신 발현성 유전자인 ConP10 유전자의 프로모터를 분리하였다.

구체적으로, 하기의 표 1의 GSP(gene specific primer)를 이용하여 PCR을 수행하였다.

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 방향	서열(5'→3')
2	ConP10-F	정방향	5'-GGTACAGCCGCATGTGAGGTGGG-3'
3	ConP10-R	역방향	5'-GTGAATGAAGAAGCCATTTCGATTG-3'

증폭된 산물의 크기는 554 bp이며, new PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE)을 이용하여 프로모터 서열을 분석하였다. 기존에 보고된 프로모터 영역에 유전자발현을 증진하는 enhancer element (-446 to -441) 1개, SV40 core enhancer (-337 to -329) 1개, 보존된 enhancer elements EEC (-317 to -311, -244 to -238, -154 to -148) 3개, 유전자의 발현을 높게 나타내는 GATA box (-185 to -182, -39 to -36) 2개가 존재하는 것으로 확인되었다.

상기 확인한 국화 유래의 ConP10의 프로모터 염기서열은 서열번호 1로 표시하였다(도 2).

실시예 2: 식물체 형질전환용 벡터 및 형질전환체 제작

식물체 형질전환용 벡터를 제작하기위 하여 ConP10 프로모터 영역을 증폭하여 infusion을 통해서 pUC57mini 운반체에 도입하였다. ConP10 프로모터 영역은 infusion을 위해서 ConP10-F (pUC57mini) (5'-AAAGCAGGCTGAATTCGGTACAGCCGCATGT-3')와 ConP10-R (pUC57mini) (5'-AAAGCTGGGTGGATCCGTGAATGAAGAAGCCATT-3')를 이용하여 PCR을 증폭한 후 QIAgen gel extraction kit를 이용하여 elution을 수행하였다. pUC57mini 벡터는 EcoRI과 BamHI 효소 처리 후 전기영동후, QIAgen gel extraction kit를 이용하여 elution을 수행하였다. pUC57mini 벡터와 PCR 산물을 infusion 후, 대장균 DH5α에 형질전환하여 pUC57mini 운반체에 ConP10 프로모터가 도입된 콜로니를 선발하였다. Plasmid DNA를 분리한후, 염기서열 분석을 실시하였다.

식물발현 운반체인 pBGWFS7 에 ConP10 프로모터를 도입하기 위해서 LR반응을 진행한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하여 ConP10 프로모터가 도입된 운반체를 선발하였고, 염기서열을 분석하였다. 최종적으로 ConP10 프로모터가 도입된 식물 발현용 운반체를 pBGWFS7_ConP10으로 명명하였다(도 3). Agrobacterium GV3101에 freeze-thaw 방법으로 pBGWFS7_ConP10 운반체를 형질전환하였다. 선발된 pBGWFS7_ConP10의 아그로박테리움 배양액을 floral-dip 방법으로 애기장대에 형질전환을 수행하였다. 선발된 형질전환체는 0.3% 바스타를 처리하여 형질전환체를 선발하였다 (도 3B).

실험예 1: 애기장대 형질전환의 조직별 GUS 염색 결과

상기 ConP10 프로모터가 도입된 형질전환된 애기장대의 조직별 GUS 염색을 비교분석하였다. 음성대조구로 형질전환을 실시하지 않은 애기장대를 사용하였으며, 양성대조구로는 전신 발현 프로모터인 CaMV35S 프로모터가 도입된 애기장대를 사용하였다.

조직화학적 염색은 GUS 염색 용액(X-gluc (cyclohexyl ammonium salt) 20 mM, NaH₂PO₄H_2O 100 mM, NaEDTA 10 mM, Triton X-100 0.1%, pH 7.5)에 침지하여 37°C에서 24 시간 침지한 후, GUS 염색용액을 제거하고 70 % 에탄올에 처리하여 엽록소를 제거한 후 실체 현미경으로 관찰하였다.

도 4를 참조하면, ConP10 프로모터가 도입된 형질전환된 애기장대 형질전환체에서 GUS 염색을 확인한 결과 형질전환체 모두 잎에서 강한 GUS 염색이 확인되었다. 또한, 음성대조구는 예상대로 잎에서 GUS 염색이 관찰되지 않았으며, 양성대조구의 경우 잎에서 GUS 염색이 확인되었다. ConP10 프로모터가 도입된 형질전환된 애기장대 형질전환체는 꽃화경(꽃줄기), 꽃등에서 GUS 염색이 확인되었다. ConP10 프로모터는 잎과 꽃의 모든 조직에서 GUS 염색을 나타내므로 작물 개량을 위해 목적 유전자를 다양한 조직에서 발현하고자 할 때 이용될 수 있는 것을 확인하였다.

실험예 2: 애기장대 형질전환의 조직별 GUS 유전자 발현 검정

잎 조직의 GUS 유전자의 발현을 확인하고자 애기장대의 샘플을 채취하고 FavorPrep™ Plant Total RNA Mini Kit(Favorgen, Pingtung, Taiwan)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 total RNA를 이용하여 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하여 실시간 유전자발현분석(qPCR)에 사용하였다. GUS의 특이적인 프라이머(GUS-Forward, 5'-TGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGC-3'(서열번호 4); GUS-Reverse, 5'-CCATACCTGTTCACCGACG -3'(서열번호 5))를 사용하여 qPCR을 수행하였으며, 유전자발현을 표준화하기 위해서 애기장대 EF1α (elongation factor 1 alpha)의 특이적인 프라이머(EF1α-Forward, 5'-GCCACACCTCTCACATTG-3'(서열번호 6); EF1α Reverse 5'-TACCAGCGTCACCATTCT-3'(서열번호 7))를 사용하여 qPCR을 수행하였다. qPCR은 Bio-Rad CFX96 Detection System(Bio-Rad Laboratories)을 사용하였고, 95°C에서 10분간 변성 후, 95°C에서 15초, 55°C에서 30초를 1회로, 총 40회 수행하였다.

도 5를 참조하면, 음성대조구 (WT)에서는 예상대로 GUS 유전자가 거의 검출되지 않았으며, 양성대조구 (GUS)에서는 GUS 유전자의 높은 발현이 확인되었다.

ConP10 프로모터가 도입된 형질전환식물체에서 잎 조직에서 GUS 유전자의 발현은 양성대조구와 비슷한 수준으로 높은 발현을 나타내었다.

이러한 결과는 본 발명에서 확보한 ConP10 프로모터가 도입유전자의 발현을 잎조직에서 높은 수준으로 유지하는 것을 의미하는 것으로, 이는 국화와 같은 작물에서 유전자의 발현을 유도할 때 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Constitutive promoter derived from chrysanthemum and use thereof <130> DP20200044 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 554 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ConP10 promoter <400> 1 ggtacagccg catgtgaggt gggggaccca cagctgggag agagagggag gacaaaaggg 60 gacaaaagcc tgacagtcta aggggctagg gggtagagcc cgtattaata gtatgacctg 120 gctaaaaata gagcgaagat cccttctttg aattgggatc tttggtgtaa atttgtaatt 180 atgtaattgg ccttgtggtg ttgtgccgtc ccgttttgtg gattggcggt ttctaatgaa 240 attcatcttt caaaaaaaaa acttagttag tcatttataa gtcattaaat tgagtcaagt 300 tgatcttctc gaattccatg taaaaaaagt gagatggtgt gccgattaat tttagtaaaa 360 agtgagttag atagtcgggc ccctgattga ctgatgggcg gagttcccaa agtaagttga 420 acctaattcc acctacaatc tcaaataaaa agagcacaca cctataacta aatacacaca 480 ctctccttat ttcacattca tcgcccccga ttatttatca aatcaaatcc aatcgaaatg 540 gcttcttcat tcac 554 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ConP10-forward primer <400> 2 ggtacagccg catgtgaggt ggg 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ConP10-reverse primer <400> 3 gtgaatgaag aagccatttc gattg 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gus-forward primer <400> 4 tggagtgaag agtatcagtg tgc 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gus-reverse primer <400> 5 ccatacctgt tcaccgacg 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1alpha-forward primer <400> 6 gccacacctc tcacattg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1alpha-Reverse primer <400> 7 taccagcgtc accattct 18

Claims (9)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 국화(Chrysanthemum) 유래 전신 발현(constitutive expression) 프로모터.
2. 제1항의 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
3. 제2항의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
4. 제3항에 있어서,
   상기 형질전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)인 것인 형질전환체.
5. 제2항에 따른 벡터 또는 제3항에 따른 형질전환체로 형질전환된 식물체.
6. 제5항에 있어서,
   상기 형질전환 식물체는 쌍자엽 식물체인 것인 형질전환 식물체.
7. 제6항에 있어서,
   상기 쌍자엽 식물체는 국화인 것인 형질전환 식물체.
8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 식물체 내에서 전신 발현시키는 형질전환 식물체의 제조 방법.
9. 제2항의 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물체 전 조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.

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