KR100862599B1

KR100862599B1 - 고구마 유래 식물 조직배양세포 고발현 프로모터 및 이를포함하는 식물 조직배양세포 고발현 벡터

Info

Publication number: KR100862599B1
Application number: KR1020070081320A
Authority: KR
Inventors: 허경혜; 김영화; 김보미
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2007-08-13
Filing date: 2007-08-13
Publication date: 2008-10-09
Also published as: WO2009022845A2; WO2009022845A3; US20100100986A1; US8232453B2

Abstract

본 발명은 식물세포가 조직배양상태에서 고발현을 유도할 수 있는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 고구마 유래 작은 GTP 결합 단백질(samll GTP binding protein) Ran GTPase 유전자의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 식물 조직배양세포 고발현 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 식물세포에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의한 조직배양세포 고발현 프로모터를 갖는 형질전환 현탁배양세포주들은 보편적으로 사용하는 CaMV 35S 프로모터보다 평균 15배 높은 활성을 갖는다. 따라서 이 프로모터는 식물조직배양세포를 이용하여 유용 의료, 산업용 단백질을 대량 생산하고자 하는 형질전환 세포주의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

프로모터, small GTP binding protein Ran, Ran GTPase, 고구마, 스트레스, 조직배양세포

Description

고구마 유래 식물 조직배양세포 고발현 프로모터 및 이를 포함하는 식물 조직배양세포 고발현 벡터{Promoter for the high level expression in plant-cell culture and vector using the same}

본 발명은 고구마 유래 식물체 작은 GTP 결합 단백질(small GTP binding protein) Ran유전자의 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 식물체 및 조직배양 세포내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 식물세포가 조직배양상태에서 고발현을 유도할 수 있는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 고구마 유래 Ran GTPase 유전자 (ibRan1)의 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 식물세포 발현 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 식물체 및 조직배양세포내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다.

최근 식물 생명공학 기술의 발달은 형질전환식물 생산을 가능하게 하였으며 이 형질전환식물 생산기술은 두 가지 측면에서 이용되고 있다. 첫째는 기존의 육종 방법으로는 불가능하였던 새로운 기능을 가진 고부가가치 식물체를 개발하는 것이고, 둘째는 식물을 바이오리액터(bioreactor)로서 이용하는 것, 즉 형질전환 식물이나 형질전환 식물 세포주를 이용하여 동물 혹은 식물 유래의 유용 단백질을 생산 하는 것을 가능하게 하였다 (Doran PM., 2000 Biochem. Engineering 11:199-204).

유용단백질을 형질전환 식물 세포주에서 생산하면, 동물 세포 배양에 비해 1) 동물 바이러스 감염의 우려가 없어서 안정성이 확보되며, 2) 식물세포주의 배양 비용이 동물세포배양의 1/30, 3) 미생물 배양의 1/3로서 훨씬 저렴한 장점이 있다. 이에 형질전환식물 세포주를 바이오리액터(bioreactor)로 사용하여 유용 단백질을 생산하고자 하는 시도가 국내외로 급증되고 있다. 하지만 이런 경우 도입유전자의 단백질이 경제성이 있는 수준 이상으로 생산이 되어야 실용적인 측면에서 가치가 있다. 형질전환 식물체 또는 세포주에서 생산한 단백질의 양이 Phytase (14.4 %)와 Xylanase (4.1%) 같은 성공적인 경우를 제외하고는 그 생산 양이 전체 용해성 단백질 양의 0.001 - 0.4%에 불과하기 때문에 경제적인 측면에서 실용성이 떨어지고 있다. 식물세포배양 기술을 통한 또 다른 성공사례는 Shikonin (일본 미쯔이석유화학)과 Texol (삼양제넥스)과 같은 2차대사산물의 생산이었으나, 이는 자연적으로 식물체가 생산하는 물질의 생산 능력 제고에 지나지 않았다. 최근 이들 생리활성물질에 관여하는 유전자들이 밝혀지기 시작함에 따라 이 대사경로에 관련된 유전자의 발현을 증강시키기 위한 원천기술개발의 필요성이 부각되고 있다 (Goossen et., 2003 PNAS 100:8595-8600).

따라서 외래 유전자의 발현양을 조절하는 프로모터에 관한 연구는 동식물유래 유용단백질 생산 및 2차대사산물의 대사경로에 관련된 유전자의 발현을 현탁배양세포를 통해 증강시키기 위해 중요한 사안이며 이러한 조건을 충족할 다양한 프로모터의 연구를 통한 개발은 다음과 같은 세 가지 이유에서 매우 중요하다.

첫째, 형질전환체에 삽입된 외래유전자의 발현정도는 조절되어야 한다. 형질전환에 사용되는 유전자는 목표형질에 따라 매우 다양하게 이용될 수 있다. 그래서 그 발현정도 또한 매우 다양하게 요구된다. 현탁배양세포에서 유용물질의 축적을 목표로 할 때는 유용물질의 생산에 관여하는 유전자의 발현정도가 강할수록 유리하다. 단백질을 대량생산하고자 할 때에는 현탁배양세포의 대수증식기에 강하게 발현하는 프로모터가 요구되며, 이차대사산물을 대량 축적하고자 할 때는 휴지기에 강하게 발현되는 프로모터가 개발되어야 한다. 이처럼 외래유전자의 발현 정도를 미세하게 조절하기 위해서는 다양한 발현정도의 프로모터가 개발되어야 한다.

둘째, 형질전환에 사용될 프로모터의 지적재산권을 확보하여야 한다. 현재 많이 사용되고 있는 CaMV 35S 프로모터 (특허번호; JP19931172-AI)는 이미 특허화되어 있기 때문에, 이를 이용하여 유용물질을 대량 생산할 경우 이 형질전환주의 사용과 함께 엄청난 액수의 로얄티를 지불해야 함으로 그 부가가치는 현저하게 감소된다.

세째, 다양한 현탁배양세포주에 적합한 프로모터의 연구개발이 필요하다. 상대적으로 성장속도가 빠른 배양세포주인 담배 BY-2 세포 (Nicotiana tobacum L. cv.)는 현재까지 재조합 단백질의 생산에 가장 적합한 세포주이지만 또한 콩, 토마토 그리고 벼의 현탁배양세포와 담배의 모상근에서도 의료용단백질들이 생성되고 있다. 예를 들면 hGM-CGF (human granulocyte-macrophage colony stimulating factor)의 생성은 항시성 프로모터(constitutive promoter)인 CaMV 35S 프로모터와 담배세포주를 이용한 것 보다 벼 세포주에서 유도성 프로모터(inducible promoter, amylase expression system)를 사용하였을 때가 훨씬 높다 (Shin et al., 2003 Biotech. and Bioengineering 82:778-783). 따라서 유용단백질의 생산에는 사례별(case-by-case) 분석에 따른 적절한 세포주와 프로모터가 요구된다.

대부분의 뿌리 작물(인삼, 도라지, 더덕 등)은 식용적, 약리적 효과가 뛰어난 고부가가치 작물이다. 하지만 대부분의 뿌리작물이 다년생으로 그 성장기간이 길며 다량의 폴리사카라이드를 함유하고 있어 DNA 및 RNA 추출이 쉽지 않으며 지하에서 성장하는 저장뿌리의 성장을 모니터링하기 어렵다는 이유로 뿌리작물의 분자육종에 관한 연구는 전무한 형편이다. 그러나 최근 이들 생리활성물질에 관여하는 유전자들이 밝혀지기 시작함에 따라 이 대사경로에 관련된 유전자의 발현을 증강시켜 생리활성물질을 대량으로 축적시키는 발현시스템개발의 필요성이 부각되고 있다. 따라서 타 작물에 비해 재배기간이 길어 경제적으로 생산하여 제품화하는데 많은 시간과 비용이 드는 약용뿌리작물의 배양근 또는 배양세포를 이용하여 유용생리활성물질을 단기간에 많이 축적시키는 프로모터 연구를 통한 원천기술개발은 경제적으로 아주 중요하다.

따라서 보다 고효율로 저렴하게 식물 현탁배양세포에서 유용한 외래단백질을 대량 생산할 수 있는 방법으로 위와 같은 유전자들, 즉 조직배양세포 고발현 유전자의 프로모터에 관한 연구가 필요하다.

한편, Ran GTPase는 동물에서 발달중인 배(embryo)와 현탁배양세포를 포함한 분열조직에 풍부하게 존재하는 단백질로 세포성장/세포증식조절과 단백질 및 RNA의 핵 수송에 직접 관여하는 중요한 단백질로 알려져 있다. 동물에서 Ran GTPase는 이 들의 조절 단백질인 Ran-결합 단백질(Ran-binding protein, RanBPs), RCC1 (a GEF, RanGEF)과 RanGAP (a GAP)과 함께 세포유사분열을 통한 nuclear processes를 조절하는 키(key) 역할을 한다.

아라비돕시스(Arabidopsis)에서는 4종류의 Ran GTPase (AtRAN1, AtRAN2 , AtRAN3, AtRAN4)가 염기서열 유사성 비교로 동정되었고 이 중 AtRAN4는 “염분 스트레스 유도되는 Ran GTPase”로 주석이 달려있으나 발표된 결과는 없다. 그 외 콩의 뿌리에서 강하게 발현하는 Ran GTPase의 cDNA가 분리 되었다. 토마토에서는 다양한 시기의 잎 (자엽, 어린 잎, 늙은 잎)뿐만 아니라 뿌리와 열매 등의 모든 조직에서 발현하는 Ran GTPase cDNA가 동정되었고 이들이 핵단백질임과 S. pombe의 pim1 돌연변이를 억제(suppress)함을 보여 주었다 (Robert et al., 1994 91:5863-5867).

그러나 이러한 많은 단백질이 합성된 뒤 목적하는 장소로 어떻게 이동되며 어떠한 기작에 의해 조직 특이적으로 발현하는지 아직 밝혀져 있지 않으며 식물에서 Ran GTPase 유전자의 프로모터 연구는 거의 되어 있지 않은 실정이다.

본 발명은 상기 문제점 및 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 고구마 Ran GTPase (ibRan1)에서 유래된 식물 조직배양세포 고발현 프로모터 염기서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식물 조직배양세포 고발현 프로모터 및 상기 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 식물 조직배양세포 고발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스트레스 유도성 프로모터 및 상기 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 식물체 형질전환용 스트레스내성 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물 조직배양세포에서 유용물질을 대량으로 생산하고자 하는 경우, 상기 고발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물조직배양세포에서 고효율로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 고구마 작은 GTP 결합 단백질(small GTP binding protein)의 한 종류인 Ran GTPase 유전자(ibRan1)의 프로모터 중 조직배양세포 고발현 프로모터를 클로닝하여서, 동일 유전자의 5' 비번역 부위를 포함시켜 식물세포 형질 전환용 발현 벡터 및 일시적 발현용 벡터를 제작하였으며 동일 벡터들의 발현을 실험을 통해 확인한 바 조직배양세포 특이성 및 스트레스 유도성이 뛰어난 것으로 나타나 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 조직배양세포 고발현 프로모터 부위 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 고구마 Ran GTPase (ibRan1)의 5' 비번역 부위 DNA 염기서열을 제공한다.

상기 서열번호 1의 프로모터 염기서열은 고구마 Ran GTPase (ibRan1)의 전사개시 부위로부터 -1 내지 -1348에서 유래된 것을 특징으로 한다(도 1 참조). 본 발명에 의한 상기 프로모터는 식물조직배양세포에서 강하게 발현하며, 식물체에서는 스트레스에 반응하여 강한 활성이 유도될 수 있다.

또한, 상기 서열번호 2의 비번역 부위는 Ran GTPase (ibRan1)의 전사개시 부위로부터 +1 내지 +50에서 유래된 것을 특징으로 한다(도 1 참조).

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 식물 조직배양세포 고발현 프로모터 및 Ran GTPase (ibRan1)의 5' 비번역 부위를 포함하는 식물체의 형질전환용 조직배양세포 고발현 벡터(pSPran1-101) 및 일시적 발현용 벡터(pSPran1-221)를 제공한다(도 2a 및 도 2b 참조).

상기 형질전환용 조직배양세포 고발현 벡터는 외래 유전자를 도입된 식물체내에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 형질전환용 바이너리 벡터이고, 일시적 발현용 벡터는 외래 유전자를 도입된 식물세포에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 벡터이다.

또한, 상기 본 발명에 의한 식물조직배양세포 고발현 벡터에서, 본 발명에 의한 프로모터 및 Ran GTPase (ibRan1)의 5' 비번역 부위는 pBI101 및 pBI221 벡터에 함유된 외래 유전자의 앞에 위치한다. 본 발명에서는 GUS 리포터 유전자가 함유 된 벡터(pBI101과 pBI221)에 본 발명에 의한 프로모터 및 5비번역 부위를 삽입한 pSPran1-101과 pSPran1-221 (도 2a와 2b)을 제조하였으나, 상기 GUS 리포터 유전자는 외래 유전자의 한 예로서 다른 유용한 목적의 외래 유전자로 치환할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

본 발명은 상기 본 발명에 의한 식물 조직배양세포 고발현 바이너리 벡터에 의해 형질전환된 식물 조직배양세포 및 식물체, 그리고 상기 일시적 발현용 벡터에 의해 일시적으로 형질전환된 식물 조직배양세포를 제공한다.

상기 식물 조직배양세포 고발현 바이너리 벡터는 아그로박테리움을 이용하는 방법, 혹은 유전자 총을 이용한 방법 등으로 식물체를 형질전환시킬 수 있다. 본 발명에서는 그 예로서 아그로박테리움을 이용하여 담배에 형질전환시켰다. 또한, 상기 조직배양세포 일시적 발현 벡터는 폴리에틸렌글리코 방법, 전기 천공법(electroporation) 등을 이용하여 세포를 일시적 형질전환시킬 수 있는데 본 발명에서는 폴리에틸렌글리코 방법을 이용하여 BY-2세포를 일시적으로 형질전환시켰다.

또한 본 발명의 식물 조직배양세포 고발현 벡터들에서 외래단백질 생산을 위한 유전자는 상기 프로모터 및 고구마 Ran GTPase (ibRan1) 유전자의 5' 비번역 부위의 뒤에 위치할 수 있으며, 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다.

나아가, 본 발명은 본 발명에 의한 식물조직배양세포 고발현 프로모터 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 3 내지 서열번호 6로 표시되는 PCR용 프라이머를 제공한다.

본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Ran GTPase (ibRan1) 유전자의 프로모터 중 조직배양세포 고발현 프로모터 부위 및 그 유전자의 5' 비번역 부위에 관한 것이다.

본 발명자들은 대표적인 뿌리작물이면서 분자생물학적 연구기법이 개발되어 있는 고구마의 현탁배양세포를 이용하여 EST 라이브러리(library)를 제작하여 1431개 high quality EST 서열을 얻었다. 기 확보된 고구마 현탁배양세포 1431개 ESTs를 고구마 잎, 뿌리의 dbESTs와 비교, 분석한 결과, 고구마배양세포에 특이적으로 높은 빈도로 존재하는 5개의 ESTs (cinnamyl-alcohol dehydrogenase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cyclophilin, GTP binding nuclear protein Ran 등)를 선별하였고 이를 노던(Northern) 분석으로 확인하였다 (Kim et al., 2006 J. Plant Biol., 49:364-370). 본 발명자들은 이 중 현탁배양세포의 초기부터 대수증식기에 걸쳐 강하게 발현하는 Ran GTPase (Ras-related nuclear protein)를 최종적으로 선별하여 아직까지 밝혀진 바가 없는 이 유전자의 프로모터 염기서열을 클로닝하여 뿌리작물 현탁배양세포용 고발현 프로모터로서 Ran GTPsae의 프로모터를 개발하였다.

상기 본 발명에 의한 Ran GTPsae의 프로모터는 식물 조직배양세포내에서 많은 양의 외래단백질을 축적하기 위해 세포분열이 왕성한 조직에서는 높은 정도의 발현을 유도한다. 그러므로 본 발명은 식물 조직배양세포에서 유용 의료, 산업용 단백질 (예, Interferon, growth hormone, Lactoferrin, Phytase 등) 유용물질을 대량으로 생산하고자 하는 형질전환 식물 세포주 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 Ran GTPsae 프로모터는 식물체에서 스트레스에 반응하여 강한 활성이 유도될 수 있어 형질전환 스트레스 내성 작물 개발에 유용하다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서는 고구마 조직배양세포 고발현 유전자 Ran GTPase 프로모터와 동일 유전자의 5' 비번역 부위를 pBI101과 pBI221에 삽입시켜서 바이너리 식물체 발현 벡터와 일시적 발현에 의한 분석용 벡터를 제조하였으며, 담배 형질전환체에서 캘러스와 현탁배양세포를 유도하여 프로모터활성을 조사한 결과, 본 발명에 의한 프로모터를 가지는 형질전환 현탁배양세포주들은 보편적으로 사용하는 CaMV 35S 프로모터를 가지는 형질전환 현탁배양세포주보다 평균 15.5배 높은 활성을 나타내었다. BY-2 세포주를 사용한 일시적 발현 분석에도 ibRan1 유전자의 프로모터가 매우 강한 활성을 나타냄을 확인하였다. 한편, 상기 프로모터는 저온처리 및 활성산소종의 처리에서도 강하게 활성이 유도됨을 확인하였다.

따라서, 본 프로모터는 형질전환 조직배양세포에서 유용 단백질을 대량으로 생산하고자 할 때, 혹은 형질전환 스트레스 내성작물을 개발하고자 할 때 효과적으로 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 고구마 현탁배양세포에서 고발현하는 Ran GTPase 유전자( ibRan )의 프로모터 클로닝

고구마 (Ipomoea batatas cv Yulmi ) Ran GTPase 유전자(ibRan)의 프로모터는 고구마(Ipomoea batatas cv White Star) Ran GTPase 유전자 (Kim et al., J. Plant Biol.,2006, Vol 49, 364-370)의 5' 영역 염기서열을 결정하여 확인하였다.

이렇게 확인된 1,348 bp 프로모터 염기서열을 GenBank에 등록하였다 (Accession no.EF119214 )(도 1 참조). 상기 도 1은 본 발명에 의한 현탁배양세포 고발현 프로모터 및 고구마 유래 Ran GTPase 유전자의 5' 비번역 부위 염기서열을 나타내는 도면이다. 도 1에서 단백질 합성 개시 코돈 'ATG'는 밑줄 친 굵은 글씨체로, 전사개시 부위인 염기 'C'는 '+1'로 표시하였다.

실시예 2: 고구마 현탁배양세포에서 고발현하는 Ran GTPase 유전자( ibRan )의 프로모터 분석

실시예 1에서 ibRan 유전자의 프로모터는 번역 개시점의 상류로부터 -1348 bp까지의 영역에 해당하는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성된다 (도 1). 상기 ibRan 유전자의 프로모터의 염기서열을 PLACE (A database of Plant cis-acting Regulatory DNA elements)를 이용하여 분석하였다.

염기서열 분석결과, ibRan 프로모터에는 진핵생물 프로모터의 조절요소 (regulatory element)부위를 갖고 있음이 확인되었는데, 전사개시를 위한 TATA box가 (TATAAA)가 -49/-44에 존재하였으며, -174/-171, -701/-698, -942/-939, -957/-954, -1063/-1060, -1135/-1132, -1306/-1303 위치에 CAAT box (CAAT)가 존재하였다. 이 외에, 식물체에서 스트레스와 연관되어 보고된 여러 전사조절 단백질이 부착하는 부위가 존재하였다. 건조와 같은 스트레스에 빠르게 반응하는 유전자의 조절에 관여한다고 알려져 있는 ACGT motif는 -180/-176, -378/-375의 두 곳에 위치하며 건조와 같은 스트레스에 빠르게 반응하는 유전자의 조절에 관여한다고 알려져 있다 (Nakashima K,et al., 2003 Plant J. 33, 259-7). 식물의 방어기작에 관여하는 G box (CACGTG)가 한 부위, GT-1 box (GRWAAW/GAAAAA)는 다섯부위에 존재하고 있었다. 저온에 반응하는 조절인자로 알려져 있는 LTRE (CCGAAA/CCGAC)도 존재하였다.

실시예 3: 현탁배양세포 고발현 벡터 및 일시적 발현 벡터의 제작

실시예 1에서 클로닝된 고구마 (Ipomoea batatas cv Yulmi ) 작은 GTP 결합 단백질(small GTP binding protein) Ran GTPsae 유전자(ibRan1)의 프로모터(서열번호 1)와 50 bp 5' 비번역 부위 (서열번호 2)(이상 도 1 참조)를 pBI101과 pBI221 벡터(Clonetech)에 삽입하여 식물 조직배양세포 고발현 벡터 및 일시적 발현 벡터를 각각 제작하였다.

먼저, 조직배양세포 고발현 벡터의 제작에 대해 구체적으로 살펴보면, 상기 서열번호 1의 클로닝된 고구마 Ran GTPase 유전자(ibRan1)의 현탁배양세포 고발현 프로모터와 서열번호 2의 50 bp 5' 비번역 부위를 표 1에 나타나 있는 프라이머들 을 사용하여 PCR로 증폭시켜서, Sal I과 BamH I으로 절단한 다음 pBI101의 Sal I, BamH I 위치에 삽입하여 pSPran1-101으로 명명하였다(도 2a 참조). 이때 PCR은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃-1분, 62℃-2분, 72℃-2분을 30회 수행한 후 72℃에서 7분간 처리하였다.

5' 프라이머	5'-ACG CGT CGA CTC CGC TTC ACT TGA GAG CGT-3'	서열번호 3
3프라이머	5'-CGG GAT CCT GCG TCG TTG CTT GGT TAG G-3'	서열번호 4

도 2a와 2b에서 GUS는 베타-글루쿠로니다제 II(β-glucuronidase II)를 코딩하는 유전자이고, NPTII는 카나마이신(kanamycin) 저항성 마커 유전자이고, Nos-pro와 Nos-ter는 NPTII의 식물체 발현 프로모터와 터미네이터이다. 그리고 GUS 리포터 유전자는 삽입된 IbRan1유전자의 프로모터와 Nos (Nopalin synthase) 터미네이터(Nos-ter)에 의해 식물체에서 발현된다.

한편, 식물 현탁배양세포 일시적 고발현 벡터의 제작은, 상기 서열번호 1의 클로닝된 고구마 Ran GTPase 유전자(ibRan1)의 현탁배양세포 고발현 프로모터와 서열번호 2의 50 bp 5' 비번역 부위를 표 2에 나타나 있는 프라이머들을 사용하여 PCR로 증폭시켜서, Sph I과 BamH I으로 절단한 다음 pBI221의 Sph I, BamH I 위치에 삽입하여 pSPran1-221로 명명하였다(도 2b 참조). 이때 PCR은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃-1분, 62℃-2분, 72℃-2분을 30회 수행한 후 72℃에서 7분간 처리하였다.

5' 프라이머	5'-ACA TGC ATG CTC CGC TTC ACT TGA GCG T-3'	서열번호 5
3' 프라이머	5'-CGG GAT CCT GCG TCG TTG CTT GGT TAG G-3'	서열번호 6

실시예 4 : 본 발명에 의한 pSRan1 -101 벡터를 이용한 담배 형질전환체 제작

실시예 3에서 제작된 pSPran1-101 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 냉-해동(Freeze-thaw) 방법(An, G. 1987, Methods in Enzymology)으로 도입하였다.

상기 얻어진 아그로박테리아(Agrobacteria) 형질전환체를 2일 동안 28℃에서 진탕 배양하고, 담배 식물체 (Nitoana Tobacum, Xanthi)의 잎 절편을 준비하여, 아그로박테리움 배양액에 잎 절편을 담가 감염시키는 방법으로 담배 형질전환체를 제작하였다.

실시예 5 : 본 발명에서 선별된 형질전환체로부터 현탁배양세포 고발현 프로모터 세포주 확립

실시예 4에서 제조된 담배형질전환체로부터 종자를 수확한 다음, 카나마이신(kanamycin, 30 mg/L)을 함유하는 MS 배지에 도말하여 저항능을 가진 형질전환 식물체를 선별하여 형질전환체로(1세대와 2세대)부터 종자를 받았다.

ibRan1 프로모터의 활성을 현탁배양세포에서 확인하기 위하여, 선별된 형질전환체 (2세대)의 잎에서 캘러스를 먼저 유도한 다음, 이 캘러스를 가지고 형질전환 현탁배양세포주를 유도하였다. 캘러스를 얻기 위하여, F2 종자를 멸균하여 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 MS 선택 배지에서 발아 시킨 후, 2~3주 동안 더 키운 다음 잎 절편체를 잘라 호르몬이 첨가된 캘러스 유도 배지 (3% sucrose, 2mg/L naphthaleneacetic acid (NAA), 0.25 mg/L 6-benzylaminopurine (BA), 0.4mg/L thiamine HCl, 0.5% phytoagar)에 올려놓아 배양한다. 약 2~3 주 후에 캘러스가 유도된다. F2세대의 자엽체에서 유도된 캘러스의 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법을 이용하여 조사하였다. 각 형질전환 캘러스조직을 염색하기 위하여, 캘러스의 각 조직은 1mM G-glu (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide), 100mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 그리고 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에 담구어 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, CaMV 35S 프로모터를 가지고 있는 pBI121 (Clonetech, USA) 벡터를 대조군으로 사용하여 실험하였다. 그 결과, 도 3a에서 나타난 것처럼 pSPran1-101로 형질전환된 담배의 캘러스조직에서 강하게 GUS의 활성이 확인되었으며, 보편적으로 사용하고 있는 pBI121로 형질전환된 담배의 캘러스조직에서는 약한 GUS 활성을 확인하였다.

캘러스에서의 GUS활성을 확인한 후, 캘러스를 작은 조각으로 나누어 현탁 배양용 배지 (3% sucrose, 2.7mM KH₂PO₄, 181μg/L 2,4-D, 1mg/L thiamine HCl)에 넣고 25℃, 100rpm에서 현탁배양세포주를 유도하였다. 일부 세포를 덜어내어 현탁배양에서의 GUS활성을 MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide) 기질을 이용한 효소화학적 방법 (Jefferson et al., 1987 EMBO J. 6: 3901-3907)으로 측정하였다. 현탁배양세포에서 고구마 ibARan1 유전자 프로모터를 가지는 형질전환 현탁배양세포주, ibRan1-7과 ibRan 1-9는 보편적으로 쓰이는 CaMV35S 프로모터를 가지는 형질전환 현탁배양세포주에 비해 29배 또는 12배 높은 프로모터 활성을 보였다(도 3b 참조).

실시예 6 : BY -2 세포주의 원형질체를 이용한 ibRan1 프로모터의 일시적 발현조사 ( transient assay )

ibRan1 프로모터를 이용한 일시적 발현조사는 BY-2 세포주 (Nicotiana tobacum L. cv Bright yellow 2)를 가지고 수행하였다. 계대배양한지 3일된 BY-2세포는 2% 셀룰라제 R-10과 0.5 % 마세로자임 (macerozyme)을 함유하는 효소액에 7시간동안 처리하여 원형질체를 분리하였다. 여기에 상기 실시예 3에서 제작된 플라스미드 벡터 pSPran1-221을 가하여 폴리에틸렌 글리콜방법을 이용하여 플라스미드 벡터 pSPran1-221을 세포내로 도입시킨 후 23 ℃ 암상태로 16시간동안 배양하였다. 이 플라스미드 벡터를 포함하는 원형질체의 형광을 실시예 5에서와 동일한 방법으로 측정함으로써, 프로모터활성을 계산하였다. 도 4에서 보는 것처럼 일시적 발현 분석의 결과, ibRan1유전자의 프로모터는 CaMV 35S프로모터에 비해 25배 높은 프로모터 활성을 보였다.

실시예 7 : 본 발명에 의한 산화스트레스 유도성 발현 프로모터( ibRan1 프로모터)의 산화스트레스 유도성 확인

실시예 5에서 선별된 형질전환체 (F2세대)의 GUS의 활성을 스트레스 처리하에서 정량적으로 조사하였다.

구체적으로는 형질전환 담배의 종자를 발아시켜 10일 된 어린 식물체들을 0.1M 의 H₂O₂ 가 함유된 MS 배지에 옮겨 24 시간 배양한 후, 어린 식물체들을 수거하여 GUS 추출 용액 (50 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium laurylsarcosine, 그리고 10 mM β-mercaptoethanol)에서 마쇄한 다음, 12,000 x g에서 원심분리하여 상등액을 취했다. 저온 처리의 경우, 발아 후 10일 된 어린 식물체를 MS 배지에 올려 4℃에서 24 시간 처리한 후 GUS 추출 용액에 넣어 마쇄한 다음, 원심분리하여 상등액을 취하였다. 각 스트레스 처리군에 대비해 스트레스를 처리하지 않은 샘플을 대조군으로 하였다.

획득된 상등액은 1mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide)와 섞어 37℃에서 반응시킨 다음, 0.2M Na₂CO₃를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 반응액은 형광계(fluorometer)를 이용하여 365 nm와 455 nm 파장에서 값을 측정하여 GUS 활성을 계산하여 도 5a 및 도 5b에 나타내었다 .

도 5a 및 도 5b에서 보여지는 GUS 활성도는 각 스트레스 처리별로 얻어진 3개 형질전환체 (T2 식물체)를 분석하여 얻어진 값이다. 그 결과 고구마 ibRan1 유전자 프로모터를 가지는 ibRan-7, ibRan-8, ibRan-9 의 형질전환체는 H₂O₂에 의해 GUS 활성이 각각 2.3배, 3.5배, 3.8배 증가하였고, 저온에 의해서는 각각 2.1배, 3.0배, 3.1배 정도 활성이 증가함을 확인하였다.

도 1은 본 발명에 의한 식물 조직배양세포 고발현 프로모터 및 고구마 유래 Ran GTPase 유전자의 5' 비번역 부위의 염기서열을 나타내는 도면.

도 2a는 본 발명에 의한 식물 조직배양세포 고발현 프로모터 및 고구마 유래 Ran GTPase 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 형질전환용 바이너리 벡터(이하, 'pSPran1-101'이라 함)를 나타내는 모식도.

도 2b는 본 발명에 의한 식물 조직배양세포 고발현 프로모터 및 고구마 유래 Ran GTPase 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 일시적 발현 분석용 벡터(이하, 'pSPran1-221'이라 함)를 나타내는 모식도.

도 3a는 본 발명에 의한 pSPran1-101 벡터를 이용하여 형질전환시킨 캘러스를 조직 화학적인 방법으로 GUS를 염색시켜 관찰한 발현 양상을 나타내는 도면.

도 3b는 본 발명에 의한 pSPran1-101 벡터를 이용하여 형질전환시킨 현탁배양세포에서 배양중의 세포를 샘플링한 후 GUS를 정량적인 방법으로 분석하여 본 발명에 의한 프로모터의 조직배양세포 고발현을 확인한 도면.

도 4는 본 발명에 의한 pSPran1-221 벡터를 이용하여 BY-2세포에서 일시적 발현을 분석한 결과를 나타내는 도면.

도 5a는 본 발명에 의한 pSPran1-101 벡터를 이용하여 형질전환시킨 담배식물체에 저온 (cold)을 처리하여 본 발명에 의한 프로모터가 저온스트레스에 의해 발현이 유도됨을 확인한 도면.

도 5b는 본 발명에 의한 pSPran1-101 벡터를 이용하여 형질전환시킨 담배식 물체에 활성산소종(H₂O₂)을 처리하여 본 발명에 의한 프로모터가 산화스트레스에 의해 발현이 유도됨을 확인한 도면.

<110> HUH, Gyung Hye <120> Promoter for the high level expression in plant-cell culture and vector using the same <130> P11-070803-01 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1348 <212> DNA <213> Ipomoea batatas cv Yulmi <400> 1 aacacatggg gttggaggaa caaagttaac tgatagccgt tacaattatt acaaccgtcc 60 gcttcacttg agagcgtttg ggttgggcta tgaactacta aaatatctgt tctaacttat 120 tcttgtataa atagtttatg cccttgcctt gtaggggcta tgaattacta aaatatctgt 180 tgaacttatt cttgtttaaa tagtcttatt cgtcaatttt ctttaatctt ctctctctct 240 cttctctcct agttggttga caaaaactcc aaaaaaaaaa aaaaacaatt actatttagc 300 ttgctctaac atcattgata aaagtttata gagactctat aataataatt taaagagtta 360 attccatttt ttgtcttaga tttataggtg acaattcagt tttagtcaat ttttattaaa 420 acatcctcat ttggtcctag tattactgcg gcatgactat ttttagtcct tcatcctcat 480 cgttaaatac aaatgcattt cagtctttct tatacaaagt atgttgaacc gttatatttt 540 tatgtttatt ttttttgaaa acatccataa ttgaagggcc gaaacatcat tgaatttaac 600 gatatttaaa ctgttttgta aattaatgac aaaaaatggt tatgttacaa taatactagg 660 accaaaagtg aatgttctaa taaaaaagga cttatggact gccacctata aatataggac 720 caaaatgaaa ttaactctaa ttttaaattc atcacttcaa agagtataaa agtttcattg 780 gagtactatt aaacattttt tttttgttaa taaaccgtcc caaaatgtaa tttttttttc 840 attcgtactt ggagaagtca tccttaagaa aaatgaagtt tatgaagaga aaaaggtcca 900 aggatgatga aaaatctaaa ttgaatccct tgtgcgtgca taaagactag aatatgttaa 960 tggattgatt acgtcactcg taatttcttt ctacagtaac tctaggacca agtcttgtga 1020 gtttaggatt aatcccaaaa aagtcaaaaa ctaaaatcac ccaaatgtaa aaaacaaaac 1080 aaaagaagtc tataaatgcc acaaaataaa ctaaaaataa aatatccaca acggtttaaa 1140 tttcaaaatt tgaatctgcg tgattttcac gtgacattac atctgcgtag gatctactcg 1200 aagcccacta actttgatcc gacggtccga atatcgcgtt aggctaaagc tacttgcatt 1260 atagtctagg ttttctgaaa aacccttcac ccactggtat ataaagtctc ctaaatctcg 1320 aaatttctca ggacaatcat tctgctct 1348 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Ipomoea batatas cv Yulmi <400> 2 ctctatagcc tccgtctctt tctctctcga cctaaccaag caacgacgca 50 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 acgcgtcgac tccgcttcac ttgagagcgt 30 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 cgggatcctg cgtcgttgct tggttagg 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 acatgcatgc tccgcttcac ttgagcgt 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 cgggatcctg cgtcgttgct tggttagg 28

Claims

서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 작은 GTP 결합 단백질(samll GTP binding protein) Ran GTPase 유전자의 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 유용성분 대량생산을 위한 형질전환체 생산용 프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 스트레스 내성 형질전환체 생산용 프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터.
서열번호 2의 염기서열을 갖는 분리된 고구마 Ran GTPase 유전자의 5' 비번역 부위.
서열번호 1의 염기서열을 갖는 작은 GTP 결합 단백질(samll GTP binding protein) Ran GTPase 유전자의 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 고구마 Ran GTPase 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 형질전환용 바이너리 벡터.
서열번호 1의 염기서열을 갖는 작은 GTP 결합 단백질(samll GTP binding protein) Ran GTPase 유전자의 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 고구마 Ran GTPase 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 일시적 발현 분석용 벡터.
제5항 기재의 형질전환용 바이너리 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제6항 기재의 일시적 발현 분석용 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제5항 기재의 형질전환용 바이너리 벡터로 형질전환된 식물체.
제5항 기재의 형질전환용 바이너리 벡터로 형질전환된 조직배양 세포주.
제1항 기재의 프로모터 또는 제5항 기재의 형질전환용 바이너리 벡터로 형질전환된 식물조직배양세포에서 외래유전자를 발현시키는 방법.
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 PCR용 프라이머.
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 PCR용 프라이머.