KR101131770B1 - 벼 유래의 건조 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래의 건조 스트레스 유도성 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물 및 상기 프로모터를 이용하여 식물의 건조 스트레스 내성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

벼, 형질전환, 건조 스트레스 유도성 프로모터, 단자엽 식물

Description

벼 유래의 건조 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도{Promoter inducible by drought stress isolated from rice and uses thereof}

본 발명은 벼 유래의 건조 스트레스 유도성 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 벼 유래의 건조 스트레스 유도성 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물 및 상기 프로모터를 이용하여 식물의 건조 스트레스 내성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화 된다.

유전자 전이(transformation)를 통한 형질전환 식물체를 개발함에 있어 상시적이면서 강한 발현을 하는 프로모터들, 예를 들어 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S(CaMV35S) 프로모터(Odell et al ., Nature 313: 810-812, 1985)가 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 프로모터에 연결된 특정 유전자의 상시적이고 과다한 발현(over-expression)은 생체대사에 불필요한 대량의 단백질이 주는 유독효과로 인하여 형질전환 식물체가 발아가 되지 않거나 왜소하게 되는 등의 부작용이 나타나는 경우가 많다. 대표적인 예로서, CaMV35S 프로모터를 사용하여 환경스트레스 전사인자 유전자 DREB1A를 과발현시킨 애기장대가 저온 및 저수분 조건에 대하여 저항성을 증진되는 것은 관찰되었으나, 성장이 저해되어 왜소증(dwarfed phenotype)을 보이면서 아미노산 프롤린 및 수용성 당류의 생산이 함께 증가하는 것이 확인되었다(Lie et al., Plant Cell 10: 1391-1406, 1998; Gilmour et al., Plant Physiol. 124: 1854-1865, 2000). 이러한 부작용은 CaMV35S 프로모터 대신 환경스트레스 관련 유전자인 rd29A의 유도성 프로모터를 사용함으로써 최소화할 수 있다(Kasuga et al, Nat . Biotechnol . 17: 287-291, 1999).

그러므로, 식물체 조직에서 모든 시간대에 상시적으로 발현을 유도하는 프로 모터 대신 특정 조건 또는 특정 시기에 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 유도성 프로모터를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 학술적으로는, 미생물이나 동물에서 분리된 프로모터를 식물에 도입하고 화학물질을 유도체로 사용하여 목적단백질의 생합성을 촉발하는 유도성 프로모터 시스템이 많이 개발되었다. 지금까지 화학물질에 의한 발현 유도 시스템으로서 식물에 적용된 예로서, 스테로이드 덱사메타손(dexamethasone), 항생제 테트라사이클린(tetracycline), 구리이온, IPTG 등 화학물질을 유도물질로 처리해 주는 방법이 소개된 바 있다(Gatz et al., Plant J. 2: 397-404, 1992; Weimann et al., Plant J. 5: 559-569, 1994; Aoyama T. and Chua N-H, Plant J. 11: 605-612, 1997). 그러나 이들 시스템에 사용하는 유도물질 화합물들의 가격이 극히 고가이고 그 화학물질 자체가 주는 유독한 효과를 발생하기도 하며 모든 식물에 적용되지 못하는 등의 문제점이 있다.

한국특허등록 제10-0781059호에는 환경스트레스에 의해 활성화되는 유도성 프로모터 및 상기 프로모터를 이용하여 공변세포에 특이적으로 목적단백질을 생산하는 형질전환 식물을 얻는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0578461호에는 벼로부터 유래한 스트레스-유도된 프로모터가 개시되어 있으나, 본 발명의 프로모터와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 환경 스트레스 중의 하나인 건조 스트레스에 의해 유도되는 프로모터 개발에 노력한 결과, 벼 유래의 특정 프로모터가 건조 스트레스에 의해 강하게 유도된다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 건조 스트레스 유도성 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 이용하여 식물의 건조 스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명이 제공하는 프로모터와 이를 이용하여 건조 스트 레스 저항성 형질전환 식물의 품종개발 기술은 다양한 경제작물의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 벼 유래의 건조 스트레스 유도성 ADF(actin depolymerization factor) 프로모터 또는 AWPM 프로모터를 제공한다.

본 발명은 벼 유래의 특정 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1(ADF 프로모터) 또는 서열번호 2(AWPM 프로모터)의 염기서열을 가진다. 또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 식물 발현 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

상기 목적 단백질은, 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질 및 셀룰로즈를 분해할 수 있는 효소이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴, 셀로바이오하이드로라제, 엔도셀룰라제, 베타글루코시다제, 자일나아제 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 건조 스트레스를 가하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 생산된 목적 단백질은 전술한 바와 같다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상 태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다. 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파 알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있으며, 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파와 같은 단자엽 식물일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 도입함으로써 식물의 건조 스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 프로모터에 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자를 작동가능하게 연결하여 식물에 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자는 탈수, 저온 또는 염 스트레스와 같은 환경 스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 데 역할을 담당하는 단백질을 암호화한다. 그의 예는 다음을 포함한다: LEA 단백질; 물 채널 단백질; 상용성 용질의 합성효소; 담배의 해독 효소; 삼투압조절 물질(예컨대 설탕, 프롤린, 또는 글리신베타인)에 대한 합성효소; 세포막 지질의 변형 효소인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 w-3 지방산 불포화화효소 및 남조류의 D9-불포화화효소를 암호화하는 유전자; 프롤린 합성의 주요 효소인 P5CS; 및 갈락티놀 합성을 위한 AtGolS3 유전자.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 300K 벼 3'- 틸링 마이크로어레이(3'- tiling microarray )

비형질전환 벼 종자(오리자 사티바 자포니카 재배종 낙동)는 SMO 배지에서 발아시켰고, 성장 챔버에서 배양시켰다(28℃에서 2일 동안 암 조건을 준 후, 1일 동안 광 조건을 줌). 유묘는 토양으로 옮겼고, 온실에서 키웠다(16h 명/8h 암 사이클). 건조 스트레스를 주기 위해, 14일간 키운 유묘는 토양으로부터 제거하였고, 하루 동안 깨끗한 물에 유지시켰으며, 티슈로 식물체에 있는 물을 제거하였고, 150 μmol.m^-2.s^-1의 계속적인 형광빛을 쪼이며 32℃ 챔버에서 건조시켰다. 0, 0.5, 2, 6, 12시간 후, 잎과 뿌리를 각각 수집하였다. 총 RNAs는 TriReagent(Molecular Research Center, Inc.)를 이용하여 추출하였다. 이 RNAs를 사용하여 벼 3'-틸링 마이크로어레이 분석으로 발현양상을 조사하였다.

벼 3'-틸링 마이크로어레이는 IRGSP, RAP1 데이터베이스 (http://rapdb.lab.nig.ac.jp)에 등록된 27,448개 유전자로부터 디자인하였다. 이 중에서 20,507개 유전자들은 cDNA/EST 기반으로 대표적인 RAP1 서열로부터, 6,941개 유전자들은 부분적인 cDNA/EST 서열로 예상되어졌다. 60-nt 길이의 프로브는 각 유전자의 정지 코돈 끝에서부터 앞쪽의 60bp부터 시작하여 10bp씩 이동시켜 제작하였는데, 이러한 방법으로 프로브 10개를 디자인하였다. 10개의 프로브는 유전자 3' 부분의 150bp를 포함할 수 있도록 디자인하였다. 엽록체 123개 유전자, 미토콘드리아 74개 유전자 및 gfp, gus, hyg, bar 및 kan와 같은 선별마커를 포함시켰다. 프로브의 평균크기는 Tm 값이 75~85℃로 조정된 60-nt 길이이다. 마이크로어레이는 NimbleGen inc (http://www.nimblegen.com/)에서 제작되었다. 혼성화 효율을 모니 터하기 위한 Random GC 프로브 (40,000)와 4개에 기준점에 225개의 프로브를 이미지 상의 그리드를 overlay하는 것을 돕기 위해 포함하였다.

마이크로어레이 분석의 재현성(reproducibility)을 평가하기 위해, 독립적으로 준비된 총 RNA를 이용하여 2 또는 3회 반복실험하였다. 이중 가닥의 cDNAs 합성을 위해 Superscript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Invitrigen, U.S.A.)을 사용하였다. 간단히, 10㎕(10 ㎍) 총 RNA에 1㎕의 올리고 dT 프라이머(100 μM)를 섞었고, 70℃에서 10분 동안 변성시킨 후 얼음에서 혼합물을 5분간 냉각시켜 renature 하였다. 첫번째 가닥 DNA는 4㎕의 5X First Strand Buffer, 2㎕의 0.1M DTT, 1㎕의 10mM dNTP mix 및 2㎕의 SuperScript 효소를 첨가하고 42℃에서 한시간 동안 반응시켜 합성하였다. 두번째 가닥을 합성하기 위해, 첫번째 가닥 반응물에 91㎕의 DEPC-water, 30㎕의 5X Second Strand Buffer, 3㎕의 10mM dNTP mix, 1㎕의 10U/㎕ DNA ligase, 4㎕의 10U/㎕ DNA Polymerase I 및 1㎕의 2U/㎕ RNase H를 첨가하였고, 반응은 16℃에서 두시간 동안 진행시켰다. RNA가닥을 RNase A (Amresco, U.S.A.)로 제거한 후, 반응 혼합물은 페놀/클로로포름 추출로 깨끗히 한 다음, 16㎕의 7.5 M 암모늄 아세테이트 및 326㎕의 차가운 에탄올을 첨가한 후 12,000 x g로 원심분리하여 cDNA를 침전시켰다. C3-표지된 타겟 DNA 절편의 합성을 위해, 1㎍ 이중 가닥 cDNA는 40㎕ (1OD)의 Cy3-9mer 프라이머(Sigma-Aldrich, U.S.A.)와 혼합하고, 98℃에서 10분 동안 가열하여 변성시켰다. 반응을 10㎕의 50X dNTP mix (각각 10mM), 8㎕의 탈이온수, 2㎕의 Klenow 절편(50 U/㎕, NEB, U.S.A.)을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. DNA는 11.5㎕의 5M NaCl 및 110㎕의 이소프로판 올을 첨가한 후에 12,000 x g로 원심분리하여 침전시켰다. 침전물은 25㎕ 물로 재현탁하였다. 각각의 샘플의 농도는 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 13㎍의 DNA는 마이크로어레이 혼성화(microarray hybridization)에 사용하였다. 샘플은 19.5㎕의 2X 혼성화 버퍼(Nimblegen, U.S.A.)와 혼합하고, 탈이온수로 최종 39㎕로 맞추었다. 혼성화는 MAUI 챔버(Biomicro, U.S.A.)를 이용하여 42℃에서 16시간 동안 수행하였다. 혼성화 반응 후에, 마이크로어레이는 MAUI Hybridization Station로부터 제거되었고, 즉시 shallow 250ml Wash I (Nimblegen, U.S.A.)에 담근 후 42℃에서 10-15초 동안 천천히 교반을 수행한 다음, Wash I의 두번째 접시로 옮겼고 천천히 교반하면서 2분 동안 반응시켰다. 마이크로어레이는 Wash II의 접시로 옮겼고, 교반하면서 Wash III로 15초간 더 세정하였다. 마이크로어레이는 500g에서 1분 동안 원심분리하여 건조시켰고, GenePix scanner 4000B (Axon, U.S.A.)을 이용하여 스캔하였다.

마이크로어레이는 Cy3 신호를 위해 5μm 해상도로 미리셋팅된 Genepix 4000 B (Axon Instruments)으로 스캔하였다. 신호는 디지털화되어 Nimblescan (Nimblegen, U.S.A.)로 분석하였다. 그리드(grid)는 칩 디자인 화일인 NDF 화일로 이미지를 정렬시켰다. 정렬은 그리드의 코너가 이미지 코너 위에 오버레이되는 것이 확인함으로써 점검되었다. 이것은 프로그램에서 일률적인 스코어에 의해 더 점검되었다. 분석은 two-part process로 수행되었다. 첫번째 페어 리포터(.pair) 파일은 서열, 프로브 및 Cy3 채널을 위한 신호 강도 정보를 모아서 생성되었다. 로컬 배경 측정계(local background estimator)를 이용한 데이터-기초 배경 삭제(Data- based background subtraction)는 높은 배경 신호로 어레이 위에 폴드 변화 수치(fold change estimates)를 향상시키기 위해 수행하였다. 데어터는 칩 사이의 신호 변이를 조정하기 위해서 분위수(quantiles)를 이용하여 큐빅 스플라인(cubic spline) 정규화로 표준화하여 진행하였다(Workman et al., 2002. Genome Biol. 3: research 0048.1 - research 0048.16). NimbleScan에서 수행된 median polish algorithm을 이용하여 Robust Multi-Chip Analysis (RMA)에 의한 프로브-수준의 요약은 콜스 파일을 만드는데 이용하였다. 방법은 주어진 유전자에 의해 측정된 발현의 전체 양상에서 outliers인 프로브들을 동정하고, 상기 outliers의 기여는 보고된 유전자의 발현 수준에서 감소된다. 이것은 마이크로어레이 결과의 민감성과 재현성을 향상시킨다(Irizarry et al., 2003. Nucleic Acids Research 31:15).

R 컴퓨팅 환경(R computing environment)에서 림마 페키지(limma package)로 다중 분석을 수행하였다.(Smyth, G. K., 2004. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology, Vol. 3, No. 1, Article 3). 페키지는 lmFit에 의해 수행된 선형의 모델링 접근과 eBayes에 의해 수행된 실험적인 Bayes 통계자료를 채택한다. 0.05 미만의 adj.p.Value 또는 false discovery의 유전자를 수집하고, 이의 유전자 발현이 스테이지 1의 것과 비교하여 적어도 하나의 스테이지에서 1보다 크거나 -1 미만인 것을 선발하였다. 클러스터링, 주요한 요소 분석 및 다차원척도법과 같은 다변수 통계적 분석은 Acuity 3.1 (Axon Instruments)으로 수행하였다. 계층적 클러스터링(Hierarchical clustering)은 squared Euclidean correlation에 기초하여 유사 매트릭스(similarity matrics)로 수행되었고 평균 연 관 클러스터링(average linkage clustering)은 유전자의 거리를 계산하기 위해 사용되었다.

2. sq RT - PCR ( Semi - quantitative RT - PCR ) 분석

RNAs는 3'-틸링 마이크로어레이를 위해 사용한 방법과 동일하게 준비하였다.첫번째 가닥 cDNA합성을 위해, 5㎍의 총 RNA는 Super Script III First Strand kit (Invitrogen)을 이용하여 제조사의 방법대로 역전사 효소반응을 수행하였다. 벼의 cDNA 혼합물은 두 번 희석하였다. 유전자 특이 프라이머는 Primer Designer 4 software (Sci-ed. Software, NC)을 이용하여 디자인하였다. PCR은 1㎕ 벼 cDNA 분취액, 0.25pM 유전자 특이 프라이머 및 10㎕의 2x PCR master mix (Intron biotechnology, Inc.)을 포함하는 20㎕ 용액에서 수행하였다. 반응은 94℃에서 2분 동안 초기 변성 후, 20~35 사이클의 PCR(95℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 30초) 반응 및 마지막으로 68℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 10㎕ 반응물은 2% 아가로스 겔에서 분리하였다. 밴드는 MultiGauge v2.3 (Fujifilm, Japan)으로 정량하였다. RT-PCR의 재현성을 얻기 위해, 3개의 독립적인 생물학적 반복 샘플로 2회 반복 실험하였다.

3. GUS 조직화학적 분석

형질전환 종자는 SM0 배지에서 발아시켰고, 성장 챔버에서 배양하였다(28℃에서 처음 2일 동안 암조건에 이은 1일 동안 명조건 후 4일 동안 16시간 명/8시간 암인 조건을 줌). 건조 스트레스를 위해, 1주 자란 유묘는 배지에서 떼어내어 붙어있는 아가를 제거하고 티슈 위에 올려 놓고 온실에서 공기로 건조시켰다. 2일 후, 전체 유묘는 GUS 조직화학적 분석을 위해 수집하였다. 아가를 제거한 후 바로 준비된 식물은 비건조 대조구로 사용되었다.

식물(건조 처리 실험군 및 대조구)은 상온에서 30분 동안 90% 아세톤에 유지시켰다. 염색 버퍼로 세정한 후에 염색 용액(소듐 포스페이트 버퍼 0.1mM, pH 7.0, EDTA 10mM, Triton X-100 0.1%, K₃Fe(CN)₆ 1mM, KFeCN 1mM 및 X-Gluc 2mM)에 담궜다. 좀더 효과적인 염색을 위해, 조직은 30분 동안 진공 침투시킨 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 염색 용액은 50% EtOH로 조직이 깨끗해질 때까지 여러번 세정하였고, 그 후 70% EtOH을 넣고 4℃에서 오랫동안 보관하였다.

실시예 1. 건조 유도성 유전자 ADF 와 AWPM

벼 유전자들 중에서, 각각 잎과 뿌리 유래의 유전자 7308개와 7104개는 0.05 이하로 보정된 p-값에서 2배 상향 조절(up-regulated)되거나 하향 조절(down-regulated)되었다. 합하면, 0.5~12시간의 건조 처리시 10537개 유전자가 유의하게 상향 조절되거나 하향 조절되었다. 이 유전자들 중에서, 1348/4721는 잎(3922) 또는 뿌리(2147)에서 상향 조절되는 것 이상으로 두 조직 모두에서 상향조절된 유전자의 수이다. 하향조절된 유전자들의 유사 지수는 각각 3336/7497, 4938 및 5895이다. 일반적으로 상향 조절된 유전자는 식물 정상 성장에 강한 스트레스 효과를 지 시하는 하향 조절된 유전자보다 적었다. 가장 많이 유도되는 유전자들 중에는 스트레스 마커로 사용되는 rab21 (Os11g0454300)와 dip1 (Os02g0669100)이 있고, 추정적인 액틴 탈중합 인자(putative actin depolymerization factor; ADF) Os03g0820500와 AWPM-19-유사/LEA3 단백질(AWPM_Os05g0381400)과 같은 발현된 유전자 산물이 있다. 잎에서 정상조건에서는 강하게 유도되고 스트레스 조건에서는 억제되는 벼 rbcS(Os12g0274700)은 또한 스트레스 마커로 사용되었다(도 1). ADF와 AWPM의 발현 양상은 sq RT-PCR로 확인하였다(도 1). 건조 조건에서 ADF는 잎과 뿌리 모두에서 강하게 발현되었고, AWPM는 뿌리에서 더 강하게 발현되었다.

실시예 2. 건조 유도성 프로모터 ADFp 와 AWPMp

각각의 cDS의 2kb 업스트림 서열을 분리하였고, 형질전환 벼를 위한 목적 벡터에서 GUS (β-glucosidase) 유전자 앞에 삽입시켰다. ADFp와 AWPMp 벡터를 갖는 각각의 독립 식물체 4와 7를 각각 얻었다. 형질전환 벼 식물체의 독립성(independence)과 삽입 위치는 T-플랭킹 서열을 통해 확인하였다(도 2 및 표 1). 형질전환 벼는 2시간 동안 공기 건조로 건조 조건을 처리하였다.

표 1. 형질전환유전자의 유전자간 영역으로의 삽입을 보여주는 T-플랭킹 서열 결과

ADFp가 유도하는 식물체에서, 정상 조건에서는 GUS가 발현되지 않았고, 건조 조건에서는 확실히 발현이 증가하였다(도 3a). 그러나, GUS 유전자의 유도는 단지 줄기에서 관찰되었다. AWPMp은 건조 조건이 처리된 식물에서 강한 GUS의 발현을 갖는 더 강하고, 효과적인 프로모터인 것 같다(도 3b). 발현 강도에서 더 강할 뿐만 아니라, GUS는 뿌리에서 잎까지 식물의 전체에서 관찰되었다. 따라서, ADFp와 AWPMp이 모두 건조 유도성을 갖는다고 하더라도 유전자 발현 정도 조절 뿐만 아니라 발현 조직에서 차이점이 있다.

도 1은 마이크로어레이 발현 패턴 결과(A) 및 sq RT-PCR로 확인한 결과(B)이다. 잎(L0) 및 뿌리(R0) 0h는 비건조 대조구 샘플로서 이용되었다. 건조 처리 식물은 0.5, 2, 6 및 12시간 동안 공기 건조시켰다.

도 2는 벡터 구조물을 나타내는 모식도(A) 및 T-DNA 플랭킹 서열로 형질전환 벼를 조사한 결과(B)이다. LB: 왼쪽 경계, RB: 오른쪽 경계, ND: 비형질전환 대조구(오리자 사티바 자포니카 재배종 낙동).

도 3은 건조하의 형질전환 벼에서 ADF 프로모터(도 3a) 및 AWPM 프로모터(도 3b) 조절하에서 GUS의 발현을 조직화학적 분석방법으로 조사한 결과이다. ADFp: ADF 프로모터, AWPMp: AWPM 프로모터, C: 비건조 대조구 식물체, D: 건조 처리 식물체.

<110> GREENGENE BIOTECH INC. <120> Promoter inducible by drought stress isolated from rice and uses thereof <130> PN09209 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1967 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gaccatcggt gtctattgcg aaatccctat aggtgccgaa ttttccaacc ggcattacgg 60 gtggcgtaga tgactccgag tcattggtgc cagttccata accagcacat ttaaggctca 120 attgagaaat cgagctgata catcgagtta ctcctcgtta ccccaactcc aattcaaatc 180 tcaaatccaa attagatcgt caccaagatc gattgaaaat cacataacgt gggcatacac 240 ataatcaaag acaacaaatt ttttttcgca aatcagcaaa ttaaacccgt cgaccattca 300 cttcacgacg tctagggaag gccgttggcc actgagcatc gactgaggca aggcggttgt 360 tgaggaaaga ttgctattga ggtcatcgag agcagatctg gtggagggca ccgcgcgggg 420 ccaaatctgg aggtcttcga gctcggacat gttagatctg gcattggagc caccaccctt 480 gccgtcacta aagaatccga cacaagaggg ctggggataa acggggcctc tagctgccaa 540 gcactagagg gggggagggt gcgaggccga ccactggtcg ctggggagag gcgcggatgg 600 agaggaagag aagagagctg gagcgggaga agctgaggat aagggcataa ggagaaccat 660 atatatttgg ctcccatgcc acacgtcgtt ttttccccac gtggcacgct cagcttgtag 720 tgatgacatc tatgatatat tataagtatt atattttaaa aaatatatta atattatagg 780 catagacttt tatctaaaat tggtacctct atgtgcttaa aaatgtagtc tttttttttt 840 cctcagtgga ggtgggaaat ggttaataag tgccgttttt aatttttttc gccctgggaa 900 ttacagttct tgtgtacgtt tgaggtgctg aacaaaaatg accgtccgtt attagctaat 960 ccgatggttc ccattccatt ctatggtctg tcagacatca caggctcaca gctagtaacg 1020 cctaacagcg gtgaattgac cgtacatgat attaccactt taccaggcgt cacagatcag 1080 aaaagctcat atacgcaagc tatcagaagg aaacgcggct agtcgttcga gtctgtgtac 1140 gtggcactgt caaggcagtg catagtacag acatgccaag ctgggcgcat ttcagttgag 1200 tttcttccct tgataaaaag aaaacacggt ggcgacgagc aactggtgcg ccggtgccgt 1260 cctggaaagt caccggccgg ccgatttgtt tcggtggatt tggtccattt gcacagcaaa 1320 gtgtgacggg gcagctacct tgcacaggtc agacgattag tacgcaacag ctgcgaattc 1380 tgaagctttt tcagttgttt actgtcatgg tgtcatattt ctcgcatcga tcctcaacat 1440 atgcatgaca acgtggactc atcatgaatt cgctgtaacg gtattagagc taattattat 1500 catttctgat cgcatatgga aagcttcaac gtcatgacta gttcagtcag caagacgtag 1560 ctgatttgaa ttaatcaaga gaagcttgtg agagaaacga cgcacaagcg gaatttggag 1620 ttttgtagtt tcagttttgg ctgggagagt gtttgtggct tgagttaggc ttcctgctgc 1680 cacgtcaaga caccatctgg aagactggaa ccatctatcc cagagcaaaa ctaacaaagc 1740 cacagtatgc tcacacgtgt acacatctcc ctctaaatta tttcttcgaa aaggactcgg 1800 acatcctatt aaaggatcca atattctgat aaaacactca caagctactg agtgcaaatc 1860 ttcaattgca actactttct gcgaacttct gatcgaccat tgcagaatcc aactaattgt 1920 ttcttcagac ttcttcagag cattctccag gacacttcga acgaaac 1967 <210> 2 <211> 1868 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 cataacggcc atcagtaatc accagccaac tgatcgaggc caaaatcaca acgtactcct 60 tgttgtacac atgccagttc ccacgcctaa gagactacga gatgtcgaga ttgttgtcat 120 ttctcaaaaa aggatgtcga gatggtacag cactctggca gaagacgcag gacggcggca 180 ggagccaccg cgaaaaggcc gggcccaaat tggcagctta cgtacgccac tagcccacta 240 ctgcccaaat tgcacgcatg tgtggttgtg agcaacgaac ctctgaccgg tttttttttt 300 taatatcaaa gaggcaacag cctccgatta gaaggatagg cacatcacat agccagtttg 360 acaggacagc cccatgggga tagaagatct cattatgctt ggctcgtact agtatagtgt 420 attccatcca tctaaaaatt ctaatcctaa aggatgtatc tggacataaa tattgtccag 480 atacatatct ataattggtt tgttttgaca gaggagtaag atttaaaacc cagcaaacaa 540 gggattaggc attttatggt tgaaggtctt aatttaaatt cgtcaatgca caaatggggg 600 agtactgact ggcctagtgg cgcgtatcga ccatggttaa atctgcatcc acgtatgtgc 660 gctcgaaaga ttctgaggat cgatgtactc cctctatttc aaaatgtttg acaccgttaa 720 ctttttagca tatgtttaac cgttcgtctt attaaaaaaa tttgtgaaat atgtaaaact 780 atatgtatac attatacata aaagtatatt taataatgaa taaaatgata tgaaaaaaat 840 aaataattac tcaaaatttt tgaataaaat gaatggtcaa atacgtactt aaaaagtcaa 900 tggtgttaaa cattttgaaa tgcagggagt acagactcca gattgctgca ttacttaggc 960 agacgataag aagtacggag taggccggat cagcgtaaac ccaaaacagg gaagcacatt 1020 tgcactaggc gtcaaagaaa ggaggaacaa aaaagaggca gcaacaccat catcatcaaa 1080 cctaaagcaa gcagctaacc ctgcctcctg ctgccacacc cgccagagta agtaaaacca 1140 cgcacacttt agcctaaatt agccgctaag gacacccaca atggttatct ataagctctc 1200 tacaagagat ccatgtcagc atatttttct acttggaagg tattaaatga agagagagag 1260 caaagctatc tactaactta gagatagtct atagagaaaa acgagacaat gcatgagaga 1320 tttatagata ccaatgtaga tatactatta aggtggttta ctattaatcg aatctattgc 1380 tgagatgtac atgttttata gatagcacct tactttatca ttgcgggtgc tctaaccacg 1440 cccgccacgt acgccgcctc tgggaccccg agccgaggcg cttgcggcga aagtccggaa 1500 ccatctgctt ctcctcccct cgatctcccg cccgcgcgtc gccacctccg cacacgccga 1560 cgccgcgcgc gctgcacttt tttacgcttt ctttaccccc gtctccctcg cgtcgcgcct 1620 ctccggaaat caccagaagc cgggcgtccg tggcgtggcc ccgcgcgtac gtgtcccccc 1680 taccccttgc cacacgccga cacgtgccat ccccatccac ccacacgtgt cacccctctc 1740 cccgcctata tatccctcca ccaaccagca cgttttctcc tcacttaatc acagtagctc 1800 tcagctagct agctaaacca gtgctaattg tgttgctaat ttgtgttgat ttgtgatttt 1860 gatacgag 1868

Claims (9)

1. 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 벼 유래의 건조 스트레스 유도성 프로모터.
2. 제1항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
3. 제2항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
4. 제3항에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 건조 스트레스를 가하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴, 셀로바이오하이드로라제, 엔도셀룰라제, 베타글루코시다제 및 자일나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제2항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

   상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
7. 제6항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물.
8. 제7항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
9. 제2항에 따른 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 도입함으로써 식물의 건조 스트레스 내성을 향상시키는 방법.

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