CN104302773A - 增加植物对热胁迫的耐受性及氨基酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在植物、植物部分或植物细胞中增加对高温或热胁迫的耐受性的方法，该方法包括向植物、植物部分或植物细胞中引入一种或多种编码(i)谷氨酰胺合成酶1；2(GS1；2)、(ii)谷氨酸脱羧酶3(GAD3)、(iii)I类谷氨酰胺酰胺转移酶(GAT1)、(iv)MYB55多肽或其任何组合的核酸。还提供了在植物、植物部分或植物细胞中增加氨基酸含量的方法，该方法包括向植物、植物部分或植物细胞中引入一种或多种编码(i)GS1；2、(ii)GAD3、(iii)GAT1、(iv)MYB55多肽或其任何组合的核酸。

Description

增加植物对热胁迫的耐受性及氨基酸含量的方法
发明领域
本发明涉及增加对热胁迫或高温的耐受性的方法以及增加一种植物、植物部分或植物细胞的氨基酸含量的方法。
发明背景
植物经受各种可不利地影响它们的生产力的胁迫条件。例如，热胁迫可不利地影响一种植物生长和发育的各个方面，包括但不限于能育性、种子萌发、胚芽鞘生长、灌浆和/或果实颜色。参见，例如，阿什拉夫(Ashraf)等人，环境与实验植物学(ENVIRON.EXP.BOT.)34:275(1994)；远藤(Endo)等人，植物细胞生理学(PLANT CELL PHYSIOL.)50:1911(2009)；贾格迪什(Jagadish)等人，实验植物学杂志(J.EXP.BOT.)61:143(2010)；科隆帕伊乌(Kolupaev)等人，俄罗斯植物生理学杂志(RUSSIAN J.PLANT PHYSIOL.)52:199(2005)；林(Lin)等人，农业食品化学杂志(J.AGRIC.FOOD CHEM.)58:10545(2010)；林-王(Lin-Wang)等人，植物细胞与环境(PLANT CELL ENVIRON.)34(7):1176(2011)；莫里塔(Morita)等人，植物学年报(ANN.BOT.)95:695(2005))。为世界人口的大约一半提供食物的水稻对热胁迫可能是特别易感的。参见彭(Peng)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)101:9971(2004)(描述响应1992年和2003年间全球夜间气温增加国际水稻研究所水稻产量减少)。
尽管大多数热响应的研究集中在热休克转录因子和热休克蛋白上，热耐受性是一个涉及到许多基因、途径和系统的复杂的过程。事实上，已显示多种蛋白质、分子和途径在棉花、小麦、玉米和其他植物中的热胁迫响应中发挥作用。
MYB转录因子调节植物生命周期中的众多过程并基于它们结合结构域中相邻重复的数量被分为三个主要的组：R1R2R3-MYB、R2R3-MYB、和R1-MYB。大部分植物MYB转录因子是R2R3类型，参与广泛的生理反应，例如调节异丙甾(isopropanoid)和类黄酮途径、控制细胞周期、根生长、各种防御和胁迫响应。杜(Du)等人，生物化学(莫斯科)(BIOCHEM.(MOSC))74:1(2009)；金(Jin)和马汀(Martin)，植物分子生物学(PLANT MOL.BIOL.)41:577(1999)；李(Lee)等人，植物-微生物分子相互作用(MOL.PLANT MICROBE INTERACT.)14:527(2001)；林-王(Lin-Wang)等人，BMC植物生物学(BMC PLANT BIOL.)10:50(2010)；梅尔韦(Mellway)等人，植物生理学(PLANT PHYSIOL.)150:924(2009)；木(Mu)等人，细胞研究(CELL RES.)19:1291(2009)；拉法埃莱(Raffaele)等人，植物细胞(PLANT CELL)20:752(2008)；斯翠克(Stracke)等人，植物生物学新见(CURR.OPIN.PLANT BIOL.)4:447(2001)；杉本(Sugimoto)等人，植物细胞(PLANT CELL)12:2511(2000)；杨(Yang)和克莱西格(Klessig)，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)93:14972(1996))。尽管MYB家族中有大数目的基因，拟南芥MYB68基因是提出的在拟南芥热耐受性中发挥作用的唯一成员。冯(Feng)等人，植物科学(Plant Sci)167:1099(2004)(描述一个突变MYB68植物在高温下生长时降低的生长和根中的高木质素水平)。
发明概述
作为一个方面，本发明提供了一种在转基因植物、植物部分或植物细胞中增加对热胁迫或高温的耐受性的方法，该方法包括向植物、植物部分或植物细胞中引入一种或多种编码(i)谷氨酰胺合成酶1；2(GS1；2)、(ii)谷氨酸脱羧酶3(GAD3)、(iii)I类谷氨酰胺酰胺转移酶(GAT1)、(iv)MYB55多肽或其任何组合的分离的核酸，以产生表达该一种或多种分离的核酸从而产生GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55、或其任何组合的转基因植物、植物部分或植物细胞，由此与一种对照物相比在该转基因植物、植物部分或植物细胞中对热胁迫或高温产生增加的耐受性。
在代表性实施例中，该方法包括：(a)向植物细胞中引入该一种或多种分离的核酸，以产生一种转基因的植物细胞；并且(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生一株转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包括该一种或多种分离的核酸并且对热胁迫或高温具有增加的耐受性。
在另外的实施例中，该方法包括：(a)向植物细胞中引入该一种或多种分离的核酸，以产生一种转基因的植物细胞；(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生一株转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包括该一种或多种分离的核酸；并且(c)从(b)的多个转基因植物中选择对热胁迫或高温具有增加的耐受性的转基因植物。
作为一个另外的方面，本发明提供了一种在转基因植物、植物部分或植物细胞中增加氨基酸含量的方法，该方法包括向植物、植物部分或植物细胞中引入一种编码MYB55多肽的分离的核酸，以产生表达用于产生该MYB55多肽的分离的核酸的转基因植物、植物部分或植物细胞，从而与一个对照物相比在该转基因植物、植物部分或植物细胞中产生增加的氨基酸含量。
在代表性实施例中，该方法包括：(a)向植物细胞中引入该分离的核酸，以产生一种转基因的植物细胞；并且(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包括该分离的核酸并且具有增加的氨基酸含量。
在另外的实施例中，该方法包括：(a)向植物细胞中引入该分离的核酸，以产生一种转基因的植物细胞；(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包括该分离的核酸；并且(c)从(b)的多个转基因植物中具有增加的氨基酸含量的转基因植物。
本发明还提供了一种获得衍生自本发明的转基因植物的子代植物的方法，其中该子代植物在其基因组中包括本发明的一种分离的核酸，并具有增加的对高温或热胁迫的耐受性和/或增加的氨基酸含量。
作为又另一个方面，本发明包括通过本发明的方法产生的一种转基因植物、植物部分或植物细胞，任选地其中该转基因植物、植物部分或植物细胞具有增加的对热胁迫或高温的耐受性和/或增加的氨基酸含量。
在本发明的以下说明中更详细地阐述本发明的这些方面和其他方面。
附图的简要说明
图1A描绘了显示栽培稻MYB55(OsMYB55)和其他物种中的它的若干同源物之间的无根的系统树。
图1B-1F显示此处描述的不同序列。图1B描绘了用于在实例3中所述的表达测定中驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的表达的OsMYB55启动子序列的部分。图1C描绘了OsMYB55启动子序列和邻接的5'非翻译区(UTR)。图1D描绘了OsMYB55基因序列，包括5'UTR、启动子序列、编码区和3'UTR。图1E描绘了OsMYB55cDNA的核苷酸序列。图1F描绘了OsMYB55蛋白的氨基酸序列。存于启动子序列中的核苷酸被加下划线。存于编码序列中的核苷酸显示为大写字母。存于DNA结合区的氨基酸显示为粗体、斜体字母。
图2A显示OsMYB55启动子序列，其中顺式-作用调节元件(CARE)和转录因子结合部位(TFBS)被突出显示。“MeJa”是指涉及在MeJa反应性中的CARE。“HSE”是指涉及在热胁迫反应性中的CARE。“ABRE”是指涉及在脱落酸反应性中的CARE。“TCA”是指涉及在水杨酸反应性中的CARE。“LTR”是指涉及在低温反应性中的CARE。“Skn-1”是指涉及在胚乳表达中的CARE。“GCC盒”是指用于活化蛋白-2(AP-2)转录因子的结合部位。“MBS盒”是指用于MYB转录因子的结合部位。“W盒”是指用于WRKY转录因子的结合部位。“DOF盒”是指用于单指DNA结合(DNA-binding with one finger)(DOF)转录因子的结合部位。OsMYB55编码序列的ATG起始密码子以星号表示。
图2B是用图形描绘了OsMYB55启动子区域中潜在的CARE的定位的图解。“MeJa”是指涉及在MeJa反应性中的CARE。“HSE”是指涉及在热胁迫反应性中的CARE。“ABRE”是指涉及在脱落酸反应性中的CARE。该图解下面的数字表示这些CARE相对于该ATG起始密码子的位置。
图3描绘了在正常生长条件下生长的野生型水稻植物的生命周期中的不同阶段OsMSB55的相对基因表达水平。
图4是显示取自于在正常生长条件下生长四周并且然后暴露于45℃持续0、1、6或24小时的野生型水稻植物的叶的相对OsMYB55转录物水平(平均值±标准差，n＝3)的图。
图5显示取自于在OsMYB55启动子区域(OsMYB55启动子-GUS)的一个2134碱基对片段(SEQ ID NO:1)的控制下表达GUS的水稻植物的叶鞘(I、II)、叶片(III)和根(IV)的横截切片，该水稻植物在正常生长条件下生长4周并且然后暴露于29℃(左)或暴露于45℃(右)持续24小时。将植物组织浸入一种包含1mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基β-G-葡糖苷酸(X-Gluc；生物合成(Biosynth)，伊塔斯加(Itasca)，IL)的溶液中以将GUS蛋白染色，并且取得切片，并使用光学显微镜可视化。
图6是显示在正常生长条件下生长四周的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的叶中的OsMYB55转录物水平的图。
图7A显示来自在萌发并在28℃或39℃下生长四天之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的种子。
图7B是显示在萌发并在28℃(对照)或39℃(高温)下生长四天之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的胚芽鞘长度(平均值±标准差，n＝3)的图。每个重复由25株幼苗组成。
图8A显示在正常生长条件下萌发并在(PROFILE产品，LLC，布法罗格罗夫，IL)中在长日光条件伴随正常温度条件(对照)或高温条件(高温)下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(55:4；55:11)。
图8B-8D是显示在正常生长条件下萌发并在(PROFILE产品，LLC，布法罗格罗夫(Buffalo Grove)，IL)中在长日光条件伴随正常温度条件(对照)或高温条件(高温)下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的(B)植物高度、(C)地面上的营养生物量和(D)根生物量(平均值±标准差，n＝6)的图。
图9A显示在泥炭苔:蛭石(1:4)中在正常日光条件伴随正常温度条件(“29”)或高温条件(“35”)下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(MYB55-4；MYB55-11)。
图9B显示在泥炭苔:蛭石(1:4)中在正常日光条件伴随高温条件下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(MYB55-4；MYB55-11)。
图9C是显示在正常日光条件伴随正常温度条件(对照)或高温条件(高温)下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(MYB55-4；MYB55-11)的地面上的营养生长干生物量(平均值±标准差，n＝6)的图。
图9D是显示在正常日光条件伴随高温条件下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(MYB55-4；MYB55-11)的植物高度和叶鞘长度(平均值±标准差，n＝6)的图。
图10A显示在正常日光条件伴随正常温度条件(左)或高温条件(右)下生长九周之后的野生型水稻植物(每个分组中最左边的植物)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(每个分组中的最右边的两株植物)的水稻圆锥花序。
图10B显示在正常生长条件下生长11周之后的野生型水稻植物的水稻圆锥花序。
图10C显示在长日光条件伴随高温条件下生长11周之后的野生型水稻植物的水稻圆锥花序。
图10D显示在正常日光条件伴随高温条件下生长11周之后的野生型水稻植物的水稻圆锥花序。
图10E显示在正常生长条件下生长17周之后的野生型水稻植物的水稻圆锥花序。
图10F显示在长日光条件伴随高温条件下生长17周的野生型水稻植物的水稻圆锥花序。
图10G显示在正常日光条件伴随高温条件下生长17周的野生型水稻植物的水稻圆锥花序。
图11A-11B是显示在正常日光条件伴随高温条件下生长四周并且然后在正常生长条件下生长直至收获(大约12个另外的周)的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的(A)总干生物量和(B)谷物产率如与在正常生长条件下生长直至收获(大约16周)的等效植物相比的百分比降低的图。
图12是显示在正常生长条件下生长的野生型水稻植物(WT)和表达OsMYB55干扰RNA(OsMYB55-RNAi)的转基因水稻植物(OsMYB55::RNAi-12；OsMYB55::RNAi-16)的叶中的OsMYB55的相对转录物水平(平均值±标准差)的图。将OsMYB55::RNAi-12的OsMYB55转录物水平用作一个参考值来计算这些相对转录物水平。
图13A是显示来自在长日光条件伴随正常温度条件(对照)或高温条件(高温)下生长四周的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的叶的总氨基酸含量(平均值±标准差，n＝3)的图。
图13B-13D是显示在长日光条件伴随正常温度条件下生长四周(对照)或在长日光条件伴随正常温度条件生长四周并且然后暴露于45℃持续1、6或24小时的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的叶中的(B)栽培稻谷氨酰胺合成酶(OsGS1；2)、(C)栽培稻I类谷氨酰胺酰胺转移酶(OsGAT1)和(D)栽培稻谷氨酰胺脱羧酶3(OsGAD3)的相对表达水平(平均值±标准差，n＝3)的图。在该图中描绘的结果是来自三个独立试验的相似结果的代表。
图14A显示使用变化量的重组OsMYB55(0-40μg)和200ng的DNA进行的电泳迁移率变动分析，该DNA包含分离自(I)OsGS1；2,(II)OsGAT1或(III)OsGAD3的启动子区域的一个拷贝。
图14B是显示在瞬时基因表达分析中的GUS的表达水平(平均值±标准差，n＝6)的图，其中将四周大的烟草植物用包括OsMYB55的一个载体和包括GUS的一个GUS报告载体在分离自OsGs1；2、OsGAT1或OsGAD3的一个启动子区域的控制下进行共转化。
图15A是显示来自在长日光条件伴随正常温度条件(对照)或高温条件(高温)下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的叶的谷氨酸含量(平均值±标准差)的图。
图15B是显示来自在长日光条件伴随正常温度条件(对照)或高温条件(高温)下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的叶的γ–氨基丁酸(GABA)含量(平均值±标准差)的图。
图15C是显示来自在长日光条件伴随正常温度条件(对照)或高温条件(高温)下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的叶的精氨酸含量(平均值±标准差)的图。
图15D是显示来自在长日光条件伴随正常温度条件(对照)或高温条件(高温)下生长四周之后的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55-4；OsMYB55-11)的叶的脯氨酸含量(平均值±标准差)的图。
图16A-16B是表示在正常生长条件下生长四周之后并且然后暴露于45℃持续一小时的野生型水稻植物(WT)和过表达OsMYB55的转基因水稻植物(OsMYB55)中显著(A)上调或(B)下调的基因的数目的文氏图(Venn diagrams)。
图17A-H显示针对不同植物MYB55同源物的氨基酸和编码序列。图17A描绘了针对来自两色蜀黍的一种MYB55同源物的氨基酸(SEQ ID NO:6)和cDNA(SEQ ID NO:14)序列。图17B描绘了针对来自玉蜀黍的一种MYB55同源物的氨基酸(SEQ ID NO:7)和cDNA(SEQ ID NO:15)序列。图17C描绘了针对来自酿酒葡萄的一种MYB55同源物的氨基酸(SEQID NO:7)序列。图17D描绘了针对来自毛果杨的一种MYB55同源物(先前指定MYB133)的氨基酸(SEQ ID NO:9)和cDNA(SEQ ID NO:16)序列。图17E描绘了针对来自苹果的一种MYB55同源物(先前指定MYB24)的氨基酸(SEQ ID NO:10)和cDNA(SEQ ID NO:17)序列。图17F描绘了针对来自大豆的一种MYB55同源物(先前指定DcMYB4)的氨基酸(SEQ ID NO:11)和cDNA(SEQ ID NO:18)序列。图17G描绘了针对来自胡萝卜的一种MYB55同源物的氨基酸(SEQ ID NO:12)和cDNA(SEQ ID NO:19)序列。图17H描绘了针对来自拟南芥的一种MYB55同源物(先前指定MYB36)的氨基酸(SEQ ID NO:13)和cDNA(SEQ IDNO:20)序列。
发明详细说明
应当理解的是，本发明可以体现为不同的形式，并且不应当被解释为对在此提出的实施例的限制。更确切地说，提出这些实施例以使得本披露将是彻底的和完整的，并将向本领域的普通技术人员充分传达本发明的范围。
除非上下文另外表明，明确地预期的是在此所述的本发明的不同特征可以按任何组合使用。
而且，本发明还考虑到在本发明的一些实施例中，在此提出的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果该说明书陈述一种包含组分A、B和C的组合物，它明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。
除非另外定义，否则所有在此使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在本发明的在此说明中使用的术语是仅出于描述具体实施例的目的，且并不旨在限制本发明。
在此提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用以其全文结合在此。
I.定义
如在本发明的说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外表明。
如在此使用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
如在此使用的术语“约”当是指一个可测量的值如剂量或时间段等时意在涵盖20％、10％、5％、1％、0.5％、或甚至0.1％的指定量的变化。
如此处使用的术语“包括(comprise、comprises和comprising)”指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、和/或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。
如在此所使用，过渡短语“基本上由…组成”意思是意在将权利要求的范围解读为包括在权利要求书中所述的所指定材料或步骤和并不实质影响要求保护的发明的一个或多个基本特征和新颖特征的那些。参见In re Herz,537F.2d 549,551-52,190U.S.P.Q.461,463(CCPA 1976)(在原文中强调)；还参见MPEP§2111.03。因此，当用于本发明的权利要求或说明书中时，术语“基本上由……组成”并不意在解释为等同于“包括(comprising)”。
除非另外指明，术语“热胁迫”和“高温”(以及相似的术语)是指将一种植物、植物部分或植物细胞暴露于比对于该植物物种和/或品种和/或发育阶段来说最佳的温度高的升高的温度。在代表性实施例中，该植物、植物部分或植物细胞被暴露于高温持续不足以导致热胁迫(例如产率降低)的时间。在本发明的实施例中，该植物、植物部分或植物细胞被暴露于高温持续足以导致热胁迫的时间。
例如，在本发明的实施例中，植物可被暴露于高温持续足够的一个时间段以在该植物中产生热胁迫并导致对植物功能、发育和/或性能的不利影响，例如降低的细胞分裂、尺寸(例如植物高度降低)和/或植物和/或其部分的数目，和/或农艺性状中的损害，例如降低的产率、落果、果实尺寸和/或数目、种子尺寸和/或数目、生产质量，这归因于外观和/或质地和/或增加的花夭折。可在多种情况下将植物、植物部分和植物细胞暴露或经受热胁迫或高温，例如将一种栽培植物暴露于归因于环境温度的热胁迫或高温；将一种植物、植物部分或植物细胞在收获、加工、储存和/或运送过程中暴露于热胁迫或高温；或将一种植物、植物部分或植物细胞暴露于热胁迫或高温来达到想要的效果(例如诱导一个热诱导启动子的活性)。
本领域的普通技术人员将认识到术语“热胁迫”和“高温”不是绝对的并且可随着植物物种、植物品种、发育阶段、水可用性、土壤类型、地理位置、白天长度、季节、其他非生物和/或生物的胁迫原的存在、以及其他在本领域的普通技术人员的水平内熟知的参数而变化。因此，当一个物种被23℃的温度严重影响时，另一个物种可以不受影响直至至少30℃等。典型地，超过30℃的温度导致大部分重要作物的产率的显著降低。
在本发明的实施例中，暴露于热胁迫或高温包括将一种植物、植物部分或植物细胞暴露于至少约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃的温度。在本发明的实施例中，暴露于热胁迫或高温是指温度从约30℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约31℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约32℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约33℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约34℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约35℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约36℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约37℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约38℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约39℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；或从约40℃至约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃。在代表性实施例中，以上温度是指白天温度。
在另外的实施例中，暴露于热胁迫或高温包括将一种植物、植物部分或植物细胞暴露于约24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃的夜间温度。在本发明的实施例中，热胁迫或高温是指从约25℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约26℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约27℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约28℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约29℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约30℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约31℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约32℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约33℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；从约34℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；或从约35℃至约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃的夜间温度。
该植物、植物部分或植物细胞可被暴露于持热胁迫或高温续任何时间段。在示例性实施例中，该植物、植物部分或植物细胞被暴露于热胁迫或高温持续至少约1、2、5、10、15、20、30、40、50、60、90或120分钟或更久；至少约1、2、5、10、15、18、24、48、72或96小时或更久；至少约1、2、3、4、7、10、14、21或30天或更久、至少约1、2、3、4、5或6周或更久；或至少约1、2、3或4个月或更久的时间段。
任选地，在营养生长阶段中将该植物、植物部分或植物细胞暴露于热胁迫或高温。通过在营养生长阶段将一种植物、植物部分或植物细胞暴露于热胁迫或高温意指使该植物、植物部分或植物细胞经受热胁迫或高温持续整个或部分的营养生长阶段，例如持续至少约1、2、5、10、15、20、30、40、50、60、90或120分钟或更久；至少约1、2、5、10、15、18、24、48、72或96小时或更久；至少约1、2、3、4、7、10、14、21或30天或更久、至少约1、2、3、4、5或6周或更久；或至少约1、2、3或4个月或更久的时间段。
在代表性实施例中，在开花和/或结实阶段中该植物、植物部分或植物细胞未被暴露于热胁迫或高温。
本发明包括通过此处所述的温度和时间段的任何组合产生的热胁迫或高温条件。
在代表性实施例中，该植物、植物部分或植物细胞被暴露于热胁迫或高温，包括约35℃的白天温度和约26℃的夜间温度，例如持续约一、二、三、四周、或更久的时间段。在本发明的实施例中，使该植物、植物部分或植物细胞经受热胁迫或高温，包括暴露于约45℃持续至少约5、10、15、20、30、40、50、60、90或120分钟或更久的时间段。
本领域的普通技术人员将理解，通常该植物、植物部分或植物细胞被暴露于一个亚致死水平的热胁迫或高温(例如对该植物、植物部分或植物细胞不是致死的)。
如此处使用的术语“增加的对热胁迫的耐受性”、“增加对热胁迫的耐受性”、“增加的对高温的耐受性”、或“增加对高温的耐受性”(以及类似的术语)是指暴露于热胁迫或高温的并包括如此处所述的核酸(例如分离的核酸)、表达盒或载体的一种植物、植物部分或植物细胞比对照的植物、植物部分或植物细胞(即不包括如此处所述的核酸、表达盒或载体的一种植物、植物部分或植物细胞)更好抵挡给定的热胁迫或高温的能力。可使用多个参数测量增加的对热胁迫或高温的耐受性，这些参数包括但不限于增加的细胞分裂、尺寸(例如植物高度)和/或植物和/或其部分的数目，和/或农艺性状中的改善，例如增加的产率、落果、果实尺寸和/或数目、种子尺寸和/或数目，和/或增加的生产质量，这归因于外观和/或质地和/或降低的花夭折。在本发明的实施例中，增加的对热胁迫或高温的耐受性可依据植物高度、植物营养生物量(例如，干重)和/或谷物产率的增加来评估。这些指数(例如产率、植物尺寸、植物高度、植物营养生物量、谷物产率等等)的增加可显示如与未经受热胁迫或高温的一种对照植物、植物部分或植物细胞相比存在增加和/或可显示如与经受热胁迫或高温但不包括如此处所述的核酸、表达盒或载体的一种对照植物、植物部分或植物细胞相比存在增加。换句话说，如与未暴露于热胁迫或高温的一种植物、植物部分或植物细胞相比可存在降低，但该降低少于在不包括如此处所述的核酸、表达盒或载体的经受热胁迫或高温的一种植物、植物部分或植物细胞中的。
如此处使用的“产率”是指一种商业上和/或农业上重要的植物、植物生物量(例如，干重)、植物部分(例如根、茎、种子、叶、果实、花)、植物材料(例如萃取物)和/或其他通过该植物产生的产物(例如重组多肽)的产量。在本发明的实施例中，“增加的产率”是依据植物高度的增加评估的。
如此处使用的“氨基酸含量的增加”、“增加的氨基酸含量”和相似术语是指氨基酸的量和/或浓度的升高。该增加可以是总氨基酸含量上的增加和/或可以是植物中发现的一种或多种个体氨基酸的含量的增加，这些氨基酸包括但不限于谷氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、或其任意组合。在本发明的实施例中，存在谷氨酸、精氨酸、GABA和/或脯氨酸含量上的增加。氨基酸含量上的增加可以是总植物生物量和/或其一个或多个部分或组织(例如叶、叶鞘和/或根)上的增加。氨基酸含量上的增加可以相对于任何合适的对照，例如不包括如此处所述的核酸、表达盒或载体的一种植物、植物部分或植物细胞进行评估。在本发明的实施例中，该植物已被暴露于热胁迫或高温。在本发明的实施例中，该植物还未被暴露于热胁迫或高温。
术语“调整”(以及语法变体)是指增加或降低。
如此处使用的术语“增加(increase、increases、increased、increasing)”和相似术语表示至少约25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的增加。
如在此使用的术语“降低(reduce、reduces、reduced、reduction)”以及相似术语意指至少大约25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更多的降低。在具体实施例中，该降低导致无或基本上无(即不显著的一个量，例如少于约10％或甚至5％)可检测的活性或量。
如此处使用的，术语“异源的”意指外来的、外源的、非天然的和/或非天然发生的。
如此处使用的“同源的”意指天然的。例如一个同源的核苷酸序列或氨基酸序列是与其所引入的宿主细胞天然相关联的核苷酸序列或氨基酸序列，一个同源的启动子序列是与一个编码序列天然相关联的一个启动子序列等等。
如此处使用的“嵌合的核酸”、“嵌合的核苷酸序列”或“嵌合的多核苷酸”包括可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列的一个启动子，该核苷酸序列与该启动子是异源的(或反之亦然)。在具体实施例中，该“嵌合的核酸”、“嵌合的核苷酸序列”或“嵌合的多核苷酸”包括可操作地与一个异源启动子序列相关联的如此处所述的核酸。
“启动子”是控制或调节一个与该启动子可操作地相关联的核苷酸序列(即编码序列)的转录的核苷酸序列。该编码序列可编码一种多肽和/或一个功能性RNA。典型地，“启动子”是指包含针对RNA聚合酶II的一个结合部位并指导转录的起始的一个核苷酸序列。一般而言，启动子发现于相对于相应的编码序列的编码区域的开始的5'或上游。启动子区域可包括充当基因表达的调节物的多个其他的元件。这些包括一个TATA盒共有序列以及常常一个CAAT盒共有序列(Breathnach和尚邦(Chambon)，(1981)生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem)，50:349)。在植物中，该CAAT盒可由AGGA盒取代(梅辛(Messing)等人，(1983)于植物的基因工程(Genetic Engineering of Plants)，T.小菅(Kosuge)，C.梅雷迪思(Meredith)和A.霍尔安德尔(Hollaender)(编辑)，普利纳姆出版社(Plenum Press)，第211-227页)。
“感兴趣的核苷酸序列”是指当引入到一种植物中时赋予该植物一种想要的特性(例如增加的对热胁迫、高温和/或干旱的耐受性)的任何核苷酸序列。该“感兴趣的核苷酸序列”可编码一种多肽和/或一种抑制性多核苷酸(例如一种功能性RNA)。
“感兴趣的异源的核苷酸序列”与其可操作相关联的启动子是异源的(例如外来的)。
“功能性”RNA包括在细胞中具有生物功能的任何未翻译的RNA，例如调节基因表达。这类功能性RNA包括但不限于RNAi(例如、siRNA、shRNA)、miRNA、反义RNA、核糖酶、RNA适体等。
如此处使用的“可操作地连接”或“可操作地关联”意指所指定的元件是彼此功能上相关的，并且通常是物理相关的。例如一个启动子可操作地连接或可操作地关联一个编码序列(例如感兴趣的核苷酸序列)，如果它控制该序列的转录。因此，如此处使用的术语“可操作地连接的”或“可操作地关联的”是指在功能上关联的一个单一核酸分子上的核苷酸序列。本领域的普通技术人员将理解这些控制序列(例如启动子)不需要与该编码序列邻接，只要它们起功能指导其表达。因此，例如，介入未翻译的、已转录的序列可以在一种启动子与一种编码序列之间存在，并且该启动子序列仍可以被认为“可操作地连接到”该编码序列上。
通过一个核酸编码序列的术语“表达(express、expressing或expression)”意指该序列被转录。在具体实施例中，术语“表达(express、expressing或expression)”(或其他语法变体)可指转录和翻译两者以产生一种编码的多肽。
“野生型”核苷酸序列或氨基酸序列是指天然存在(“天然”)或内源核苷酸序列(包括与其相应的cDNA)或氨基酸序列。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”在此是互换地使用的，除非语境另外说明。这些术语涵盖RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA、部分或全部合成的(例如化学合成的)RNA和DNA、以及RNA和DNA的嵌合体。该核酸、多核苷酸或核苷酸序列可以是双链的或单链的，并且进一步可以是使用核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)合成的。此类核苷酸可以例如用于制备具有改变的碱基配对能力或对核酸酶的增强的抗性的核酸、多核苷酸和核苷酸序列。本发明进一步提供了为本发明的核酸、多核苷酸或核苷酸序列的互补体(该互补体可以是完全互补体或部分互补体)的一种核酸、多核苷酸或核苷酸序列。核苷酸序列在此仅以单链呈现，以5'至3'方向，从左到右，除非特别另外说明。核苷酸和氨基酸此处是以IUPAC-IUB生物化学命名法委员会推荐的方式表示的，或(对于氨基酸)以单字母密码表示，都根据37CFR§1.822和已建立的用法。
本发明的这些核酸和多核苷酸是任选地分离的。“分离的”核酸分子或多核苷酸是通过人工从其天然环境中分开而存在的一种核酸分子或多核苷酸并因此不是自然的产物。分离的核酸分子或分离的多核苷酸可能以纯化形式存在或可能存在于非天然环境(例如像重组宿主细胞)中。因此，例如术语“分离的”意指将该多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出。如果将一种核酸或多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出并且然后将其插入它并不天然存在于其中的遗传背景、染色体、染色体位置、和/或细胞中，则该多核苷酸也是被分离的。本发明的重组核酸分子和多核苷酸可以被认为是“分离的”。
另外，“分离的”核酸或多核苷酸是一种核苷酸序列(例如，DNA或RNA)，该核苷酸序列不与在其衍生而来的生物的自然发生的基因组中的与其邻近(位于5'末端的或位于3'末端的)的核苷酸序列相邻。该“分离的”核酸或多核苷酸可存在于一个细胞(例如植物细胞)中，任选地稳定整合到基因组中。根据本实例，该“分离的”核酸或多核苷酸可以是与它所引入的细胞/生物体是外来的，或者它可以与该细胞/生物体是天然的但以一种重组形式(例如为嵌合的核酸或多核苷酸)存在和/或可以是一种内源的核酸或多核苷酸的一个另外的拷贝。因此，“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”还可包括这样的一种核苷酸序列，它衍生自并插入相同的天然原初细胞类型，但是却以非天然状态存在，例如，在不同的遗传背景下以不同拷贝数目存在，和/或处于与在该核酸分子或多核苷酸的天然状态中发现的那些不同的调节序列的控制下。
在代表性实施例中，该“分离的”核酸或多核苷酸是基本上不含细胞材料(包括天然关联的蛋白，例如组蛋白、转录因子等)、病毒材料、和/或培养基(当通过重组DNA技术产生时)、或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。任选地，在代表性实施例中，该分离的核酸或多核苷酸是至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更纯的。
如此处使用的术语“重组”核酸、多核苷酸或核苷酸序列是指已通过基因工程技术而被构建、改变、再排列和/或修饰的一种核酸、多核苷酸或核苷酸序列。术语“重组”不指因天然存在的事件(如自发突变)或因非自发诱变而产生的改变。
“载体”是用于将一个核酸克隆和/或转移到一个细胞中的任何核酸分子。一个载体可以是一个复制子，另一个核苷酸序列可附接到该复制子以允许所附接的核苷酸序列的复制。“复制子”可以是在该细胞中充当核酸复制的自主单元，即能够在其自身的控制下进行核酸复制的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒基因组)。术语“载体”包括用于在体外、离体和/或体内将一个核酸引入到一个细胞的病毒的和非病毒的(例如质粒)核酸分子，并且任选地是一种表达载体。在本领域中可以使用大量的载体来操纵、递送和表达多核苷酸。可将载体工程化以包含编码选择标记的序列，该选择标记提供对包含该载体和/或已经将该载体的核酸的一些或所有整合到细胞基因组中的细胞的选择。这类标记允许对合并和表达由该标记编码的蛋白的宿主细胞的鉴定和/或选择。“重组”载体是指一种种病毒或非病毒载体，其包括感兴趣的一或多种核苷酸序列(例如转基因)，例如两种、三种、四种、五种或更多感兴趣的核苷酸序列。
在细胞、连同有生命的动物受试者中，病毒载体已广泛地用在基因递送应用中。可以使用的植物病毒载体包括但不限于根瘤土壤杆菌、发根土壤杆菌以及双生病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒、脂质体、带电荷的脂质(细胞转染剂)、核酸-蛋白络合物、以及生物聚合物。除了感兴趣的核酸植物，载体还可包括一个或多个调节区域和/或在选择、测量和监测核酸转移结果(例如向特定组织的递送、表达持续时间等)中有用的选择标记。
术语“片段”，如适用于核酸或多核苷酸，应理解为意指一种相对于参考或全长核苷酸序列的长度减少的核苷酸序列并且包括来自该参考或全长核苷酸序列的连续核苷酸，或基本上由其组成和/或由其组成。根据本发明，在适宜的情况下，这种片段可以包含于它作为组分的较大多核苷酸内。在一些实施例中，这类片段可包括如下的寡核苷酸或基本上由其组成和/或由其组成，这些寡核苷酸具有来自该参考或全长核苷酸序列的大于和/或至少约8、10、12、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500个核苷酸(任选地连续核苷酸)或更多，只要该片段比该参考或全长核苷酸序列短。在代表性实施例中，该片段是有生物活性的核苷酸序列，如该术语此处所述的。
“有生物活性的”核苷酸序列是基本上保留正常地与该野生型核苷酸序列相关联的至少一种生物活性，例如该核苷酸序列编码一种具有酶活性、结合活性(例如DNA结合活性)、转录因子活性(例如增加转录的能力)、增加对热胁迫的耐受性的能力、和/或增加氨基酸含量的能力的多肽。在具体实施例中，该“有生物活性的”核苷酸序列基本上保留未修饰的序列所拥有的所有生物活性。通过"基本上保留"生物活性意指该核苷酸序列保留至少约50％、60％、75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或更多的天然核苷酸序列的生物活性(并且甚至可以具有比该天然核苷酸序列更高水平的活性)。
当两个核苷酸序列共享至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或甚至100％序列一致性时，它们被称为彼此“基本上一致”。在本发明的实施例中，如与参考序列相比，一个“基本上一致”的核苷酸序列单独或集体地具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸取代、插入和/或缺失。
当两个氨基酸序列各自共享至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或甚至100％序列一致性或相似性时，它们被称为彼此“基本上一致”或“基本上相似”。在本发明的实施例中，如与参考序列相比，一个“基本上一致”的氨基酸序列单独或集体地具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、插入和/或缺失。在本发明的实施例中，如与参考序列相比，一个“基本上相似”的氨基酸序列单独或集体地具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、插入和/或缺失，其中该氨基酸取代可以是保守的和/或非保守的取代。
如本文所用“序列同一性”指两个最佳比对的多核苷酸序列或多肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口范围内不变的程度。
如此处使用的“序列相似性”类似于序列一致性(如此处所述的)，但允许保守的氨基酸(例如侧链具有相似结构性和/或生化特性的氨基酸)的取代，这在本领域中是众所周知的。
如本领域己知，可以使用数个不同的程序来鉴定与已知序列相比一个核酸是否具有序列一致性抑或一个氨基酸序列是否具有序列一致性或相似性。序列一致性或相似性可以使用本领域中已知的标准技术确定，包括但不限于史密斯(Smith)&沃特曼(Waterman)，应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2,482(1981)的局部序列一致性算法、通过内德勒曼(Needleman)&温斯迟(Wunsch)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48,443(1970)的序列一致性比对算法、通过皮尔森(Pearson)&李普曼(Lipman)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85,2444(1988)的相似性方法的搜索、通过威斯康星州遗传学分析软件包，遗传学计算机组，575科学驱动(Science Drive)，麦迪逊(Madison)，WI中的这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA、以及TFASTA)的计算机化实施、由德弗罗(Devereux)等人，核酸研究(Nucl.Acid Res.)12,387-395(1984)所述的最佳拟合序列程序，优选地施用默认设置，或通过检视。
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP创建了来自一组相关序列的多个序列比对，使用渐进的、两两比对。它还可以标绘显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用了冯(Feng)&杜利特尔(Doolittle)，分子进化杂志(J.Mol.Evol.)35,351-360(1987)的渐进式比对方法的简化；该方法类似于由希金斯(Higgins)&夏普(Sharp)，CABIOS 5,151-153(1989)所述的方法。
有用的算法的另一个实例是BLAST算法，描述于阿尔丘尔(Altschul)等人，分子生物学(J.Mol.Biol.)215,403-410，(1990)和卡林(Karlin)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90,5873-5787(1993)中。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其是从阿尔丘尔(Altschul)等人，酶学方法(Methods in Enzymology)，266,460-480(1996)中获得；http://blast.wustl/edu/blast/README.html。WU-BLAST-2使用了若干搜索参数，这些参数优选地被设置为默认值。这些参数是动态值并且由该程序本身依赖具体序列的组成和具体数据库的组成针对所搜索的感兴趣的序列是哪个而建立，然而，这些值可被调整以增加敏感度。
另外的一个有用的算法是缺口BLAST，如由阿尔丘尔(Altschul)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，25,3389-3402(1997)中报道的。
还可以使用CLUSTAL程序来确定序列相似性。该算法由希金斯(Higgins)等人(1988)基因(Gene)73:237；希金斯(Higgins)等人(1989)CABIOS 5:151-153；科尔佩(Corpet)等人(1988)核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:10881-90；黄(Huang)等人(1992)CABIOS8:155-65以及皮尔森(Pearson)等人(1994)分子生物学方法(Meth.Mol.Biol.)24:307-331描述。
该比对可包括在待比对的序列中引缺口。另外，对于包含比此次披露的核酸更多或更少核苷酸的序列，应理解在一个实施例中，序列一致性百分比将基于相对于核苷酸碱基的总数的一致的核苷酸的数目来确定。因此，例如在一个实施例中，比此处特别披露的序列更短的序列的序列一致性将使用在更短的序列中的核苷酸碱基的数目确定。在百分比一致性计算中，对于序列变化的不同表现形式(例如插入、缺失、取代等)未指定相对重量。
当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时这两个核苷酸序列也可以被认为是实质上一致的。“严格”杂交条件的一个非限制实例包括由50％与5x Denhardt溶液、0.5％SDS和1x SSPE在42℃下的洗涤严格性表示。在核酸杂交实验(如DNA和RNA杂交)的背景下“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。对核酸杂交的广泛指导见于蒂森(Tijssen)的生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)第2章第I部分“杂交原理和核酸探针测定策略综述(Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays)”，爱思唯尔(Elsevier)，纽约(1993)。在一些代表性实施例中，被认为实质上一致的两个核苷酸序列在高严格条件下彼此杂交。总体上，高严格杂交和洗涤条件在一种限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。
如本文所用，除非另外指明，否则术语“多肽”包括肽和蛋白(包括融合蛋白)。
“融合蛋白”是当编码两种(或更多)不同的在自然中未发现融合在一起的多肽的两个异源核苷酸序列或其片段在正确的翻译阅读框中融合在一起时产生的一种多肽。
本发明的多肽任选地是“分离的”。“分离的”多肽是通过人工从其天然环境中分开而存在的一种多肽并因此不是自然的产物。分离的多肽能以纯化形式存在或能存在于非天然环境(例如像重组宿主细胞)中。本发明的重组多肽可以被认为是“分离的”。
在代表性实施例中，“分离的”多肽意指一种多肽，这种多肽与天然发生的生物体或病毒(例如该细胞或病毒结构性组分)的或发现通常与该多肽相关联的其他多肽或核酸的其他组分的至少一些分开或基本上不含它们。在具体实施例中，该“分离的”多肽是至少约1％、5％、10％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更纯的(w/w)。在其他实施例中，“分离的”多肽表示与起始材料相比，实现该蛋白的至少约5倍、10倍，25倍、100倍、1000倍、10,000倍或更大富集(w/w)。在代表性实施例中，该分离的多肽是使用重组核酸技术产生的一种重组多肽。在本发明的实施例中，该多肽是一种融合蛋白。
术语“片段”，如适用于多肽，应理解为意为一种相对于参考或全长多肽的长度减少的氨基酸并且包含来自该参考或全长多肽的连续氨基酸的序列，或基本上由其组成和/或由其组成。根据本发明，在适宜的情况下，这种片段可以包括为一种融合蛋白(是其一个成分)的部分。在一些实施例中，这类片段可包括如下的多肽或基本上由其组成和/或由其组成，这些多肽具有来自该参考或全长多肽的至少约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、375、400、425、450、475、或500个氨基酸(任选地连续的氨基酸)或更多的长度，只要该片段比该参考或全长多肽短。在代表性实施例中，该片段是有生物活性的，如该术语此处定义的。
“有生物活性的”多肽是基本上保留正常地与该野生型多肽相关联的至少一种生物活性，例如酶活性、结合活性(例如DNA结合活性)、转录因子活性(例如增加转录的能力)、增加对热胁迫的耐受性的能力、和/或增加氨基酸含量的能力。在具体实施例中，该“有生物活性的”多肽基本上保留未修饰的(例如天然的)序列所拥有的所有生物活性。通过“基本上保留”生物活性意指该多肽保留至少约50％、60％、75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或更多的天然多肽的生物活性(并且甚至可以具有比该天然多肽更高水平的活性)。
如此处使用的，“等效的”氨基酸序列是指被一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。该等效物可任选地具有“保守的”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性。具体地，这类变化可通过氨基酸之间在物理特性(例如电荷密度、亲水性/疏水性、尺寸和构型)中的相似来引导，以至于氨基酸被其他基本具有相同功能特性的氨基酸取代。例如：Ala可被替换为Val或Ser；Val可被替换为Ala、Leu、Met、或Ile，优选Ala或Leu；Leu可被替换为Ala、Val或Ile，优选Val或Ile；Gly可被替换为Pro或Cys，优选Pro；Pro可被替换为Gly、Cys、Ser、或Met，优选Gly、Cys、或Ser；Cys可被替换为Gly、Pro、Ser、或Met，优选Pro或Met；Met可被替换为Pro或Cys，优选Cys；His可被替换为Phe或Gln，优选Phe；Phe可被替换为His、Tyr、或Trp，优选His或Tyr；Tyr可被替换为His、Phe或Trp，优选Phe或Trp；Trp可被替换为Phe或Tyr，优选Tyr；Asn可被替换为Gln或Ser，优选Gln；Gln可被替换为His、Lys、Glu、Asn、或Ser，优选Asn或Ser；Ser可被替换为Gln、Thr、Pro、Cys或Ala；Thr可被替换为Gln或Ser，优选Ser；Lys可被替换为Gln或Arg；Arg可被替换为Lys、Asp或Glu，优选Lys或Asp；Asp可被替换为Lys、Arg、或Glu，优选Arg或Glu；并且Glu可被替换为Arg或Asp，优选Asp。一旦进行了，可以定期筛选变化来确定其对功能的影响。
另外，一个等效的氨基酸序列可具有“非保守的”变化(例如将甘氨酸替换为色氨酸)。类似的小的变化还可包括氨基酸缺失或插入或两者。可以使用本领域中熟知的计算机程序(例如LASERGENETM软件)发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指导。
在进行氨基酸取代时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予一种蛋白以交互性生物功能中的重要性在本领域中通常是被理解的(参见凯特(Kyte)和杜利特尔(Doolittle),(1982)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105)。接受的是该氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白的次级结构，该次级结构进而定义该蛋白与其他分子(例如酶、基质、受体、DNA、抗体、抗原等等)的相互作用。
每种氨基酸已基于其疏水性和电荷特征被指定了一个亲水指数(凯特(Kyte)和杜利特尔(Doolittle)，Id.)，并且这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
在本领域中也理解氨基酸的取代可基于亲水性进行。美国专利号4,554,101说明一种蛋白的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性支配的)与该蛋白的生物特性对应。
如在美国专利号4,554,101中详述的，已将以下亲水性值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(±3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±I)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在一种植物细胞、植物组织、植物部分和/或植物的背景下“引入”意指使一种核酸分子与该植物细胞、植物组织、植物部分和/或植物以使该核酸分子进入该植物细胞或该植物组织、植物部分或植物的细胞的内部的方式接触。在引入多于一种核酸分子的情况下，这些核酸分子可以被装配成一种单一聚核苷酸或核酸构建体的一部分，或装配成分开的聚核苷酸或核酸构建体，并且可以位于相同或不同的核酸构建体上。举例说明，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中、或者作为育种方案的一部分，将这些多核苷酸引入到植物细胞中。
在此使用的术语“转化”是指将一种异源的和/或分离的核酸引导入一种细胞中。细胞的转化可以是稳定或瞬时的。因此，本发明的一种转基因植物细胞、植物组织、植物部分和/或植物可被稳定的转化或瞬时地转化。
在多核苷酸背景下的“瞬时转化”意指：一种多核苷酸被引入细胞中并且没有整合到该细胞的基因组中。
如在此所使用，在被引入细胞中的多核苷酸背景下的“稳定引入”、“稳定地引入的”、“稳定转化”或“稳定的转化的”(以及相似术语)意指引入的多核苷酸被稳定地整合到该细胞的基因组中(例如整合到染色体中或作为一种稳定的染色体外元件)。如此，整合的多核苷酸能够由其子代细胞和植物继承。
如在此所使用的“基因组”包括核和/或质体基因组，并且因此包括多核苷酸到例如叶绿体基因组中的整合。如在此所使用的稳定转化还可以指被保持在染色体外，例如，作为一种微染色体的多核苷酸。
如在此所使用，术语“转化的”和“转基因的”是指含有至少一种重组或分离的核酸、多核苷酸或核苷酸序列的全部或部分的任何植物、植物细胞、植物组织(包括愈伤组织)、或植物部分。在代表性实施例中，该重组或分离的核酸、多核苷酸或核苷酸序列稳定地整合到该植物的基因组(例如整合到染色体中或作为稳定的染色体外元件)中，以使得该细胞或植物传递到后续代。
如此处使用的术语“植物部分”包括但不限于生殖组织(例如花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、花托、花药、花粉、花、果实、花芽、胚珠、种子、胚胎、坚果、内核、穗、穗轴和外壳)；营养组织(例如叶柄、茎、根、根毛、根尖、髓、胚芽鞘、茎秆、芽、枝、树皮、顶端分生组织、腋芽、子叶、下胚轴和叶)；维管组织(例如韧皮部和木质部)；特化细胞例如表皮细胞、薄壁组织细胞、厚角组织细胞、厚壁组织细胞、气孔、保卫细胞、角质层、叶肉细胞；愈伤组织；以及插条。术语“植物部分”还包括植物细胞，包括在植物和/或植物的部分中完整的植物细胞、植物原生质体、植物组织、植物器官植物细胞组织培养物、植物愈伤、植物团(plant clump)等。如此处使用的，“芽”是指包括叶和茎的地上部分。
术语“组织培养”包括组织培养物、细胞、原生质体和愈伤组织。
如在此使用的，“植物细胞”是指该植物的一种结构和生理单元，该单元典型地包括细胞壁但还包括原生质体。本发明的植物细胞可以处于一种分离的单一细胞形式，或者可以是一种培养细胞，或者可以是作为较高级的组织单位(例如一种植物组织(包括愈伤组织)或一种植物器官)的一部分。
在实践本发明中可采用任何植物(或将植物分组为例如一个属或更高的目分类)，包括被子植物或裸子植物、单子叶植物或双子叶植物。
示例性植物包括但不限于玉米(玉蜀黍(Zea mays))、卡罗拉(canola)(欧洲油菜、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.))、苜蓿(紫花苜蓿)、水稻(栽培稻(Oryza sativa)，包括但不限于籼稻和/或粳稻)、油菜(欧洲油菜)、黑麦(Secale cereale)、高粱(两色蜀黍(Sorghumbicolor)、Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、黄豆(大豆(glycine max))、烟草(普通烟草(Nicotiana tabacum))、马铃薯(阳芋(Solanum tuberosum))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、棉花(陆地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(番薯(Ipomoea batatas))、木薯(树薯(Manihotesculenta))、咖啡(咖啡属亚种)、椰子(可可椰子(Cocosnucifera))、菠萝(凤梨(Ananas comosus))、柑桔树(柑橘属物种)、可可(Theobroma cacao)、茶(茶树(Camellia sinensis))、香蕉(芭蕉属物种)、鳄梨(牛油果(Persea americana))、无花果(Ficuscarica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(杧果(Mangifera indica))、橄榄(油橄榄(Olea europaea))、番木瓜(木瓜(Carica papaya))、腰果树(Anacardium occidental)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、扁桃(巴旦杏(Prunus amygdalus))、甜菜(Beta vulgaris)、苹果(Maluspumila)、黑莓(悬钩子属)、草莓(草莓属)、胡桃(普通胡桃(Juglansregia))、葡萄(酿酒葡萄(Vitis vinifera))、杏(Prunus armeniaca)、樱桃(李属)、桃(Prunus persica)、李(欧洲李(Prunus domestica))、梨(西洋梨(Pyrus communis))、西瓜(Citrullus vulgaris)、浮萍(浮萍属)、燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordium vulgare)、蔬菜、观赏植物、针叶树和草坪草(例如观赏性、娱乐或饲料用)、生物质禾草(如柳枝稷和芒草)。
蔬菜包括茄属物种(例如西红柿、番茄)、莴苣(例如Lactueasativa)、胡萝卜(Caucus carota)、花椰菜(甘蓝)、芹菜(根芹菜)、茄子(Solanum melongena)、芦笋(石刁柏(Asparagus officinalis))、秋葵(黄秋葵(Abelmoschus esculentus))、四季豆(菜豆)、青豆(大莱豆)、豌豆(香豌豆属)，南瓜属的成员例如笋瓜(C.Hubbard)、冬南瓜(中国南瓜(C.moschata))、密生西葫芦(Zucchini)(西葫芦(C.pepo))、曲颈南瓜(C.crookneck)、C.argyrosperma、C.argyrospermassp sororia、C.digitata、C.ecuadorensis、旱地油瓜(C.foetidissima)、C.lundelliana、以及C.martinezii，以及黄瓜属的成员例如黄瓜(Cucumissativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)、以及甜瓜(香瓜(C.melo))。
观赏植物包括杜鹃花(杜鹃属)、八仙花(绣球花(Macrophyllahydrangea))、木槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(玫瑰属(Rosaspp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp))、水仙花(水仙属(Narcissus spp.))、喇叭花(碧冬茄(Petunia hybrida))、康乃馨(麝香石竹(dianthus caryophyllus))、猩猩木(一品红(Euphorbiapulcherima))、以及菊花。
可以用于实践本发明的针叶树包括例如松树，例如台大松(火炬松(Pinus taeda)、湿地松(slash pine)(湿地松(Pinus elliotii))、杰克松(西黄松(Pinus ponderosa))、黑松(小干松(Pinus contorta))以及蒙特利松树(辐射松(Pinus radiata))；花旗松(Douglas-fir)(北美海滨黄杉(Pseudotsuga menziesii))；美国西部铁杉(加拿大铁杉(Tsugacanadensis))；美国西加云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；冷杉(例如银杉(美国冷杉(Abiesamabilis)))和香脂冷杉(加拿大胶杉(Abies balsamea))；以及雪松，例如北美香柏(北美香柏(Thuja plicata))以及阿拉斯加黄杉(Alaskayellow-cedar)(加拿逊扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。
草坪草包括但不限于结缕草、剪股颖、羊茅草、早熟禾、奥古斯丁草、百慕达草、bufallograsses、黑麦草、以及鸭茅。
还包括的是主要充当实验室模式的植物，例如拟南芥。
II.增加对高温或热的耐受性和/或氨基酸含量的方法
本发明提供了将谷氨酰胺合成酶1；2(GS1；2；E.C.6.3.1.2)、谷氨酸脱羧酶3(GAD3；E.C.4.1.1.15)、I类谷氨酰胺酰胺转移酶(GAT1；E.C.2.6.5.2)、MYB55多肽、或其任意组合引入到一种植物材料(例如一种植物、植物部分(包括愈伤组织)或植物细胞)中(例如以在该植物材料中表达GS1；2、GAD3、GAT1和/或MYB55多肽)。在代表性实施例中，该方法包括用如此处所述的编码该GS1；2、GAD3、GAT1和/或MYB55多肽的一种核酸(例如分离的核酸)、表达盒、或载体转化该植物材料。该植物可以瞬时或稳定地转化。
作为一个方面，本发明包括一种在转基因植物、植物部分或植物细胞中增加对热胁迫或高温的耐受性的方法，该方法包括将编码(i)GS1；2、(ii)GAD3、(iii)GAT1、(iv)MYB55多肽或其任意组合的一种或多种核酸(例如分离的核酸)引入到该植物、植物部分或植物细胞中以产生一种转基因植物、植物部分或植物细胞，该转基因植物、植物部分或植物细胞表达该一种或多种核酸以产生GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合(例如处于对增加对热胁迫或高温的耐受性有效的量)，从而导致如与一种对照植物、植物部分或植物细胞相比，在转基因植物、植物部分或植物细胞中对热胁迫或高温的耐受性增加。该植物、植物部分或植物细胞可以被瞬时或稳定地转化。
该增加对热胁迫或高温的耐受性可相对于任何相关的对照植物进行评估，例如未根据本发明的方法用该一种或多种核酸转化的一种植物、植物部分或植物细胞。该对照植物通常在物种、品种、龄期等方面匹配并且任选地经受相同的生长条件，例如温度、土壤、阳光、pH、水等。一种适合的对照植物的选择对本领域的普通技术人员来说是常规的。
在代表性的实施例中，该一种或多种核酸编码GS1；2、GAD3以及GAT1。这些酶可由一种或多于一种(例如两种或三种)分离的核酸编码。例如每种酶可由一种不同的核酸编码。可替代地，一种核酸可编码两种或所有三种酶。任选地，该方法可进一步包括将编码MYB55多肽的一种核酸(例如分离的核酸)引入到该植物、植物部分或植物细胞中。该MYB55多肽可由一种分开的核酸编码或可由与该GS1；2、GAD3和/或GAT1酶中的一种或多种相同的核酸编码。
在具体实施例中，该方法包括：(a)将编码(i)GS1；2、(ii)GAD3、(iii)GAT1、(iv)MYB55多肽或其任意组合的一种或多种核酸(例如分离的核酸)引入到一种植物细胞(包括愈伤组织细胞)中以产生一种转基因植物细胞；并且(b)从(a)的转基因植物细胞中再生转基因植物，任选地其中该转基因植物在其基因组中包括该一种或多种核酸，并且作为一个另外的选择，与一种对照植物相比，具有增加的对热胁迫或高温的耐受性(例如表达有效于增加该植物中对热胁迫或高温的耐受性的GS1；2、GAD3、GAT1和/或MYB55多肽)。
在另外的实施例中，该方法包括：(a)将编码(i)GS1；2、(ii)GAD3、(iii)GAT1、(iv)MYB55多肽或其任意组合的一种或多种核酸(例如分离的核酸)引入到一种植物细胞(包括愈伤组织细胞)中以产生一种转基因植物细胞；以及(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生转基因植物，任选地其中该转基因植物在其基因组中包括该一种或多种核酸；并且(c)从(b)的多个转基因植物中选择一种具有增加的对热胁迫或高温的耐受性转基因植物(例如该转基因植物以有效于增加该植物中对热胁迫或高温的耐受性的量表达GS1；2、GAD3、GAT1和/或MYB55多肽)。
任选地，本发明的方法可进一步包括在例如营养生长阶段中将该植物、植物部分或植物细胞暴露于热胁迫或高温。通过在营养生长阶段将一种植物、植物部分或植物细胞暴露于热胁迫或高温意指使该植物、植物部分或植物细胞经受热胁迫或高温持续整个或部分的营养生长阶段。
另外，在本发明的实施例中，本发明的方法导致与一种适合的对照相比增加的产率，例如如与不是根据本发明的方法产生的植物相比在植物高度、植物生物量(例如干重)和/或种子上的增加。本领域的普通技术人员将理解如与未暴露于该热胁迫或高温的一种植物、植物部分或植物细胞相比仍可存在降低的产率。
在代表性实施例中，增加一种植物对热胁迫或高温的耐受性的方法包括降低作为热胁迫或高温的结果(例如降低的细胞分裂、尺寸(例如植物高度)和/或植物和/或其部分数目，和/或农艺性状中的损害，例如降低的产率、落果、果实尺寸和/或数目、种子尺寸和/或数目，降低的生产质量(归因于外观和/或质地和/或增加的花夭折))对植物功能、发育和/或性能的不利影响。
本发明还考虑了一种增加转基因植物、植物部分或植物细胞的氨基酸含量的方法，该方法包括向植物、植物部分或植物细胞中引入一个编码MYB55多肽的核酸(例如分离的核酸)，以产生表达该核酸以产生该MYB55多肽的转基因植物、植物部分或植物细胞(例如处于有效于增加氨基酸含量的量)，从而导致与对照植物、植物部分或植物细胞相比在该转基因植物、植物部分或植物细胞中产生增加的氨基酸含量。该植物、植物部分或植物细胞可以被瞬时或稳定地转化。
该增加的氨基酸含量可相对于任何相关的对照植物进行评估，例如未根据本发明的方法用编码一种MYB55多肽的核酸转化的一种植物、植物部分或植物细胞。该对照植物通常在物种、品种、龄期等方面匹配并且经受相同的生长条件，例如温度、土壤、阳光、pH、水等。一种适合的对照植物的选择对本领域的普通技术人员来说是常规的。
在具体实施例中，该方法包括：(a)将编码一种MYB55多肽的核酸(例如分离的核酸)引入到一个植物细胞(包括愈伤组织细胞)中以产生一种转基因植物细胞；并且(b)从(a)的转基因植物细胞中再生转基因植物，任选地其中该转基因植物在其基因组中包括该核酸，并且作为一个另外的选择，与一种对照植物相比，具有增加的氨基酸含量(例如表达有效于增加该植物中氨基酸含量的量的MYB55多肽)。
在另外的实施例中，该方法包括：(a)将编码一种MYB55多肽的核酸(例如分离的核酸)引入到一个植物细胞(包括愈伤组织细胞)中以产生一种转基因植物细胞；并且(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生转基因植物，任选地其中该转基因植物在其基因组中包括该核酸；并且(c)从(b)的多个转基因植物中选择具有增加的氨基酸含量的转基因植物(例如该转基因植物表达有效于增加该植物中氨基酸含量的量的MYB55)。
任选地，本发明的方法进一步包括在例如营养生长阶段中将该植物、植物部分或植物细胞暴露于热胁迫或高温。
在代表性实施例中，在该植物、植物部分或植物细胞中的总氨基酸的含量增加。在另外的实施例中，一种或多种个体氨基酸的含量增加。在具体实施例中，在该植物、植物部分或植物细胞中谷氨酸、精氨酸、GABA和/或脯氨酸含量增加。
相对于总植物生物量可观察到增加的氨基酸含量和/或可在一个或多个植物部分或组织(例如叶、叶鞘、根、或其任意组合)内观察到。在代表性实施例中，增加的氨基酸含量可存在于从根据本发明的方法产生的转基因植物细胞再生的转基因植物、植物部分或植物组织中。任选地，一种或多种具体氨基酸的含量可在一个植物部分或组织中增加，并且一种不同的氨基酸或氨基酸的组合的含量在另一个植物部分或组织中增加。
本发明还考虑了包括编码GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合的核酸(例如分离的核酸)的子代植物的产生。在本发明的实施例中，该方法进一步包括获得衍生自该转基因植物的子代植物(例如通过有性繁殖或营养繁殖)。任选地该子代植物在其基因组中包括编码GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合的一种分离的核酸，并且与对照植物相比，具有增加的对热胁迫或高温的耐受性(例如以有效于增加该植物中对热胁迫或高温的耐受性的量表达GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合)。在另外的实施例中，该子代植物在其基因组中包括编码GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合的一种分离的核酸，并且与对照植物相比，具有增加的氨基酸含量(例如以有效于增加该植物中氨基酸含量的量表达GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合)。
举例说明，在一个实施例中，本发明提供了生产一种子代植物的方法，该方法包括：(a)使包括编码GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合的一种或多种核酸(例如分离的核酸)的转基因植物与其自身或另一植物杂交以产生包括该一种或多种核酸的种子；并且(b)使子代植物从该种子生长以产生转基因植物，任选地其中该子代植物在其基因组中包括编码GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合的一种或多种核酸，并且与对照植物相比，具有增加的对热胁迫或高温的耐受性和/或具有增加的氨基酸含量(例如以有效于增加植物中对热胁迫或高温的耐受性的量表达GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合)。在另外的实施例中，该方法可进一步包括(c)使该子代植物与其自身或另一植物杂交并且(d)重复步骤(b)和(c)持续另外的0-7(例如，0、1、2、3、4、5、6或7及其任意范围)代，以产生一种植物，任选地其中该植物在其基因组中包括编码GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其任意组合的一种或多种核酸，并且具有增加的对热胁迫或高温的耐受性和/或具有增加的氨基酸含量(例如以在该植物中有效于增加对热胁迫或高温的耐受性和/或氨基酸含量的量表达GS1；2、GAD3、GAT1、MYB55多肽或其组合)。
术语“GS1；2”、“GAD3”和“GAT1”旨意是广泛的，并且包括现在已知的或以后发现的任何“GS1；2”、“GAD3”和/或“GAT1”(包括其有生物活性的等效物)以及全长GS1；2、GAD3和GAT1多肽的有生物活性的片段以及这类片段的等效物。术语“GS1；2”、“GAD3”和“GAT1”还包括对一种天然发生的多肽或其与一种天然发生的多肽具有基本上相似的或一致的氨基酸序列并且具有酶活性和/或增加对热胁迫或高温的耐受性和/或增加一种植物、植物部分或植物细胞中氨基酸含量的等效物的修饰(例如缺失和/或截短)。该GS1；2、GAD3和GAT1可来自于任何物种起源(例如植物物种，包括但不限于水稻[包括籼稻和/或粳稻品种]、小麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、黑麦、甘蔗、拟南芥等)，并且术语“GS1；2”、“GAD3”和“GAT1”还包括天然发生的等位基因变异、亚型、剪接变体等。该GS1；2、GAD3和GAT1可进一步被完全或部分地合成。这些酶在本领域中是众所周知的，并且先前在数个植物物种中已说明。
例如已知植物具有2类谷氨酰胺合成酶的多种同工酶。该GS1:2同工酶是胞质形式的，并且涉及在将谷氨酰胺转化为谷氨酸中并且表示氨基酸生物合成中的早期步骤中的一个。该酶是高八聚体(homo-octomer)，由分为两个面对面的环的八个一致亚单元构成。ATP结合到靠近一个阳离子结合部位的活性部位的顶部，而谷氨酸盐靠近一个第二阳离子结合部位结合在该活性部位的底部。铵而不是氨结合到活性部位，因为该结合部位是极性的并且暴露于溶剂。数种GS1；2的核苷酸和氨基酸序列是已知的，例如在水稻(基因库登录号NP_001051067和P14654[氨基酸]和AB180688.1和NM_001057602[核苷酸])、玉米(基因库登录号NP_001105443和BAA03433[氨基酸]和NM_001111973(核苷酸)、大豆(基因库登录号NP_001242332[氨基酸]和NM_001255403[核苷酸])、拟南芥(基因库登录号NP_176794[氨基酸]和NM_105291[核苷酸])、甘蔗(基因库登录号AAW21275[氨基酸]和AY835455[核苷酸])等等中的。已在GS1；2蛋白中识别了数个功能结构域，包括β-掌握结构域(Grasp domain)和催化结构域。该玉米GS1a的晶体结构描述于海野(Unno)等人(2006，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，281:29287-29296；还参见，RCSB蛋白数据库ID2D3C)。
GAT1还被称为氨基甲酰磷酸合成酶并且涉及在原核生物和真核生物中的精氨酸生物合成中的第一个关键步骤中。数个GAT1的核苷酸和氨基酸序列是已知的，例如在水稻(基因库登录号BAD08105.1和NP_001047880[氨基酸]和NM_001054415[核苷酸])、玉米(基因库登录号NP_001132055[氨基酸]和NM_001138583[核苷酸])、大豆(基因库登录号XP_003525104[氨基酸]和XM_003525056[核苷酸])、拟南芥(基因库登录号NP_566824[氨基酸]和NM_113690[核苷酸])等等中的。在GAT1蛋白中已鉴定数个功能结构域，包括由半胱氨酸、组氨酸和谷氨酸的保守的催化三元组定义的催化(活性)部位。已描述了来自多种细菌的GAT1的晶体结构，包括来自嗜热菌(RCSB蛋白数据库ID 2YWD)和古细菌(P.horikoshii)(RCSB蛋白数据库ID 2D7J)的GAT1。
GAD3涉及在将L-谷氨酸转化为GABA中。数个GAD3的核苷酸和氨基酸序列是已知的，例如在水稻(基因库登录号AAO59316[氨基酸]和AY187941[核苷酸])、大豆(基因库登录号BAF80895[氨基酸]和AB240965[核苷酸])、拟南芥(基因库登录号NP_178309[氨基酸]和NM_126261[核苷酸])等中的。已在GAD3蛋白中鉴定了数个功能结构域，包括吡哆醛5'-磷酸盐(辅因子)结合部位和催化(活性)部位。已从细菌(包括大肠杆菌(RCSB蛋白数据库ID 3FZ7和3FZ6)中分解了GAD3的晶体结构。
通常，当在一种植物、植物部分或植物细胞中表达时，根据本发明的方法使用的GS1；2、GAT1和GAD3具有酶活性和/或增加的对热胁迫或高温的耐受性。
除非另外指明，该GS1；2、GAT1和GAD3多肽包括融合蛋白，该融合蛋白包括本发明的GS1；2、GAT1或GAD3多肽。例如将这些多肽表达为一种可通过可商购的抗体(例如FLAG基序)检测的融合蛋白或表达为一种以另外方式可被更容易地检测或纯化的融合蛋白(例如通过添加一种聚His尾可以是有用的。此外，可产生增强该蛋白的稳定性的融合蛋白，例如包括麦芽糖结合蛋白(MBP)或谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白。如另一个可替代的，该融合蛋白可包括一个受体分子。
术语“GS1；2”、“GAT1”和“GAD3”包括全长多肽和其有生物活性的片段连同前述的具有基本上相似的或基本上一致的氨基酸序列(例如至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或甚至100％氨基酸序列相似性或一致性)的任一种的有生物活性的等效物，其中该有生物活性的片段或有生物活性的等效物保留了该天然酶的生物活性中的一种或多种。
将进一步了解，天然发生的GS1；2、GAT1和GAD3将典型地允许在氨基酸序列中的取代并且实质上保留生物活性。为了按照常规鉴定出有生物活性的多肽而不是天然发生的GS1；2、GAT1和GAD3，氨基酸取代可以基于本领域中已知的任何特性，包括氨基酸侧链取代基的相对相似性或差异，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。在具体实施例中，在编码该GS1；2、GAT1和GAD3多肽的氨基酸序列中进行保守取代(即用具有相似特性的一种氨基酸残基进行的取代)。
在代表性实施例中，有生物活性的GS1；2、GAT1和GAD3(包括其等效物和片段)是有催化活性的并且增加植物、植物部分或植物细胞中对热胁迫或高温的耐受性。针对这些酶评估酶活性的方法在本领域中是已知的，如同测量一种植物、植物部分或植物细胞对热胁迫或高温的耐受性的方法一样。使用存在于本领域中的广博知识和本申请中的教导，本领域的普通技术人员能够按照常规鉴定这些酶的有生物活性的等效物和其有生物活性的片段和有生物活性的等效物。
GS1；2、GAT1或GAD3片段(例如有生物活性的片段)的长度不是关键性的。说明性的片段包括一种全长多肽的至少约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个氨基酸(任选地连续的氨基酸)。
在代表性实施例中，GS1；2的一种有生物活性的等效物、GS1；2的一个有生物活性的片段、或其一种有生物活性的等效物包括该催化结构域和/或该β-掌握域(beta-Grasp domain)，并且任选地在这一或这些区域的外部发生任意序列变异性。在实施例中，该有生物活性的等效物、有生物活性的片段或该片段的生物等效物是一种胞质多肽。
在代表性实施例中，GS1；2的一种有生物活性的等效物、GAT1的一个片段、或其一个有生物活性的等效物包括该催化部位，在这一区域的外部发生任意序列变异性。在实施例中，该催化三元组(半胱氨酸、组氨酸和谷氨酸)是保守的。
在代表性实施例中，GAD3的一个有生物活性的等效物、GAD3的一个片段、或其一个有生物活性的等效物包括吡哆醛5'-磷酸盐(辅因子)结合部位和/或催化部位，并且任选地在这一或这些区域的外部发生任意序列变异性。
在另外的实施例中，该GS1；2、GAT1和GAD3多肽是全长多肽并排除有生物活性的片段。
本发明进一步提供编码GS1；GAD3和GAT1多肽的核酸。
术语“MYB55多肽”目的是广泛的并且包括现在已知的或以后鉴定的MYB55多肽及其增加对热胁迫或高温的耐受性和/或增加植物中氨基酸含量的等效物(包括其片段和等效物)。术语“MYB55”多肽还包括对一种天然发生的MYB55多肽或其与一种天然发生的MYB55多肽具有基本上相似的或一致的氨基酸序列并且增加对热胁迫或高温的耐受性和/或增加一种植物、植物部分或植物细胞中氨基酸含量的等效物的修饰(例如缺失和/或截短)。另外，该MYB55多肽可来自于任何植物物种起源(例如水稻[包括籼稻和/或粳稻品种]、小麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、黑麦、甘蔗等)，并且术语“MYB55”还包括天然发生的等位基因变异、亚型、剪接变体等。该MYB55多肽可进一步被完全或部分地合成。
已经在数个植物物种包括栽培稻(例如SEQ ID NO:5[氨基酸]和SEQID NO:4以及SEQ ID NO:3[核苷酸]的核苷酸4062至5126)、两色蜀黍(例如SEQ ID NO:6[氨基酸]和SEQ ID NO:14[核苷酸])、玉蜀黍(例如SEQ ID NO:7[氨基酸]和SEQ ID NO:15[核苷酸])、酿酒葡萄(例如SEQID NO:8[氨基酸])、毛果杨(例如SEQ ID NO:9[氨基酸]和SEQ ID NO:16[核苷酸])、苹果(例如SEQ ID NO:10[氨基酸]和SEQ ID NO:17[核苷酸])、大豆(例如SEQ ID NO:11[氨基酸]和SEQ ID NO:18[核苷酸])、胡萝卜(例如SEQ ID NO:12[氨基酸]和SEQ ID NO:19[核苷酸])、以及拟南芥(例如SEQ ID NO:13[氨基酸]和SEQ ID NO:20[核苷酸])中鉴定了MYB55多肽。还参见图1A、D-F，图17A-H，以及WO 2010/200595的SEQ ID NO:311。来自其他生物体(具体地其他植物)的同源物可按照常规使用本领域中已知的方法鉴定。例如，可使用PCR和其他扩增技术和杂交技术来鉴定此类同源物(基于它们与在此列出的序列的序列相似性)。
通常，当在一种植物、植物部分或植物细胞中表达时，根据本发明的方法使用的MYB55多肽具有转录因子活性和/或增加对热胁迫或高温的耐受性和/或增加氨基酸含量。
除非另外指明，MYB55多肽包括MYB55融合蛋白，该融合蛋白包括本发明的一种MYB55多肽。例如将该MYB55多肽表达为一种可通过可商购的抗体(例如FLAG基序)检测的融合蛋白或表达为一种以另外方式可被更容易地检测或纯化的融合蛋白(例如通过添加一种聚His尾)可以是有用的。此外，可产生增强该蛋白的稳定性的融合蛋白，例如包括麦芽糖结合蛋白(MBP)或谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白。如另一个可替代的，该融合蛋白可包括一个受体分子。
在具体实施例中，该MYB55多肽包括SEQ ID NO:5-13中任一个的氨基酸序列或其等效物(包括片段和其等效物)、基本上由其组成或由其组成。
本发明的MYB55多肽的等效物包括与一种天然发生的MYB55多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:5-13)或其一个片段(任选地一个有生物活性的片段)具有实质性氨基酸序列一致性或相似性，例如至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多氨基酸序列一致性或相似性的那些。
应理解，天然发生的MYB55将典型地允许在氨基酸序列中的取代并且实质上保留生物活性。为了按照常规识别出本发明的有生物活性的MYB55多肽而不是天然发生的MYB55多肽(例如SEQ ID NO:5-13)，氨基酸取代可以基于本领域中已知的任何特性，包括氨基酸侧链取代基的相对相似性或差异，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。在具体实施例中，在编码该MYB55多肽的氨基酸序列中进行保守取代(即用具有相似特性的一种氨基酸残基进行的取代)。
本发明的MYB55多肽还包括MYB55多肽片段和其增加对热或高温的耐受性和/或增加植物中氨基酸含量的等效物，以及其等效物。该MYB55片段长度不是关键性的。说明性的MYB55多肽片段包括一种全长MYB55多肽的至少约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250或275个氨基酸(任选地连续的氨基酸)。
在代表性实施例中，MYB55多肽的一种有生物活性的等效物、MYB55多肽的一个有生物活性的片段或其一个有生物活性的等效物包括一个DNA结合结构域(例如螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域)，并且任选地在该DNA结合结构域的外部发生所有变异性。在本发明的实施例中，MYB55多肽的一种有生物活性的等效物、MYB55多肽的一个有生物活性的片段或其一种有生物活性的等效物包括SEQ ID NO:5的氨基酸14-113或基本上与其相似的一个序列。在本发明的实施例中，MYB55多肽的一种有生物活性的等效物、MYB55多肽的一个有生物活性的片段或其一个有生物活性的等效物包括包括SEQ ID NO:5的氨基酸38-62或基本上与其相似的一个序列和/或SEQ ID NO:5的氨基酸90-113或基本上与其相似的一个序列。在本发明的实施例中，MYB55多肽的一种有生物活性的等效物、MYB55多肽的一个有生物活性的片段或其一个有生物活性的等效物包括氨基酸14-64或基本上与其相似的一个序列。任选地，这些区域是保守的并且在这些序列外部发生所有变异性。
在另外的实施例中，该MYB55多肽包括选自下组的一个氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，该组由以下各项组成：(a)SEQ ID NO:5-13中任一项的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO:5-13中任一项的氨基酸序列具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多氨基酸序列一致性或相似性的一个氨基酸序列，任选地其中该MYB55多肽是有生物活性的；和(c)包括以上(a)或(b)的氨基酸序列的至少约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250或275个氨基酸(任选地连续的氨基酸)的一个片段，任选地其中该片段增加对热胁迫或高温的耐受性和/或增加植物中的氨基酸含量。
本发明的编码MYB55多肽的核酸可以来自任何物种起源(例如植物物种)或可以是部分或完全合成的。在代表性实施例中，编码该MYB55多肽的核酸是一种分离的核酸。
本发明还提供了编码本发明的MYB55多肽的多核苷酸。在代表性实施例中，编码该MYB55多肽的核苷酸序列是一个天然发生的核苷酸序列(例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3的核苷酸4062至5126、或SEQ ID NO:14-20)或编码一种天然发生的MYB55多肽(例如SEQ ID NO:5-13)，或是与其具有实质性核苷酸序列一致性的并编码一种有生物活性的MYB55多肽的一个核苷酸序列。
本发明进一步提供了编码本发明的MYB55多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与一个天然发生的编码一种MYB55多肽的核苷酸序列(例如SEQID NO:4或SEQ ID NO:14-20)或编码一种天然发生的MYB55多肽的一个核苷酸序列(例如SEQ ID NO:5-13)在如本领域的普通技术人员已知的严格杂交条件下杂交并编码一种有生物活性的MYB55多肽。
另外，本领域的普通技术人员将理解在编码该MYB55多肽的多核苷酸中可存在变异性，归因于遗传密码的简并性和/或内含子或其他非翻译元件的存在。遗传密码的简并性(允许不同的核苷酸序列编码相同的蛋白)在本领域中是众所周知的。此外，植物或物种偏爱的密码子可以在编码该MYB55多肽的多核苷酸中使用，一样也在本领域中众所周知。
在示例性但非限制性实施例中，编码一种MYB55多肽的核酸包括(例如重组或分离的核酸)选自下组的一个核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成，该组由以下各项组成：(a)包括SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14-20中任一项的核苷酸序列的一个核苷酸序列；(b)包括SEQ ID NO:4或SEQID NO:14-20中任一项的核苷酸序列的至少约50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或750或更多个核苷酸(例如连续的核苷酸)的一个核苷酸序列(例如编码SEQ ID NO:5-13中任一项的MYB55多肽的有生物活性的片段)；(c)与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多序列一致性的一个核苷酸序列；(d)在严格杂交条件下与(a)或(b)的核苷酸序列的完整互补体杂交的一个核苷酸序列；和(e)不同于(a)至(d)中任一项的核苷酸序列的一个核苷酸序列，归因于遗传密码的简并性。在代表性实施例中，该核苷酸序列编码一种有生物活性的MYB55多肽，该多肽增加对热胁迫或高温的耐受性和/或增加植物中的氨基酸含量。
在代表性实施例中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:5-13中任一项的多肽，或与SEQ ID NO:5-13中任一项具有实质性氨基酸序列一致性或相似性的一种等效物多肽(任选地增加对热胁迫或高温耐受性和/或增加氨基酸含量的一种有生物活性的等效物)。在代表性实施例中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:5-13中任一项的多肽的一种等效物(任选地一种有生物活性的等效物)，并在严格杂交条件下与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14-20中任一项的核苷酸序列的完整互补体杂交。
在代表性实施例中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:5-13中任一项的多肽。根据这个实施例，该核苷酸序列可包括SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14-20中任一项，基本上由其组成或由其组成。
III.表达盒
在代表性实施例中，本发明的核酸(例如，分离的核酸)被包括在一个表达盒内并且与一个启动子(例如，异源启动子)可操作关联。在实施例中，该核酸与天然启动子可操作地关联。在具体实施例中，该核酸与一个异源启动子可操作地关联。GS1；2、GAD3、GAT1和/或MYB55多肽可以被包括在一种或多种表达盒内。例如，这些多肽中的每一种可以由一个不同的核酸编码，该核酸可以被包括在一种或多种表达盒(例如，一种、两种、三种或四种)内。作为一种替代方案，一个核酸可以编码这些多肽中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)，该核酸可以被包括在一种或多种表达盒(例如，一种、两种或三种)内。
该异源启动子可以是在本领域已知的任何适合的启动子(包括细菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳动物以及植物启动子)。在具体实施例中，该启动子是一种用于在植物中表达的启动子。适合与本发明一起使用的启动子的选择可以在许多不同类型的启动子中做出。因此，启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于：细胞或组织特异性表达、所希望的表达水平、效率、可诱导性和/或可选择性。例如，除可诱导性之外，在希望在特异性组织或器官中表达的情况下，可以使用一种组织特异性或组织优先启动子(例如，根特异性或优先启动子)。相比之下，在希望响应于一个刺激表达的情况下，可以使用由其他刺激或化学物可诱导的启动子。在希望在植物的所有细胞中连续表达的情况下，可以选择组成型启动子。
组成型启动子的非限制性实例包括夜香树属(cestrum)病毒启动子(cmp)(美国专利号7,166,770)、肌动蛋白启动子(例如，水稻肌动蛋白1启动子；王(Wang)等人(1992)，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)12:3399-3406)；以及美国专利号5,641,876)、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(奥德尔(Odell)等人(1985)，自然(Nature)313:810-812)、CaMV 19S启动子(劳顿(Lawton)等人(1987)，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)9:315-324)、冠瘿碱合成酶启动子(例如，nos、mas、ocs等；(艾柏特(Ebert)等人(1987)，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci USA)84:5745-5749)、Adh启动子(沃克(Walker)等人(1987)，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84:6624-6629)、蔗糖合成酶启动子(杨(Yang)和拉塞尔(Russell)(1990)，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:4144-4148)、以及泛素启动子。
用于与本发明一起使用的组织特异性启动子的一些非限制性实例包括衍生自编码种子贮藏蛋白(例如，β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白、菜豆素等)，玉米素或油体蛋白(如油质蛋白)，或脂肪酸生物合成中涉及的蛋白质(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))的基因的那些，以及在胚发育中表达的其他核酸(如Bce4，参见例如克里德(Kridl)等人(1991)种子科学研究(Seed Sci.Res.)1:209-219；以及欧洲专利号255378)。因此，与这些组织特异性核酸相关联的启动子可以使用于本发明中。
组织特异性启动子的另外的实例包括但不局限于：根特异性启动子RCc3(郑(Jeong)等人植物生理学(Plant Physiol.)153:185-197(2010))与RB7(美国专利号5459252)，凝集素启动子(林斯特龙(Lindstrom)等人(1990)Der.Genet.11:160-167；以及沃德金(Vodkin)((1983)临床生物学研究进展(Prog.Clin.Biol.Res.)138:87-98)，玉米醇脱氢酶1启动子(丹尼斯(Dennis)等人(1984)核酸研究(NucleicAcids Res.)12:3983-4000)，S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(范德米金斯布鲁格(Vander Mijnsbrugge)等人(1996)植物与细胞生理学(Plantand Cell Physiology)，37(8):1108-1115)，玉米集光复合体启动子(班赛尔(Bansal)等人(1992)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:3654-3658)，玉米热激蛋白启动子(奥德尔(O'Dell)等人(1985)欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)5:451-458；以及罗切斯特(Rochester)等人(1986)欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)5:451-458)，豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(卡什莫尔(Cashmore),植物遗传工程中的29-39页“编码核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶的小亚基的核基因”(“Nuclear genesencoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase”pp.29-39In:Genetic Engineering of Plants)，霍兰德尔(Hollaender)编辑，Plenum出版社(Plenum Press)1983；以及波尔森(Poulsen)等人(1986)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)205:193-200)，Ti质粒甘露氨酸合酶启动子(兰格里奇(Langridge)等人(1989)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:3219-3223)，Ti质粒胭脂碱合酶启动子(兰格里奇(Langridge)等人(1989)，同上)，矮牵牛查尔酮异构酶启动子(范杜能(van Tunen)等人(1988)欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)7:1257-1263)，豆富甘氨酸蛋白1启动子(凯勒(Keller)等人(1989)基因与发育(Genes Dev.)3:1639-1646)，截短的CaMV 35S启动子(奥德尔(O'Dell)等人(1985)自然(Nature)313:810-812)，马铃薯块茎储藏蛋白启动子(温茨勒(Wenzler)等人(1989)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)13:347-354)，根细胞启动子(山本(Yamamoto)等人(1990)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7449)，玉米素启动子(克里茨(Kriz)等人(1987)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)207:90-98；兰格里奇(Langridge)等人(1983)细胞(Cell)34:1015-1022；雷纳(Reina)等人(1990)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:6425；雷纳(Reina)等人(1990)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7449；以及万德尔特(Wandelt)等人(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)17:2354)，球蛋白-1启动子(贝朗葛(Belanger)等人(1991)遗传学(Genetics)129:863-872)，α-微管蛋白cab启动子(沙利文(Sullivan)等人(1989)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)215:431-440)，PEPCase启动子(哈得斯佩斯(Hudspeth)&久拉(Grula)(1989)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)12:579-589)，R基因复合体-相关启动子(钱德勒(Chandler)等人(1989)植物细胞(Plant Cell)1:1175-1183)，以及查尔酮合酶启动子(弗兰肯(Franken)等人(1991)欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)10:2605-2612)。对于种子特异性表达特别有用的是豌豆球蛋白启动子(扎科(Czako)等人(1992)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)235:33-40；以及美国专利号5,625,136)。对于在成熟叶中表达的其他有用启动子是在衰老开始时开启的那些，如来自拟南芥属的SAG启动子(甘(Gan)等人(1995)科学(Science)270:1986-1988)。
此外，可以使用在质体中发挥功能的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因95'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。随本发明可用的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
其他组织特异性或组织优先启动子包括花序特异性或优先启动子和分生组织特异性或优先启动子。
在一些实施例中，诱导型启动子可以与本发明一起使用。与本发明一起可用的诱导型启动子的实例包括但不局限于四环素阻抑物系统启动子、Lac阻抑物系统启动子、铜诱导型系统启动子、水杨酸酯诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素诱导型启动子(青山(Aoyama)等人，(1997)植物杂志(Plant J.)11:605-612)和蜕皮激素诱导型系统启动子。诱导型启动子的其他非限制性实例包括：ABA诱导型启动子和膨胀诱导型启动子、生长素结合蛋白基因启动子(施沃布(Schwob)等人(1993)，植物杂志4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(罗尔斯顿(Ralston)等人(1988)，遗传学(Genetics)119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(科尔德罗(Cordero)等人(1994)，植物杂志6:141-150)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(科勒(Kohler)等人(1995)植物分子生物学29:1293-1298；马丁内斯(Martinez)等人(1989)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)208:551-565；以及奎格利(Quigley)等人(1989)分子进化学杂志(J.Mol.Evol.)29:412-421)、苯磺酰胺诱导型启动子(美国专利号5,364,780)以及谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，人们可以使用描述于以下文献中的任何适当的诱导型启动子：盖兹(Gatz)(1996)生物工艺学现行观点(Current Opinion Biotechnol.)7:168-172以及盖兹(1997)植物生理学与植物分子生物学年度综述(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)48:89-108。
其他适合的启动子包括来自感染宿主植物的病毒的启动子，包括但不局限于分离自以下各项的启动子：芋头花叶病毒，小球藻病毒(例如，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶启动子；米特拉(Mitra)等人，(1994)植物分子生物学(Plant Molecular Biology)26:85)，番茄斑萎病毒，烟草脆裂病毒，烟草坏死病毒，烟草环斑病毒，番茄环斑病毒，黄瓜花叶病毒，花生根茬(stump)病毒，苜蓿花叶病毒等。
在另外的实施例中，该启动子被热胁迫或高温诱导，例如MYB55启动子。术语“MYB55启动子”旨在涵盖在此具体披露的启动子序列(例如，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的核苷酸1921至4061，SEQ ID NO:2的核苷酸2562或4061，或SEQ ID NO:2)，及其与在此具体披露的MYB55启动子序列具有基本上一致的核苷酸序列的等效物(任选地，有生物活性的等效物)，以及全长MYB55启动子的片段(任选地，有生物活性的片段)及其与在此具体披露的MYB55启动子序列的片段具有基本上一致的核苷酸序列的等效物(任选地，有生物活性的等效物)。术语“MYB55启动子”包括来自稻的序列以及来自其他植物物种的同系物，包括天然发生的等位变异、亚型、剪接变体等，或可以是部分地或完全地合成的。
可以使用本领域已知的方法鉴定来自其他生物(特别是其他植物)的同系物。例如，可以根据它们与在此列出的序列的序列相似性，使用PCR以及其他扩增和杂交技术鉴定此类同系物。
与MYB55启动子关联的生物活性包括但不局限于控制或调节可操作地关联的编码序列的转录的能力。另一种非限制性生物活性包括结合一种或多种转录因子和/或RNA聚合酶II的能力。其他生物活性包括但不局限于被热胁迫、高温、ABA、MeJa和/或水杨酸诱导的能力。
因此，在示例性实施例中，该分离的核酸包括SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:2的核苷酸1921至4061，SEQ ID NO:2的核苷酸2562至4061，或SEQ ID NO:2或上述的任一者的等效物(任选地，有生物活性的等效物)，基本由其组成，或由其组成。
本发明的MYB55启动子的等效物涵盖与在此具体披露的MYB55启动子序列(例如，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的核苷酸1921至4061，SEQ IDNO:2的核苷酸2562至4061，或SEQ ID NO:2)或其片段具有例如至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％或更高的实质性核苷酸序列一致性的多核苷酸，并且任选是有生物活性的。在代表性实施例中，在以下各项中不存在序列变异性：TATA盒，CAAT盒，热激元件(HSE)中的一种或多种(例如，一种、两种或三种)，ABA应答元件中的一种或多种(ABRE；例如，一种、两种或三种)，茉莉酸甲酯(MeJa)应答元件中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种或五种)，低温反应性(LTR)元件，DOF结合部位中的一种或多种(“DOF盒”；例如，一种、两种或三种)，MYB结合部位(“MBS盒”)，AP-2结合部位(“GCC盒”)，WRKY结合部位中的一种或多种(“W盒”；例如，一种或两种)，Skn-1结合部位中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种或五种)和/或TCA元件(参见例如，图2A和2B中的示意图)，即这些序列是保守的并且任何序列变异性都不处于这些区域内。
本发明的MYB55启动子还包括在如本领域的普通技术人员已知的严格杂交条件下与在此具体披露的MYB55启动子序列(例如，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的核苷酸1921至4061，SEQ ID NO:2的核苷酸2562或4061，或SEQ ID NO:2)的完整互补体或其片段杂交的多核苷酸并且任选是有生物活性的。
MYB55启动子序列涵盖在此具体披露的MYB55启动子序列(例如，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的核苷酸1921至4061，SEQ ID NO:2的核苷酸2562至4061，或SEQ ID NO:2)的片段及其等效物(任选地，有生物活性的片段)。MYB55启动子片段的长度不是关键的。示意性片段包括全长序列的至少和/或大于约8个、10个、12个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个、1800个、1900个、2000个、2050个、2100个、2105个、2110个、2115个、2120个、2125个、2130个、2131个、2132个、2133个、2134个、2135个、2136个、2137个、2138个或2139个或更多个核苷酸(任选地，连续核苷酸)。
在代表性实施例中，该MYB55启动子序列包括以下各项：TATA盒序列，CAAT盒序列，HSE元件中的一种或多种(例如，一种、两种或三种)，ABRE元件中的一种或多种(例如，一种、两种或三种)，MeJa元件中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种或五种)，LTR元件，DOF结合部位中的一种或多种(“DOF盒”；例如，一种、两种或三种)，MYB结合部位(“MBS盒”)，AP-2结合部位(“GCC盒”)，WRKY结合部位中的一种或多种(“W盒”；例如，一种或两种)，Skn-1结合部位中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种或五种)和/或TCA元件(参见例如，图2A和2B中的示意图)，即这些序列是保守的并且任何序列变异性都不处于这些区域内。
在本发明的实施例中，包括该MYB55启动子的核酸不包括任何MYB55编码区(例如，SEQ ID NO:3的核苷酸4062至5126；图1D)。在本发明的实施例中，感兴趣的核苷酸序列不编码MYB55多肽(例如，SEQ ID NO:5；图1F)。在本发明的实施例中，感兴趣的核苷酸序列编码MYB55多肽。
因此，在代表性实施例中，本发明提供了一种核酸(例如，重组或分离的核酸)，该核酸包括选自下组的核苷酸序列，基本由其组成，或由其组成，该组由以下各项组成：(a)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的核苷酸1921至4061，SEQ ID NO:2的核苷酸2562至4061，或SEQ ID NO:2；(b)一个包括SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的核苷酸1921至4061，SEQ ID NO:2的核苷酸2562至4061，或SEQ ID NO:2的至少约8个、10个、12个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个、1800个、1900个、2000个、2050个、2100个、2105个、2110个、2115个、2120个、2125个、2130个、2131个、2132个、2133个、2134个、2135个、2136个、2137个、2138个或2139个或更多个核苷酸(任选地，连续核苷酸)的核苷酸序列；(c)一个在严格杂交条件下与(a)或(b)的核苷酸序列的完整互补体杂交的核苷酸序列；以及(d)一个与(a)至(c)的任一种的核苷酸序列具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列一致性的核苷酸序列。在代表性实施例中，该核苷酸序列是一个有生物活性的启动子序列(例如，具有启动子活性)并且任选地被热胁迫、高温、ABA、水杨酸和/或MeJa诱导。
在本发明的实施例中，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的核苷酸1921至4061，SEQ ID NO:2的核苷酸2562至4061，或SEQ IDNO:2的核苷酸序列，基本由其组成，或由其组成。
本发明的表达盒可以进一步包括一个转录终止序列。根据本发明，可以使用本领域已知的任何适合的终止序列。终止区可以与转录起始区一起是天然的，可以与感兴趣的核苷酸序列一起是天然的，或者可以衍生自另一个来源。适宜的终止区从根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒可获得，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。还参见，古拉因奥(Guerineau)等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)262,141(1991)；普劳德富特(Proudfoot)，细胞(Cell)64,671(1991)；萨恩夫肯(Sanfacon)等人，基因与发育(Genes Dev.)5,141(1991)；摩根(Mogen)等人，植物细胞(Plant Cell)2,1261(1990)；芒罗(Munroe)等人，基因(Gene)91,151(1990)；巴拉斯(Ballas)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)17,7891(1989)；以及乔希(Joshi)等人，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)15,9627(1987)。另外的示例性终止序列是豌豆RubP羧化酶小亚基终止序列和花椰菜花叶病毒35S终止序列。其他适合的终止序列对本领域的普通技术人员而言将是清楚的。
另外，在具体实施例中，感兴趣的核苷酸序列与翻译起始位点可操作地关联。该翻译起始位点可以是与感兴趣的核苷酸序列关联的天然翻译起始位点，或可以是任何其他适合的翻译起始密码子。
在示意性实施例中，该表达盒在转录的5'至3'方向包括一个启动子、一个感兴趣的核苷酸序列、以及一个在植物中起作用的转录和翻译终止区。
本领域的普通技术人员将理解本发明的表达盒可以进一步包括与该启动子结合的增强子元件和/或组织优先元件。
另外，在一些实施例中，包括一种用于选择转化的细胞的选择标记基因对该表达盒而言是有利的。适合的选择标记基因包括但不局限于编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些，以及赋予对除草化合物的抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码一种对该除草剂不敏感的修饰的靶蛋白或编码一种在植物中在该除草剂起作用之前降解或将该除草剂脱毒的酶。参见，德布洛克(DeBlock)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)6,2513(1987)；德布洛克(DeBlock)等人，植物生理学(Plant Physiol.)91,691(1989)；弗洛姆(Fromm)等人，生物技术(BioTechnology)8,833(1990)；戈登-卡姆(Gordon-Kamm)等人，植物细胞(Plant Cell)2,603(1990)。例如，已经使用编码突变靶酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因获得了对草甘膦或磺酰脲除草剂的抗性。已经通过使用编码使对应的除草剂脱毒的草丁膦乙酰转移酶、腈水解酶、或2,4-二氯苯氧乙酸酯单加氧酶的细菌基因获得了对草铵膦、溴草腈、以及2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D)的抗性。
可以根据本发明使用的选择标记基因进一步包括但不局限于编码以下各项的基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley等人，在植物科学(PlantScience)4,1(1986)中的CRC关键评论(CRC Critical Reviews))；氨腈水合酶(迈尔-格雷纳(Maier-Greiner)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88,4250(1991))；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶(珀尔(Perl)等人，生物技术(BioTechnology)11,715(1993))；bar基因(托奇(Toki)等人，植物生理学(Plant Physiol.)100,1503(1992)；马尔(Meagher)等人，作物科学(Crop Sci.)36,1367(1996))；色氨酸脱羧酶(古迪恩(Goddijn)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)22,907(1993))；新霉素磷酸转移酶(NEO；萨瑟恩(Southern)等人，分子与应用遗传学杂志(J.Mol.Appl.Gen.)1,327(1982))；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG；清水(Shimizu)等人，分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)6,1074(1986))；二氢叶酸还原酶(DHFR；郭(Kwok)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83,4552(1986))；草丁膦乙酰转移酶(德布洛克(DeBlock)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)6,2513(1987))；2,2-二氯丙酸脱卤酶(布坎南-乌拉特龙(Buchanan-Wollatron)等人，细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)13D,330(1989))；乙酰羟酸合酶(Anderson(Anderson)等人的美国专利号4,761,373；豪恩(Haughn)等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)221,266(1988))；5-烯醇丙酮-莽草酸-磷酸合酶(aroA；措美(Comai)等人，自然(Nature)317,741(1985))；卤代芳基腈水解酶(斯托克(Stalker)等人的WO 87/04181)；乙酰辅酶A羧化酶(帕克(Parker)等人，植物生理学(Plant Physiol.)92,1220(1990))；二氢蝶酸合酶(sulI；古拉因奥(Guerineau)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol).15,127(1990))；以及32kDa光和体系II多肽(psbA；希施贝里(Hirschberg)等人，科学(Science)222,1346(1983))。
还包括编码对以下各项的抗性的基因：氯霉素(赫雷拉-爱丝特雷娜(Herrera-Estrella)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)2,987(1983))；甲氨蝶呤(赫雷拉-爱丝特雷娜(Herrera-Estrella)等人，自然(Nature)303,209(1983)；梅耶尔(Meijer)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)16,807(1991))；潮霉素(沃尔德伦(Waldron)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)5,103(1985)；志坚(Zhijian)等人，植物科学(Plant Science)108,219(1995)；梅耶尔(Meijer)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Bio.)16,807(1991))；链霉素(琼斯(Jones)等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)210,86(1987))；以及大观霉素(布列塔尼-萨格纳德(Bretagne-Sagnard)等人，转基因研究(Transgenic Res.)5,131(1996))；博来霉素(希勒(Hille)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)7,171(1986))；磺酰胺(古拉因奥(Guerineau)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Bio.)15,127(1990))；溴草腈(斯托克(Stalker)等人，科学(Science)242,419(1988))；2,4-D(斯代比尔(Streber)等人，生物技术(Bio/Technology)7,811(1989))；草丁膦((德布洛克(DeBlock)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)6,2513(1987))；大观霉素(布列塔尼-萨格纳德(Bretagne-Sagnard)和库皮奥(Chupeau)，转基因研究(Transgenic Research)5,131(1996))。
其他选择标记基因包括pat基因(针对双丙氨膦和草丁膦抗性)、针对咪唑啉酮抗性的ALS基因、针对潮霉素抗性的HPH或HYG基因、针对Hc毒素的抗性的Hm1基因、以及本领域的普通技术人员常规使用并且已知的其他选择剂。总体上参见，雅兰通(Yarranton)，生物技术现行观点(Curr.Opin.Biotech.)3,506(1992)；科斯图费尔森(Chistopherson)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,6314(1992)；姚(Yao)等人，细胞(Cell)71,63(1992)；列兹尼科夫(Reznikoff)，分子微生物学(Mol.Microbiol.)6,2419(1992)；巴克利(BARKLEY)等人，操纵子(THE OPERON)177-220(1980)；胡(Hu)等人，细胞(Cell)48,555(1987)；布朗(Brown)等人，细胞(Cell)49,603(1987)；费济(Figge)等人，细胞(Cell)52,713(1988)；戴斯科勒(Deuschle)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86,5400(1989)；Fuerst(Fuerst)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86,2549(1989)；戴斯科勒(Deuschle)等人，科学(Science)248,480(1990)；拉波(Labow)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)10,3343(1990)；塞姆布莱蒂(Zambretti)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,3952(1992)；贝姆(Baim)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88,5072(1991)；乌布斯科(Wyborski)等人，核酸研究(Nuc.Acids Res.)19,4647(1991)；海勒南德-威斯曼(Hillenand-Wissman)，分子与结构生物学总论(Topics in Mol.And Struc.Biol.)10,143(1989)；德根科尔布(Degenkolb)等人，抗微生物剂与化学疗法(Antimicrob.Agents Chemother.)35,1591(1991)；克莱因斯科尼特(Kleinschnidt)等人，生物化学(Biochemistry)27,1094(1988)；盖兹(Gatz)等人，植物杂志(Plant J.)2,397(1992)；戈森(Gossen)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,5547(1992)；Oliva(Oliva)等人，抗微生物剂与化学疗法(Antimicrob.Agents Chemother.)36,913(1992)；赫拉夫卡(HLAVKA)等人，实验药理学手册(HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY)78(1985)；以及希尔(Gill)等人，自然(Nature)334,721(1988)。
感兴趣的核苷酸序列可以另外地被可操作地连接至编码一种转运肽的序列，该转运肽将感兴趣的被编码的多肽的表达指向具体的细胞区室。将蛋白质在高等植物细胞中的积累靶向叶绿体、线粒体、液泡、细胞核、以及内质网(用于细胞外的分泌)的转运肽在本领域中是已知的。将蛋白质靶向内质网的转运肽对于分泌性蛋白的正确加工而言是令人希望的。已经显示将蛋白质表达靶向叶绿体(例如，使用来自RubP羧化酶小亚基基因的转运肽)导致重组蛋白在这一细胞器中的非常高浓度的积累。已经使用豌豆RubP羧化酶小亚基转运肽序列来在植物中表达并靶向哺乳动物基因(赫雷拉-爱丝特雷娜(Herrera-Estrella)等人的美国专利号5,717,084和5,728,925)。可替代地，可以使用哺乳动物转运肽来靶向重组蛋白表达，例如靶向线粒体和内质网。已经证明植物细胞识别靶向内质网的哺乳动物转运肽(希亚特(Hiatt)等人的美国专利号5,202,422和5,639,947)。
另外，该表达盒可以包括一个5'前导序列，该前导序列起作用以增强感兴趣的可操作关联的核苷酸序列的表达(转录、转录后加工和/或翻译)。前导序列在本领域中是已知的并且包括来自以下各项的序列：微小核糖核酸病毒前导区，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区；埃尔罗伊-斯泰因(Elroy-Stein)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，86,6126(1989))；马铃薯Y病毒组前导区，例如TEV前导区(烟草蚀纹病毒；艾利森(Allison)等人，病毒学(Virology)，154,9(1986))；人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP；马克雅克(Macajak)和萨尔诺(Sarnow)，自然(Nature)353,90(1991))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导区(AMV RNA 4；乔布林(Jobling)和耶尔克(Gehrke)，自然(Nature)325,622(1987))；烟草花叶病毒前导区(TMV；盖里(Gallie)，RNA的分子生物学(MOLECULAR BIOLOGYOF RNA)，237-56(1989))；以及玉米褪绿斑驳病毒前导区(MCMV；隆梅尔(Lommel)等人，Virology 81,382(1991))。还参见，德拉-乔帕(Della-Cioppa)等人，植物生理学(Plant Physiology)84,965(1987)。
IV.转基因植物、植物部分以及植物细胞
本发明还提供了通过本发明的方法产生并且包括在此描述的核酸、表达盒及载体的转基因植物、植物部分以及植物细胞。
因此，作为一个方面，本发明提供了一个包括如在此描述的核酸、表达盒、或载体的细胞。该细胞可以用该核酸、表达盒或载体瞬时或稳定转化。另外，该细胞可以是一个培养的细胞，一个获得自植物、植物部分或植物组织的细胞，或一个在植物、植物部分或植物组织中的原位细胞。细胞可以来自任何适合的物种，包括植物(例如稻)、细菌、酵母、昆虫和/或哺乳动物细胞。在代表性实施例中，该细胞可以是一个植物细胞或细菌细胞。
本发明还提供了一个包括如在此描述的核酸、表达盒、或载体的植物部分(包括植物组织培养物)。该植物部分可以用该核酸、表达盒或载体瞬时或稳定转化。另外，该植物部分可以处于培养中，可以是一个获得自植物的植物部分，或一个原位植物部分。在代表性实施例中，该植物部分包括一个如在此描述的细胞。
还提供了包括如在此描述的核酸、表达盒、或载体的种子。任选地，该核酸、表达盒或载体被稳定地掺入进种子的基因组中。
本发明还预期了一种包括如在此描述的核酸、表达盒、或载体的转基因植物。该植物可以用核酸、表达盒或载体瞬时或稳定转化。在代表性实施例中，该植物包括如在此描述的细胞或植物部分。
再者，本发明涵盖一种包括多个如在此描述的转基因植物的作物。包括本发明的多个转基因植物的作物类型的非限制性实例包括农田，高尔夫球场，住宅草坪或花园，公共草坪或花园，路边种植，果园和/或娱乐场(例如，包括本发明的多个转基因植物的栽培区域)。
还提供了收获自本发明的植物的产物。收获的产物的非限制性实例包括种子、叶、茎、芽、果实、花、根、生物质(例如，用于生物燃料生产)和/或萃取物。
在一些实施例中，提供了产生自收获的产物的加工产物。加工产物的非限制性实例包括多肽(例如，重组多肽)，萃取物，药品(例如，作为抗疟药的阿提秘辛(artemicin))，纤维或编织纺织品，香料，干果，生物燃料(例如，乙醇)，烟草产品(例如，烤烟、卷烟、嚼烟、雪茄烟等)，油(例如，葵花油、玉米油、菜籽油等)，坚果或种子黄油，面粉或粉(meal)(例如，小麦或水稻面粉、玉米粉)和/或任何其他动物饲料(例如，大豆、玉米、大麦、稻、苜蓿)和/或人类食品(例如，加工的小麦、玉米、稻以及大豆食品)。
V.引入核酸的方法
本发明还提供了将如在此描述的核酸、表达盒或载体引入靶标植物或植物细胞(包括愈伤组织细胞或原生质体)、植物部分、种子、植物组织(包括愈伤组织)等的方法。本发明进一步包括用如在此描述的核酸、表达盒或载体瞬时或稳定转化的宿主植物、细胞、植物部分、种子或组织培养物(包括愈伤组织)。
本发明提供了将GS1；2、GAD3、GAT1和/或MYB55多肽引入进一种植物材料中的方法，该植物材料是植物、植物部分(包括愈伤组织)或植物细胞。在代表性实施例中，该方法包括用本发明的编码GS1；2、GAD3、GAT1和/或MYB55多肽的核酸、表达盒或载体转化植物细胞，以产生一个转化的植物细胞，并且由该转化的植物细胞再生一个稳定转化的转基因植物。
本发明进一步涵盖通过本发明的方法产生的转基因植物(及其子代)、植物部分、以及植物细胞。
本发明还提供了产生自发明的转基因植物的种子。任选地，该种子包括稳定地掺入进基因组中的如在此描述的分离的核酸、表达盒或载体。
将核酸瞬时或稳定地引入进植物、植物组织、细胞、原生质体、种子、愈伤组织等中的方法在本领域中是已知的。稳定转化的核酸可以被掺入进基因组中。示例性转化方法包括使用病毒和细菌(例如，土壤杆菌属)的生物方法，物理化学方法，如电穿孔、花序浸渍法(floral dip method)、弹道基因枪转化、微注射等。其他转化技术包括基于矿物纤维的须(whisker)技术(参见例如，美国专利号5,302,523和5,464,765)和花粉管转化。
其他示例性转化方法包括但不局限于：磷酸钙介导的转化，环糊精介导的转化，纳米颗粒介导的转化，声处理，浸润，PEG介导的核酸摄取，以及将核酸引入进植物细胞中的任何其他电的、化学的、物理的(机械的)和/或生物的机制，包括其任何组合。对于本领域已知的不同植物转化方法的一般指导包括今井(Miki)等人(在格里克B.R.(Glick,B.R.)和汤普逊J.E.(Thompson,J.E.)编辑的植物分子生物学与生物技术方法(Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology)中的“用于将外来DNA引入植物中的程序(Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants)”(CRC出版公司(CRC Press,Inc.)，波卡拉顿(Boca Raton)，1993)，第67-88页)和拉科沃奇-特罗扬诺夫斯卡(Rakowoczy-Trojanowska)(细胞与分子生物学快报(Cell.Mol.Biol.Lett.)7:849-858(2002))。
因此，在一些具体实施例中，向植物、植物部分、植物组织、植物细胞、原生质体、种子、愈伤组织等中的引入方法包括细菌介导的转化、粒子轰击转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、须(whisker)介导的核酸递送、微注射、声处理、浸润、聚乙二醇介导的转化、将核酸引入进植物、植物部分和/或其细胞中的任何其他电的、化学的、物理的和/或生物的机制，或其组合。
在一种形式的直接转化中，通过使用微量移液管将该载体直接微注射进植物细胞中，以机械地转移重组DNA(克罗思维(Crossway)，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genetics)202:179(1985))。
在另一个方案中，使用聚乙二醇将遗传材料转移进植物细胞中(克伦思(Krens)等人自然(Nature)296,72(1982))。
在仍另一种方法中，将原生质体与包含有待被转移进植物中的核苷酸序列的微细胞、细胞、溶酶体、或其他可融合的脂质表面体融合(弗雷利(Fraley)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79,1859(1982))。
还可以通过电穿孔将核酸引入进植物细胞中(弗洛姆(Fromm)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82,5824(1985))。在这一技术中，在包括该表达盒的核酸的存在下，电穿孔植物原生质体。高场强的电脉冲可逆地渗透化生物膜，从而允许引入核酸。电穿孔的植物原生质体重建细胞壁、分裂并再生。电穿孔的一个优势在于可以通过这一方法转化大段的DNA(包括人工染色体)。
弹道转化典型地包括以下步骤：(a)提供一种作为靶标的植物材料；(b)在该植物靶标处以足够刺穿该靶标内的细胞壁并且足够沉积该靶标的细胞内的核苷酸序列的速度推进一种携带异源核苷酸序列的微弹，以由此提供一种转化的靶标。该方法可以进一步包括用一种选择剂培养转化的靶标的步骤并且任选地，再生一个转化的植物。如下所示，该技术可以单独用作为沉淀物(湿的或冻干的)的核苷酸序列代替包含该核苷酸序列的水溶液来进行。
可以使用任何弹道细胞转化装置来实践本发明。示例性装置由桑福德(Sandford)等人(微粒科学与技术(Particulate Science and Technology)5,27(1988))、克莱因(Klein)等人(自然(Nature)327,70(1987))披露，以及披露于EP 0 270 356中。已经使用此类装置转化了玉米细胞(克莱因(Klein)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85,4305(1988))、大豆愈伤组织(克里斯托(Christou)等人，植物生理学(Plant Physiol.)87,671(1988)，麦凯布(McCabe)等人，生物技术(BioTechnology)6,923(1988))，酵母线粒体(约翰斯顿(Johnston)等人，科学(Science)240,1538(1988))、以及衣藻属叶绿体(博因顿(Boynton)等人，科学(Science)240,1534(1988))。
可替代地，可以利用如由克莱因(Klein)等人(自然(Nature)70,327(1987))描述而配置的装置。这一装置包括一个轰击室，该轰击室由一个可调节高度的挡板分为两个单独的区室。在轰击室的顶部安装有一个加速管。通过火药进料将宏弹(macroprojectile)推进到挡板处的加速管的下端。该挡板具有一个在其中形成的钻孔，该钻孔的直径比微弹小。宏弹携带这个或这些微弹，并且在钻孔处瞄准并射击该宏弹。当宏弹被挡板挡住时，这个或这些微弹通过钻孔被推进。靶标被定位在轰击室中，这样使得通过钻孔被推进的一个或多个微弹穿透该靶标中的细胞的细胞壁并且将其上携带的感兴趣的核苷酸序列沉积在该靶标的细胞中。在使用之前，该轰击室被部分地抽空，以阻止大气阻力不适当地减缓微弹。该室仅被部分地抽空，这样使得在轰击过程中靶组织不变干燥。约400至约800毫米的汞体积是适合的。
在替代性实施例中，未使用微弹而实现弹道转化。例如，可以由宏弹携带包含作为沉淀物的感兴趣的核苷酸序列的水溶液(例如，通过将该水溶液直接放置在不具有微弹的宏弹的板接触端，在此处通过表面张力保留该水溶液)，并且该溶液单独地在该植物组织靶标处被推进(例如，通过以如上描述的相同的方式将宏弹推进到加速管的下端)。其他途径包括将核酸沉淀物本身(“湿的”沉淀物)或冻干的核苷酸沉淀物直接放置在不具有微弹的宏弹的板接触端。在不存在微弹的情况下，认为该核苷酸序列必须以比由一个微弹携带所需的速度更大的速度在组织靶标处被推进，或导致该核苷酸序列必须运行较短的距离到达该靶标(或两者)。
在具体实施例中，通过一个微弹递送该核苷酸序列。考虑到颗粒的速度以及颗粒必须运行的距离，该微弹可以形成自具有足够有待被推进通过细胞壁的密度和粘着性的任何材料。用于制造微弹的材料的非限制性实例包括金属，玻璃，硅石，冰，聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯，以及碳化合物(例如，石墨、金刚石)。适合的金属的非限制性实例包括钨、金以及铱。这些颗粒应该具有这样的尺寸:其足够小以避免它们在靶组织中接触的细胞的过度破坏并且足够大以提供穿透靶组织中的感兴趣的细胞所需的惯性。直径在约二分之一微米至约三微米范围内的颗粒是适合的。颗粒不一定是球形的，因为颗粒上的表面不规则可以增强其负载力。
该核苷酸序列可以通过沉淀被固定在颗粒上。如本领域中已知的，利用的精确沉淀参数将取决于如利用的颗粒加速程序的因素而变化。可以任选地用一种成胶囊剂(例如聚赖氨酸)包衣运载体颗粒，以改进固定在其上的核苷酸序列的稳定性，如在EP 0 270 356(第8栏)中所讨论。
可替代地，可以使用根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌转化植物。土壤杆菌介导的核酸转移利用了根瘤土壤杆菌和发根土壤杆菌将DNA转移进植物染色体中的能力。土壤杆菌是一种分别将在被叫做根瘤土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒的T-DNA区中编码的一组基因转移进植物细胞中的植物病原体。Ti质粒的转移的典型结果是被叫做冠瘿的肿瘤性生长，在冠瘿中T-DNA被稳定地整合进宿主染色体中。Ri质粒被整合进宿主染色体DNA中导致被称作“发根病”的情况。可以通过缺失T-DNA中的基因而不丢失DNA转移和整合来除去在宿主植物中引起疾病的能力。有待被转移的DNA附接至定义整合的T-DNA的端点的边界序列。
借助工程化的土壤杆菌属菌株的转移对于许多双子叶植物而言已经变为常规。然而，在使用土壤杆菌转化单子叶植物(特别是谷物植物)中经历了一些困难。然而，已经在若干单子叶植物物种中实现了土壤杆菌介导的转化，包括谷物物种，例如黑麦、玉米(罗兹(Rhodes)等人，科学(Science)240,204(1988))、以及稻(日江井(Hiei)等人，(1994)植物杂志(Plant J.)6:271)。
虽然以下讨论将聚焦于使用根瘤土壤杆菌来实现植物中的基因转移，但是本领域的普通技术人员将意识到这一讨论也适用于发根土壤杆菌。已经模拟根瘤土壤杆菌的转化研发了使用发根土壤杆菌的转化并且被已经成功地利用于转化例如苜蓿、龙葵、以及白杨(莱尔思(Ryals)等人的美国专利号5,777,200)。如由伯吉斯(Burgess)等人的美国专利号5,773,693所描述，使用无害的根瘤土壤杆菌菌株是优选的(如下所述)，然而，可以利用野生型发根土壤杆菌。发根土壤杆菌的一种示意性菌株是菌株15834。
在具体方案中，将土壤杆菌菌株修饰为包含有待被转移进植物中的核苷酸序列。有待被转移的核苷酸序列被掺入进T区中并且典型地侧接至少一个T-DNA边界序列，任选地两个T-DNA边界序列。多种土壤杆菌菌株在本领域中是具体已知的，并且可以用于本发明的方法中。参见例如，霍伊卡(Hooykaas)，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)13,327(1989)；史密斯(Smith)等人，作物科学(Crop Science)35,301(1995)；奇尔顿(Chilton)，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90,3119(1993)；莫劳尼(Mollony)等人，纽约理论与应用遗传学专著(Monograph Theor.Appl.Genet NY)19,148(1993)；石田(Ishida)等人，自然生物技术(Nature Biotechnol.)14,745(1996)；以及科玛丽(Komari)等人，植物杂志(The Plant Journal)10,165(1996)。
除T区之外，该Ti(或Ri)质粒还包含一个vir区。该vir区对于有效转化而言是重要的并且似乎是物种特异性的。
两种示例性类别的重组Ti和Ri质粒载体系统在本领域是常用的。在一种被叫做“共合体(cointegrate)”的类别中，通过遗传重组将包含感兴趣的基因的穿梭载体插入进包含如例如在德布洛克(DeBlock)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)3,1681(1984)的PMLJ1穿梭载体中的植物转化所需的顺式作用和反式作用元件两者的非致癌Ti质粒以及由萨摩布里斯克(Zambryski)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)2,2143(1983)描述的非致癌Ti质粒pGV2850中。在第二种类别或“二元”系统中，将感兴趣的基因插入进包含植物转化所需的顺式作用元件的穿梭载体中。其他必须功能由如由贝文(Bevan)，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)12,8711(1984)描述的pBIN19穿梭载体所示例的非致癌Ti质粒，以及由豪科玛(Hoekma)等人，自然(Nature)303,179(1983)描述的非致癌Ti质粒PAL4404以反式方式提供。
已经研发了二元载体系统，其中携带感兴趣的异源核苷酸序列的操纵的无害T-DNA和vir功能存在于分开的质粒上。以这种方式，包括外来DNA(有待被转移的核酸)的修饰的T-DNA区被构建在于大肠杆菌中复制的小质粒中。这一质粒以三亲杂交方式或经由电穿孔被并合地转移进包含与毒性基因序列相容的质粒的根瘤土壤杆菌中。以反式方式提供vir功能，以将T-DNA转移进植物基因组中。此类二元载体在本发明的实践中是有用的。
在本发明的具体实施例中，利用超级二元载体(super-binary vector)。参见例如，美国专利号5,591,615和EP 0 604 662。已经构建了这样一种包含一个DNA区的超级二元载体，该DNA区源自被包含在展示出极高的转化率的超毒力的根瘤土壤杆菌A281中的Ti质粒pTiBo542(金(Jin)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169,4417(1987))的高毒性区(霍德(Hood)等人，生物技术(Biotechnol.)2,702(1984)；霍德(Hood)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)168,1283(1986)；科玛丽(Komari)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)166,88(1986)；金(Jin)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169,4417(1987)；科玛丽(Komari)，植物科学(PlantScience)60,223(1987)；ATCC登录号37394)。
本领域的普通技术人员已知的示例性超级二元载体包括pTOK162(日本专利申请(专利公开)号4-222527，EP 504,869，EP 604,662以及美国专利号5,591,616)和pTOK233(科玛丽(Komari)，植物细胞报告(PlantCell Reports)9,303(1990)；石田(Ishida)等人，自然生物技术(NatureBiotechnology)14,745(1996))。可以通过以上参考文件中列出的方法构建其他超级二元载体。超级二元载体pTOK162能够在大肠杆菌和根瘤土壤杆菌两者中复制。另外地，该载体包含来自pTiBo542的毒性区的virB、virC和virG基因。该质粒还包含一个抗生素抗性基因、一个选择标记基因、以及有待被转化进植物中的感兴趣的核酸。有待被插入进植物基因组中的核酸典型地位于T区的两个边界序列之间。可以构建具有以上针对pTOK162描述的特征的本发明的超级二元载体。将用于本发明的超级二元载体和其他载体的T区构建为具有用于插入有待被递送的基因的限制酶切位点。可替代地，可以利用体内同源重组将有待被转化的DNA插入进载体的T-DNA区中。参见，赫雷拉-爱丝特雷娜(Herrera-Esterella)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)2,987(1983)；霍希(Horch)等人，科学(Science)223,496(1984)。这样的同源重组依赖于以下事实，该超级二元载体具有一个与pBR322或其他类似的质粒的区同源的区。因此，当将这两个质粒拿到一起时，通过遗传重组经由同源区将所希望的基因插入进超级二元载体中。
在通过土壤杆菌介导的转化而稳定转化的植物中，感兴趣的核苷酸序列被掺入进植物核基因组中，典型地侧接至少一个T-DNA边界序列并且通常是两个T-DNA边界序列。
可以通过本领域已知的任何手段用土壤杆菌转化植物细胞，例如通过用培养的离体原生质体进行共培养，或完整细胞或组织的转化。第一种途径使用允许培养原生质体以及随后由培养的原生质体的植物再生的已确立的培养系统。通常通过在转化载体中包括一个选择标记或通过获得成功的细菌感染的证据来完成转化的细胞或植物的鉴定。
将核酸引入进植物中的方法还可以包括遗传材料的体内修饰，用于其的方法在本领域中是已知的。例如，可以使用体内修饰来将如在此描述的分离的核酸插入进植物基因组中。
用于体内修饰的适合的方法包括描述于高(Gao)等人，植物杂志(Plant J.)61,176(2010)；李(Li)等人，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)39,359(2011)；美国专利号7,897,372和8,021,867；美国专利公开号2011/0145940中以及描述于国际专利公开号WO 2009/114321、WO2009/134714和WO 2010/079430中的技术。例如，可以使用一种或多种转录效应物(affector)样核酸酶(TALEN)和/或一种或多种大范围核酸酶来将如在此描述的分离的核酸掺入进植物基因组中。在代表性实施例中，该方法包括在靶位点处用TALEN和/或大范围核酸酶切割植物基因组并且提供一个包括与靶位点的至少一部分同源的序列的多核苷酸，并且进一步包括一种本发明的分离的核酸，这样使得发生同源重组并且将该分离的核酸插入进基因组中。
已经通过本领域已知的任何方法转化的原生质体也可以被再生，以使用已知的技术产生完整的植物。
从培养的原生质体的植物再生描述于埃文斯(Evans)等人，植物细胞培养手册(Handbook of Plant Cell Cultures)，第1卷：(麦克米兰出版公司(MacMilan Publishing Co.)纽约，1983)；以及瓦希尔I.R.(Vasil I.R.)(编)，植物的细胞培养与体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants)，学术出版社(Acad.Press)，奥兰多(Orlando)，第I卷，1984和第II卷，1986)。基本上所有植物物种都可以再生自培养的细胞或组织，包括但不局限于甘蔗、甜菜、棉花、果树以及豆类的所有的主要物种。
用于再生的手段在植物的物种与物种间各不相同，但是通常首先提供转化的原生质体的悬浮液或包含转化的外植体的培养皿。形成愈伤组织并且可以由愈伤组织诱导芽以及随后地是根。可替代地，可以在愈伤组织中诱导体细胞胚形成。这些体细胞胚作为天然胚发芽以形成植物。培养基将通常包含不同氨基酸和植物激素(例如生长素和细胞分裂素)。向培养基中添加谷氨酸和脯氨酸也是有利的，尤其是用于如玉米和苜蓿这样的物种而言。有效的再生将取决于培养基、取决于基因型、并且取决于培养史。如果控制这三个变量，那么再生通常是可再现并可重复的。
将再生植物转移至标准土壤条件并且以常规方式栽培。使用常规程序种植并收获这些植物。
可替代地，可以使用花序浸渍法产生转基因植物(参见例如，克拉夫(Clough)和本特(Bent)(1998)植物杂志(Plant Journal)16:735-743)，该方法避免了植物组织培养或再生的需要。在一个代表性方案中，使植物生长于土壤中，直到主花序约10cm高。剪去主花序，以诱导多个次花序的出现。典型地将这些植物的花序浸渍在包含感兴趣的载体、单糖(例如，蔗糖)以及表面活性剂的土壤杆菌悬浮液中。浸渍过程之后，使这些植物生长至成熟并且收获种子。可以通过在选择压力下发芽对来自这些处理的植物的转基因种子进行选择(例如，使用化学品双丙氨膦)。包含选择标记的转基因植物幸免于处理并且可以被移植到单独的盆中，用于随后的分析。参见，贝克托尔德(Bechtold)，N.和佩列蒂耶(Pelletier)，G.分子生物学方法(Methods Mol Biol)82,259-266(1998)；钟(Chung)，M.H.等人转基因研究(Transgenic Res)9,471-476(2000)；克拉夫(Clough)，S.J.和本特(Bent)，A.F.植物杂志(Plant J)16,735-743(1998)；迈索尔(Mysore)，K.S.等人植物杂志(Plant J)21,9-16(2000)；塔格(Tague)，B.W.转基因研究(Transgenic Res)10,259-267(2001)；王(Wang)，W.C.等人植物细胞报告(Plant Cell Rep)22,274-281(2003)；叶(Ye)，G.N.等人植物杂志(Plant J.)，19:249-257(1999)。
可以由本领域的普通技术人员优化用于转化、选择及再生的具体条件。影响转化效率的因素包括植物的物种，靶组织或细胞，培养基的组成，选择标记基因，载体的种类，以及光照/黑暗条件。因此，可以改变这些以及其他因素来决定对于任何具体植物物种而言最佳的转化方案。应该意识到，并不是每个物种都以相同的方式对转化条件作出反应并且可能需要在此披露的方案的轻微不同的修饰。然而，通过改变这些变量中的每者，可以获得对于任何植物物种而言最佳的方案。
另外，工程化进在此描述的本发明的转基因种子与植物、植物部分和/或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长被传代，并且因此可以在子代植物中被维持和遗传。通常，维持和传代利用了被开发以适合特定目的(如收获、播种或耕作)的已知农业方法。
本发明在以下的实例中进行更具体地描述，这些实例仅意在作为说明性的，因为其中众多改变与变体对于本领域内的普通技术人员是明显的。
实例
如在以下实例中所使用，术语“正常生长条件”是指包括以下各项的生长条件：29℃白天温度，23℃夜间温度，白天过程中的12小时的光照(大约500μmol m-2s-1)以及在夜间过程中的12小时的黑暗。
如在以下实例中所使用，术语“正常温度条件”是指包括29℃白天温度和23℃夜间温度的生长条件。
如在以下实例中所使用，术语“高温条件”是指包括35℃白天温度和26℃夜间温度的生长条件。
如在以下实例中所使用，术语“正常日光条件”是指包括白天过程中的12小时的光照(大约500μmol m-2s-1)以及在夜间过程中的12小时的黑暗的生长条件。
如在以下实例中所使用，术语“长日光条件”是指包括白天过程中的16小时的光照(大约500μmol m-2s-1)以及在夜间过程中的8小时的黑暗的生长条件。
实例1
OsMYB55的表征
OsMYB55的867bp全长cDNA序列(SEQ ID NO:4；图1E)编码一种预测为289个氨基酸长的R2R3-MYB转录因子(SEQ ID NO:5；图1F)。使用(国家生物技术信息中心，贝塞斯达，马里兰州)检索来鉴定OsMYB55的同系物。使用最近的同系物的氨基酸序列(SEQ ID NOs:6-13；图17A-H)来生成一个显示OsMYB55与其同系物之间的相似性的系统树(图1A)。
包含5'UTR的基因组DNA序列、启动子序列、MYB55编码区(包含三个外显子和两个内含子)以及3'UTR示于图1D(SEQ ID NO:3)中；单独的5'UTR和启动子序列示于图1C(SEQ ID NO:2)中。OsMYB55启动子序列的2134bp部分(缺少核苷酸-1至-5)示于图1B(SEQ ID NO:1)中并且被用于构建GUS报告基因构建体(实例3)。
为了理解OsMYB55基因的调节，使用PlantCARE数据库(法兰德斯大学校际生物技术研究所(Flanders Interuniversity Institute forBiotechnology)，津维纳拉德(Zwijnaarde)，比利时；在http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/可获得)进行OsMYB55启动子区(～2100bp)的电子(in-silico)分析。在OsMYB55启动子区中鉴定了许多潜在的CARE和TFBS(图2A-2B)。
全局表达分析揭示OsMYB55在植物组织中区别表达并且揭示在整个植物生命周期过程中其表达变化(图3)。在营养阶段过程中直到分蘖和花序阶段，转录物水平是较高的。在这些阶段过程中，根组织中的转录比叶组织中的高。在种子发育过程中、在种子成熟时两者，在种子中观察到OsMYB55的最低表达水平。
实例2
OsMYB55表达响应于热胁迫被上调
：OsMYB55转录物
将来自野生型稻植物的种子种植在包含生长培养基的500ml盆中，该培养基包括处于1:4的比例的泥炭苔和蛭石。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长四周。
在正常生长条件下生长四周后，将植物暴露于45℃，持续0、1、6或24小时。从每株植物收获叶，立即冷冻在液氮中并且在-80℃下储存。
叶的定量实时RT-PCR分析显示在暴露于45℃一小时后OsMYB55表达被上调并且显示在暴露于45℃持续6或24小时后OsMYB55表达回至基础水平(图4)。
实例3
OsMYB55表达响应于热胁迫被上调
：GUS报告蛋白
为了产生OsMYB55启动子-GUS构建体，使用OsMYB55启动子-BamH1正向引物(5'-TGGTGAGGAGGATTGTGCAAGGATCCGCG-3'；SEQ ID NO:21)和OsMYB55启动子-EcoR1反向引物(5'-CCGGAATTCTTGCACAATCCTCCT CACCA-3'；SEQ ID NO:22)从基因组DNA扩增OsMYB55启动子区的2134碱基对片段。
使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)萃取法从生长在正常生长条件下的四周龄植物中分离DNA。将扩增的片段(SEQ ID NO:1；图1B)克隆进BamHI与EcoRI限制酶切位点之间的pCAMBIA1391Z(冈比亚公司(Cambia)，布里斯班，澳大利亚)的多克隆位点中，以驱动GUS报告蛋白的表达。使用土壤杆菌介导的转化产生包括OsMYB55启动子-GUS构建体的转基因水稻系，并且根据三木(Miki)等人，植物生理学(PlantPhysiol.)138(4):1903(2005)的方法选择阳性转化系。
将来自表达OsMYB55启动子-GUS构建体的转基因水稻植物的种子种植在包含生长培养基的500ml盆中，该培养基包括处于1:4的比例的泥炭苔和蛭石。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长四周。
在正常生长条件下生长四周后，将植物暴露于29℃或45℃，持续0、1、6或24小时。处理后24小时收获植物组织并且通过浸没在包含1mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-Gluc)(生物合成国际有限公司(Biosynth International,Inc.)，伊塔斯加，IL)的0.1M柠檬酸钠-HCl缓冲液pH 7.0中进行染色，真空渗入五分钟并且在37℃下孵育16小时。通过将组织在75％乙醇中进行孵育从组织除去叶绿素。将这些样品保存在10％甘油中，直到检查。制备徒手切片并使用光学显微镜进行研究。
如图5所示，暴露于45℃持续24小时的植物比暴露于29℃持续24小时的植物中的GUS表达高。
实例4
过表达OsMYB55的转基因水稻植物
由于OsMYB55表达响应于高温被上调，所以我们研究了OsMYB55表达在一种或多种热胁迫应答和/或热耐受性中是否发挥作用。在不同发育阶段进行实验，以确定OsMYB55过表达对植物耐热性的影响。
使用玉米泛素启动子产生用于过表达OsMYB55的构建体。使用土壤杆菌介导的转化产生转基因植物。使用磷酸甘露糖异构酶(PMI)测试对阳性转化植物进行选择(尼格罗图(Negrotto)等人植物细胞报告(Plant CellRep.)19:798(2000))。
表达分析显示与野生型水稻植物相比，在正常生长条件下生长四周后的OsMYB55表达在转基因水稻植物的叶中高五十到九十倍(图6)。
实例5
在高温下OsMYB55过表达增加胚芽鞘长度
使来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子发芽并且在28℃或39℃下生长四天。
如图7A和7B所示，尽管在39℃下生长的所有植物中的胚芽鞘长度减小，但是在39℃下生长的过表达OsMYB55的转基因水稻植物的胚芽鞘显著地长于其野生型对应物的胚芽鞘。
实例6
在长日光条件下OsMYB55过表达增强生长
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中，这些盆包含(普勒菲尔产品有限责任公司(PROFILE Products,LLC)，布法罗格罗夫，伊利诺伊州(IL))(一种粒度在2.5与3.5mm之间的100％烘焙焙烧粘土生长培养基)。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长，直到发芽不久之后(种植后10天)，然后在伴随正常温度条件或高温条件的长日光条件下生长4周。
如图8A-8D所示，在正常温度条件下生长的植物的高度、营养生物量以及根生物量无显著差异。在高温条件下生长的野生型水稻植物在植物高度上显示出降低(图8B)并且在干生物量上显示出增加(图8C-8D)。与其野生型对应物相比，在高温条件下生长的过表达OsMYB55的转基因水稻植物在植物高度上显示出较少减小(图8B)并且在植物生物量上显示出显著增加(图8C-8D)。
实例7
在正常日光条件下OsMYB55过表达增强生长
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在包含生长培养基的500ml盆中，该培养基包括处于1:4的比例的泥炭苔和蛭石。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长，直到发芽不久之后(种植后10天)，然后在伴随正常温度条件或高温条件的正常日光条件下生长四周。
如图9A-9D所示，在正常温度条件下生长的植物的高度和营养生物量无显著差异。在高温下生长的野生型水稻植物在植物高度(图9C)、营养生物量以及叶鞘长度上显示出降低。与其野生型对应物相比，在高温条件下生长的过表达OsMYB55的转基因水稻植物在营养生物量上显示出较少减小(图9C)。OsMYB55的过表达还减弱高温条件对过表达OsMYB55的转基因水稻植物的高度和叶鞘长度的负影响。
实例8
在连续高温下生长的有害影响
在长日光条件下比在正常日光条件下更严重
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长，直到发芽不久之后(种植后10天)，然后在正常生长条件下、在伴随高温条件的正常日光条件下或在伴随正常温度条件或高温条件的长日光条件下生长4、9、11或17周。
如图10A-10G所示，与在正常温度条件下生长相比，在连续高温下生长导致花序变形并且引起完全的结实失败。OsMYB55的过表达不显著减少花序变形或结实失败的出现。对于野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物两者而言，在连续高温下生长的有害影响在长日光条件下生长的植物中比在中性日光条件下生长的植物中更严重。
实例9
针对高温OsMYB55过表达改进植物
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长，直到发芽不久之后(种植后10天)，然后在正常生长条件下或在伴随高温条件的正常日光条件下生长四周。四周处理周期后，使植物在正常生长条件下生长，直到收获(约12周)。
如图11A-11B所示，尽管在高温条件下生长四周导致野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物两者的总干生物量和谷粒产率的显著减少，但是在过表达OsMYB55的转基因水稻植物中这些减少是更不显著的。
实例10
表达OsMYB55-RNAi构建体的水稻植物
根据三木(Miki)等人，植物生理学(Plant Physiol.)138(4):1903(2005)的方法制备OsMYB55-RNAi构建体。使用OsMYB55-491正向引物(5’-CGTCAAGAACTACTGGAACAC C-3’；SEQ ID NO:23)和OsMYB55-491反向引物(5’-CCATGTTCGGGAAGTA GCAC-3’；SEQ ID NO:24)，通过PCR扩增长度为491bp并且与其他水稻基因具有较低相似性的OsMYB55的cDNA序列片段。将所得片段克隆进pENTER克隆载体(生命技术公司(Life Technologies Corp.)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中，并且通过位点特异性重组方法在由三木(Miki)等人，植物生理学(Plant Physiol)138(4)1903(2005)描述的pANDA二元载体中使用Gateway LR Clonase Enzyme Mix(生命技术公司(Life TechnologiesCorp.)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)在玉米泛素启动子的下游产生被一个GUS内含子序列分开的插入的DNA序列。使用土壤杆菌介导的转化获得转基因水稻系，并且根据三木(Miki)等人，植物生理学(PlantPhysiol.)138(4):1903(2005)的方法选择阳性转化系。
尽管在表达OsMYB55-RNAi构建体的四周龄水稻植物中OsMYB55的转录物水平少大约三倍(图12)，但是在野生型水稻植物与表达OsMYB55-RNAi构建体的植物之间未观察到表型差异。不希望被理论所束缚，目前认为在表达OsMYB55-RNAi构建体的水稻植物中缺少可辨别的表型可以归因于R2R3-MYB转录因子家族的大量成员以及这一家族之间的高冗余。
实例11
OsMYB55过表达增强总叶氨基酸含量
为了理解通过OsMYB55增强植物耐热性的生理与分子机制，收集不同植物组织并且进行生物化学分析，以鉴定野生型水稻植物与过表达OsMYB55的转基因水稻植物之间的差异(例如，糖含量、淀粉含量、过氧化氢含量、氨基酸含量等的差异)。
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长，直到发芽不久之后(种植后10天)，然后在正常生长条件下或在伴随高温条件的正常日光条件下生长四周。
四周处理周期后，收集组织并冷冻干燥24小时，然后使用0.75mL的100％甲醇萃取三次。每次萃取在70℃下进行持续15分钟。通过将500μL萃取物添加至355μL水和835μL氯仿中使萃取物经受氯仿纯化。离心后，收集上相并冷冻干燥，然后溶解于去离子水中。根据Rosen(Rosen)，生物化学与生物物理学档案(Arch.Biochem.Biophys.)67:10(1957)的方法测定总氨基酸含量。
如图13A所示，当在伴随正常温度条件或高温条件的长日光条件下生长时，过表达OsMYB55的转基因水稻植物的叶具有比其野生型对应物更高的总氨基酸含量。暴露于高温条件增加了野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物两者的叶氨基酸含量。过表达OsMYB55的转基因水稻植物的叶氨基酸含量比野生型水稻植物的叶氨基酸含量增加地显著更多。
实例12
OsMYB55过表达上调
氨基酸代谢中涉及的基因的表达
根据总氨基酸分析结果，我们怀疑OsMYB55可能在涉及氨基酸代谢的基因的活化中发挥作用。为了测试这一假设，使用暴露于高温的野生型水稻植物和过表达OcMYB55的转基因水稻植物的全局微阵列分析进行全基因组转录组分析。
因为微列阵分析可能错过基因表达中的更加微妙的变化，所以使用对应于氨基酸生物合成和转运中涉及的其他基因的引物进行定量实时PCR。使用设计自所选基因的序列的特异性引物进行定量实时RT-PCR。使用 RNA分离试剂(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corp.)，圣路易斯，密苏里州)从植物组织中分离总RNA。为了消除任何残余的基因组DNA，用无RNA酶的RQ1DNA酶(普洛麦格公司(PromegaCorp.)，麦迪逊，威斯康星州)处理总RNA。使用反转录系统试剂盒(量化生物科技公司(Quanta BioSciences,Inc.)，盖瑟斯堡，马里兰州)从总RNA合成cDNA。使用Primer Express 2.0软件(通过生命技术公司(LifeTechnologies Corp.)的应用生物系统公司(Applied Biosystems)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)设计针对靶基因的引物。使用由利瓦克(Livak)和斯科米特根(Schmittgen)，方法(Methods)25:402(2001)描述的2CΤ方法计算每个靶基因的相对于内控肌动蛋白2的相对定量(RQ)值。
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在伴随正常温度条件的长日光条件下生长，并且然后暴露于45℃，持续0、1、6或24小时。
发现三个对氨基酸生产而言重要的候选基因被上调：OsGS1；2，OsGAT1以及OsGAD3(图13B-13D)。GS1；2涉及在将谷氨酰胺转化为谷氨酸中并且代表氨基酸生物合成的早期步骤之一。也被称为氨基甲酰磷酸合成酶的GAT1涉及在原核生物和真核生物中的精氨酸生物合成的第一关键步骤中(霍尔登(Holden)等人，结构生物学现行观点(Current Opin.Structural Biol.)8:679(1998))。GAD基因涉及在将L-谷氨酸转化为GABA中(藤原浩(Hiroshi)，分子催化B-酶杂志(J.Mol.Catalysis B:Enzymatic)10:67(2000))。定量实时PCR分析揭示在将水稻植物暴露于45℃后一小时三种上述基因的上调。在暴露于45℃后6小时OsGAT1和OsGAD3的转录物水平下降到接近基础水平(图13C-13D)，而暴露于45℃后6小时OsGS1；2转录物水平仍旧显著增加(图13B)。
在氨基酸代谢中涉及的其他基因的转录物中未检测到显著差异。
实例13
OsMYB55结合至氨基酸代谢中涉及的基因
使用PlantCARE数据库(法兰德斯大学校际生物技术研究所，津维纳拉德，比利时；在http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/可获得)分析对应于在实例12中鉴定的基因(OsGS1；2，OsGAT1以及OsGAD3)的启动子的DNA序列。结果显示所有三个启动子都包含针对MYB蛋白的潜在的结合部位，一个CAGTTA基序。CAGTTA基序分别位于离OsGS1；2，OsGAT1以及OsGAD3cDNA中的第一个ATG密码子1079bp，460bp以及554bp。因为该CAGTTA基序是一个针对MYB转录因子的结合盒(binding box)并且因此是一个针对OsMYB55的潜在的结合部位，进行电泳迁移率变动测定(EMSA)，以确定OsMYB55是否在体外与OsGS1；2、OsGAT1或OsGAT3的CAGTTA盒结合。
如下制备重组OsMYB55。使用MYB55-P28-BamHI正向引物(5’-CGCGGAT CCATGGGGCGCGCGCCGT-3’；SEQ ID NO:25)和MYB55-P28-HinIII反向引物(5’-CCCAAGCTTTGTCAGGGTGTTGCAGAGACCCTGT-3’；SEQ ID NO:26)扩增OsMYB55cDNA的全长编码区。用BamHI和HindIII消化PCR产物和pET15b载体(EMB生物科学公司(EMB Biosciences))。连接后，根据生产厂商的指示，将构建体转化进Arctic Express(DE3)RIL感受态细胞(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，圣克拉拉，加利福尼亚州)中。使用His标签纯化系统(凯杰公司(Qiagen,Inc.)，巴伦西亚，加利福尼亚州)纯化重组OsMYB55。
使用特异性引物扩增来自OsGS1；2、OsGAT1以及OsGAD3的启动子的潜在的OsMYB55结合部位，以产生包含一个拷贝的其对应的MYB结合盒的DNA产物。
使用EMSA试剂盒(Cat.#E33075，分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)，尤金(Eugene)，俄勒冈州)，用变化量的重组OsMYB55蛋白(0、10、20或40μg)和OsGS1；2、OsGAT1以及OsGAD3DNA产物(0或200ng)进行EMSA。将包含DNA和/或蛋白质的样品在200V下装载进Ready Gel TBE，梯度4％–20％聚丙烯酰胺非变性凝胶(Bio-Rad实验室(Bio-Rad Laboratories)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)中，持续45分钟。使用提供于EMSA试剂盒中的绿对凝胶中的DNA染色并且使用ChemiDocTM成像系统(Bio-Rad实验室，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)可视化。
如图14A所示，OsMYB55与包含CAGTTA盒基序的OsGS1；2、OsGAT1以及OsGAD3启动子序列强烈结合。
实例14
OsMYB55活化氨基酸代谢中涉及的基因
OsMYB55蛋白与OsGs1；2、OsGAT1以及OsGAD3的启动子序列的结合支持以下想法，OsMYB55可能通过活化这些基因来增强氨基酸含量。为了研究这一假设，使用GUS作为报告蛋白，进行使用瞬时基因表达策略的转录活化测定。
将对应于OsGS1；2、OsGAD3以及OsGAT1启动子的DNA序列克隆进包含内含子的GUS报告载体中。使用OsGS1；2启动子正向引物(5’-CACCTGCGGTGAATGGAAGACGTTTG-3’；SEQ ID NO:27)和OsGS1；2启动子反向引物(5’-TGCTCAAAGCAGAAGAGATCTGAATGAG-3’；SEQID NO:28)、OsGAT1启动子正向引物(5'-CACCGACGGAGGAAGTAGTG TGGAACCAT-3’；SEQ ID NO:29)和OsGAT1启动子反向引物(5’-TGGTGGTAGGGTG CGGC-3’；SEQ ID NO:30)或OsGAD3启动子正向引物(5’-CACCCAGATCAAATGTCAAAAGGGGCG-3’；SEQ ID NO:31)和OsGAD3启动子反向引物(5’-CTTGCCT GCCGAGCTATCAACC-3’；SEQ ID NO:32)从水稻基因组DNA扩增OsGS1；2、OsGAD3以及OsGAT1启动子(cDNA的ATG起始密码子的上游1.5-2kb)的DNA序列。将所得片段克隆进TOPO pENTER载体(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中，并且通过位点特异性重组方法经由LR酶混合物(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)在DMC162通道(gateway)载体中制备最终的构建体。使用OsMYB55-Pent正向引物(5'-ATGGGGCGCGCGCCGTG-3'；SEQID NO:33)和OsMYB55-Pent反向引物(5'-CTATGTCAGGGTGTTGCAGAG ACC-3'；SEQ ID NO:34)紧邻35S启动子将OsMYB55插入进DMC32载体中。在共转化瞬时表达分析中，将这一质粒用作活化剂。为了标准化GUS活性值，使用由pJD312质粒(由斯坦福大学的维吉尼亚瓦拉波特博士(Dr.Virginia Walbot)友善捐赠)中的35S启动子驱动的萤火虫(北美萤火虫(Photinus pyralis))荧光素酶基因。通过粒子轰击将来自不同质粒构建体的等量的DNA转化进四周龄烟草(皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia))叶中。在室温下、在黑暗中孵育48小时后，从每个样品萃取总蛋白并且测量GUS和荧光素酶活性。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶底物4-甲基伞形酮基β-D-葡糖苷酸(MUG)的切割确定GUS活性。根据生产厂商的指示，使用荧光素酶测定系统试剂盒(Luciferase Assay System kit)(Cat.#E1500，普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康星州)测量荧光素酶活性。在这一实验中，将空载体用作阴性对照。
如图14B所示，与对照实验相比，OsMYB55将OsGs1；2、GAT1以及GAD3在烟草表皮细胞中的表达活化将近八倍。与实例13的结果结合，这些结果表明OsMYB55直接调节OsGs1；2、OsGAT1以及OsGAD3的表达。
实例15
OsMYB55过表达增强叶谷氨酸和精氨酸含量
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长，直到发芽不久之后(种植后10天)，然后在伴随正常温度条件或高温条件的长日光条件下生长四周。
四周处理周期后，收集组织并冷冻干燥24小时，然后使用0.75mL的100％甲醇萃取三次。每次萃取在70℃下进行持续15分钟。通过将500μL萃取物添加至355μL水和835μL氯仿中使萃取物经受氯仿纯化。离心后，收集上相并冷冻干燥，然后溶解于去离子水中。根据生产厂商的指示，使用L-谷氨酸和精氨酸试剂盒(Megazyme Intl.，布拉伊(Bray)，爱尔兰)确定谷氨酸和精氨酸含量。
谷氨酸是由氮化合物合成的第一氨基酸之一并且可以被转化为其他氨基酸。与当在正常生长条件下生长时过表达OsMYB55的转基因水稻植物具有比野生型水稻植物更高的OsGS1；2转录物水平的发现一致，当在正常生长条件下生长时过表达OsMYB55的转基因水稻植物具有比野生型水稻植物更高的根谷氨酸含量。在正常生长条件下，过表达OsMYB55的转基因水稻植物的叶的谷氨酸含量与野生型水稻植物的叶的谷氨酸含量类似(图15A)。使植物在高温条件下生长增加野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物两者的叶和叶鞘的谷氨酸含量，但是与其野生型对应物相比，在过表达OsMYB55的转基因水稻植物中的增加是显著更高的(图15A)。
植物中的多胺生物合成需要精氨酸，这已经被报道在若干植物发育与胁迫条件中涉及(Alcazar(Alcazar)等人，生物技术快报(BIOTECH.LETT.)28:1867(2006)；程(Cheng)等人，综合植物生物学杂志(J.INTEGRATIVE PLANT BIOL.)51:489(2009))。我们的结果显示当在正常温度条件下生长四周时，过表达OsMYB55的转基因水稻植物的叶具有与野生型水稻植物的叶相同水平的精氨酸(图15C)。使植物在高温条件下生长增加野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物两者的叶的精氨酸含量，但是在过表达OsMYB55的转基因水稻植物中的增加是显著更高的(图15C)。
实例16
OsMYB55过表达增强叶GABA含量
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长，直到发芽不久之后(种植后10天)，然后在伴随正常温度条件或高温条件的长日光条件下生长四周。
收集植物组织并且如由张(Zhang)和鲍恩(Bown)，植物杂志(PLANT J.)44:361(2005)所描述确定GABA含量。简言之，在25℃下，用400μl甲醇萃取0.1g的冷冻组织，持续10分钟。将这些样品真空干燥，并且溶解于1ml的70mM氯化镧中。然后将这些样品振荡15分钟，在13,000x g下离心5分钟，并且将0.8ml的上清液移到第二1.5ml试管中。向其中添加160μl的1M KOH，随后振荡5min，并且如前离心。将所得上清液用于以下描述的分光光度计GABA测定中。
1ml测定包含550μl的样品，150μl 4mM NADP+，200μl0.5M K+焦磷酸盐缓冲液(通过滴加0.15M磷酸以达到pH8.6而制备)，50μl的2单位GABASE/ml以及50μl的20mMα-酮戊二酸。在添加α-酮戊二酸之前在340nm处读取初始的A，并且在60min后读取最终的A。使用A值的差异构建校准图。将商业化GABASE酶制剂溶解于包含12.5％甘油和5mM 2-巯基乙醇的0.1M K-Pi缓冲液(pH 7.2)中。将所得溶液冷冻，直到使用。
在这一研究中，在正常温度条件下，与其野生型对应物相比，我们发现了过表达OsMYB55的转基因水稻植物的叶GABA含量的增加(图15B)。使植物在高温条件下生长增加野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物两者的叶的GABA含量，但是在过表达OsMYB55的转基因水稻植物中的增加是显著更明显的(图15B)。
实例17
OsMYB55过表达增强叶脯氨酸含量
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长，直到发芽不久之后(种植后10天)，然后在伴随正常温度条件或高温条件的长日光条件下生长四周。
收集植物组织并且根据先前由亚伯拉罕等人，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)639:317(2010)报道的方案确定脯氨酸含量。简言之，用500μL3％磺基水杨酸萃取100mg冷冻组织并且将上清液用于脯氨酸定量。向200μL的萃取物中添加200μL的冰乙酸和200μL酸性茚三酮的反应混合物。将该反应在96℃下孵育60分钟并且在冰中终止。在1mL甲苯中从这些样品萃取脯氨酸并且在离心后在520nm处测量上相中的吸光度。使用标准曲线确定脯氨酸浓度并且在鲜重基础上进行计算。
在这一研究中，在正常温度条件下，在野生型水稻植物与过表达OsMYB55的转基因水稻植物之间的脯氨酸含量中未发现显著差异(图15D)。使植物在高温条件下生长增加野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物两者的叶的脯氨酸含量，但是在过表达OsMYB55的转基因水稻植物中的增加是显著更高的(图15D)。
实例18
微阵列杂交及数据分析
将来自野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物的种子种植在500ml盆中。使用1g包含氮、磷和钾(13-13-13)的缓释肥料并且补充有微量营养素，在全营养条件下使植物在生长室(Conviron公司，马尼托巴省，加拿大)中生长。使植物在正常生长条件下生长四周，并且然后暴露于45℃，持续一小时。收获野生型和转基因水稻植物的叶，并且分离总RNA。
从来自每个样品的5μg的总RNA合成双链cDNA。合成自cDNA的标记的互补RNA与水稻全基因组阵列(Cat.No.900601，昂飞公司(Affymetrix,Inc.)，圣克拉拉，加利福尼亚州)杂交。通过基因芯片扫描仪(GeneChip Scanner)3000(昂飞公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)获得阵列的杂交信号并且通过微阵列套件(Microarray Suite)5.0(昂飞公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)进行量化。使用自定义算法，将探针组25个测量值总结为减去整个阵列的平均强度的底部5％的处于一组的所有探针的加权平均值的值。将每个阵列的所有探针组的整体强度进一步缩放至100的靶标强度，以能够直接比较。使用GeneSpring软件(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)分析数据。首先鉴定具有两倍变化的基因，并且然后使用ANOVA来鉴定显著的基因(韦尔奇(Welch)t检验，p值截取值为0.05)。
如图16A-16B所示，在野生型水稻植物和过表达OsMYB55的转基因水稻植物两者中，发现许多基因响应于高生长温度而被上调和/或下调。
实例19
统计分析
使用将错误率设置为α＝0.05的SigmaStat(SPSS公司，芝加哥，伊利诺斯州)进行所有统计分析。使用杜克的真实显著性差异测试(Tukey’sHonestly Significant Difference Test)测试处理之间的显著性差异。
实例20
讨论
我们鉴定了一种MYB转录因子，该转录因子在营养生长阶段过程中增强水稻植物对高温的耐受性。OsMYB55的过表达改进在高温条件下的植物生长和生产力。在高温下生长，如与野生型植物相比，转基因植物维持更高的植物高度和更多干燥生物量。在生命周期的前六周中将野生型植物暴露于高温四周在收获时降低谷物产率。然而，这一减少在转基因植物中是显著更小的。同时，这些结果表明转基因株在高温下比野生型生长和表现更好。尽管OsMYB55过表达对植物热耐受性具有正影响，但是其表达的RNAi敲除与野生型未显示出任何显著差异。这可能归因于在这一基因家族中的高水平的冗余，尽管它可以归因于以下事实:这些系仍具有OsMYB55基因的一些表达(尽管较低)。
为了探索OsMYB55在高温下增强植物生长的作用，已经进行了不同生物化学和分子分析。在高温下生长的野生型和转基因植物的叶、叶鞘以及茎组织的组织学分析未揭示任何显著差异(数据未示出)，从而说明更高的植物高度和叶鞘长度是增强一般植物性能而非影响细胞膨胀或分裂的结果。另外，与野生型植物相比，在转基因植物中淀粉、糖和作为用于抗氧化剂活性的指示剂的过氧化氢的生物化学分析未显示显著变化(数据未示出)。里韦罗(Rivero)等人，植物生物学(Plant Biol.)(Stuttg))＝6:702(2004)说明了含氮化合物和脯氨酸在热耐受性中的重要性。我们研究了在两个不同温度下生长的野生型和转基因植物中的硝酸盐和季铵化合物并且未发现显著差异(数据未示出)。
在本研究中，过表达OsMYB55的植物在总氨基酸含量中具有一个增加。已知在植物对高温的应答中涉及的若干热激转录因子和热激蛋白的转录物分析揭示在野生型与转基因植物之间无显著差异(数据未示出)。全局转录组分析的确鉴定了针对水稻OsMYB55的三个靶标，即OsGS1；2、GAT1以及GAD3。OsMYB55在体外与这些基因的启动子结合并且在烟草叶细胞中将其反式活化。
OsMYB55过表达导致改进的热耐受性并且增强总氨基酸和谷氨酸、脯氨酸、精氨酸(并且特别是GABA)两者的水平。应该指出，虽然在响应于高温的过表达系中脯氨酸含量是增加的，但是在脯氨酸生物合成中涉及的基因的表达无显著差异。这些结果说明脯氨酸含量的增加是间接的并且可以归因于包括如由贝克尔(Becker)和福克(Fock)，光合作用研究(Photosynthesis Res.)8:267(1986)所说明的蛋白质阻断的其他途径。
总之，OsMYB55的过表达导致在营养阶段过程中水稻植物的增加的热耐受性。这导致增加的生物量并且如果随后使这些植物生长在正常条件下，导致增加的种子产率。这一性状将变得越来越重要，因为在许多重要水稻生长区中的作物产量由于考虑到全球变暖的较高温度而降低。因此，探索用于改善这一问题的不同作物遗传解决方案具有重大意义。通过其自身或与其他基因结合调整OsMYB55的表达是一种潜在的解决方案。
以上所述情形是用作说明本发明的，并且不应当解释为本发明的限制。本发明是由以下权利要求书所定义的，这些权利要求的等效物被包括在其中。
在此引用的所有的公开、专利申请、专利、数据库登录号以及在此引述的其他参考文件通过引用以其全文结合在此用于与参考出现于其中的句子和/或段落有关的传授。

Claims (30)

1.一种在转基因植物、植物部分或植物细胞中增加对热胁迫的耐受性的方法，该方法包括向一种植物、植物部分或植物细胞中引入一种或多种编码(i)谷氨酰胺合成酶1；2(GS1；2)、(ii)谷氨酸脱羧酶3(GAD3)、(iii)I类谷氨酰胺酰胺转移酶(GAT1)、或其任何组合的分离的核酸，以产生表达该一种或多种分离的核酸从而产生GS1；2、GAD3、GAT1、或其任何组合的一种转基因植物、植物部分或植物细胞，由此与一种对照物相比在该转基因植物、植物部分或植物细胞中产生对热胁迫的增加的耐受性。
2.如权利要求1所述的方法，其中该一种或多种分离的核酸编码GS1；2、GAD3以及GAT1。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该方法进一步包括向该植物、植物部分或植物细胞中引入一种编码MYB55多肽的分离的核酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该一种或多种分离的核酸被包括在一种或多种表达盒内，该一种或多种表达盒包括与在植物细胞中起作用的一种或多种启动子可操作关联的该一种或多种分离的核酸。
5.如权利要求4所述的方法，其中该一种或多种表达盒包括一种选择标记。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括将该植物、植物部分或植物细胞暴露于热胁迫。
7.如权利要求6所述的方法，其中在生长的营养阶段过程中将该植物、植物部分或植物细胞暴露于热胁迫。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中与一种对照物相比，对热胁迫增加的耐受性产生增加的产率。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该转基因植物、植物部分或植物细胞在其基因组中包括该一种或多种分离的核酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该方法包括：
(a)向一种植物细胞中引入该一种或多种分离的核酸，以产生一种转基因的植物细胞；并且
(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生一种转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包括该一种或多种分离的核酸并且对热胁迫具有增加的耐受性。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该方法包括：
(a)向一种植物细胞中引入该一种或多种分离的核酸，以产生一种转基因的植物细胞；
(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生一种转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包括该一种或多种分离的核酸；并且
(c)从(b)的多个转基因植物中选择对热胁迫具有增加的耐受性的转基因植物。
12.一种在转基因植物、植物部分或植物细胞中增加氨基酸含量的方法，该方法包括向植物、植物部分或植物细胞中引入一种编码MYB55多肽的分离的核酸，以产生一种表达该分离的核酸而产生该MYB55多肽的转基因植物、植物部分或植物细胞，从而与一种对照物相比在该转基因植物、植物部分或植物细胞中产生增加的氨基酸含量。
13.如权利要求12所述的方法，其中在该转基因植物、植物部分或植物细胞中，谷氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、脯氨酸、或其任何组合的含量是增加的。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中该分离的核酸被包括在一种表达盒内，该表达盒包括与一种在植物细胞中起作用的启动子可操作关联的该分离的核酸。
15.如权利要求14所述的方法，其中该表达盒包括一种选择标记。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其中该增加的氨基酸含量存在于该转基因植物或植物部分的叶、叶鞘、根、或其任何组合中或存在于再生自该转基因的植物细胞的转基因植物或植物部分中。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中该转基因植物、植物部分或植物细胞在其基因组中包括该分离的核酸。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其中该方法包括：
(a)向一种植物细胞中引入该分离的核酸，以产生一种转基因的植物细胞；并且
(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生一种转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包括该分离的核酸并且具有增加的氨基酸含量。
19.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其中该方法包括：
(a)向一种植物细胞中引入该分离的核酸，以产生一种转基因的植物细胞；
(b)从(a)的该转基因的植物细胞再生一种转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包括该分离的核酸；并且
(c)从(b)的多个转基因植物中选择具有增加的氨基酸含量的转基因植物。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括获得一种衍生自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包括该分离的核酸并且具有增加的氨基酸含量。
21.如权利要求12-20中任一项所述的方法，其中该分离的核酸包括：
(a)一种编码SEQ ID NO:5-13的任一者的氨基酸序列的核苷酸序列；或
(b)一种编码与SEQ ID NO:5-13的任一者的氨基酸序列至少95％相似的氨基酸序列并且在表达其的转基因植物中提供对热胁迫的增加的耐受性的核苷酸序列。
22.如权利要求12-21中任一项所述的方法，其中该分离的核酸包括一种编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的核苷酸序列。
23.如权利要求12-22中任一项所述的方法，其中该分离的核酸包括一种编码该MYB44多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：
(a)SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14-20的任一者的核苷酸序列；
(b)一种与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14-20的任一者的核苷酸序列至少95％一致并且在表达其的转基因植物中提供对热胁迫的增加的耐受性的核苷酸序列；
(c)一种在严格条件下、在42℃下与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14-20的任一者的核苷酸序列的完整互补体杂交并且在表达其的转基因植物中提供对热胁迫的增加的耐受性的核苷酸序列，该严格条件包括具有5xDenhardt氏溶液、0.5％SDS以及1x SSPE的50％甲酰胺的洗涤严格性；或
(d)一种由于遗传密码的简并性而不同于(a)至(c)的任一者的核苷酸序列的核苷酸序列。
24.如权利要求12-23中任一项所述的方法，其中该核苷酸序列是SEQID NO:4的核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸4062至5126。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中该引入是经由细菌介导的转化、粒子轰击转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、须介导的核酸递送、微注射、声处理、浸润、聚乙二醇介导的转化、或其组合。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中该植物是一种单子叶植物。
27.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中该植物是一种双子叶植物。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中该植物是水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、燕麦、黑麦、甘蔗、大豆或拟南芥属。
29.通过权利要求1-10中任一项所述的方法或当从属于权利要求1-10中任一项时的权利要求25-28中任一项所述的方法产生的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中该转基因植物、植物部分或植物细胞对热胁迫具有增加的耐受性。
30.通过权利要求12-24中任一项所述的方法或当从属于权利要求12-25中任一项时的权利要求25-28中任一项所述的方法产生的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中该转基因植物、植物部分或植物细胞具有增加的氨基酸含量。
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