KR20100107263A - 환경 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물 및 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

벼, 형질전환, 환경 스트레스 유도성 프로모터, sGFP, 단자엽 식물

Description

환경 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도{Promoters inducible by environmental stresses and uses thereof}

본 발명은 환경 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물 및 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화 된다.

유전자 전이(transformation)를 통한 형질전환 식물체를 개발함에 있어 상시적이면서 강한 발현을 하는 프로모터들, 예를 들어 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S(CaMV35S) 프로모터(Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985)가 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 프로모터에 연결된 특정 유전자의 상시적이고 과다한 발현(over-expression)은 생체대사에 불필요한 대량의 단백질이 주는 유독효과로 인하여 형질전환 식물체가 발아가 되지 않거나 왜소하게 되는 등의 부작용이 나타나는 경우가 많다. 대표적인 예로서, CaMV35S 프로모터를 사용하여 환경스트레스 전사인자 유전자 DREB1A를 과발현시킨 애기장대가 저온 및 저수분 조건에 대하여 저항성을 증진되는 것은 관찰되었으나, 성장이 저해되어 왜소증(dwarfed phenotype)을 보이면서 아미노산 프롤린 및 수용성 당류의 생산이 함께 증가하는 것이 확인되었다(Lie et al., Plant Cell 10: 1391-1406, 1998; Gilmour et al., Plant Physiol. 124: 1854-1865, 2000). 이러한 부작용은 CaMV35S 프로모터 대신 환경스트레스 관련 유전자인 rd29A의 유도성 프로모터를 사용함으로써 최소화할 수 있다(Kasuga et al, Nat. Biotechnol. 17: 287-291, 1999).

그러므로, 식물체 조직에서 모든 시간대에 상시적으로 발현을 유도하는 프로 모터 대신 특정 조건 또는 특정 시기에 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 유도성 프로모터를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 학술적으로는, 미생물이나 동물에서 분리된 프로모터를 식물에 도입하고 화학물질을 유도체로 사용하여 목적단백질의 생합성을 촉발하는 유도성 프로모터 시스템이 많이 개발되었다. 지금까지 화학물질에 의한 발현 유도 시스템으로서 식물에 적용된 예로서, 스테로이드 덱사메타손(dexamethasone), 항생제 테트라사이클린(tetracycline), 구리이온, IPTG 등 화학물질을 유도물질로 처리해 주는 방법이 소개된 바 있다(Gatz et al., Plant J. 2: 397-404, 1992; Weimann et al., Plant J. 5: 559-569, 1994; Aoyama T. and Chua N-H, Plant J. 11: 605-612, 1997). 그러나 이들 시스템에 사용하는 유도물질 화합물들의 가격이 극히 고가이고 그 화학물질 자체가 주는 유독한 효과를 발생하기도 하며 모든 식물에 적용되지 못하는 등의 문제점이 있다.

한국특허등록 제10-0781059호에는 환경스트레스에 의해 활성화되는 유도성 프로모터 및 상기 프로모터를 이용하여 공변세포에 특이적으로 목적단백질을 생산하는 형질전환 식물을 얻는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0578461호에는 벼로부터 유래한 스트레스-유도된 프로모터가 개시되어 있으나, 본 발명의 프로모터와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 환경 스트레스, 특히 건조(한발) 스트레스에 의해 유도되는 프로모터 개발에 노력한 결과, 벼 유래의 특정 프로모터가 환경 스트레스에 의해 강하게 유도된다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 이용하여 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명이 제공하는 프로모터와 이를 이용하여 환경스트 레스 저항성 형질전환 식물의 품종개발 기술은 다양한 경제작물의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 유전자 형질전환을 위한 환경 스트레스 유도성 프로모터를 제공하며, 더욱 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터를 제공한다.

본 발명은 벼 유래의 특정 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1의 Wsi18(water-stress induced protein 18) 프로모터, 서열번호 2의 LEA(late embryogenesis abundant protein) 프로모터, 서열번호 3의 UGE(UDP-glucose 4-epimerase) 프로모터, 서열번호 4의 DIP2(drought induced protein 2) 프로모터, 서열번호 5의 NCED3(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 3) 프로모터, 서열번호 6의 PSY2(phytoene synthase 2) 프로모터, 서열번호 7의 DXS2(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase 2) 프로모터이다.

또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 7의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1 내지 7의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 프로모터에 있어서, 상기 환경 스트레스는 건조, 고온, 냉해, 염해, 중금속 등일 수 있으며, 바람직하게는 건조 스트레스이다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 재조합 식물 발현 벡터의 일례로서, 도 2에 기재된 벡터를 예를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 벡터는 본 발명의 프로모터에 변형된 녹색형광단백질 유전자(sGFP), 프로테아제 저해제 II 터미네이터 유전자(T_PINII), OsCc1 프로모터 (Pcytc), 제초제 저항성 유전자 Bar (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자) 및 노팔린 신타아제 터미네이터(T_NOS)가 작동가능하게 연결되어 있다. 또한, 오른쪽 경계 서열(right-border sequence) 말단에 MAR 서열을 장착함으로써 염색체 내 도입부위에 따른 발현양의 변화를 최소화하여 본 발명의 프로모터 고유의 활성만을 측정할 수 있도록 하였다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않 는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러 스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 식물 발현 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

상기 목적 단백질은, 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 환경 스트레스를 가하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 생산된 목적 단백질은 전술한 바와 같다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기 천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함 하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다. 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있으며, 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파와 같은 단자엽 식물일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 식물에 도입함으로써 식물의 환 경 스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 프로모터에 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자를 작동가능하게 연결하여 식물에 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자는 탈수, 저온 또는 염 스트레스와 같은 환경 스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 데 역할을 담당하는 단백질을 암호화한다. 그의 예는 다음을 포함한다: LEA 단백질; 물 채널 단백질; 상용성 용질의 합성효소; 담배의 해독 효소; 삼투압조절 물질(예컨대 설탕, 프롤린, 또는 글리신베타인)에 대한 합성효소; 세포막 지질의 변형 효소인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 w-3 지방산 불포화화효소 및 남조류의 D9-불포화화효소를 암호화하는 유전자; 프롤린 합성의 주요 효소인 P5CS; 및 갈락티놀 합성을 위한 AtGolS3 유전자.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 프로모터 서열 예측(prediction) 및 추출(extraction)

기존의 보고된 환경 스트레스 유도 단백질들의 유전자 서열을 IRGSP(international rice genome sequencing project) 서열과 blastN을 수행하여 예측한 프로모터 지역과 TIGR(The Institute for Genomic Research)의 annotation data를 근거로 한 프로모터 지역을 분리하여 벼 형질전환용 벡터 제작에 사용하였다. 코딩 서열(CDS)의 ATG 위치에서부터 약 2 킬로베이스페어(kbp) 위쪽(upstream) 까지의 서열을 프로모터 지역으로 예측하고, 이 서열만 따로 추출하여, 이 2 킬로베이스페어(kbp) 내에서 전체 크기가 1.8-2kb 정도의 프로모터를 분리하기 위한 PCR Primer 제작용 주형(template)으로 사용하였다.

2. 프로모터(promoter)의 증폭(amplification) 및 분리(isolation)

예측된 2kbp의 프로모터 서열를 주형으로, primer designer4 program(ver.4.20, Scientific & Educational software)을 이용, 전체 크기가 1.8-2kb 정도의 프로모터를 분리하기 위한 PCR 프라이머를 디자인하였다. 디자인 조건은 PCR 조건이 프라이머의 GC% 범위가 40-60%, Tm 범위 55-65℃, salt 및 free Mg의 농도를 각각 0, 0.15 mM로 하였다. PCR 프라이머는 그 길이가 주형 특이적 영역(template-specific region)이 20bp, 5' 어댑터 서열(adaptor sequence)이 12bp가 되도록 하였다. 이 어댑터 서열은 기존의 제한효소(restriction enzyme)와 DNA ligase(DNA 접합효소)를 이용한 클로닝 방법이 아닌 site-specific recombination을 위해 삽입한 서열이다. PCR 반응의 주형으로 사용할 DNA는 자포니카형(japponica type) Nipponbare 품종(cultivar)의 벼를 파종하여, 온실에서 3주간 키운 후, 잎 부분만 절제하여, 게놈(genomic) DNA를 추출하였다. 게놈 DNA는 우선 절제한 잎을 액체 질소로 급냉동 시키고, 막자사발을 이용하여 곱게 마쇄한 후, DNAzol(molecular research center, Cat. No. DN128) 용액을 이용하여 분리하였다. PCR 반응은 두 단계로 나누어서 진행하였다. 1차 반응은 벼의 게놈에서 특정 프로모터를 분리하기 위한 반응으로, 12bp 어댑터 서열로 연결된 전체 크기 32bp 주형 특이적 서열 프라이머를 사용한다. 프라이머 서열은 아래와 같다.

주형 특이적 정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCT-주형 특이적 서열-3'

주형 특이적 역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGT-주형 특이적 서열-3'

1차 PCR은 게놈 DNA 50ng, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 주형 특이적 프라이머 각각 10pmol, 전체 50ul 반응으로, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분, 30 사이클로 진행하였다.

2차 반응은 프로모터를 형질전환용 벡터에 삽입하기 위해 필요한 특정 어댑터 서열 (att site)를 삽입, 증폭하기 위해 실시하였다. 프로모터에 부가적으로 삽입되어야 할 서열의 길이는 약 29 bp로, PCR의 효율을 높이기 위하여 이 서열의 일부 (12 bp)만을 주형 특이적 서열에 overhang으로 달아 첫 번째 PCR을 수행한 후, 이 PCR 반응액의 1/50(1ul)을 취해 다시 전체 재조합(recombination) 서열을 갖는 프라이머(어댑터 서열 프라이머)로 두 번째 PCR 반응을 한다. 따라서, 이 반응물은 벼의 프로모터와 재조합을 위한 att 서열을 모두 갖게 된다. 어댑터 서열 프라이머의 서열은 아래와 같다.

attB1 어댑터 프라이머: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열번호 8)

attB2 어댑터 프라이머: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'(서열번호 9)

2차 PCR은 1차 PCR 반응물 1ul, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 어댑터 프라이머 각각 2pmol, 전체 50ul 반응으로, 95℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 2분, 5 사이클 후, 다시 95℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 2분, 20 사이클로 진행하였다.

위의 PCR 방법은 Gateway System(Invitrogen, Cat. No.12535-029)을 이용하기 위해 Invitrogen에서 제시한 방법으로 수행하였다.

3. 증폭된 프로모터의 클로닝(cloning)

Gateway system(Invitrogen, Cat. No.12535-029)을 이용하여 벼 형질전환용 운반체에 삽입하였다. 먼저, 증폭시킨 프로모터는 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동 후, 겔 상에서 밴드 분리 및 Mega-spin agarose gel extraction kit(Intron, Cat. No.17183)으로 정제(purification)하였다. 정제한 프로모터 5ul, BP clonase enzyme mixture 4ul, 5X BP 반응 버퍼 4ul, pDONR 벡터 300ng/2ul, TE 버퍼(10mM Tris/pH8.0, 1mM EDTA), 전체 20ul BP 반응을 25℃, 16시간동안 수행하였다. 이후, 이 반응물에 LR clonase enzyme mixture 6ul, 0.75M NaCl 1ul, 형질전환용 운반체 450ng/3ul 첨가하여 전체 30ul, 25℃, 8시간동안 LR 반응시켰고, proteinase K 3ul를 첨가, 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 이 중 2ul를 취해 DH5α competent cell에 형질전환하였다. 형질전환시킨 DH5α 세포는 50ug/ml 스펙티노마이신(spectinomycin) 항생제를 포함한 LB 아가 배지에 깔고, 37℃ 항온기에서 12시간 키운 후, 항생제 저항성을 가진 선발된 세포에서 DNA를 추출하여 프로모터가 삽입되어있는지를 PCR 반응을 통하여 확인한 후, 시퀀싱 및 예측했던 프로모터 서열과 BLASTN을 수행, 분리한 프로모터의 완전한 삽입을 확인하였다.

벼 형질전환용 운반체(pMJ401)는 다음과 같다. 오른쪽 경계 서열(right-border 서열)과 왼쪽 경계서열(left-border sequence) 사이에 재조합 후 프로모터 와 교체가 될 카세트가 3' 방향에 마커 유전자(visiable marker gene)인 sGFP와 PINII(protease inhibitor II) 터미네이터로 연결되어 있다. 이 카세트는 BP 및 LR 반응을 수행할 수 있도록 attR 서열을 가지고 있다. 선발 유전자(selectable marker gene)는 제초제 저항성 유전자 Bar 유전자 (bar, phosphinothricin acetyltransferase gene)이 본 실험실에서 개발한 항시발현 프로모터 OsCc1에 의해서 조절되도록 제조되었고, 이 유전자는 NOS(nopalin synthase) 터미네이터로 연결되어 있다. 또한, 오른쪽 경계 서열(right-border sequence) 말단에 MAR 서열을 장착함으로써 염색체내 도입부위에 따른 발현양의 변화를 최소화하여 프로모터 고유의 활성만을 측정할 수 있도록 하였다.

4. 아그로박테리움(Agrobacterium-mediated)을 이용한 벼의 형질전환(transformation)

낙동 벼 종자(Oryza sativa L. cv Nakdong)를 겉 호영만 제거한 후, 70%(v/v) 에탄올을 첨가하고, 1분동안 가볍게 흔들어 씻어냈다. 씻어낸 종자들은 다시 20% chlorax 에 넣어 1시간 동안 흔들어 소독하고, 멸균수로 여러 번 세척하였다. 세척한 벼 종자는 형질전환을 위해, 장(Jang)에 의해 기술된 바와 같이(Jang, I-C. et al., Mol breeding, 5:453-461, 1999) 캘러스 유기 배지(2N6)에서 한 달간 배양하여 배아 캘러스(embryogenic callus)를 유기한 후, Agrobacterium triple mating 방법으로 얻은 아그로박테리움과 공동배양(co-cultivation)하여 상기 프로모터가 삽입된 형질전환 운반체를 벼 게놈에 삽입시킨 후, 형질전환된 캘러스 선택배지(2N6-CP)에서 한 달간 배양하였다. 이후, 선택적으로 자란 세포들을 골라 재분화 배지(MS-CP)에서 한 달에서 두 달간 배양 후 재분화된 식물체를 온실에서 순화시켰다. 순화된 T0 벼는 비선택성 제초제인 바스타(basta) 처리를 하여 제초제 저항성을 보이는 식물체만 골라 후대검정을 하였다.

5. 벼 기관별 GFP 발현 관찰

프로모터의 활성 분석을 위하여 사용한 마커 유전자 sGFP의 발현 확인은 종자, 발아 후 20일, 60일이 지난 벼의 잎과 뿌리, 출수 전의 꽃 기관에서 한발 스트레스 처리 전과 후에 관찰하였다. 유전자의 발현 관찰은 유전자 삽입 및 분리가 확실히 관찰될 수 있는 T₂, T₃ 단계에서 실시하였다. 종자에서의 GFP 발현은 종자를 종단, 횡단면으로 잘라 LAS3000 system(Fuji photo film. co.)과 stereomicroscope SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 배와 배유에서 GFP 발현을 관찰하였다. 종자에서 GFP 발현을 관찰한 종자들은 다시 에탄올과 20% chlorax 용액에 소독, 선발 마커 bar 유전자의 활성 확인을 위하여, PPT 성분이 함유되어 있는 MS-P 배지(PPT 4mg/l)에서 암상태에서 이틀간 발아시킨 후, 광 조건의 항온기(incubator chamber)에서 3일간 키운 후, 상토로 옮겨 심어 성숙한 식물체의 잎과 뿌리에서의 유전자 발현을 관찰하였다. LAS3000의 조건은 precision, standard, exposure time 1초(excitation filter 460nm, barrier filter 510nm)로 하였다.

환경 스트레스에 의한 유전자 발현 유도의 여부 확인은 vegetative tissue의 경우에는 빛 조건의 온실, 자연풍에 2시간동안 말린 후, 꽃은 출수하기 직전에 화분에 심어져 있는 상태 그대로 3일 동안 말린 후, 채취하여 stereomicroscope SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용, 잎과 뿌리, 꽃의 호영을 제거하기 전과 후를 관찰, 기관별 GFP 발현을 관찰하였다.

6. RT-PCR(reverse-transcriptase PCR)을 통한 sGFP 발현양 관찰

스트레스 처리 전과 후에, 발아 후 20일, 60일이 지난 형질전환 벼의 잎과 뿌리, 출수 전의 꽃 기관, 종자에서 total RNA를 추출하였다. total RNA 추출에는 RNeasy plant mini kit(Qiagen, Cat. No. 74904)을 사용하였다. 추출한 total RNA 400ng으로 first strand cDNA 합성을 하였고(Invitrogen, Cat. No. 18080-051), 이 cDNA 합성 반응물 2ul를 취해 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 두 종류의 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 프라이머는 프로모터간 삽입된 GFP의 발현양을 상대 비교하기 위한 프라이머(프라이머 GFP)이고, 두 번째 프라이머는 사용한 cDNA 양(loading control) 비교를 위한 프라이머(프라이머 Ubi)이다. 프라이머 서열은 아래와 같다.

GFP 정방향 프라이머: 5'-GCAGAAGAACGGCATCAAGG-3'(서열번호 10)

GFP 역방향 프라이머: 5'-GGTGCTCAGGTAGTGGTTGT-3'(서열번호 11)

Ubi 정방향 프라이머: 5'-GAATCGCCTTCTCAAGATGC-3'(서열번호 12)

Ubi 역방향 프라이머: 5'-AATGGTGTCCGAGGACTCAA-3'(서열번호 13)

PCR 조건은 PTC200 PCR machine(MJ research), cDNA 2ul, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 주형 특이적 프라이머 각각 4pmol, 전체 20ul 반응으로, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 4℃ 10분, 25 사이클로 진행하였다.

실시예 1. 프로모터에 의해 조절되는 내재 유전자 발현양의 비교

프로모터들을 분리하기 전에, 이 프로모터들에 의해 발현이 조절되어지는 유전자들의 발현양을 낙동 벼에서 관찰하였다. 전 발달단계, 대표적인 기관들에서 스트레스 처리 전과 처리 후, total RNA를 추출하여, 각 유전자들에 특이적인 프라이머를 제작하여 RT-PCR을 수행하였다. 예상대로, 스트레스 처리 전에는 거의 발현하지 않다가, 처리 후 그 발현양이 현격히 증가함을 관찰하였고, 따라서 이 유전자들의 프로모터들을 분리하였다. Wsi18, LEA, UGE 유전자는 종자에서도 발현하였고, 전 발달단계에서 스트레스 처리 후에 발현양이 현격히 증가하였다. 특히 LEA는 종자에서의 발현양이 다른 프로모터들보다 가장 높았고, 잎과 뿌리 모두에서 발현율이 우수하였다. Wsi18은 스트레스 처리 후에 특히 뿌리에서의 발현양이 잎보다 훨씬 우수하였다. UGE는 꽃에서의 유도성은 그리 높지 않았지만, 잎과 뿌리에서는 발현율이 다른 프로모터들 못지 않았다. DIP2는 basal level expression이 다른 프로모터들에 비해서 높고, 종자에서는 거의 발현을 하지 않았다. 하지만, 발아 후 20일째에는 발현율이 그다지 높지 않았으나, 그 이후의 발단단계에서는 발현양이 증가하였다. NCED3, PSY2, DXS2 프로모터는 캘러스, 종자, 발아 후 7일, 20일, 30일, 60일 그리고 꽃 단계에서 스트레스 처리 전과 후에 관찰하였다. 위의 프로모터들과 는 다르게 종자에서는 전혀 발현을 하지 않았고, 전 발달단계의 vegetative tissue에서 스트레스 처리 후 발현양이 증가하였다 (도 1).

실시예 2. 프로모터의 증폭을 위한 프라이머 서열 디자인

벼의 게놈에서 본 발명의 특정 프로모터를 분리하기 위한 프로모터 특이적 프라이머 서열은 하기와 같다.

a. Wsi18 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTCTAATATTATCAGCCCGGAG(서열번호 14)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTACCAACACACGAACTGAAAC(서열번호 15)

b. LEA 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTTCACATGCAGCGATATGAAT(서열번호 16)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTGCGCGAATGTTAGAACTCTG(서열번호 17)

c. UGE 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTCGATCGAATGACGGACGTTA(서열번호 18)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTGTGTGTGGGGTTTGATGAAG(서열번호 19)

d. DIP2 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTATAGCTGTTGTACTGATGTC(서열번호 20)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTCTCTCGCAGTATTACCAACA(서열번호 21)

e. NCED3 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTTCCAGCTAGTTCCAGCTAAG(서열번호 22)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTTGGTGAGACGCGGCCAAGAT(서열번호 23)

f. PSY2 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTCTACGTTCGTCGTTCCTCAC(서열번호 24)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTGTCGACGAACACGCGTTGCC(서열번호 25)

g. DXS2 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTACGCATGCTCTTATCGTAGG(서열번호 26)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTTACCGCGACGCAGCAAGCAAG(서열번호 27)

실시예 3. 본 발명의 프로모터 서열의 분리

본 발명에서 분리한 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터 서열은 하기와 같다: ① Wsi18 프로모터 서열(1887bp); AK064074 (서열번호 1), ② LEA 프로모터 서열(1963bp); AK119713 (서열번호 2), ③ UGE 프로모터 서열(1889bp); AB087745 (서열번호 3), ④ DIP2 프로모터 서열(1799bp); AF503583 (서열번호 4), ⑤ NCED3 프로모터 서열(1938bp); AK119780 (서열번호 5), ⑥ PSY2 프로모터 서열(1928bp); AK108154 (서열번호 6), ⑦ DXS2 프로모터 서열(1863bp); AK100909 (서열번호 7).

실시예 4. 벼 형질전환용 벡터 제작

벼 형질전환용 벡터를 제작하였으며, 도 2에 도시하였다. 도 2의 A는 PCR로 분리한 프로모터를 클로닝하기 위한 모벡터인 pMJ401이다. attR1, attR2 자리는 BP 반응 후 프로모터가 가지고 있는 attL1, attL2 서열과 재조합(자리 특이적 재조합)이 일어나는 부위로, LR 반응 후, 프로모터는 카세트와 교체되고 attR1, attR2 서열도 attB1, attB2 서열로 교체된다. 각 유전자에 대한 설명은 하기와 같다. MAR: matrix attachment region(1.3kb), X98408; 카세트 B: 전환 카세트 B(1.7kb), invitrogen, Cat. No. 11828-019; sGFP : 변형된 녹색 형광 단백질 유전자(0.74kb), U84737; T _PINII : 프로테아제 저해제 II 터미네이터(1.0kb), X04118; P _{OsCc1 ;} OsCc1 프로모터(0.92kb), Af399666; Bar : 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자(0.59kb), X17220; T _NOS : 노팔린 신타아제 터미네이터(0.28kb).

도 2의 B는 삽입되는 본 발명의 프로모터를 포함하는 벡터를 나타낸다. 각 프로모터에 대한 설명은 하기와 같다: P _Wsi18 , Wsi18 프로모터 서열(1887bp); AK064074; P _LEA , LEA 프로모터 서열(1963 bp); AK119713; P _UGE , UGE 프로모터 서열(1889bp); AB087745; P _DIP2, DIP2 프로모터 서열(1799bp); AF503583; P _NCED3, NCED3 프로모터 서열(1938bp); AK119780; P _PSY2, PSY2 프로모터 서열(1928bp); AK108154; P _DXS2, DXS2 프로모터 서열(1863bp); AK100909. 프로모터에 의해 조절되어지는 유전자의 accession number를 뒤에 표시하였다.

실시예 5. 형질전환 벼 종자 내에서의 sGFP 형광 발현

각 프로모터 운반체를 형질전환시킨 벼로부터 T₂, T₃단계까지 후대 획득 후, 종자를 종단, 횡단면으로 잘라 stereomicroscope SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 GFP 발현을 관찰하였다. 형질전환을 시키지 않은 대조구(negative control)에서는 배(embryo) 쪽에 약간의 background가 있지만, 종자 전체적으로 GFP가 발현되지 않았다. 호영을 벗겨낸 현미상태에서, 새롭게 개발한 환경 유도성 프로모터들의 GFP 발현 패턴은 크게 두가지로 나뉘었다. Wsi18 프로모터, LEA 프로모터, UGE 프로모터는 종자의 배 뿐만 아니라 배유에서도 강한 GFP 발현을 보였다. 종자 내에서 단백질 발현양이 제일 높다고 알려진 호분층(aleurone layer)뿐만 아니라, 전분(starch)이 대부분인 배유의 내부 녹말저장세포에서도 GFP가 발현되었다. 이 프로모터들의 형광 발현양은 항시 발현 프로모터 중, 종자에서 가장 발현양이 높았던 maize ubiquitin 프로모터보다 훨씬 강했다. 반면에, DIP2 프로모터는 배유에서는 발현을 하지 않았고, 배와 호분층(aleurone layer)에서만 발현하였다. 이들 프로모터들의 발현양은 rbcS 프로모터보다 훨씬 높았고, 특히 DIP2의 경우는 OsCc1 프로모터와 형광 발현양이 거의 비슷하였다 (도 3).

실시예 6. 형질전환된 성숙한 식물체에서의 sGFP 형광 발현

각 프로모터 운반체를 형질전환시킨 벼로부터 T₂ 단계까지 후대 획득 후, 종자에서 호영을 벗겨 내고 stereomicroscope SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 GFP 발현을 관찰하여 동형접합체(homozygote)인지를 확인하였다. 확인된 종자들은 종자 소독 후, 항온기(27℃)에서 암 상태 및 광 상태로 5일간 발육 시킨 후, 상토로 옮겨 심어 약 60일 후, 성숙한 식물체의 잎과 뿌리에서의 유전자 발현을 관찰하였다. 환경 스트레스에 의한 유전자 발현 유도의 여부 확인은 빛 조건의 온실, 자연풍에 화분상태로 물을 주지 않은 채, 3일 동안 말린 후, 채취하여 stereomicroscope SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용, 잎과 뿌리에서 GFP유전자의 발현을 관찰하였다. 도 4에서 왼쪽 패널은 스트레스를 처리하지 않은 상태 식물체의 잎과 뿌리이고, 오른쪽 패널은 한발 스트레스 3일 처리 후의 GFP 발현 그림이다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환을 시키지 않은 대조구(negative control)에서 GFP는 발현하지 않았지만, 종자의 배와 배유에서 GFP 발현이 강했던 Wsi18 프로모터, LEA 프로모터, UGE 프로모터는 스트레스 처리 후의 유전자 발현양도 상당히 높았다. 하지만, LEA의 경우, 엽록소가 없는 잎의 안쪽면을 사용하여 관찰한 결과, GFP가 나타나지 않았다. DIP2 프로모터는 스트레스를 처리하지 않은 상태에서도 발현을 보였고, 스트레스 처리 후에도 발현이 증가함을 관찰할 수 있었다. 이는 내재 유전자의 발현양상을 관찰한 결과와 같다.

실시예 7. 형질전환 벼 꽃에서의 sGFP 형광 발현

종자 및 어린 묘에서 GFP 발현을 균등(homozygous)하게 보이는 T₂ 후대 종자를 온실에 파종하여 꽃이 출수하기 직전에 빛 조건의 온실, 자연풍에 화분상태로 물을 주지 않은 채, 3일 동안 말린 후, 채취하여 스트레스를 처리 전과 처리 후, stereomicroscope SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용, 꽃의 호영을 제거하 기 전과 후, 조직별 GFP 발현을 관찰하였다. 60일의 성숙한 식물체에서 관찰하였듯이, 스트레스를 처리하지 않은 상태에서는 꽃에서도 유전자가 발현을 하지 않았다. 하지만, DIP2의 경우에는 다른 환경 유도성 프로모터와 달리 스트레스를 처리하지 않은 상태에서도 꽃의 전체에서 GFP가 강하게 발현되었다. 이는 DIP2 프로모터가 환경 스트레스 유도성 프로모터이면서, 그 유전자의 발현에 있어 그 외 다른 프로모터들과 구별되는 기작을 가지고 있음을 나타낸다. 전체적으로 모든 프로모터가 vegatative tissue에서처럼 스트레스 처리 후 꽃의 모든 기관에서 GFP가 발현되었다 (도 5).

실시예 8. RT-PCR을 이용한 벼 식물체에서의 sGFP 발현양 관찰

한발 스트레스 처리 전과 후, 발아 후 20일, 60일이 지난 벼의 잎과 뿌리, 출수 전의 꽃 기관, 종자에서 total RNA를 추출하였다. total RNA 추출은 RNeasy plant mini kit(Qiagen, Cat. No. 74904)을 사용하였다. 추출한 total RNA 400ng으로 first strand cDNA 합성을 하였고(Invitrogen, Cat. No. 18080-051), 이 cDNA 합성 반응물 2ul를 취해 주형으로 PCR을 수행하여 증폭시킨 후, 1.2% 아가로스 겔에 전기영동하였다. 마커는 100bp ladder 500ng을 사용하였고, 각 PCR product는 5ul 씩 로딩하였다. GFP 프라이머로 증폭시킨 PCR 산물로, 프로모터간 삽입된 GFP의 발현양을 상대 비교하기 위한 것으로 산물의 크기는 142bp이다. 스트레스 처리 전에는 그 기본 발현양(basal expression level)이 거의 없거나, 약간 발현하는 수준으로 다양하지만, 모든 프로모터가 vegatative tissue인 잎과 뿌리, reproductive organ인 꽃에서 스트레스에 의해 발현양이 증가함을 관찰하였다. 이는 현미경으로 관찰한 GFP의 발현과 같다.

Wsi18, LEA, UGE의 경우, 처리 전의 발현양은 극히 미미하였으나, 스트레스에 의한 발현양은 현저하게 증가하였다. 이 세 프로모터, 특히, Wsi18의 경우, 서로 다른 3라인간의 발현양의 증가가 다른 프로모터들에 비해 균일하였고, 뿌리에서의 발현양의 증가는 상당히 우수하였다. LEA는 현미경의 이미지와는 다르게 뿌리보다 잎에서의 발현양의 증가가 현저하였고, 잎에서의 스트레스 처리 전의 발현양은 다른 프로모터들보다 가장 낮았다. DIP2 프로모터는 basal expression level이 가장 높았으나, 전 발달단계에서 스트레스에 의해 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이 프로모터들은 종자와 꽃에서도 유전자의 삽입 부위가 서로 다른 3라인에서 모두 발현하는 것을 관찰하였다. 결과적으로, 이 프로모터들은 전 발달단계, 모든 식물체의 기관에서 스트레스에 의해 발현이 유도되어졌다 (도 6).

실시예 9. 스트레스 처리 후 시간 경과에 따른 벼 식물체에서의 sGFP 발현양 변화

한발 스트레스 처리 후, 시간의 경과에 따른 유전자들의 변화 추이를 관찰하였다. DIP2, Wsi18의 경우, 스트레스 처리 4시간까지 증가하다가, 그 이후 발현양이 감소하였고, UGE 역시 발현양의 증가가 DIP2, Wsi18처럼 현저하진 않지만, 기본 발현양보다 4배 증가 후 발현양이 유지됨을 관찰하였다. LEA는 2시간까지의 증가율이 가장 높지만, 그 발현양은 시간이 흐를수록 증가하였다 (도 7).

지금까지의 결과로 환경 유도성 프로모터는 크게 두 부류로 나뉘었다. 종자의 배와 배유에서 발현을 하고, 스트레스 처리 시 모든 기관에서 발현양이 급격히 증가하는 Wsi18 프로모터, LEA 프로모터, 주로 잎과 뿌리에서 발현이 유도되어지는 UGE 프로모터, 배, 호분층에서만 발현을 하고, basal expression level은 높지만 전 발달단계와 기관에서 스트레스에 의해 유도, 발현하는 DIP2 프로모터이다. 이 프로모터들은 시간의 경과에 따른 프로모터의 활성에 따라, 계속 증가하는 LEA, 4시간까지 증가하다가 감소하는 DIP2, Wsi18 그리고 증가 후 발현양이 유지되는 UGE 프로모터로 나뉜다. 특히, 이 DIP2 프로모터는 다른 프로모터들과 다른 기작이 존재함을 암시한다.

도 1은 본 발명의 프로모터에 의해 조절되는 내재 유전자 발현양을 비교한 것이다. 패널 A에서, DAG는 days after germination을 나타내며, "-"는 한발 스트레스 처리 전 상태를 나타내며, "+"는 한발 스트레스 처리 후 상태를 나타낸다. 패널 B에서, 예를 들면, 7d는 한발 스트레스 처리 전 상태를 나타내며, 7d-dro는 한발 스트레스 처리 후 상태를 나타낸다.

도 2는 환경 스트레스 유도성 프로모터 활성 분석용 벼 형질전환 운반체 모식도이다.

도 3은 형질전환 벼 종자 내에서의 sGFP 형광 발현 결과이다. NC: 음성 대조구 Nakdong(비형질전환 종자); Wsi18: Wsi18 프로모터; LEA: LEA 프로모터; UGE: UDP-glucose 4-epimerase 프로모터; DIP2: DIP2 프로모터.

도 4는 형질전환된 성숙한 식물체에서의 sGFP 형광 발현 결과이다. 왼쪽 패널(Normal)은 스트레스를 처리하지 않은 상태 식물체의 잎과 뿌리이고, 오른쪽 패널(Drought)은 한발 스트레스 3일 처리 후의 GFP 발현 그림이다. NC: 음성 대조구 Nakdong(비형질전환 종자); Wsi18: Wsi18 프로모터; LEA: LEA 프로모터; UGE: UDP-glucose 4-epimerase 프로모터; DIP2: DIP2 프로모터.

도 5는 형질전환 벼 꽃에서의 sGFP 형광 발현 결과이다. 각 기호는 도 4와 동일하다.

도 6은 RT-PCR을 이용한 벼 식물체에서의 sGFP 발현양 관찰 결과이다. DAG는 days after germination을 나타내며, "0"는 한발 스트레스 처리 전 상태를 나타내 며, "2" 및 "3"은 한발 스트레스 처리 후 상태를 나타내며, #1, #2 및 #3는 서로 다른 3가지 라인을 나타낸다.

도 7은 스트레스 처리 후 시간 경과에 따른 벼 식물체에서의 sGFP 발현양 변화를 나타낸다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation <120> Promoters inducible by environmental stresses and uses thereof <130> PN09062 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1887 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1887) <223> Wsi18 promoter <400> 1 ctaatattat cagcccggag aaagtacaca tatatattgt gggaaagttt gtaggtggct 60 ttaagcttga ggctagctgc aagcttgagt catagggaga aaacaaatcg atcatatttg 120 actcttttcc ctccatctct cttaccggca aaaaaagtag tactggttta tatgtaaagt 180 aagattcttt aattatgtga gatccggctt aatgcttttc ttttgtcaca tatactgcat 240 tgcaacaatt gccatatatt cacttctgcc atcccattat atagcaactc aagaatggat 300 tgatatatcc cctattacta atctagacat gttaaggctg agttgggcag tccatcttcc 360 caacccacca ccttcgtttt tcgcgcacat acttttcaaa ctactaaatg gtgtgttttt 420 taaaaatatt ttcaatacaa aagttgcttt aaaaaattat attgatccat ttttttaaaa 480 aaaatagcta atacttaatt aatcacgtgt taaaagaccg ctccgttttg cgtgcaggag 540 ggataggttc acatcctgca ttaccgaaca cagcctaaat cttgttgtct agattcgtag 600 tactggatat attaaatcat gttctaagtt actatatact gagatgaata gaataagtaa 660 aattagaccc accttaagtc ttgatgaagt tactactagc tgcgtttggg aggacttccc 720 aaaaaaaaaa gtattagcca ttagcacgtg attaattaag tactagttta aaaaacttaa 780 aaaataaatt aatatgattc tcttaagtaa ctctcctata gaaaactttt acaaaattac 840 accgtttaat agtttggaaa atatgtcagt aaaaaataag agagtagaag ttatgaaagt 900 tagaaaaaga attgttttag tagtatacag ttataaacta ttccctctgt tctaaaacat 960 aagggattat ggatggattc gacatgtacc agtaccatga atcgaatcca gacaagtttt 1020 ttatgcatat ttattctact ataatatatc acatctgctc taaatatctt atatttcgag 1080 gtggagactg tcgctatgtt tttctgcccg ttgctaagca cacgccaccc ccgatgcggg 1140 gacgcctctg gccttcttgc cacgataatt gaatggaact tccacattca gattcgatag 1200 gtgaccgtcg actccaagtg ctttgcacaa aacaactccg gcctcccggc caccagtcac 1260 acgactcacg gcactaccac ccctgactcc ctgaggcgga cctgccactg ttctgcatgc 1320 gaagctatct aaaattctga agcaaagaaa gcacagcaca tgctccggga cacgcgccac 1380 ccggcggaaa agggctcggt gtggcgatct cacagccgca tatcgcattt cacaagccgc 1440 ccatctccac cggcttcacg aggctcatcg cggcacgacc gcgcacggaa cgcacgcggc 1500 cgacccgcgc gcctcgatgc gcgagcccat ccgccgcgtc ctccctttgc ctttgccgct 1560 atcctctcgg tcgtatcccg tttctctgtc ttttgctccc cggcgcgcgc cagttcggag 1620 taccagcgaa acccggacac ctggtacacc tccgccggcc acaacgcgtg tcccccctac 1680 gtggccgcgc agcacatgcc catgcgcgac acgtgcacct cctcatccaa actctcaagt 1740 ctcaacggtc ctataaatgc acggatagcc tcaagctgct cgtcacaagg caagaggcaa 1800 gaggcaagag catccgtatt aaccagcctt ttgagacttg agagtgtgtg tgactcgatc 1860 cagcgtagtt tcagttcgtg tgttggt 1887 <210> 2 <211> 1963 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1963) <223> LEA promoter <400> 2 tcacatgcag cgatatgaat gaaatgacca ttctaccctt atataccata tagaaaagaa 60 taaaaaaaga aaacaaatgt tttcacgcgt gtatgatcgt tttacaattg tcacttatga 120 ttgctacaac caagcactga tcgtataaat tcttttgtcg gccaccctcc gcaataatat 180 tgggcatggg ctggcctgtt tatttttcct gtttgtcttt tctttctttt ctatatggta 240 tataatggta gaatagtcat ttcattgagg atgacttggc atgctcacgt ggcatttttt 300 ttggtctaag gactatatta acccaaatga ttaatttaga ggacttgtct ggacgatttg 360 aaatctcaag aactaaactg agctcaaaac gaaacttcaa ggaccatatt aactattcac 420 cctagtttta atcgcactcg tgcaaagtaa gtattcccta tgtccctaaa tataagagat 480 tttggtctga tgtgatatat ttcatatcta gatttatcgt attaggattt atcatatcta 540 accaaaatcc cttatattta gggaggaggg agcactacgg cgcaccgact gaccgaccta 600 tggggcttac ccatgagccc cgaagttgga cgtgtcaggt gagatacgcg cgtgtaccga 660 tgccacaata tgtacgtatg gtcgatgctg caccgaggct agcagcacga aagggcctcc 720 ataacctacg cctagcccta gcacgatgga tggcacagtg cgtgcccatc ctgcatctgc 780 atgggttagt gcgtgctacg ctgcgacggc gacgacgatg tagcctagcc ggtgtgtgca 840 gtgcagtgca ggtcaggatt gccactatga ccaaaggatg cttgtgtgcg atcaataatg 900 gccgctcaat gtgtcatcgt acggtgacac accactcatc ctttgttgat ctgtggtgat 960 cgacttgagt taatcggcaa ggcccagccc atggtttgag gtcagggcca ggctgaattt 1020 ggcccagtaa ttttggtttg agaagcccac ttcgtcacag cgtcaggccg aattactggc 1080 ccatggtgag cccatggcat ccatccccat gaattgacct tgtctttctc ttttttctct 1140 cgatctcgaa aagatgagca gatactcgta attaaaccgc aaacatctgc cacccatgta 1200 atgataacaa tcgttaacga tgccatgcat ctcccgaagc ttctgtgcct actcatttga 1260 gtgcgagacc ttcctaacat gtgtcccctt aacattgttt actccctttg ccgccaaagt 1320 ggttactaca cactccaaac ttttgtggca gaagtacact caaaagcgaa aggtagcaga 1380 acacatcagg catccaaatt aacaacaaca ccatttacaa tcagacctga acacgttgat 1440 cggcgacatc aggcgccgca catggcaacg acacccgatc gtcaccaagt gtaaaaacta 1500 aagccgcatc caacttgtac tcgccaaaca gccaccgacg atcgacgttt cgatcgcctg 1560 tatcgacaca ctgagtcgat ctgatcatga tcagtttcaa ctcgctgtgc ccacgtgtcg 1620 agagatcggc acgtgcctga gctctcagcc gctcataaat acacttgttt agtagcaaca 1680 gtatactata gtagtcctct cctgtttggc ttttagcttg catatcgatg gatggatgga 1740 tggatcgcat gagagggctt cgcgaaggta cggaacctta cacaacgcgt gtcctttcta 1800 cgtggccatc gtgtaggcgt ctcgccatgc tacgtgtccc ggaggatgtc tcgatgccaa 1860 cccttataaa tactgttcca ttccaatccc atcgccacag ccagtgcaaa tctgagcgat 1920 caagataatc gagcaaaatc catcagagtt ctaacattcg cgc 1963 <210> 3 <211> 1889 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1889) <223> UGE promoter <400> 3 cgatcgaatg acggacgtta tgcttattcc ggtgaaagaa atgcgtgtca cacgcattcc 60 ggtgacttga ttttaagcaa gcaatcaagc tagctagcgc caccccgcgg agtcaaccgt 120 acgtggatcc atgcatccat cgattcatgc ttaattatat atatgctcct gcgtgcgagg 180 gccttaaagc gcatcaaatc aaatgactag ctaatgcggt aatgccttca acttcaaatg 240 gagtacctgc ctatttacgt acgttgcaca atcaagcaac cacatccact ttaattttct 300 ctatctctct tgagcctctg tttccttcct ttacttgctg tcaaaaaagt ggcatcaccc 360 ccacctcaca atgcaagcaa tgctgctgta acatgatcaa cgacagcata tatattgcgc 420 tacttgctgt taacgttaat gattcgactc tacatagtaa cgatggaagt acaggcgggg 480 aaacgaatta gacacagttt tcgtgttcct tccccccggc ggggtgggtg tcccttaatt 540 aaataacacg atgcaagtac tacaagcgta acacaacaca cttgagccta acgaatcaat 600 ttaattatct ccatgtgttt acaaaaagag ccacacagtt cgctcttaat ttactccctt 660 ttgttgaagg ggaagttaat ttacttggtg agatttgagc aaatccacaa acttgaaggt 720 ggttggcagc cgaataatat gcgtttagtt gttatagggg ctgtttagat tgatgctatt 780 ttcagccata caaagttgac aaaaatttgt taccaaattt ggtaaatata taaaaaatgc 840 tgtcaaaatt ttggcaatat tgccaacttg atagggttta ttttggctgc aatctgaaca 900 ggcctatgga aggaaggtaa aagaaagagg gaccgacgat atatagattt cttaatagaa 960 gtggtgagta ggagtaataa acaatggagt gataatctct atctctatct ctactattat 1020 aaaaattgaa atgtttatgc ggtccatcat ccgtgtttga ggttcgtcat ccgtatttga 1080 agtcggtttt ctttggtttt aatctatatc tcttctctac tattacaaaa actgaagatg 1140 tttttgcggg tattttgata catcatccgt gtttgagtcg ggtttttaaa ttcatttgct 1200 tttggaaata caaaaggaat catataaaaa tctctttaaa caaacttgta tgctaacttg 1260 agatgaatgt cgaactccta attgcagctc atgtttttct agaaaaaaaa tccaagcgaa 1320 ttcccacggt ggattaacag ttataagatt aaaatagcat tcatccgttg caacgcacgg 1380 acattttcgt tcacttttgg taatatagaa gaaatcatat aagaaatcta tttaaaaaac 1440 tcgcatgcta gtcgtgggaa gaaaactcgt gaaggaagga gaagattttg caaagagata 1500 agaattgggc gtacacgtgg gcggggcaga tcgatcttag atacatacag attgaaaaag 1560 aaaaaaaaga aaagaagaag gagaggttga gggagggaag gaagctagga aaaagggaaa 1620 tactcctaag gaacgcggcg gccgtttccc gaaccgtcgc gggcgttccc tagttggact 1680 gggcggttcc atcccagacg caacgcgcag cggtcgtagg agtaggtgtt ttttttttgt 1740 tttgcagttg ccttctctcg aggccggggg gctcggctat atatcctcct cctccccctc 1800 agttccgcac aaacacaaat taacctcctc ctcttcttct tcttccgctc tctagctttg 1860 ctttgcttgc ttcatcaaac cccacacac 1889 <210> 4 <211> 1799 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1799) <223> DIP2 promoter <400> 4 atagctgttg tactgatgtc gtgcctaatg aggaaattgg agtaactgtc taactgattc 60 aacagaggaa attaaatcca ggtgagggat gatcagtgaa tccaaatatt gtactaatga 120 tcatgagtat tttatgtggg cattcttctt gacttgaagt tgtaaccgga cataactgtt 180 gctaggaatg tatgacttga agctttaagc actactacat ctgatgatcc ttacatgttg 240 agcaagaggc tggaagaaaa aaaggatgag agccttttaa cccatgtaac tccaatgctg 300 tctgcaaacc tttcagctgg ttgtgagttg tggctgcaga tctgaggaag ccactgagag 360 agcactaggt aaggtttcta tgttatatct gtaattctgt atatgtttaa tgtgttgtgc 420 tcatttaaaa aaagaactgc atagattcac aaactgcctg gagctttcct cttcactttg 480 ctaatagtat tgaccatgtt ttgggcttgt tgtgtgtttg gaaggagtgg gtctataggc 540 cgtcagtgtt taggcctact aattaagcca gttcagttgg gccttggctg cttccatgga 600 ttaattatga gactaatcgc tgatactcgt acatcaatgc gagaatttgt caaatcaatt 660 ggatcagtat atatcttgcc tgtatgattc acatccatac gtttctatcg agttggttgg 720 aagatttgtg ccgtcgatga cagtgcagaa gagaagcttc cttgcaacta gtgtcgtggc 780 agaagcagag gtagacacat gaaatcgtgt tctaatccgt cgcagctagc tagcatggca 840 gcgacgtgtt tgacgatgac accaccttgc atatccagat gcctctgttt gacctggatg 900 gaacaaacaa taacgtacgt ttttcgagca tctaaatggt ataaattttt agagaaattt 960 ttatgtgtaa tttctttctt ataatatagt tttaaaatct gtttcacaac taatcaattc 1020 agtcgtttgt atcctcgaat cattttcatg ttcaacattc catccattta ggcatttatg 1080 cacagaacag tagaatacat agtttgtcca tgctttaaac gaaaagtaaa aaagaaagaa 1140 aaagacacat attcctctta aaacaatatt cgtttgagat ggtggaggga acaaaggcca 1200 ttgatttgct gcagggtccc tccctaacaa gctgtgatga ttctgtatac gacgatcgtg 1260 caattaagct agtgctttga aagagacaga cagacagaca acttttttcc tcctaatacg 1320 atcggatgaa aactgtcgag cttttatgta gcgtataaac cttgactgtt gcgaggaaaa 1380 aaaagctgta ggaaacaaag aaatcgagga aatgaatttg tcctggtttc gtatatatgt 1440 acatgtacta tatgccaaaa acgcccgtgc ttaacagcta agaaatcggc caaaattcag 1500 gcaaacaaga gacaaagtta gcaggcaacg cgtcactacc gcgtgatcat ttcgacgcga 1560 aggcaatttg gccggtgatc gagcgcgtct cgtgcagtga atgaagtagc ttaatttgct 1620 agtccccaca agtacgtggc actctgccat gtcttctctt agtataaata tatggaagcc 1680 aaagccaaag ccagtcagtt catcagttgc agttcagagt tgcccactgc tactttactt 1740 tgcagctatt ttgcttctgc ttcttcttgt tcttgttgct gttggtaata ctgcgagag 1799 <210> 5 <211> 1938 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1938) <223> NCED3 promoter <400> 5 tccagctagt tccagctaag caacacacac cccccaaccc tacacataca caaacacaag 60 agtgagagag agattaaaat ctaagcactt tttgatgcag tcaacacggc ttaagtgtgg 120 ggtaacttgt aagcagggcc tttcgaggga gagggacacg tgtacaggca gctgatacca 180 ctacacatgt actacttcat ttgctctaaa ataaatttat tttccactca tccctgcaca 240 tgtttatata tgtttatata gaactaaaaa tactatatat aatacccgta cttcataaac 300 tccgagaaaa atataaggaa ctgaaagtaa atttattcta gaatggtgaa ttatctttct 360 ggaacaaaat agtgtacaaa acgcatcttg agaatgcatc gtaagctatt tgataaggat 420 agatgtgacg ttagtgtcac gttgggatag tggtaaaaac caaacctcga atacccagat 480 ttccatacat tttcgtctat gatgaaaaaa atttatgagt ggtgtacttt atatttctga 540 cggtttcttg tttccataaa aacaagcaac caagtctccc caattggttg gttaaaacaa 600 taaatgaacc tcacaaaatt ttgtagtggc cggaatttga tttgaagcat aactaactaa 660 aaagctacta ggagtattgg tttaattttt tatgctaagc tactggttta atttgatagg 720 acggtgtgcc gagtaaaaat taattaggca gaaaggtcta tacattgctc tgcgctctct 780 ctctcctcat ggcagacact aactccactg gagaaaaatg ttaactggaa ttatttggta 840 ttccctccct tcgtttcaca atatattttc ctttttattt atcctaaaac aaatttactt 900 ttaagtaatc actacatcaa attaaagtta atgaaaatag aggataaatc tctactatta 960 tatataaaaa ttaaagatgt ttttgccggt attttggtac gttatccgtg tatgagtatg 1020 tttttaagtt catttggttt tggaaataca tatccatatt tgaatcggtt cttaagttcg 1080 tttgcttttg gtaatacaga aggaattgta taaaaaatct gtctaaaaaa actcgcatat 1140 taacttgaga ctattggatt cctaactgca gctcatgact ttctaaaagt atatatatcc 1200 aaacgaattc cacagtcatc ttaactaaac catatataat aataattaga ttaaaataga 1260 ttttacccgt tgcaatgcac gggtattttc ttatagtaca ttaaaaattt ttaaaaaaac 1320 aaggaataat tgtattaaga tttaataaat tatgatattt taaacttttt aaaaaaaacg 1380 agatttgaag ggagatatcc ctccaaacat tttttataag aaattatgag cgtgttacgg 1440 attaaacaca ggaccatata agtgaaatca tataaccctt tactatcaaa tgcatctcta 1500 atttagtttt ttttattcgg gagtactgat tatatcccct aataaaagaa acatgaagca 1560 atttagtcat gcgttaatca cacaacaagg acaacttatt aaaaagtgtg atccatccac 1620 gtggtgtttt gagccactgc agcagtggta ttgtgacaga caaaggagga ttccatgcgt 1680 ctacaaccaa aaaccatcag cctctcctcc cgccacgtgt cccccccacc cgctcccgcc 1740 actttcaaac cccacttccc ctttgaccgc ctctcccgcc acctcctata aatctcccca 1800 tgattcctcc ctcccattcc ccacctcacc tcacctcctc ctccacctcc tcgaaattat 1860 tcgaatccat ctccttctcc ctcctcccaa cccgcgccaa atcgatcgat cgcgagcgat 1920 cttggccgcg tctcacca 1938 <210> 6 <211> 1928 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1928) <223> PSY2 promoter <400> 6 ctacgttcgt cgttcctcac acccccaccg catccgcacg ccgatgccgt gcgcgcgccg 60 cacccgcgtc gcgggtggag ccggccggcc accacacaag tactacgtac gtacgtcggg 120 tggggcgcgc gacgtgccgg cacgcggcgc ggttgggcgg gagctcgtgc gtaagcgagc 180 acccgcgcga cagcggcggc gaccgaggaa atgaatgaga tcgagcgcaa caacgacggc 240 caccgcgggt tattagggtt gggtggggag gccaccacag tctggtctac gggccaatca 300 tagcgcggga gggcccacac tggccgatcg acatgggtgg gcccactctc ctcgcgcccc 360 caccacgtgt ccccgagact cccccagtcg tgggtcggtg acatgtggga cccagcacag 420 atgagtgcat tggtagtttg gtcggtgaat ttttaattaa tctctcaagt ctcaactgta 480 ctgacgtgca tgtttggaca aatcttgata ctcctatgtg agaacaatct tgcgatgaat 540 tttgctcgcc tttgtacgag gtaagtactt gtacagttgt actagatgaa gagtgtgcag 600 ctcctcaggt caagtaaatg tctagtttcc tcgcaaaaaa aaaaaaagag taaatgtcta 660 gtttaatcgc tcctggacta gcatgtgtcg agtagtatgt atccatgtat acgactcttg 720 gtcttggtga agtaagaatg ccaagcacat cgtggtttaa tttgttgttc agccgagtac 780 agtagtcgtg taggatgaga aagagaccgt catgaaacag aacgatactg ggtgactggt 840 tgtgcgattg tgtttgtgaa agtgtgtcta gctggtttct gtaggatgat gcgccataga 900 ccatatcgca ccaacatcag acaataatat gctgcacaaa gtgcatatgc cacttcttgc 960 ttgatactat ctccatccta aaataaattc atttttcaca catctcgcac ataccataaa 1020 aaaaatcaaa atatctctac tttatcaaat tccaatgtaa ttatttcaca ctttagctac 1080 tcccaatata attattttct attttcacaa actcagataa aataattact cgaaaaataa 1140 acttattttg aacaaatgta aaaaaaaatt atcatgggac atagtagtag ggaactgctt 1200 tagcagctcg agtggacgtc cacccgttta ttgcatgtca tctaaatgtt ttatgaaaaa 1260 attaaaaaaa tatgaacaat atgtaatata tcaatctaca aacatattag ttaaaattta 1320 acttctacaa attgtaacaa aaataacaaa caaaactcaa attactatat gtattaaatt 1380 tgttattttt gttataactt gtagaagtta aatttaaact tgtatgtttt tgaagtgata 1440 tattacatat tgatctatct tgttattttt taaaaaactt ttcgtaacta cctagttgac 1500 atacaataaa cgggggtgga cgttactcta gctattagaa tccatgtccg agcagcagta 1560 gtagtagcta ccctgcctac tagctgacca gtatcattct ggcacttgtt ctcacgatgt 1620 catcgataag gttcacttca cctgcatgcc cagccaatga gccagcaatc gcgttgttcc 1680 tgctgccgcg aagagctgca ggtgtaagac tgccacgtgt cctctcgcct ccacattaca 1740 aaacggccgc cagggagcaa cgagctttgt gagactgtga gctaactcct gcagctagct 1800 gaagaagaag aagaagaaga aaccagcggc caagtacgtc gtcgtcggcc atgatgtcca 1860 ccaccaccac cagcagcgcg gcggggtcgc cggtgtgcgc tcgtcggcgg caacgcgtgt 1920 tcgtcgac 1928 <210> 7 <211> 1863 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1863) <223> DXS2 promoter <400> 7 acgcatgctc ttatcgtagg aaagtttatt ttggttgagg ctgccaaata aattggactt 60 ctttctcatc aactttggcc tcaaaatata ttctgagcac ggtttaacgg tgatggtgaa 120 cataaagcta attataagcc cattagttca aaattggctt gcttttatta attagttatc 180 gccacttctt tttcatcggc ttggttcaaa attgacttgc atttatttat tatcatctta 240 ctgtatctta aaatattaat ttaaaaaaca aggtaatgag ttgagccaga atgaaatcaa 300 ctttatttaa gatcagttag ttttattctt aaaaataaaa cgagagtata tgtaattgaa 360 gtaattttga tcattgccaa tgtgttgtcc acataggttg ttattttttt agttaaacaa 420 gggttgtacg tattaattgt tagttagaat atatatttgc ctgctacatg catataggca 480 tatgcctttt ttggactttg cagcttgcag aaggaggtta tttggcaact attttcttta 540 aaaaaaaagg gacaaaagac agtaggggcc tcaccatctt attgtcaatt aaaaagttcc 600 aacaattaca tgttggtcct caattggaag gctccacaag gaaaataaaa attacaattg 660 agcccttttc acaaacagag ctaccgctag tgatatcctt tcttcttttt ttaataaatg 720 atgacattga ctttttaata tacgtttaac cattttgtct gatttaaaaa ttgtgtaaat 780 acataagata taaatcatgc ttaaaatgct ataaaacaac taacagtaaa ataaataata 840 attacataaa aaattaaaat aagccgaata atcaaatgga tatctaaaag taaacaacgt 900 catctattta aaaagagata gtatgttact gtatgattaa ggaccacaga tacatgtctt 960 tttggacttt atacaaggtg gatatgttgt gatttttttt tttgaaaaat gaacaatggc 1020 catatgggcc ttatcaccct attcatcata ttaccaattt aaacaaggga ccatttcctt 1080 gtaataaata acatgtaggt cctcatcaag gaccaaagat aaaaataaaa aactacatat 1140 tattgagccc ttgtcagtaa caaagctagt gatatacggt acaattattg aggctaacct 1200 tttgtacatg tcagctcatc tcactctcga ctacttggct tctaatttac agtaatttta 1260 tcctaaaaga aaaaattata ttttttttga cacagttaaa tttcggacac atatttaacc 1320 attcgactta ttaaaaattt atacaaacac ataagatata aatcatgctt aaaatatttt 1380 tagcgataaa acaactcaca ataaaataaa taataattac gtaaattttt ctaaataaaa 1440 caaatggtca acctctagtt aaagttaacg gcgttaactg tataccccgc gagacaatga 1500 cacatcatct cacgagaagt tatatagcag cactgcagca gcttcccccc gaaagcacag 1560 tcattttctc gcgccacgtt taaatcgttt ttatttaaat ttaattcttc tcccgctaaa 1620 acttgcttgt ctgtttgttt tatttattta tgacgtcatt attcccctct cgcgcgccta 1680 taaaatccgc ctccatctct gcttctcctc ccactcctct tcctcctcct cctcctcctc 1740 ctgcgatccc ggcgcagcat cgatcgccat tgccactcga gctccgagct cctcggaaaa 1800 gcagtgaacc caccactaag ctcgcgacat ctcgcaacac agcttgcttg ctgcgtcgcg 1860 gta 1863 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 adapter primer <400> 8 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 adapter primer <400> 9 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP forward primer <400> 10 gcagaagaac ggcatcaagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP reverse primer <400> 11 ggtgctcagg tagtggttgt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi forward primer <400> 12 gaatcgcctt ctcaagatgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi reverse primer <400> 13 aatggtgtcc gaggactcaa 20 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wsi18 promoter forward primer <400> 14 aaaaagcagg ctctaatatt atcagcccgg ag 32 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wsi18 promoter reverse primer <400> 15 agaaagctgg gtaccaacac acgaactgaa ac 32 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEA promoter forward primer <400> 16 aaaaagcagg cttcacatgc agcgatatga at 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEA promoter reverse primer <400> 17 agaaagctgg gtgcgcgaat gttagaactc tg 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UGE promoter forward primer <400> 18 aaaaagcagg ctcgatcgaa tgacggacgt ta 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UGE promoter reverse primer <400> 19 agaaagctgg gtgtgtgtgg ggtttgatga ag 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIP2 promoter forward primer <400> 20 aaaaagcagg ctatagctgt tgtactgatg tc 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIP2 promoter reverse primer <400> 21 agaaagctgg gtctctcgca gtattaccaa ca 32 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCED3 promoter forward primer <400> 22 aaaaagcagg cttccagcta gttccagcta ag 32 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCED3 promoter reverse primer <400> 23 agaaagctgg gttggtgaga cgcggccaag at 32 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSY2 promoter forward primer <400> 24 aaaaagcagg ctctacgttc gtcgttcctc ac 32 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSY2 promoter reverse primer <400> 25 agaaagctgg gtgtcgacga acacgcgttg cc 32 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DXS2 promoter forward primer <400> 26 aaaaagcagg ctacgcatgc tcttatcgta gg 32 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DXS2 promoter reverse primer <400> 27 agaaagctgg gttaccgcga cgcagcaagc aag 33

Claims (10)

1. 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 벼 유래의 환경 스트레스 유도성 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 건조 스트레스인 것을 특징으로 하는 프로모터.
3. 제1항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
4. 제3항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
5. 제4항에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 환경 스트레스를 가하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민 및 에리스로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제3항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

   상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
8. 제7항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물.
9. 제8항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
10. 제1항에 따른 프로모터를 식물에 도입함으로써 식물의 환경 스트레스 내성을 향상시키는 방법.

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