CN114605511B

CN114605511B - 新型烟草胺外排基因的克隆及其应用

Info

Publication number: CN114605511B
Application number: CN202011431787.9A
Authority: CN
Inventors: 晁代印; 晁振飞; 韩美玲; 王亚玲; 王鹏云; 张楚莹
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2040-12-07
Also published as: CN114605511A

Abstract

本发明揭示了新型的烟草胺(Nicotianamine，NA)外排基因，包括NAET1和NAET2，编码NAET1和NAET2蛋白。本发明首次发现NAET1和NAET2蛋白能够定位于细胞内特定的位置，藉由囊泡进行烟草胺的转运，调控Cu、Fe和/或NA利用和/或增加Cu、Fe和/或NA在植物不同部位的积累。本发明为植物的定向改良以及生物制备分泌型烟草胺提供了新的途径。

Description

新型烟草胺外排基因的克隆及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及新型烟草胺(NA)外排基因的克隆及其应用。

背景技术

铁和铜不仅是植物生长发育必需的矿质营养元素，在植物体内多种生理代谢过程中都发挥着重要作用。更为重要的是，因为植物来源的食品普遍存在铁含量较低，抗营养因子较高的现象，从而导致以植物作为主食的人类铁营养缺乏的普遍问题。因此，铁和铜的缺乏不仅会影响其本身生长发育，同时也影响植食性人类和动物的营养获取。因此解析植物对Cu和Fe的稳态调控机制十分重要。铜和铁既能以离子的形式直接被转运蛋白进行转运，也可以和金属螯合物进行结合形成复合物被金属转运蛋白转运。烟草胺(Nicotianamine，NA)就是这些有机小分子中的一员，它在植物体内可以和铁、锌、铜、锰、镍等多种金属离子螯合，参与这些金属离子的运输和分布，维持植物体内金属离子的平衡。而且植物体内NA含量和分配直接影响植物对环境中金属离子的吸收以及金属离子在植物体内不同器官和组织的积累水平。更为重要的是，近年来的研究发现，NA可以解除食物中抗营养因子对于铁的鏊合，增加动物和人类对于铁的生物可获得性和利用率。

目前植物参与NA转运的基因很少被报道。在早期的研究中，科学家通过运用酵母功能回补实验，从植物中克隆出了一些能参与NA-Metal复合物运输的家族成员基因，例如YellowStripe1-Like(YSL)，但是它们均被报道参与NA往胞内的运输。拟南芥ZIF1(Zinc-induced facilitator 1)是种定位在液泡膜的转运蛋白，可以将Zn-NA复合物转运至液泡中。有报道称，体外实验表明水稻转运蛋白ENA1和ENA2具备NA外排活性，但缺乏遗传学和体内证据。因此，具体参与NA往胞外分泌的蛋白对于本领域而言仍然未知。

基于NA的分子特性，NA既然能被YSL家族转运蛋白运输到胞内，那么必然存在转运蛋白能将NA转运到胞外或者存在NA分泌的机制。因此，本领域亟待对NA的转运以及由此带来的植物性状变化进行更为深入的研究，以期应用于植物改良。

发明内容

本发明的目的在于提供新型烟草胺外排基因的克隆及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种烟草胺外排蛋白或其调节分子的用途，用于(i)转运烟草胺，或(ii)调节植物地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布，或(iii)提高单细胞生物制备烟草胺的效率，简化单细胞生物制备烟草胺流程；其中，所述的烟草胺外排蛋白包括：NAET1或NAET2。

在一个优选例中，所述的调节分子为上调分子，所述烟草胺外排蛋白或其上调分子的用途包括选自：将细胞内的烟草胺转运到胞外；较佳地，所述烟草胺外排蛋白通过将烟草胺转运到囊泡中，介导控制烟草胺向胞外转运；提高植物地上部的Cu和/或Fe的量、降低地下部的Cu和/或Fe的量；较佳地，所述烟草胺外排蛋白通过参与Cu在木质部中的运输和Fe在韧皮部中的运输，调控Cu和/或Fe的分布。

在另一优选例中，所述的“Cu在木质部中的运输和Fe在韧皮部中的运输”为长距离运输(长途转运)。

在另一优选例中，所述的烟草胺外排蛋白包括其同源物。

在另一优选例中，所述的上调分子包括：过表达所述烟草胺外排蛋白的表达盒或表达构建物(包括表达载体)；或，敲除所述烟草胺外排蛋白的5’UTR上的上游开放阅读框(upstream open reading frame；uORF)，提高所述烟草胺外排蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物；或，与所述烟草胺外排蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调分子。

在另一优选例中，所述的调节分子为下调分子，其用途包括选自：抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运；较佳地，减少烟草胺向囊泡的转运，从而减少烟草胺向胞外转运；降低植物地上部的Cu和/或Fe的量、提高地下部的Cu和/或Fe的量。

在另一优选例中，所述下调分子包括：敲除或沉默烟草胺外排蛋白的编码基因的试剂，抑制烟草胺外排蛋白活性的试剂；较佳地，所述下调分子包括：针对所述烟草胺外排蛋白的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将烟草胺外排蛋白进行功能丧失性突变；或，特异性干扰烟草胺外排蛋白的编码基因表达的干扰分子。

在另一优选例中，所述的下调分子为基因编辑试剂，其将NAET1或将NAET2进行包括(但不仅限于)选自下组的突变：NAET1第27位核苷酸处，其后插入碱基使蛋白翻译移码；在NAET2第21位核苷酸处，其后插入了碱基使蛋白翻译移码。

在另一优选例中，(i)中，所述转运烟草胺包括：在生产烟草胺的细胞中，促进烟草胺由胞内向外分泌；较佳地，所述促进烟草胺由胞内向外分泌能够提高单细胞生物制备烟草胺的效率，简化单细胞生物制备烟草胺流程。

在本发明的另一方面，提供一种调控烟草胺转运或植物中Cu和/或Fe分布的方法，包括：在植物中调控烟草胺外排蛋白的表达或活性；其中，所述的烟草胺外排蛋白包括：NAET1或NAET2。

在一个优选例中，所述的调控为将细胞内的烟草胺转运到胞外或提高植物地上部的Cu和/或Fe的量、降低地下部的Cu和/或Fe的量；所述方法包括：在植物中上调烟草胺外排蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述的调控为抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运或降低植物地上部的Cu和/或Fe的量、提高地下部的Cu和/或Fe的量；所述方法包括：在植物中下调烟草胺外排蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述在植物中上调烟草胺外排蛋白的表达或活性包括：在植物中过表达烟草胺外排蛋白；或，以与烟草胺外排蛋白相互作用的上调分子进行调控，从而提高烟草胺外排蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述在植物中下调烟草胺外排蛋白的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默烟草胺外排蛋白的编码基因，或抑制烟草胺外排蛋白的活性；较佳地包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除烟草胺外排蛋白的编码基因；以同源重组的方法敲除烟草胺外排蛋白的编码基因；以特异性干扰烟草胺外排蛋白编码基因表达的干扰分子来沉默；或将烟草胺外排蛋白进行功能丧失性突变。

在本发明的另一方面，提供一种生产烟草胺的方法，包括：在生产烟草胺的细胞中，引入烟草胺外排蛋白；其中，所述的烟草胺外排蛋白包括：NAET1或NAET2；较佳地，所述生产烟草胺的细胞中包括外源的烟草胺合成酶；较佳地，所述烟草胺外排蛋白促进烟草胺由胞内向外分泌。

在另一优选例中，所述的细胞包括真核细胞或原核细胞；较佳地，所述真核细胞包括：酵母细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、霉菌细胞、哺乳动物细胞；更佳地，所述的酵母细胞包括：酿酒酵母细胞或毕赤酵母细胞；更佳地，所述的植物细胞包括：人参细胞；较佳地，所述的原核细胞包括：大肠杆菌、枯草杆菌细胞。

在另一优选例中，所述植物为表达烟草胺外排蛋白或其同源物的植物，或所述植物为单子叶植物或多子叶植物；较佳地，所述的植物为或所述烟草胺外排蛋白来自：十字花科植物，禾谷类作物，豆科植物，茄科植物。

在另一优选例中，所述地上部包括：花，果荚，籽粒，叶片，茎，种子；较佳地，包括花和种子。

在另一优选例中，所述的地下部包括：根。

在另一优选例中，所述的NAET1的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(i)多肽功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％、≥98％或≥99％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在另一优选例中，所述的NAET2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i’)具有SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的多肽；(ii’)将如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(i’)多肽功能的、由(i’)衍生的多肽；(iii’)氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％、≥98％或≥99％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv’)SEQID NO:4所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v’)在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在本发明的另一方面，提供烟草胺外排蛋白或其编码基因的用途，用作鉴定植物的地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布的分子标记物；其中，所述的烟草胺外排蛋白包括：NAET1或NAET2。

在一个优选例中，通过特异性检测烟草胺外排蛋白或其编码基因的抗体、引物或探针进行所述的鉴定；较佳地，所述引物包括针对NAET1的：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；或所述引物包括针对NAET2的：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定植物的地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布改变的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物体内烟草胺外排蛋白的表达或活性，若该测试植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性高于该类植物(对照植物)中烟草胺外排蛋白的表达或活性的平均值，则其为地上部的Cu和/或Fe的量高、地下部的Cu和/或Fe的量低的植物；或，若该测试植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性低于该类植物(对照植物)中烟草胺外排蛋白的表达或活性的平均值，则其为地上部的Cu和/或Fe的量低、地下部的Cu和/或Fe的量高的植物；其中，所述的烟草胺外排蛋白包括：NAET1或NAET2。

在另一优选例中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。

在另一优选例中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。

在另一优选例中，所述量高是指与同类或同种植物的量相比，有统计学意义的高，如高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。

在另一优选例中，所述量低是指与同类或同种植物的量相比，有统计学意义的低，如低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。

在本发明的另一方面，提供一种筛选调节烟草胺转运或调节植物地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达烟草胺外排蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中烟草胺外排蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高(显著提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高)，则表明该候选物质为可用于将细胞内的烟草胺转运到胞外或提高植物地上部的Cu和/或Fe的量、降低地下部的Cu和/或Fe的量的物质；若其表达或活性降低(显著降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低)，则表明该候选物质为可用于抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运或降低植物地上部的Cu和/或Fe的量、提高地下部的Cu和/或Fe的量的物质；其中，所述烟草胺外排蛋白包括：NAET1或NAET2。

在一个优选例中，所述方法还包括：设置不添加所述候选物质的对照组，从而明确分辨测试组中所述烟草胺外排蛋白表达或活性与对照组的差异。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述烟草胺外排蛋白或其编码基因或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。

在本发明的另一方面，提供一种植物细胞、组织或器官，其中含有有外源的烟草胺外排蛋白的上调分子，所述上调分子包括选自：过表达所述烟草胺外排蛋白的表达盒或表达构建物(包括表达载体)；或，敲除所述烟草胺外排蛋白的5’UTR上的上游开放阅读框(upstream open reading frame；uORF)，提高所述烟草胺外排蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物；或，与所述烟草胺外排蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调分子。

在一个优选例中，所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖能力。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、用实时定量PCR方法和Gus组织化学染色方法研究NAET1(A，C)和NAET2(B，D)在各个组织部位的表达模式。NAET1和NAET2在幼苗的叶子和根(a，b，f，g)，成苗的叶子(c，h)，成苗的茎(d，i)成苗的花和果荚(e，j)均有表达。图Cd和图Di是茎的横切。

图2、NAET1和NAET2的亚细胞定位。图A为用pA7质粒将GFP分别连在NAET1和NAET2的N端和C端，观察其在叶片原生质体中的亚细胞定位。图B为用PHMS-NAET1-GFP和PHMS-NAET2-GFP转化naet1naet2得到的阳性苗观察亚细胞定位，同时用BFA处理，观察其定位情况。图C和图D是将1300-NAET1-GFP和1300-NAET2-GFP分别和高尔基标志物CD3-967，反式高尔基标志物VHAα1-mCherry，PHO1-mCherry共同转化烟草表皮细胞，观察共定位。

图3、NAET1和NAET2在酵母中和烟草胺合成酶共表达后，可以将NA转运到细胞外。A：pYES2-NAET1-GFP转入野生型酵母BY4741后，观察NAET1在酵母中亚细胞定位；B：pYES2-NAET2-GFP转入野生型酵母BY4741后，观察NAET2在酵母中亚细胞定位；C：NAET1，NAET2与空载在酵母中和烟草胺合成酶基因AhNAS3分别共表达和单转后，培养OD＝1时，离心收集沉淀的菌体，检测NA的含量。

图4、利用CRISPR-Cas9技术构建NAET1和NAET2的突变体。A：NAET1和NAET2单突变体和双突变体的突变类型。B：长日照四周正常土壤生长的NAET1和NAET2单突变体和双突变体的叶片表型。

图5、A：长日照水培条件下7周，突变体与野生型中木质部汁液中NA的含量。B：长日照水培条件下7周，突变体与野生型中根部，老叶，新叶，花和种子中NA的含量。

图6、npf双突变体材料与野生型相比，Cu和Fe的稳态发生变化。双突变体地上部Cu积累量降低，根部积累升高。幼叶等幼嫩组织中的Fe含量降低。A：长日照水培条件下7周突变体与野生型中Cu在各个组织中含量的变化；B：长日照水培条件下7周突变体与野生型中Fe在各个组织中含量的变化；C：长日照水培条件下7周突变体与野生型中Cu在木质部流中含量的变化；D：长日照水培条件下7周突变体与野生型中Fe在木质部流中含量的变化。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，克隆获得了一类新型的烟草胺(NA)外排基因，包括NAET1和NAET2，编码NAET1和NAET2蛋白。本发明首次揭示，NAET1和NAET2蛋白能够定位于细胞内特定的位置，藉由囊泡进行烟草胺的转运，调控Cu和/或Fe利用和/或增加Cu和/或Fe在植物不同部位的积累。

术语

如本文所用，所述的“长距离运输”或“长途转运”是指将Cu和/或Fe由地下部(根部)转运至地上部的运输；较佳地，该Cu藉由木质部进行运输，Fe藉由韧皮部进行运输。所述的“长距离运输”表明，本发明的蛋白并非仅能在细胞内或相邻细胞间实现目标元素(Cu和/或Fe)的转运，而是能够将目标元素从地下部向地上部转运。

如本文所用，所述的“地上部”也称为“地上部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以上的部分。

如本文所用，所述的“地下部”也称为“地下部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以下的部分。

如本文所用，所述的“植物”包括表达NAET1或NAET2的植物。根据本领域的知识，存在NAET1或NAET2的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。所述的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。例如，所述的“植物”可以是选自以下的植物：禾本科(Gramineae)、十字花科(Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)、豆科(Leguminosae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、菊科(asteraceae)、杨柳科(Salicaceae)、桑科(Moraceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、(Selaginellaceae)、银杏科(Ginkgoaceae)、松科(Pinaceae)、苏铁科(Cycadaceae)、天南星科(Araceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、悬铃木科(Platanaceae)、榆科(Ulmaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、桦科(Betulaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、椴树科(Tiliaceae)、柽柳科(Tamaricaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、景天科(Crassulaceae)、苏木科(Caesalpinaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、石榴科(Punicaceae)、珙桐科(Nyssaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、八角枫科(Alangiaceae)、卫矛科(Celastraceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、黄杨科(Buxaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、小盘木科(Pandaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、漆树科(Anacardiaceae)，橄榄科(Burseraceae)、桔梗科(Campanulaceae)、红树科(Rhizophoraceae)、檀香科(Santalaceae)、木犀科(Oleaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、露兜树科(Pandanaceae)、黑三棱科(Sparganiaceae)、水蕹科(Aponogetonaceae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、茨藻科(Najadaceae、冰沼草科(Scheuchzeriaceae)、泽泻科(Alismataceae)、花蔺科(Butomaceae)、水鳖科(Hydrocharitaceae)、霉草科(Triuridaceae)、莎草科(Cyperaceae)、棕榈科(槟榔科)(Palmae(Arecaceae))、天南星科(Araceae)、浮萍科(Lemnaceae)、须叶藤科(Flagellariaceae)、帚灯草科(Restionaceae)、刺鳞草科(Centrolepidaceae)、黄眼草科(Xyridaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、田葱科(Philydraceae)、灯心草科(Juncaceae)、百部科(Stemonaceae)、百合科(Liliaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、蒟蒻薯科(箭根薯科)(Taccaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、芭蕉科(Musaceae)、姜科(Zingiberaceae)、美人蕉科(annaceae)、竹芋科(Marantaceae)、水玉簪科(Burmanniaceae)、藜科(Chenopodiaceae)或兰科(Orchidaceae)的植物。可通过鉴定其中NAET1或NAET2或其同源物的存在情况，来确定适用的植物。

如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％更高的调节。

关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

NA外排蛋白

在本发明中，除非特别说明，所述NA外排蛋白包括了NAET1和NAET2蛋白或它们的同源物(同源蛋白)。所述NAET1为具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽，所述NAET2为具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。，该两个基因的序列登录号也可分别见At5g14940和At3g01350。NA外排基因NAET1和NAET2是同源基因，氨基酸相似性为74.1％。本发明还包括具有与NA外排蛋白相同功能的序列变异形式。

所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的NA外排蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有所述NA外排蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

来源于拟南芥以外其它物种的与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中

本发明中，所述的“NA外排蛋白”也包括它们的同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的NA外排蛋白，但是获自其它物种、特别是禾本科植物的与所述NA外排蛋白高度同源(如具有70％以上，更特别80％，85％、90％、95％、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。

本发明还提供了分离的蛋白，其是NA外排蛋白的片段或在两端添加其它蛋白或标签等形成的。

本发明还涉及编码本发明的NA外排蛋白或其序列变异形式的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4序列的多肽，但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的基因组序列或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体(变体)，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如Bar、GUS。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。

植物改造

本发明通过系统研究，首次克隆获得NA外排基因NAET1和NAET2的全长序列，并鉴定了它们的生物学功能。

在具体实施例中，本发明人利用荧光定量PCR和Gus组织化学染色方法研究NAET1和NAET2在中的表达，发现两个基因在根部与地上部均有表达，在根系的表达量高于地上部。它们主要表达在根部木质部薄壁细胞和韧皮部，以及地上部的维管组织，叶肉细胞和花粉中。

在具体实施例中，利用瞬时转化和稳定转化体系研究了NAET1和NAET2的亚细胞定位，发现其定位在高尔基，反式高尔基和未知的小囊泡中，表明其可能参与物质的运输或分泌。

在具体实施例中，本发明人分析了NAET1和NAET2的组织表达，发现其在根部与地上部均有表达，在根系的表达量高于地上部。它们主要表达在根部木质部薄壁细胞和韧皮部，以及地上部的维管组织，叶肉细胞和花粉中。

在具体实施例中，本发明人利用酵母异源表达体系，发现NAET1和NAET2能够将酵母体内异源合成的NA分泌到胞外。通过时空表达模式的分析，发现NAET1和NAET2主要在的根，茎和页维管束的木质部薄壁细胞，韧皮部以及叶肉细胞中表达。通过对NAET1和NAET2的突变体的分析发现，与野生型相比，NAET1和NAET2的双突变体在正常情况下，地上部的Cu减少而地下部的Cu增多，种子中Cu和Fe减少。

在具体实施例中发现，通过HPLC方法检测NA外排基因NAET1和NAET2敲除突变体中NA的含量，发现双突变体中木质部流中NA显著降低，地下部NA含量升高，突变体中NA从地下部往地上部的转运受阻。突变体中花和果荚组织中NA含量降低，表明突变体中NA的韧皮部运输受阻。

在具体实施例中发现，通过ICP-MS方法检测双突变体植株离子组变化，发现双突变体各组织的Cu和Fe的稳态发生变化。因此NAET1和NAET2可被用于基因工程改造用来调控Cu和Fe的长距离运输。

因此，本发明揭示了：细胞中NA在细胞质中合成之后被NAET1和NAET2转运到囊泡中进而被分泌到细胞外，螯合二价阳离子并协助它们的运输。参与Cu在木质部中的长距离运输和Fe在韧皮部中的长距离运输。

基于本发明人的新发现，提供了一种NA外排蛋白或其调节分子的用途，用于：(i)转运NA，或(ii)调节植物地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布。

同时，本发明也提供了一种调控NA转运或植物中Cu和/或Fe分布的方法，包括：在植物中调控NA外排蛋白的表达或活性；其中，所述的NA外排蛋白包括其同源物。

应理解，在得知了所述NA外排蛋白在NA转运以及植物元素调控方面的作用后，可以根据实际所需，采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的NA外排蛋白的表达或活性，这些方法均被包含在本发明中。

可以利用NA外排蛋白的表达或活性的上调剂来上调NA外排蛋白的活性。所述的NA外排蛋白的表达或活性的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”。任何可提高NA外排蛋白蛋白的活性、提高NA外排蛋白基因或蛋白的稳定性、上调NA外排蛋白基因的表达、增加NA外排蛋白蛋白的有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调NA外排蛋白或其编码的蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

作为一种优选的实施方式，提供一种上调植物中NA外排蛋白的表达的方法，所述的方法包括：将NA外排蛋白或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物中。

优选地，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的本发明的多肽的编码核酸转入植物器官或组织，获得转化入所述多肽的编码核酸的植物组织或器官；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源的本发明的多肽的编码核酸的植物组织或器官再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的NA外排蛋白的编码核酸；

(s2)将植物组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码核酸转入并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入所述NA外排蛋白的编码核酸的植物组织或器官；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物组织或器官再生成植物。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述多肽的编码核酸的转基因植物。

作为一种尤其优选的方式，敲除所述烟草胺外排蛋白的5’UTR上的上游开放阅读框(upstream open reading frame；uORF)，提高所述烟草胺外排蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物。uORF广泛存在于真核生物mRNA中，其为一种翻译调控元件。通常，uORF的翻译优先于mORF(主要开放阅读框)，导致mORF翻译受阻。本发明中，靶向敲除所述烟草胺外排蛋白的5’UTR上的uORF，从而可有效提高所述烟草胺外排蛋白翻译效率，提高其表达。

本发明中，所述的NA外排蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低NA外排蛋白的活性、降低NA外排蛋白或其编码基因的稳定性、下调NA外排蛋白的表达、减少NA外排蛋白有效作用时间、抑制NA外排基因的转录和翻译的物质、或降低蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调NA外排蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰NA外排蛋白或其它信号通路基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑NA外排基因的基因编辑试剂，等等。

作为本发明的一种优选方式，提供一种下调植物中NA外排蛋白的方法，包括对NA外排蛋白进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使NA外排蛋白转变为其突变体，从而使其不再发挥作用。作为一种更为具体的实施例方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。本发明的实施例中提供了优选的基因编辑试剂。

作为其它可选的方式，所述下调植物中NA外排蛋白的表达的方法可包括：(1)将干扰NA外排基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

植物定向筛选及分子标记

本领域中，技术人员对于NA的转运以及随之带来的植物元素(Cu/Fe)分布缺乏清晰的了解，现有技术中缺乏鉴定植物中Cu或Fe分布情况的分子标记。基于本发明人的新发现，本发明提供了适用于鉴定植物中Cu或Fe在地上部和地下部的分布的分子标记，即NA外排基因。本发明还提供了针对所述NA外排基因设计的特异性分子标记，以及鉴定策略。

因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定农艺性状被调节的植物的方法，包括：鉴定测试植物体内烟草胺外排蛋白的表达或活性，若该测试植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性高于该类植物(对照植物)中烟草胺外排蛋白的表达或活性的平均值，则其为地上部的Cu和/或Fe的量高、地下部的Cu和/或Fe的量低的植物；或，若该测试植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性低于该类植物(对照植物)中烟草胺外排蛋白的表达或活性的平均值，则其为地上部的Cu和/或Fe的量低、地下部的Cu和/或Fe的量高的植物。

根据本发明的新发现，本领域技术人员可以采用任何本领域公知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列的分析，这些技术均可被包含在本发明中。所述的方法例如包括但不限于：测序法，PCR扩增法，探针法，杂交法，限制性酶切分析法，等位基因多态性分析法(如溶解曲线法)进行核酸序列的鉴定，等等。

本发明的鉴定方法，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的长度，就可以准确、快速地判断待测样品的表型或产量，成本低廉，适合于大规模鉴定，而且所需的样品量很少。如果需要，本领域技术人员能够设计出鉴定所述分子标记的引物。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

本发明在分子设计育种及利用基因工程技术进行农作物品种改良等方面具有良好的应用前景。

在得知了NA外排基因的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控NA转运或植物Cu和/或Fe元素分布的物质或潜在物质。

本发明提供了一种筛选调节烟草胺转运或调节植物地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达烟草胺外排蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中烟草胺外排蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为可用于将细胞内的烟草胺转运到胞外或提高植物地上部的Cu和/或Fe的量、降低地下部的Cu和/或Fe的量的物质；若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运或降低植物地上部的Cu和/或Fe的量、提高地下部的Cu和/或Fe的量的物质。

以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、双分子荧光互补实验、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于NA外排蛋白或其编码基因，对植物细胞的NA转运或Cu和/或F分布有调控作用的潜在物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

序列信息

NAET1的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

ATGGCTGGAGGAGAGAAAAGAAGAGGACTTAGTAAATCTTGTGCTCTTCTCATAGTGATTGCTGGGATAGAGAGATATGCATTCAAAGGAGTTGCATCAAACTTAGTGACATATCTAACTGATGTAGTGAAGATGAGCAATTCAAGAGCAGCCACGACTGTGAACACTTGGAGTGGCTTCACTTTCATGTTGCCTCTCTTCTCTGCTCCTTTTGCCGATTCTTATTGGGACAGATTCTTCACCATCCTTGCTTCTTCTTCTCTCTACTTTGTGGGTCTAGTGGGATTGACATTTACGGCATTTGCTGGGTCACGTTCGACTACAAAAACAATCTCTCTTTACTTCCTCTACACTTCACTTTCCCTCGTCGCTCTAGGCCTTGGCGTCTTAAACCCATCTCTACAAGCCTTTGGTGCTGACCAGCTCGACTACGACCTTGACCATGACAATGACCACGAGCCATCCTCAGAGAACAAAGAAGTCAAATCGAACCGCAAGACTCAGTTTTTCCAATGGTGGTATTTTGGTGTCTGCGCCGGTAGTCTTCTAGGAGTCACCGTCATGGCTTACATCCAAGACACGTTTGGATGGGTTATCGGTTTTGCAATCCCAACCGCTTCGATGTTGTTGTTGATCTTCTTGTTCTTGTGTGGCTGCGGGGTCTATGTTTATGCTGATCCAGACCTCAAAGCTAAACCATTTCAAAGGATATTAGAGATTATCAAAGAAAGAGTGTGTGGAAGAAATAAGATCACTCTTGTTAACGACCACGATTTAAATGCCATGGAACTAGAGCTGCAAGATCAGAAGCCTCTATGTAACTGTAGCAACACTGAAGCTAATACTACTACCAAGAGCTTACCTGATGATCATAAAAGCTGCAAAACCGGTTTTTCGGGGCTTGAAACCGTCAAGCTATTGCTTCGACTTTTACCTATATGGACGATGCTTCTTATGTTTGCAGTTATATTCCAACAACCCGCGACCTTTTTCACAAAGCAAGGTATGACTATGAAGAGAAACATCGGACCAAACTTCAAGATCCCACCAGCAACACTACAAAGCACTATCACTTTATCCATAATCCTTCTTATGCCCTTCTACGACAAAATCTTGATACCGATCGCCAAAAAACTAACGAAAAACGAAAAGGGTATTTCTGTGAAGGAAAGAATGGGGATTGGGATGTTCCTGTCCATCATCGCCATTGTTATTGCCGCGTTAGTCGAAAGAAAAAGACTAAAGATAAGCAAAATGATGAAGACTACACCTAATTTGGACCCCGTAAGCATATTGTGGCTCCTACCTCAGTACATTCTATTGGGAATCTCGGACATTTTCACAGTTGTTGGAATGCAAGAGTTCTTCTACAGCGAGGTTCCTGTTAGCATGAGAACAATGGGATTTGCTTTGTACACAAGCGTTTTCGGTGTGGGGAGTTTTGTGAGTGCTGCGTTGATTTCGATAATAGAGACTTACACGAGCTCAAGAGGTGGAAAACATAACTGGTTTGCAGATGATATGTCGGAAGCTAGACTTGATAACTATTATTGGCTTTTGGCTTTCACAAGTGCTATTAGCTTCTTGATGTATATTGTTATTTGCAAGCATTTCAAGAGTAGAAGTGATGATGATGATCAATGTGATACAAATTGTTAA

NAET1的氨基酸序列(SEQ ID NO:2；552aa)

MAGGEKRRGLSKSCALLIVIAGIERYAFKGVASNLVTYLTDVVKMSNSRAATTVNTWSGFTFMLPLFSAPFADSYWDRFFTILASSSLYFVGLVGLTFTAFAGSRSTTKTISLYFLYTSLSLVALGLGVLNPSLQAFGADQLDYDLDHDNDHEPSSENKEVKSNRKTQFFQWWYFGVCAGSLLGVTVMAYIQDTFGWVIGFAIPTASMLLLIFLFLCGCGVYVYADPDLKAKPFQRILEIIKERVCGRNKITLVNDHDLNAMELELQDQKPLCNCSNTEANTTTKSLPDDHKSCKTGFSGLETVKLLLRLLPIWTMLLMFAVIFQQPATFFTKQGMTMKRNIGPNFKIPPATLQSTITLSIILLMPFYDKILIPIAKKLTKNEKGISVKERMGIGMFLSIIAIVIAALVERKRLKISKMMKTTPNLDPVSILWLLPQYILLGISDIFTVVGMQEFFYSEVPVSMRTMGFALYTSVFGVGSFVSAALISIIETYTSSRGGKHNWFADDMSEARLDNYYWLLAFTSAISFLMYIVICKHFKSRSDDDDQCDTNC

NAET2的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)

ATGGATTTAGAACAGAAGACAAGAGGACTTAGCAAGTCATGTGCCCTTCTCATAGTGATTGCGGGAATGGAGAGATATGCATTCAAAGGAGTTGCATCAAACTTAGTGACATATCTAACAGATGTAGTGAAGATGAGTAATTCAAGAGCAGCCAAAACTGTTAACACTTGGGCTGGTTTCACTTCTATGTTGCCTCTCTTCTCTGCTCCTTTGGCTGATACTTATTGGGACAGATTCTTCACCATCCTTGCTTCTTCTTCCGTCTACTTTGTGGGACTAGTGGGATTGACATGGACGGCATTTGCTGGGTCACGTTCAGCTACTAAGACTATCTCTTCTTACTTTCTCTACTCTTCACTATGTCTTGTCTCAATCGGTTTAGGCGTCTTAAACCCTTCTCTTCAAGCCTTTGGTGCAGACCAACTCGACCACGACCTCGATAAGAATTTCGATCTTTCCTCGGGTGATCAAAAGGACGCGAAAGCTACCCGAAAGACTCAGTTTTTCCAATTGTGGTACTTTGGCGTCTGCACCGGCAGCCTTATGGGTGTCACAGTCATGGCTTATATTCAAGACACTTTTGGTTGGGTTCTCGGTTTCGCCATTCCTGGTATCGTGATATTCCTGTCGATTTTGGTGTTCATGTCGGGTTGTGGAATTTATGTTTATGCTCCGGGCGCCCGTCTGAAGAAGAAAACAACTACTACACCTTTTGAGAAGATTCTTAAATTCATTAAAGGGAGAGTAGTGAAGCAGAGAAGCATATATACACTTGCAGATGAGAAAGATTTGGATGCTATGGAGCTTGAGCTAGAGGAGAGGCCTCTCTGTAAATGTGAGACCGAAGACATTGAGACTCCTTCAACAACCTCCAAAGGATTGGAAGATGACGAGAGCTCGAAAACGGTTTTCTCTGGAATTGATAATGTTAAGTTAGTGATTCGCCTTTTCCCCATATGGATGATGCTTCTCATGTTCGCGGTTATCTTCCAGCTACCAGCAACCTTTTTCACCAAACAAGGTGTGACTATGAAGAGAAACATTGGGTCCAACTTCAAAATCCCACCTGCAACCCTGCAAAGCACGATCACATTATCAATCATCCTGCTTATGCCATTATATGATAAGATTTTGATACCTATTACCAAGAGAATCAAGAAAAACGGTACAGGTATCTCTGTGATGGAGAGAATGGGAGTCGGAATGTTTCTATCCATCATTGCCATTGTTATTGCGGCAATAGTCGAAAGGAAAAGACTAGCCATAAGCCAAAAGATGAAGACTTTACCTGATTATGATCCAGAAACCGTCCCACTGAGCATCTTCTGGCTGCTGCCTCAGTACATCCTCTTGGGAATCTCAGATATATTCACAGTCGTTGGGATGCAAGAGTTTTTCTACAGTGAGGTTCCTGTAAGAATGAGAACAATGGGATTTGCTCTCTACACAAGTGTTTTTGGTGTTGGAAGCTTTGTGAGCGCCGCACTGATCTCAATTGTCGAGGCTTACTCGAGCTCAACAGGTGACCGACAAAACTGGTTTGCAGATGATATGTCGGAAGCTCGGCTTGACAAATACTACTGGCTTCTTGCTCTTACAAGTACAATAAGCTTTGTAGTCTACATATTTCTATGCAAGTTTTTCAAGAGTAGCAGTGATCAAGGCGATGAAAAAGAAGAAGCCCCTAAATGA

NAET2的氨基酸序列(SEQ ID NO:4；563aa)

MDLEQKTRGLSKSCALLIVIAGMERYAFKGVASNLVTYLTDVVKMSNSRAAKTVNTWAGFTSMLPLFSAPLADTYWDRFFTILASSSVYFVGLVGLTWTAFAGSRSATKTISSYFLYSSLCLVSIGLGVLNPSLQAFGADQLDHDLDKNFDLSSGDQKDAKATRKTQFFQLWYFGVCTGSLMGVTVMAYIQDTFGWVLGFAIPGIVIFLSILVFMSGCGIYVYAPGARLKKKTTTTPFEKILKFIKGRVVKQRSIYTLADEKDLDAMELELEERPLCKCETEDIETPSTTSKGLEDDESSKTVFSGIDNVKLVIRLFPIWMMLLMFAVIFQLPATFFTKQGVTMKRNIGSNFKIPPATLQSTITLSIILLMPLYDKILIPITKRIKKNGTGISVMERMGVGMFLSIIAIVIAAIVERKRLAISQKMKTLPDYDPETVPLSIFWLLPQYILLGISDIFTVVGMQEFFYSEVPVRMRTMGFALYTSVFGVGSFVSAALISIVEAYSSSTGDRQNWFADDMSEARLDKYYWLLALTSTISFVVYIFLCKFFKSSSDQGDEKEEAPK

实施例1、NAET1和NAET2基因在中的表达特征

1、总RNA的提取

将种子经70％乙醇消毒1min、10％次氯酸钠溶液消毒5min后，用无菌水洗涤4-5次，然后用1/2MS培养基培养至2周左右，选择大小一致的幼苗转移至培养桶中，用Hogland营养液培养5周后，取不同组织的样品于液氮中保存，利用植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克公司)提取RNA。

2、总cDNA的合成

使用反转录试剂盒(南京诺唯赞公司)进行总cDNA的合成。

3、荧光定量PCR

反转录合成总cDNA第一链后，以其为模板进行荧光定量PCR扩增，并以泛素蛋白基因(Ubiquitin5)为内参基因进行表达量校正。基因Ubiquitin5，NAET1和NAET2基因的定量PCR程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃7min。基因名称和引物设计如表1。

表1

4、Gus染色分析NAET1和NAET2的组织特异性表达

(1)ProNAET1-Gus和ProNAET2-Gus植物表达载体的构建和转化

以野生型Col-0的基因组DNA为模板，通过PCR扩增NAET1和NAET2，包括基因区加上游启动子2kb区域(NAET1_pro或NAET2_pro)的基因组序列PCR产物经电泳回收后克隆到植物表达载体PCambia1300(简称P1300或1300)-Gus载体上。

阳性克隆进行测序验证正确后保存，并转化农杆菌，通过农杆菌浸花转化法转化野生型Col-0植株，利用潮霉素筛选阳性苗。

(2)转基因阳性苗不同组织样品Gus活性染色

Gus染液配方如表2。

表2

Gus染色步骤：

向50ml塑料管中加入30ml的配置好的GUS染液(X-Gluc现用现加)，将培养的幼苗放入染液中。在真空泵中抽真空10min，重复三次，最后幼苗应完全沉入培养皿底部。将培养皿放置在37℃培养箱避光静置5-8h后，使用75％乙醇对幼苗进行脱色处理，在体视显微镜下进行观察(图1C和D)。

用实时定量PCR方法对NAET1和NAET2表达分析。结果发现，NAET1和NAET2在各个组织中均有表达，根部表达量相对较高(图1A和B)。

Gus染色结果显示，NAET1和NAET2在根，茎和叶的维管束，叶肉细胞，花粉和果荚中均有表达。

实施例2、NAET1和NAET2亚细胞定位

NAET1和NAET2在原生质体中瞬时表达步骤如下：

1、根据NAET1和NAET2的cDNA序列，以cDNA为模板利用高保真酶KODplus(TOYOBO公司)进行PCR扩增，同时设计相应的引物扩增GFP片段，用OverlapPCR的方式分别将NAET1，NAET2在N端和C端和GFP片段融合。连接成功PCR产物经电泳回收后克隆到瞬转载体pA7上，阳性克隆进行测序验证正确后保存。

35S:NAET1-GFP：以35S启动子驱动NAET1-GFP的表达；

35S:GFP-NAET1：以35S启动子驱动GFP-NAET1的表达；

35S:NAET2-GFP：以35S启动子驱动NAET2-GFP的表达；

35S:GFP-NAET2：以35S启动子驱动GFP-NAET2的表达。

2、将瞬时表达载体利用PEG-Ca²⁺的方法转化到原生质体中，利用Zeiss SP8激光共聚焦显微镜进行观察(图2A)。

3、根据NAET1和NAET2的基因序列，以基因组DNA为模板利用高保真酶KODplus(TOYOBO公司)进行PCR扩增，序列长度包括启动子2kb和基因全长。利用同源重组的方式构建到双元载体PHMS-GFP载体上，得到PHMS-NAET1Pro：NAET1-GFP质粒和PHMS-NAET2Pro：NAET2-GFP质粒。阳性克隆进行测序验证正确后保存。

4、将PHMS-NAET1Pro：NAET1-GFP(对应图2中pNAET1:NAET1-GFP组)和PHMS-NAET2Pro：NAET2-GFP(对应图2中pNAET2:NAET2-GFP组)质粒通过农杆菌介导的浸花法转化到双突变体naetnaet2(其中NAET1和NAET2均发生缺失，具体建立方法见实施例4)中，抗生素筛选鉴定到的2周的阳性苗叶片利用Zeiss SP8激光共聚焦显微镜进行亚细胞定位的观察。用BFA(BrefeldinA)处理30min的叶片同样用显微镜观察，观察NAET1-GFP和NAET2-GFP的定位改变(图2B)。

5、本发明人利用用另一个载体p1300-GFP载体，以35s驱动建立质粒。将1300-NAET2-EGFP质粒通过农杆菌介导的方法打入烟草表皮细胞中，同时与高尔基标记物CD3-967，反式高尔基标记物VHAα1-mCherry(图2中对应1300-NAET2-EGFP、1300-VHAα1-mCherry组)，PHO1-mCherry(图2中对应1300-NAET2-EGFP、1300-PHO1-mCherry组)共同转化，用激光共聚焦显微镜观察定位情况(图2C)。

瞬时转化原生质体实验显示，NAET1和NAET2在细胞中呈现点状分布(图2A)。

BFA实验处理稳定转化的叶表皮细胞内可以形成BFA小体，提示NAET1和NAET2参与囊泡运输过程(图2B)。

烟草共定位实验表明，NAET1和NAET2部分共定位于高尔基体，反面高尔基体管网状结构(TGN)以及未知的小囊泡中(图2C-D)。

实施例3、NAET1和NAET2在酵母中和烟草胺合成酶共表达后，可以将烟草胺转运到细胞外

(1)NAET1和NAET2酵母表达表达载体的构建

根据NAET1和NAET2的cDNA序列，分别设计去掉终止密码子的特异引物，以cDNA为模板利用高保真酶KODplus(TOYOBO公司)进行PCR扩增，同时设计相应的引物扩增GFP片段，用OverlapPCR的方式分别将NAET1，NAET2和GFP片段融合。连接成功PCR产物经电泳回收后克隆到酵母表达载体pYES2上。阳性克隆进行测序验证正确，从而获得pYES2-NAET1-GFP和pYES2-NAET2-GFP质粒。

根据NAET1和NAET2的cDNA序列，以Col-0根部的cDNA为模板利用高保真酶KODplus(TOYOBO公司)进行PCR扩增，将NAET1和NAET2的CDS序列连接到pPR3-N载体上，从而获得pPR3-N-NAET1，pPR3-N-NAET2质粒。

根据烟草胺合成酶基因AhNAS3(GenBank登录号CAE45015.1；物种来源：叶芽鼠耳芥Arabidopsis halleri)的cDNA序列，以Arabidopsis helleri根部的cDNA为模板利用高保真酶KODplus(TOYOBO公司)进行PCR扩增，将AhNAS3的CDS序列连接到pBT-STE(pBT3-STE)载体(购自上海唯地公司)上。阳性克隆进行测序验证正确，从而获得pBT-STE-AhNAS3质粒。

(2)酵母转化

将pYES2-NAET1-GFP和pYES2-NAET2-GFP质粒转化到野生型酵母BY4741中，用缺Ura缺陷型培养基筛选。

将pPR3-N-NAET1，pPR3-N-NAET2和pPR3-N空载分别与pBT-STE-AhNAS3质粒共转化到NMY51酵母中，用缺Leu和Trp缺陷型培养基筛选。

(3)酵母亚细胞定位观察

转化pYES2-NAET1-GFP和pYES2-NAET2-GFP质粒阳性的BY4741酵母在SD-Ura(+Glucose)酵母培养基中过夜培养到OD＝2～3，用SD-Ura(+Galactose)酵母培养基稀释到OD＝0.2，摇到OD＝1时用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位(图3A)。

(4)酵母细胞中NA含量检测

将pPR3-N-NAET1，pPR3-N-NAET2和pPR3-N空载分别与pBT-STE-AhNAS3质粒共转化的NMY51酵母用SD-LeuTrp的酵母培养基摇到OD＝1(100ml)，1500g，离心15min，分别收集菌体和上清，菌体统一定容到500μl，上清统一低温浓缩到1ml，之后80℃水浴，萃取30min；13400g，4℃离心10min；用1ml规格注射器取上清，注射器连接水系0.22μm滤膜，用力将上清液打过滤膜，滤液用1.5ml进口离心管收集，立即进行质谱检测。(NA含量采用LC-LTQOrbitrap XL MS/MS Thermo Fisher Scientific进行检测)(图3B和图3C)。

酵母中亚细胞定位观察发现，NAET1和NAET2在酵母中也呈现点状分布(图3A)，与在植物细胞中定位一致，提示其参与到囊泡运输过程中。将酵母细胞内异源表达NAS合成酶之后，发现表达NAET1和NAET2的菌体内烟草胺(NA)的含量显著低于空载组(图3B)，而上清中NA含量显著高于空载(图3C)。

实施例4、NAET1和NAET2 CRISPR载体的构建与NAET1和NAET2突变体的鉴定

本实施例中，建立NAET1和NAET2纯合的单突变体和双突变体：

naet1：突变在NAET1第27位核苷酸处，其后插入了5个碱基导致蛋白翻译移码。

naet2：突变在NAET1第21位核苷酸处，其后插入了1个碱基导致蛋白翻译移码。

naet1naet2：通过naet1和naet2杂交，F2代中分离出纯合。

1、NAET1和NAET2 CRISPR载体的构建

设计点突变体载体的引物：

DT1-BsF：GGTCTCGTGCTGGAGGAGAGAAAAGAAGGTT(SEQ ID NO:11)

DT1-F0：TGCTGGAGGAGAGAAAAGAAGGTTTTAGAGCTAGAAAGC(SEQ ID NO:12)

DT2-R0：AACCTTGTCTTCTGTTCTAACACTCTTAGTCGACTCTAC(SEQ ID NO:13)

DT2-BsR：TTGGTCTCGAAACCTTGTCTTCTGTTCTAAC(SEQ ID NO:14)

PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-DT1T2为模板(来自中国农业大学陈其军实验室)进行四引物PCR扩增。-BsF/-BsR为正常引物浓度；-F0/-R0稀释20倍。

纯化回收PCR产物，建立如下酶切-连接体系如表3。

表3

取5ul转化大肠杆菌感受态。利用Kan抗性培养板筛选。

U626-IDF+U629-IDR＝726bp菌落PCR鉴定采用如下引物：

U626-IDF：TGTCCCAGGTAGAGTAGGC(SEQ ID NO:15)，

629-IDR：AGCCCTCTTCTTTCGCCCAAC(SEQ ID NO:16)。

用U626-IDF测序鉴定。将正确的载体转入农杆菌备用。

2、NAET1和NAET2突变体的鉴定

扩增包含NAET1靶位点的片段，应用的引物如下：

Cri8-F：GTAGTTTGTTTTCTAGGAAC(SEQ ID NO:17)，

Cri8-R：CTGTCCCAAAGACGGCAA(SEQ ID NO:18)。

扩增包含NAET2靶位点的片段，应用的引物如下：

Cri9-F：CCACTCACAACCAAC(SEQ ID NO:19)，

Cri9-R：CTTGCACAAGTTAACCC(SEQ ID NO:20)。

提取叶片的总DNA，以DNA为模板，利用设计的扩增引物进行PCR验证突变体的纯合性(图4A)。

3、纯合突变体和野生型苗期生长表型拍照

将NAET1和NAET2纯合的单突变体和双突变体和野生型在长日照正常土壤培养四周，取地上部拍照，纯合突变体呈现株型的显著减小(图4B)。

4、纯合突变体和野生型植株的组织中NA的含量

长日照水培条件下7周，检测突变体与野生型中木质部汁液中NA的含量，如图5A，纯合突变体在木质部汁液中NA大大降低。

长日照水培条件下7周，检测突变体与野生型中根部、老叶、新叶、花和种子中NA的含量，如图5B，与野生型相比，纯合突变体的NA聚集于根中；叶组织中则NA含量接近；在花和种子中，纯合突变体的NA含量大大低于野生型。因此，NAET1、NAET2调控植物中NA的分布。

实施例5、naet1naet2突变体和野生型的NA分布或转运情况分析

对naet1naet2突变体和野生型中各个组织中NA总量的测定，具体实施过程如下：

(1)选取突变体材料(naet1naet2)以及背景野生型Col-0。利用1/2MS萌发2周。

(2)将幼苗移至500ml的水培盒中，用Hogland营养液培养5周，期间每3天更换一次营养液。

(3)收集突变体和野生型各个组织样品，包括根，老叶，新叶，花和果荚，液氮速冻，存于超低温冰箱。

(4)收集突变体和野生型植株木质部流。将突变体和野生型植株从薹基部往上约1cm处剪断，将苗放在高湿度，22℃培养箱，收集植株吐出的木质部流。第一滴丢弃，收集之后4h内吐出的木质部流，取等量体积的样品冻存。

(5)液氮研磨组织鲜样，充分研磨。

(6)称取0.2g研磨成的样品粉末至1.5ml进口离心管。

(7)300ul超纯水(18.25Ω)至离心管，反复震荡混匀。

(8)离心管放入80℃水浴，萃取30min。13,400x g、4℃离心10min。

(9)用l规格注射器取上清，注射器连接水系0.22μm滤膜，用力将上清液打过滤膜，滤液用1.5ml进口离心管收集，立即进行质谱检测(NA含量采用LC-LTQ Orbitrap XL MS/MSThermo Fisher Scientific进行检测)。

结果表明，naet1naet2双突变体材料与野生型相比，根中富集更多的NA，木质部流中的NA含量降低(图6A；B)，表明突变体中NA从地下部往地上部的转运受阻。突变体中老叶和新叶中的NA含量并无变化(图6C；D)，但是花和果荚组织中NA含量降低，表明突变体中NA的韧皮部运输受阻。

总的结果表明，突变体中质外体即胞内往外分泌的NA减少，导致库组织花和果荚中NA降低，源组织根中NA含量升高。

实施例6、naet1naet2双突变体与野生型的金属转运分析

对naet1naet2突变体和野生型中各个组织中Cu和Fe总量的测定，具体实施过程如下：

(3)收集突变体和野生型各个组织样品，包括根，茎，老叶，新叶，花，果荚，用去离子水清洗5遍，称取2-5mg样品放入玻璃管中，与65℃烘箱烘3d。

(4)收集突变体和野生型植株木质部流。将突变体和野生型植株从薹基部往上约1cm处剪断，将苗放在高湿度，22℃培养箱，收集植株吐出的木质部流。第一滴丢弃，收集之后4h内吐出的木质部流，取等量体积的样品进行后续消解。

(5)向放各个组织玻璃管中添加1ml 65％HNO₃，在115℃石墨炉中消煮4h。

(6)用去离子水将样品消煮液定容至10ml，充分混匀。

(7)利用ICP-MS测定各样品中Cu和Fe含量。

结果表明，naet1naet2双突变体材料与野生型相比，根中富集更多的Cu，地上部各组织中的Cu降低，包括木质部流(图6A；C)；而Fe只在幼嫩的组织如幼叶，茎，花，果荚组织中降低，老叶和木质部流中并未变化(图6B；D)。表明NAET1和NAET2参与调控Cu和Fe的长距离运输过程，包括但不限于Cu在木质部流中运输和Fe在韧皮部中的运输。

同时，本发明人试验将NAET的翻译效率提高来使得蛋白过表达，从而促进提高植物地上部的Cu和/或Fe的量。具体地，考虑到uORF可抑制下游翻译，本发明人敲除NAET2的5’UTR上的一uORF，使得NAET2在它自身表达的位置翻译效率提高，其蛋白表达量的提高提示种子中Cu和Fe离子含量提高的表型。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 新型烟草胺外排基因的克隆及其应用

<130> 206669

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1659

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atggctggag gagagaaaag aagaggactt agtaaatctt gtgctcttct catagtgatt 60

gctgggatag agagatatgc attcaaagga gttgcatcaa acttagtgac atatctaact 120

gatgtagtga agatgagcaa ttcaagagca gccacgactg tgaacacttg gagtggcttc 180

actttcatgt tgcctctctt ctctgctcct tttgccgatt cttattggga cagattcttc 240

accatccttg cttcttcttc tctctacttt gtgggtctag tgggattgac atttacggca 300

tttgctgggt cacgttcgac tacaaaaaca atctctcttt acttcctcta cacttcactt 360

tccctcgtcg ctctaggcct tggcgtctta aacccatctc tacaagcctt tggtgctgac 420

cagctcgact acgaccttga ccatgacaat gaccacgagc catcctcaga gaacaaagaa 480

gtcaaatcga accgcaagac tcagtttttc caatggtggt attttggtgt ctgcgccggt 540

agtcttctag gagtcaccgt catggcttac atccaagaca cgtttggatg ggttatcggt 600

tttgcaatcc caaccgcttc gatgttgttg ttgatcttct tgttcttgtg tggctgcggg 660

gtctatgttt atgctgatcc agacctcaaa gctaaaccat ttcaaaggat attagagatt 720

atcaaagaaa gagtgtgtgg aagaaataag atcactcttg ttaacgacca cgatttaaat 780

gccatggaac tagagctgca agatcagaag cctctatgta actgtagcaa cactgaagct 840

aatactacta ccaagagctt acctgatgat cataaaagct gcaaaaccgg tttttcgggg 900

cttgaaaccg tcaagctatt gcttcgactt ttacctatat ggacgatgct tcttatgttt 960

gcagttatat tccaacaacc cgcgaccttt ttcacaaagc aaggtatgac tatgaagaga 1020

aacatcggac caaacttcaa gatcccacca gcaacactac aaagcactat cactttatcc 1080

ataatccttc ttatgccctt ctacgacaaa atcttgatac cgatcgccaa aaaactaacg 1140

aaaaacgaaa agggtatttc tgtgaaggaa agaatgggga ttgggatgtt cctgtccatc 1200

atcgccattg ttattgccgc gttagtcgaa agaaaaagac taaagataag caaaatgatg 1260

aagactacac ctaatttgga ccccgtaagc atattgtggc tcctacctca gtacattcta 1320

ttgggaatct cggacatttt cacagttgtt ggaatgcaag agttcttcta cagcgaggtt 1380

cctgttagca tgagaacaat gggatttgct ttgtacacaa gcgttttcgg tgtggggagt 1440

tttgtgagtg ctgcgttgat ttcgataata gagacttaca cgagctcaag aggtggaaaa 1500

cataactggt ttgcagatga tatgtcggaa gctagacttg ataactatta ttggcttttg 1560

gctttcacaa gtgctattag cttcttgatg tatattgtta tttgcaagca tttcaagagt 1620

agaagtgatg atgatgatca atgtgataca aattgttaa 1659

<210> 2

<211> 552

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Ala Gly Gly Glu Lys Arg Arg Gly Leu Ser Lys Ser Cys Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ile Val Ile Ala Gly Ile Glu Arg Tyr Ala Phe Lys Gly Val Ala

20 25 30

Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Thr Asp Val Val Lys Met Ser Asn Ser

35 40 45

Arg Ala Ala Thr Thr Val Asn Thr Trp Ser Gly Phe Thr Phe Met Leu

50 55 60

Pro Leu Phe Ser Ala Pro Phe Ala Asp Ser Tyr Trp Asp Arg Phe Phe

65 70 75 80

Thr Ile Leu Ala Ser Ser Ser Leu Tyr Phe Val Gly Leu Val Gly Leu

85 90 95

Thr Phe Thr Ala Phe Ala Gly Ser Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Leu Tyr Phe Leu Tyr Thr Ser Leu Ser Leu Val Ala Leu Gly Leu Gly

115 120 125

Val Leu Asn Pro Ser Leu Gln Ala Phe Gly Ala Asp Gln Leu Asp Tyr

130 135 140

Asp Leu Asp His Asp Asn Asp His Glu Pro Ser Ser Glu Asn Lys Glu

145 150 155 160

Val Lys Ser Asn Arg Lys Thr Gln Phe Phe Gln Trp Trp Tyr Phe Gly

165 170 175

Val Cys Ala Gly Ser Leu Leu Gly Val Thr Val Met Ala Tyr Ile Gln

180 185 190

Asp Thr Phe Gly Trp Val Ile Gly Phe Ala Ile Pro Thr Ala Ser Met

195 200 205

Leu Leu Leu Ile Phe Leu Phe Leu Cys Gly Cys Gly Val Tyr Val Tyr

210 215 220

Ala Asp Pro Asp Leu Lys Ala Lys Pro Phe Gln Arg Ile Leu Glu Ile

225 230 235 240

Ile Lys Glu Arg Val Cys Gly Arg Asn Lys Ile Thr Leu Val Asn Asp

245 250 255

His Asp Leu Asn Ala Met Glu Leu Glu Leu Gln Asp Gln Lys Pro Leu

260 265 270

Cys Asn Cys Ser Asn Thr Glu Ala Asn Thr Thr Thr Lys Ser Leu Pro

275 280 285

Asp Asp His Lys Ser Cys Lys Thr Gly Phe Ser Gly Leu Glu Thr Val

290 295 300

Lys Leu Leu Leu Arg Leu Leu Pro Ile Trp Thr Met Leu Leu Met Phe

305 310 315 320

Ala Val Ile Phe Gln Gln Pro Ala Thr Phe Phe Thr Lys Gln Gly Met

325 330 335

Thr Met Lys Arg Asn Ile Gly Pro Asn Phe Lys Ile Pro Pro Ala Thr

340 345 350

Leu Gln Ser Thr Ile Thr Leu Ser Ile Ile Leu Leu Met Pro Phe Tyr

355 360 365

Asp Lys Ile Leu Ile Pro Ile Ala Lys Lys Leu Thr Lys Asn Glu Lys

370 375 380

Gly Ile Ser Val Lys Glu Arg Met Gly Ile Gly Met Phe Leu Ser Ile

385 390 395 400

Ile Ala Ile Val Ile Ala Ala Leu Val Glu Arg Lys Arg Leu Lys Ile

405 410 415

Ser Lys Met Met Lys Thr Thr Pro Asn Leu Asp Pro Val Ser Ile Leu

420 425 430

Trp Leu Leu Pro Gln Tyr Ile Leu Leu Gly Ile Ser Asp Ile Phe Thr

435 440 445

Val Val Gly Met Gln Glu Phe Phe Tyr Ser Glu Val Pro Val Ser Met

450 455 460

Arg Thr Met Gly Phe Ala Leu Tyr Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Ser

465 470 475 480

Phe Val Ser Ala Ala Leu Ile Ser Ile Ile Glu Thr Tyr Thr Ser Ser

485 490 495

Arg Gly Gly Lys His Asn Trp Phe Ala Asp Asp Met Ser Glu Ala Arg

500 505 510

Leu Asp Asn Tyr Tyr Trp Leu Leu Ala Phe Thr Ser Ala Ile Ser Phe

515 520 525

Leu Met Tyr Ile Val Ile Cys Lys His Phe Lys Ser Arg Ser Asp Asp

530 535 540

Asp Asp Gln Cys Asp Thr Asn Cys

545 550

<210> 3

<211> 1692

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

atggatttag aacagaagac aagaggactt agcaagtcat gtgcccttct catagtgatt 60

gcgggaatgg agagatatgc attcaaagga gttgcatcaa acttagtgac atatctaaca 120

gatgtagtga agatgagtaa ttcaagagca gccaaaactg ttaacacttg ggctggtttc 180

acttctatgt tgcctctctt ctctgctcct ttggctgata cttattggga cagattcttc 240

accatccttg cttcttcttc cgtctacttt gtgggactag tgggattgac atggacggca 300

tttgctgggt cacgttcagc tactaagact atctcttctt actttctcta ctcttcacta 360

tgtcttgtct caatcggttt aggcgtctta aacccttctc ttcaagcctt tggtgcagac 420

caactcgacc acgacctcga taagaatttc gatctttcct cgggtgatca aaaggacgcg 480

aaagctaccc gaaagactca gtttttccaa ttgtggtact ttggcgtctg caccggcagc 540

cttatgggtg tcacagtcat ggcttatatt caagacactt ttggttgggt tctcggtttc 600

gccattcctg gtatcgtgat attcctgtcg attttggtgt tcatgtcggg ttgtggaatt 660

tatgtttatg ctccgggcgc ccgtctgaag aagaaaacaa ctactacacc ttttgagaag 720

attcttaaat tcattaaagg gagagtagtg aagcagagaa gcatatatac acttgcagat 780

gagaaagatt tggatgctat ggagcttgag ctagaggaga ggcctctctg taaatgtgag 840

accgaagaca ttgagactcc ttcaacaacc tccaaaggat tggaagatga cgagagctcg 900

aaaacggttt tctctggaat tgataatgtt aagttagtga ttcgcctttt ccccatatgg 960

atgatgcttc tcatgttcgc ggttatcttc cagctaccag caaccttttt caccaaacaa 1020

ggtgtgacta tgaagagaaa cattgggtcc aacttcaaaa tcccacctgc aaccctgcaa 1080

agcacgatca cattatcaat catcctgctt atgccattat atgataagat tttgatacct 1140

attaccaaga gaatcaagaa aaacggtaca ggtatctctg tgatggagag aatgggagtc 1200

ggaatgtttc tatccatcat tgccattgtt attgcggcaa tagtcgaaag gaaaagacta 1260

gccataagcc aaaagatgaa gactttacct gattatgatc cagaaaccgt cccactgagc 1320

atcttctggc tgctgcctca gtacatcctc ttgggaatct cagatatatt cacagtcgtt 1380

gggatgcaag agtttttcta cagtgaggtt cctgtaagaa tgagaacaat gggatttgct 1440

ctctacacaa gtgtttttgg tgttggaagc tttgtgagcg ccgcactgat ctcaattgtc 1500

gaggcttact cgagctcaac aggtgaccga caaaactggt ttgcagatga tatgtcggaa 1560

gctcggcttg acaaatacta ctggcttctt gctcttacaa gtacaataag ctttgtagtc 1620

tacatatttc tatgcaagtt tttcaagagt agcagtgatc aaggcgatga aaaagaagaa 1680

gcccctaaat ga 1692

<210> 4

<211> 563

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 4

Met Asp Leu Glu Gln Lys Thr Arg Gly Leu Ser Lys Ser Cys Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ile Val Ile Ala Gly Met Glu Arg Tyr Ala Phe Lys Gly Val Ala

20 25 30

Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Thr Asp Val Val Lys Met Ser Asn Ser

35 40 45

Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Thr Trp Ala Gly Phe Thr Ser Met Leu

50 55 60

Pro Leu Phe Ser Ala Pro Leu Ala Asp Thr Tyr Trp Asp Arg Phe Phe

65 70 75 80

Thr Ile Leu Ala Ser Ser Ser Val Tyr Phe Val Gly Leu Val Gly Leu

85 90 95

Thr Trp Thr Ala Phe Ala Gly Ser Arg Ser Ala Thr Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Ser Leu Cys Leu Val Ser Ile Gly Leu Gly

115 120 125

Val Leu Asn Pro Ser Leu Gln Ala Phe Gly Ala Asp Gln Leu Asp His

130 135 140

Asp Leu Asp Lys Asn Phe Asp Leu Ser Ser Gly Asp Gln Lys Asp Ala

145 150 155 160

Lys Ala Thr Arg Lys Thr Gln Phe Phe Gln Leu Trp Tyr Phe Gly Val

165 170 175

Cys Thr Gly Ser Leu Met Gly Val Thr Val Met Ala Tyr Ile Gln Asp

180 185 190

Thr Phe Gly Trp Val Leu Gly Phe Ala Ile Pro Gly Ile Val Ile Phe

195 200 205

Leu Ser Ile Leu Val Phe Met Ser Gly Cys Gly Ile Tyr Val Tyr Ala

210 215 220

Pro Gly Ala Arg Leu Lys Lys Lys Thr Thr Thr Thr Pro Phe Glu Lys

225 230 235 240

Ile Leu Lys Phe Ile Lys Gly Arg Val Val Lys Gln Arg Ser Ile Tyr

245 250 255

Thr Leu Ala Asp Glu Lys Asp Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Leu Glu

260 265 270

Glu Arg Pro Leu Cys Lys Cys Glu Thr Glu Asp Ile Glu Thr Pro Ser

275 280 285

Thr Thr Ser Lys Gly Leu Glu Asp Asp Glu Ser Ser Lys Thr Val Phe

290 295 300

Ser Gly Ile Asp Asn Val Lys Leu Val Ile Arg Leu Phe Pro Ile Trp

305 310 315 320

Met Met Leu Leu Met Phe Ala Val Ile Phe Gln Leu Pro Ala Thr Phe

325 330 335

Phe Thr Lys Gln Gly Val Thr Met Lys Arg Asn Ile Gly Ser Asn Phe

340 345 350

Lys Ile Pro Pro Ala Thr Leu Gln Ser Thr Ile Thr Leu Ser Ile Ile

355 360 365

Leu Leu Met Pro Leu Tyr Asp Lys Ile Leu Ile Pro Ile Thr Lys Arg

370 375 380

Ile Lys Lys Asn Gly Thr Gly Ile Ser Val Met Glu Arg Met Gly Val

385 390 395 400

Gly Met Phe Leu Ser Ile Ile Ala Ile Val Ile Ala Ala Ile Val Glu

405 410 415

Arg Lys Arg Leu Ala Ile Ser Gln Lys Met Lys Thr Leu Pro Asp Tyr

420 425 430

Asp Pro Glu Thr Val Pro Leu Ser Ile Phe Trp Leu Leu Pro Gln Tyr

435 440 445

Ile Leu Leu Gly Ile Ser Asp Ile Phe Thr Val Val Gly Met Gln Glu

450 455 460

Phe Phe Tyr Ser Glu Val Pro Val Arg Met Arg Thr Met Gly Phe Ala

465 470 475 480

Leu Tyr Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Ser Phe Val Ser Ala Ala Leu

485 490 495

Ile Ser Ile Val Glu Ala Tyr Ser Ser Ser Thr Gly Asp Arg Gln Asn

500 505 510

Trp Phe Ala Asp Asp Met Ser Glu Ala Arg Leu Asp Lys Tyr Tyr Trp

515 520 525

Leu Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ile Ser Phe Val Val Tyr Ile Phe Leu

530 535 540

Cys Lys Phe Phe Lys Ser Ser Ser Asp Gln Gly Asp Glu Lys Glu Glu

545 550 555 560

Ala Pro Lys

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ggaactagag ctgcaagca 19

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

ggttgttgga aactgca 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

tctactttgt gggactagtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

ggtttaagac gcctaaaccg 20

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

agaagcaagc acaagc 16

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

cagcaagctt caactcct 18

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

ggtctcgtgc tggaggagag aaaagaaggt t 31

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

tgctggagga gagaaaagaa ggttttagag ctagaaagc 39

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

aaccttgtct tctgttctaa cactcttagt cgactctac 39

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

ttggtctcga aaccttgtct tctgttctaa c 31

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

tgtcccaggt agagtaggc 19

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

agccctcttc tttcgcccaa c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

gtagtttgtt ttctaggaac 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

ctgtcccaaa gacggcaa 18

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

ccactcacaa ccaac 15

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

cttgcacaag ttaaccc 17

Claims

1. 一种烟草胺外排蛋白的用途，用于转运烟草胺、将细胞内的烟草胺转运到胞外；其中，所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述细胞为生产烟草胺的细胞。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述烟草胺外排蛋白通过将烟草胺转运到囊泡中，介导控制烟草胺向胞外转运。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述转运烟草胺包括：在生产烟草胺的细胞中，促进烟草胺由胞内向外分泌；所述促进烟草胺由胞内向外分泌能够提高单细胞生物制备烟草胺的效率，简化单细胞生物制备烟草胺流程。

4. 一种烟草胺外排蛋白的用途，用于提高植物地上部的Cu和/或Fe的量、降低地下部的Cu和/或Fe的量；其中，所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述植物为十字花科植物拟南芥。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述烟草胺外排蛋白通过参与Cu在木质部中的运输和Fe在韧皮部中的运输，调控Cu和/或Fe的分布。

6. 一种烟草胺外排蛋白的下调分子的用途，用于抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运；所述下调分子为：针对所述烟草胺外排蛋白的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将烟草胺外排蛋白进行功能丧失性突变；所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述细胞为生产烟草胺的细胞。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运包括：减少烟草胺向囊泡的转运。

8. 一种烟草胺外排蛋白的下调分子的用途，用于降低植物地上部的Cu和/或Fe的量、提高地下部的Cu和/或Fe的量；所述下调分子为：针对所述烟草胺外排蛋白的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将烟草胺外排蛋白进行功能丧失性突变；所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述植物为十字花科植物拟南芥。

9.如权利要求6至8任一所述的用途，其特征在于，所述的下调分子为基因编辑试剂，其将NAET1或将NAET2进行包括选自下组的突变：

NAET1第27位核苷酸处，其后插入碱基使蛋白翻译移码；

在NAET2第21位核苷酸处，其后插入了碱基使蛋白翻译移码。

10. 一种调控烟草胺转运的方法，包括：在细胞中调控烟草胺外排蛋白的表达或活性；其中，所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；

所述的调控为利用烟草胺外排蛋白将细胞内的烟草胺转运到胞外；或

所述的调控为下调烟草胺外排蛋白的表达或活性，抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运；

所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述细胞为生产烟草胺的细胞。

11. 一种调控植物中Cu和/或Fe分布的方法，包括：在植物中调控烟草胺外排蛋白的表达或活性；其中，所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；

所述的调控为利用烟草胺外排蛋白提高植物地上部的Cu和/或Fe的量、降低地下部的Cu和/或Fe的量；或

所述的调控为下调烟草胺外排蛋白的表达或活性，降低植物地上部的Cu和/或Fe的量、提高地下部的Cu和/或Fe的量；

所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述植物为十字花科植物拟南芥。

12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述下调烟草胺外排蛋白的表达或活性包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除烟草胺外排蛋白的编码基因，以同源重组的方法敲除烟草胺外排蛋白的编码基因，将烟草胺外排蛋白进行功能丧失性突变。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述地上部为花，果荚，籽粒，叶片，茎，种子。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的地下部为根。

15.一种生产烟草胺的方法，其特征在于，包括：在生产烟草胺的细胞中，引入烟草胺外排蛋白；其中，所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述生产烟草胺的细胞中包括外源的烟草胺合成酶；所述烟草胺外排蛋白促进烟草胺由胞内向外分泌；

所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

16. 烟草胺外排蛋白或其编码基因的用途，用作鉴定植物的地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布的分子标记物；其中，所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述植物为十字花科植物拟南芥。

17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，通过特异性检测烟草胺外排蛋白或其编码基因的抗体、引物或探针进行所述的鉴定。

18. 如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述引物包括针对NAET1的：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 6；或所述引物包括针对NAET2的：SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8。

19.一种定向选择或鉴定植物的地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布改变的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物体内烟草胺外排蛋白的表达或活性，若该测试植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性高于该类植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性的平均值，则其为地上部的Cu和/或Fe的量高、地下部的Cu和/或Fe的量低的植物；或，

若该测试植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性低于该类植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性的平均值，则其为地上部的Cu和/或Fe的量低、地下部的Cu和/或Fe的量高的植物；

其中，所述的烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQID NO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述植物为十字花科植物拟南芥。

20.一种筛选调节烟草胺转运的物质的方法，包括：

(1)将候选物质加入到表达烟草胺外排蛋白的体系中；

(2)检测所述体系，观测其中烟草胺外排蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为可用于将细胞内的烟草胺转运到胞外的物质；若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运的物质；

其中，所述烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述细胞为生产烟草胺的细胞。

21.一种筛选调节植物地上部和地下部的Cu和/或Fe的分布的物质的方法，包括：

(1)将候选物质加入到表达烟草胺外排蛋白的体系中；

(2)检测所述体系，观测其中烟草胺外排蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为提高植物地上部的Cu和/或Fe的量、降低地下部的Cu和/或Fe的量的物质；若其表达或活性降低，则表明该候选物质为降低植物地上部的Cu和/或Fe的量、提高地下部的Cu和/或Fe的量的物质；

其中，所述烟草胺外排蛋白为NAET1或NAET2；所述NAET1的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述NAET2的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，或为在其N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或为在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；所述植物为十字花科植物拟南芥。