KR950008571B1 - 할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포 - Google Patents

할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포 Download PDF

Info

Publication number
KR950008571B1
KR950008571B1 KR1019870700813A KR870700813A KR950008571B1 KR 950008571 B1 KR950008571 B1 KR 950008571B1 KR 1019870700813 A KR1019870700813 A KR 1019870700813A KR 870700813 A KR870700813 A KR 870700813A KR 950008571 B1 KR950008571 B1 KR 950008571B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fragment
plasmid
fragments
gene
dna
Prior art date
Application number
KR1019870700813A
Other languages
English (en)
Other versions
KR880701050A (ko
Inventor
데이비드 엠. 스토커
Original Assignee
롱쁠랑 아그로시미
프랑수와 크레띠엥
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 롱쁠랑 아그로시미, 프랑수와 크레띠엥 filed Critical 롱쁠랑 아그로시미
Publication of KR880701050A publication Critical patent/KR880701050A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR950008571B1 publication Critical patent/KR950008571B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포
본 출원과 관련된 문헌
본 출원은 본 명세서에 참고로 기제한 1986년 1월 8일에 출원된 출원번호 제 817,226 호의 일부 계속출원 (C-I-P) 인 1986년3월28일에 출원된 출원번호 제 845,662 호의 일부 계속 출원이다.
발명의 배경
발명의 분야
미생물 및 고등 생물의 세포에 새로운 유전적 가능성을 제공하는 기회는 새로운 가능성의 길을 넓게 열었다. 그 중 한 분야는 그 세포독성 효과 때문에 이용될 수 있는 각종 약품에 관한 것이다. 예를들어, 농업에 이용되는 많은 화합물은 해충, 잡초 등을 죽이도록 되어 있다. 많은 경우에, 이들 화합물은 상당히 긴 잔류시간 또는 장기간에 걸친 잔류물을 가질 수 있다.
많은 상황에서는, 남기고자 하는 종과 죽이고자 하는 종을 구별하여야 한다. 예를들어, 곡물에는 최소한의 역 효과를 주면서 잡초를 선택하여 죽이는 것이 종종 요구된다. 대부분의 경우에, 광범위 스펙트럼의 제초제중 많은 것들은 곡물에 심각한 역효과를 미치기 때문에 그 사용을 우선적으로 발아전 사용 또는 발아후의 조심스러운 사용으로 제한하여야 한다.
따라서, 살아있는 세포로 하여금 세로득소 같은 스트레스에 내성을 갖도록 하는 것은 대단히 흥미로운 일이다.
관련 문헌에 대한 설명
미합중국특허 제 4,535,060 호에는 글리포세이트-민감성 세포에 게 글리포세이트 내성을 부여하는 세균성 aroA 유전자의이용이 개재되어 있다. 슈와 캄퍼[Hsu and Camper, Can. J.Microbiol. (1976).22:537~543]는 토양-강화 배양물로부터 이옥시닐 분해제(degrader)를 분리하는 것을 설명하였다. 슈와 클렘슨[Hsu and Clemson, Dissert. Abstr. Intrn. B36 (1976),8호, 3708]은 제초제 3,5-디할로게노-4-히드록시벤조니트릴계의 미생물학적 분해(degradation)를 설명하였다. 인그람과 풀린[Ingram and Pullin,Pestic. Sci (1974) 5: 287~291]은 세가지 토양형에 브로모크시닐이 존속하는 것을 설명하였다.
스미드[smith. Abstrp. Meeting Weed Soc, Am. (1971), 16~17 페이지]는 레기나 헤비 클레이 (Regina heavy clay) 에서의 브로모크시닐의 분해를 설망하였다.
스미드와 플래쳐[Smith and Fletcher,Hort. Res. (1964), 4:60~62]는 3,5-디할로게노-4-히드록시벤조니트릴 및 토양 미생물을 보고하였다.
본 발명의 요지
니트릴라제, 및 이러한 니트릴라제를 코딩하는 헥산 서열, 및 외래 니트릴라제 유전자를 함유하는 목적 숙주에 의해 인지되는, 조절 유전자의 전사 및 번역 조절조정하에 있는 니트릴라제-코딩 유전자를 함유하는 구조물(construct), 및 이러한 구조물을 함유하는 숙주세포, 그리고 이러한 구조물을 함유하는 생명체 및 생명체 부분 및 생성물이 제공된다. 브로모크시닐 - 및/또는 이소크시닐 - 특이적 니트릴라제는 브로모크시닐 및 그와 관련된 제초제를 함유하는 환경을 해독하고 이러한 제초제의 세포독성 작용으로부터 숙주 세포를 보호하는데 사용된다. 구조물은 구조물을 함유하는 숙주 세포와 이러한 구조물을 함유하지 않은 숙주세포를 구별하는데 사용된다.
본 발명의 목적에 따르면, 할로겐화 히드록시벤조니트릴, 특히 3,5-디브로모-또는 3,5-디요오드-4-히드록시벤조니트릴의 가수분해와 관련하여 신규 DNA 서열, 구조물, 형질 전환된 세포, 식물 및 펩티드가 제공한다. 본 발명은 니트릴을 가수분해 함으로써 니트릴의 제초활성을 해독하고, 제초제에 민감한 세포 또는 숙주를 보호하고 또는 제초제에 오염된 환경을 해독할 수 있는 효소의 제조에 관한 것이다.
본 발명의 구조(structural) 유전자는, 벤조니트릴을 질소원으로 이용할 수 있으며, 통상적으로 벤조니트릴을 전용 질소원으로 이용할 수 있는 단세포 미생물, 특히 세균으로부터 수득할 수 있다. 이후에는, 벤조니트릴 또는 니트릴라제에 있어서, 벤조니트릴은 할로겐호 p-히드록시벤조니트릴, 특히 3,5-디요오드-또는 3,5-디브로모-4-히드록시벤조니트릴을 의미하며, 니트릴라제는 할로겐화 벤조니트릴을 질소원, 특히 전용 질소원으로 사용할 수 있는 니트릴라제를 의미한다.
효소는 다른 방법으로도 얻을 수 있는데, 통상적으,로, 브로모크시닐 또는 이소크시닐을 함유하는 환경에 천역적으로 존재하는 균으로부터 얻을 수 있다. 특히 장내 세균, 보다 상세하게는 클레브시엘라 속에 속하는 것이 바람직하다. 클레브시엘라 뉴모니아에, 특히 변종 오자에나에를 이용할 수 있다. 생명체를 토양으로부터 분리하는 것보다는, 높은 농도의 벤조니트릴 및 감소된 양의 다른 질소원을 함유하는 토양 또는 배지에서 증식시켜 벤조 니트릴을 유일한 질소원으로 이용하여 생존하 수 있게 된 생명체로부터 얻는 것이 바람직하다.
니트릴라제를 함유하는 세균의 공급원에 상관없이, 니트릴라제가 벤조니트릴의 해독에 확실히 효과적일수 있도록 반드시 스크리닝하여야 한다. 덧붙여, 니트릴라제는 할로겐을 포함하지 않거나, 않거나, 다른 치환체를 갖는 벤조니트릴 유사체가 아니라 벤조니트릴 자체에만 특이적이어야 한다. 따라서 본 발명의 니트릴라제는 벤조니특릴에 특이적이며, 유사체에 대해서는 상당히 불활성이거나 또는 실질적으로 덜 활성을 가져야 한다. 바람직하게는, 질소원으로서 비교 농도의 벤조니트릴을 이용하여 균을 중식시켰을때 그 증식 속도가 암모니아 등의 통사의 질소원의 존재하에 증식시켰을때 보다 현저하게, 즉 약 10% 이상 감소하지 않아야 한다. 이러한 결과를 비특이적 벤조니트릴로는 관찰되지 않는다.
일단 하나 또는 그 이상의 균주가 확인되기만 하면, 니트릴라제의 코딩 서열을 확인하기 위한 기술을 적용시킬 수 있다. 유전자는 염색체 또는 플라스미드에 존재할 수 있다. 게놈(genome)은 특히 제한 엔도누 클레아제를 이용하여 단편화할 수 있으며, 하나 또는 여러 엔도누클레아제를 적용시켜 약 5Kb~50Kb의 단편을 제공할 수 있다. 단편은 편리한 세균, 편리한 세균, 예를들어 이. 콜리. 내에서 적절한 벡터상에서 클로닝할 수 있으며, 생성된 형질 전환체는 니트릴라제 활성에 대해 스크리닝하는데, 이때 숙주 생명체는 음성 배경을 나타낸다.
하나 또는 그 이상의 클론이 니트릴라제 활성을 갖는 것으로 확인되면, 공지의 기술, 예를들어 숙주의 분해, DNA의 침전 및 벡터 DNA, 플라스미드 또는 비루스 DNA의 분리법 등에 의해 염색체 DNA로부터 목적 DNA 단편, 플라스미드 또는 비루스를 함유하는 염색체의 요소를 분리할 수 있다. 그 다음에 제한 엔도누클레아제를 이용하여 염색체의 요소를 절단하고, 크기가 다른 단편을 분리 및 확인하는 각종 기술, 예를들어 전기영동, 밀도구배 원심분리 등에 의해 목적 단편을 분리한다.
단편의 크기에 따라, 유전자 및 그 측면의 조절 구역의 크기에 보다 가깝도록 그 크기를 축소시킬 수 있다. 효소를 코딩하는 서열 및 그 측면의 조절 서열을 함유하는 단편을 조작하는 각종 기술이 존재한다. 서로 다른 반응 혼합물내에서 서로 다른 제한 효소로 부분 절단한후 단편을 클로닝함으로써 어떤 단편이 니트릴라제를 형질 발현시킬 수 있는 능력을 계속 갖고 있는가를 결정한다.
한편, 효소를 분리하고 부분적으로 시퀀싱할 수 있다. 아미노산 서열을 기초로 하여, 유전자를 갖는 단편을 확인하는데 사용할 수 있는 탐침을 제조할 수 있다. 이러한 접근과 제한효소 절단을 결합함으로써, 단편을 클로닝하고 목적 유전자의 존재를 스크리닝할 수 있다. 덧붙여 Ba131 같은 엑소누클레아제를 이용하여 단편의 한 말단 또는 양 말단으로부터 누클레오티드를 제거함으로서 여분의 뉴클레오티드의 수를 감소시킬 수 있다.
한편, 유전자는 적절한 숙주내에서 클로닝할 수 있고, 적절한 시험관내 또는 생체내 번역계((예. 크세노푸스 오오시테스 또는 망상 적혈구 분해물 등)내에서 확인함으로써 탐침에 의하 스크리닝으로 전달(messenger) RNA를 분리할 수 있다. 분리된 전달 RNA는 역 전사효소 및 DNA 폴리머라제에 의한 상보사슬의 형성을 포함하는 공지의 기술에 이용된 cDNA를 제조하는데 이용할 수 있다. 이런 경우에, 생성된 구조 유전자에는 전사와 관련된 조절 구역이 존재하지 않는다.
니트릴라제를 형질 발현시키는 구조 유전자를 함유하는 DNA 서열은 적절한 숙주 세포에 도입시키기 위해서 각종 다른 DNA 서열과 결합시킬수 있다. 그러한 서열은 숙주의 특성, 숙주에 도입되는 DNA 서열의 도입방법 및 에피솜(episome)의 유지 또는 통합이 요구되는가 또는 그렇지 않은가에 따라 결정된다.
원핵 숙주의 경우에, DNA 서열의 형질 전환, 접합, 형질 도입 또는 트랜스펙션(transfection)에 의해 숙주에 도입시키는데 이용할 수 있는 각종 벡터가 존재한다. DNA 서열은 pBR322,pACYC184, pMB9,pRK290 등의 각종 플라스미드 : pVK100 등의 코스미드 : 또는 p22 등의 비루스를 포함한다.
진핵 숙주의 경우에, DNA를 도입시키기 위하여, 비복제 DNA 서열, 플라스미드 또는 소형 염색체를 포함하는 Ca++-침전 DNA에 의한 형질전환, 아그로박테리움 내에서의 T-DNA 함유 서열에 의한 형질전환, 미량피펫을 이용한 미량수자 또는 일렉트로포레이션(electroporation) 등의 각종 기술을 이용할 수 있다. 수용능력이 있는 복제계가 DNA 구조물내에 있는가 없는가에 따라, DNA가 에피솜 요소처럼 복제될 수 있는가 또는 DNA를 숙주에서 통합시켜야 하는 가를 결정하고 숙주에서 구조 유전자를 발현시킨다. 숙주에 치명적이지 않으며 구조 유전자가 존재하는 에피솜, 예를들어 종양 유발 플라스미드(예, Ti 또는 Ri)또는 그의 단편, 비루스(예, CaMV, TMV) 또는 그의 단편을 구조 유전자가 형질 발현될 수 있는 방법으로 이용할 수 있다. 특히, 복제 기능을 가지며, 종양성 또는 독성(virulence 등의 다른 기능을 갖지 않는 단편이 바람직하다.
니트릴라제 원으로부터 수득한 단편은 적절한 클로닝 벡터를 이용하여 클로닝할 수 있다. 클로닝은 적절한 단세포 생물, 예를들어 이. 콜리. 등의 세균내에서 실시할 수 있다. 바람직하게는, 부분 또는 완전 소화에 의해 목적하는 크기를 단편이 제공되는 코스미드를 사용할 수 있다. 예를들어, 적절한 제한 효소를 이용하여 코스미드 pVK100을 부분 소화시키고, 이를 플라스미드, 염색체 또는 그 단편의 부분 또는 완전 소화에 의해 생성된 단편에 결찰시킬 수 있다. 패키징(packaging)에 의해 원하는 크기를 갖는 단편만이 팩킹되고 숙주 생물내에 형질 도입되는 것을 확인할 수 있다.
숙주 생물은 벤조니트릴 내성인 것으로 선택할 수 있다. 수용(recipient) 균주를 변화시켜 형질 도입체의 선택을 가능케하는 적절한 유전 특성을 갖도록 할 수 있다. 미생물에서, 형질 도입체는 필요에 따라 이동 플라스미드를 이용하여 다른 미생물에 접합시키는데 이용할 수 있다. 니트릴라제의 구조 유전자를 함유하는 단편의 크기를 더 감소시키기 위하여 각종 기술을 사용할 수 있다. 예를들어, 코스미드 벡터를 분리하고, 각종 제한 엔도누클레아제(예. EcoR I, BalII, Sma I 등)를 이용하여 절단하고, 생성된 단편을 적절한 단편, 편리하게는 이미 사용한 바 있는 코스미드 벡터에 클로닝할 수 있다. 코스미드 벡터 대신에, pACYC177 및 pACYC184 같이 작은 크기를 갖는 각종 클로닝 벡터를 사용할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 약 5Kb 이하, 통상적으로는 약 4Kb 이하, 보다 바람직하게는 약 2Kb 이하의 단편을 클로닝하여 벤조니트릴 내성을 부여할 수 있다.
바람직하게는, 단편은 약 1Kb이며 약 5Kb이하이고, 바람직하게는 약 4Kb 이하이고 특히 최소한 약 1047bp이며, 보다 특별하게는 최소한 약 1100bp, 바람직하게는 약 1.5KB 이하의 측면 구역을 포함한다.
특히 클레브시엘라 오자에나에로부터 얻은 BalII-Sma I 단편, 보다 특별하게는 약 1210bp의 Pst I-Hinc II 단편이 바람직하다.
니트릴라제 효소는 공지의 공급원, 즉 세균, 효모, 사상(
Figure kpo00001
狀) 곰팡일, 식물 세포를 포함한 원핵 또는 진핵 공급원에 의해 형질 발현될 수 있다. 분비물이 얻어지지 않는 경우에는 세포를 분해하여 효소를 분리하고 공지의 방법에 따라 니트릴라제는 분리할 수 있다. 그 방법으로는 크로마토그래피, 전기영동, 친화력 크로마토그래피등이 포함된다.
편리하게는, 브로모크시닐을 적절한 작용기(예, 카르복실가)를 통하여 불용성 지지체에 접합시켜 니트릴라제 분리용 펙킹으로 사용할 수 있다.
니트릴라제 비활성은 하퍼[Harper, Biochem. J. (1977) 167 : 685~692]에 의해 기술된 조건하에서 최소한 약 0.1μmol 암모니아/분/mg 단백질, 일반적으로 최소한 약 0.5 또는 그 이상이다.
정제된 효소는 각종 방법에 사용될 수 있다. 브로모크시닐, 이소크시닐 또는 기타 관련된 벤조니트릴의 분석에 직접 사용할 수 있다. 한편 당해 효소는 목적 분석물(예, 합텐 또는 항원) 또는 항체 등에 접합된 상태로 미합중국특허 제 3,654,090 호 ; 제 3,817,837 호 ; 및 3,850,752 호에 기술된 분석과 같은 진단 분석의 표지의 사용될 수도 있다. 분석물의 농도 결정법 뿐만 아니라 접합법도 상기 특허에 상세히 설명되어 있으며, 본 명세서에 그 문헌의 적절한 부분을 참고로 삽입하였다.
니트릴라제를 코딩하는 DNA 서열은 각종 방법에 사용할 수 있다. DNA 서열은 야생형 또는 변이된 니트릴라제를 분리하는 탐침으로 이용될 수 있다. 또한 DNA 서열은 제조합에 의해 숙주에 통합되어 숙주에 벤조니트릴 내성을 부여한다.
식물 세포에 있어서는, 구조물의 일부인 구조 유전자를 미량 피펫 주사법에 의해 식물 세포 핵에 도입함으로서 제조합에 의해 숙주 게놈에 통합시킬 수 있다. 또한 구조 유전자를 식물 숙주에 도입시키기 위한 방법으로서 일렉트로포레이션법을 이용할 수 있다. 구조 유전자가 식물 숙주에 의해 인지되지 않는 조절 시그널을 갖는 공급원으로부터 얻어진 경우에는, 형질 발현을 위해 적절한 조절시그널을 도입하는 것이 필요할 수 있다. 비루스 또는 플라스미드, 예를들어 종양 유발 플라스미드는 사용하고 맵핑(mapping)한 경우에는 프로모터로부터 하류에 있고, 프로모터로부터 적절한 거리에 떨어져 있는 위치에 구조 유전자를 삽입할 수 있는 제한 부위(restriction site)를 선택할 수 있다. DNA 서열에 적절한 제한위치가 없는 경우에는 Ba131과 같은 엑소누클레아제로 여러번 소화시키고 합성 제한 엔노누클레아제 부위(링커)를 삽입할 수 있다.
니트릴라제 유전자를 식물세포 염색체에 통합시킬 수 있는 경우에는 암-유발 플라스미드, 특히 Ti 또는 Ri를 이용하는 것이 바람직하다. Ti-플라스미드 및 Ri-플라스미드의 사용법은 PCT 공고 WO84/02913호, 02919 호 및 02920 호, 그리고 EPO 출원 0116718 호, 그리고 문헌[Matzke and Chilton J. Mol. App. Genetics (1981) 1 :39~49]에 설명되어 있다.
가장자리(border)가, 식물 숙주에 의해 인지되는 전사 및 번역의 개시 및 종료 조절시그널 아래에 니트릴라제 구조 유전자를 함유하는 형질 발현 카세트와 접합 경우에는 T-DNA 오른쪽 가장자리 또는 양쪽가장자리를 모두 이용함으로써 형질 발현 카세트를 식물 게놈에 통합시키고 식물 세포내에소 각종 분화단계에서 니트릴라제 효소를 형질발현시킬 수 있다.
식물 세포내에서 형질 전환시키기 위하여 각종 구조물을 제조할 수 있다. 구조물은 식물 숙주내에서 니트릴라제를 발현시키기 위하여 식물내에서 기능을 나타내는 형질발현 카세트를 제공한다.
전사를 위하여 조직적인 또는 유도성인 각종 전자개시 구역(프로모터구역)을 사용할 수 있다.
번역되지 않은 5'-구역에 ATG가 없다면 전사 개시구역을 니트릴라제-코딩 구조 유전자에 결합시킴으로써 개시코돈으로부터 상류에, 즉 개시 코돈으로부터 약 200 염기이내에 전사 개시 구역을 제공한다.
구조 유전자의 3'-말단은 식물 숙주내에서 기능을 갖는 전사 종료 구역에 결합하게될 하가 또는 그 이상의 정지 코돈을 갖게 되는데, 그 종료 규역은 개시 구역으로서 동일하거나 서로다른 구조 유전자와 결합할 수 있다.
형질발현 카세트는 전사방향으로 개시구역, 개시구역의 전사 조절하에 있는 구조 유전자, 및 전사의 종료와 전달 RNA의 프로세싱을 담당하는 종료구역을 적절히 갖는 특징을 갖는다.
전사 및 번역 조절 구역으로는 오파인(opine) 프로모터 및 테미네이터 구여을 사용할 수 있는데, 니트릴라제 유전자의 조직적이 형질 발현을 가능하게 한다. 또한 다른 프로모터 및 /또는 터미네이터, 특히 식물숙주내에서 유도성 형질 발현 및 조절된 형질 발현을 위한 프로모터를 사용할수 있다. Ti-플라스미드로 부터 얻는 사용 가능한 프로모터 구역으로는 옥토핀 신타제(synthase) 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터,아그로핀 신타제 프로모터, 만노핀 신타제 프로모터 등의 오파인 프로모터가 포함된다. 기타 프로모터로는, CaMV 레젼(Region)VI 프로모터 또는 풀 랭쓰(full length)(355) 프로모터등의 비루스 프로모터, 리불로스-1,5-비스포스패이트 카르복실레이트 유전자와 결합된 프로모터(예, 작은 서브유니트, 파세올린, 단백질 보존, B-콩글리시닌, 셀룰로스 형성등과 관련된 유전자)가 포함된다.
각종 서열은 공지의 방법으로 함께 결합시킬 수 있다. 프로모터 구역은 구조 유전자,예를들면 오파인 유전자로부터 5'인 구역 및 제한 맵핑 및 시퀀싱에 의해 확인하고 선택하고 분리할 수 있다. 비슷하게, 터미네이터 구역은 구조 유전자로부터 3'구역으로서 분리할수 있다. 서열을 클로닝하고 적절한 방향으로 결합시켜 식물 숙주내에 니트릴라제 유전자가 조직적으로 형질 발현되게 한다.
니트릴라제 효소를 형질 발현하는 작용성 유저나를 도입시켜 농작물 세포를 변화시킴으로써, 각종 농작물에는 거의 영향을 미치지 않으면서 실직적으로 거의 또는 완전하게 잡초를 제거할 수 있는 농도의 브로모크시닐, 이소크시닐 또는 유사체 제조체를 사용할수 있다.
니트릴라제 효소를 발현시키는 형질 발현 카세트는 옥수수, 밀, 콩, 담배, 목화, 토마토, 감자, 브라시카속, 벼, 땅콩, 페튜니아, 해바라기, 사탕무우, 잔디 등을 포함하는 각종 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물에 도입시킬수 있다. 유전자는 세포 또는 칼루스, 조직, 뿌리, 괴경, 프로파귤, 묘목, 씨았, 잎, 묘종, 꽃가루등의 부이에 존재할 수 있다.
벤조니트릴-내성식물을 제공함으로써, 농작물 성장을 증강하고 영양분에 대한 경쟁을 감소시키기 위하여 농작물을 잡초로부터 보호하는데 각종 제제를 사용할 수 있다. 예를들어, 해바라기, 콩, 옥수수, 목화같은 안전 작물의 접초를 발아후 조절하기 위하여 브로모크시닐을 그대로 사용하거나 또는 다른 생성물과 배합한제제 형태로 사용할 수 있다.
다른 제초제는 약 0.1~4lb/에이커의 유효성분의 양을 사용하여야 하지만, 약 0.1~ 4lb/ 에이커, 바람직하게는 0.2~2lb/ 에이커의 브로모크시닐을 포함하는 제제의 형태로 통상적인 양의 살충제를 밭에 살포한다.
제제는 세정제, 보조제, 확산제, 부착제, 안정제 등의 다른 첨가제를 함유한다. 제제는 이 분야에서 알려진대로, 유동성 분말, 유화농축액 및 액체 농축액 등을 포함하는 습식 또는 건식 제제일수 있다.
제초용액은 공지 방법에 따라, 예를들어 분무, 관주 또는 살포등을 통하여 이용할수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하는데 본 발명이 거기에 제한되는 것은 아니다.
실험
재료 및 방법
제한효소 및 결찰용 T4 리가제는 제작자의 권고에 따라 사용하였다. 문헌[Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]에 따라 클로닝 및 분자 분석을 실시하였다. 문헌[Ish-Horowitz et al., Nucl. Acids Res. (1981) 9:2989~2998]에 따라 클론 분석을 실시하였다.
모든 클로닝 실험에서 이. 콜리. 균주 MM294를 사용하였다.(Hanahan, Mol. Biol. (1983) 166:557-80).
항생제를 사용한 경우, 그 농도는 Cm(클로람페니콜) 25μg/ml: Tc(테트라사이클린) 10μg/ml: Ap/(페니실린) 300μg/ml 이었다.
이, 콜리 내에서의 플라스미드 DNA의 형질 전환은 만델 및 히가의 방법[Mandel and Higa, J. Mol. Biol. (1970) 53:159~162]에 따라 수행하였다.
브로모크시닐 오염 토양 시료로부터 세균 분리물을 분리하고 스크리닝하였다. 이러한 생명체중 하나는 클레브시엘라 뉴모니아에 아종 오자에나에로 확인되었다. 상기 생물체로부터 수득한 브롬호크시닐 특이적 니트릴라제를 부분 정제 및 특성지적하여 약 34kDal 분자량을 갖는 유효 효소를 수득하였다.
고체 L-한천위에 케이. 오자에나에를 반복 개대배양함으로써, 바넷 및 잉그라함[Barnet and Ingraham, J.Appl. Bactreriol. (1975) 18: 131~143]이 설명한 대로 1l당 KH2PO4(1.5g), K2HPO4(3.5g), MgSO4.7H2O(0.1g), 효모 추출액(50mg), 0.1%의 시트레이트, 글리세롤 및 숙시네이트 및 미량원소를 포함하는 한정 액체배지에서 배양했을때 더이상 단독 질소원으로서 브로모크시닐을 이용할 수 없는 변종을 분리하였다. 상기 배지는 이후에 YETE 멀티-탄소 배지로 표시한다. 상기 생명체는 브로모크시닐을 단독 질소원으로서 이용할 수 없긴 하지만, 0.05% 브로모크시닐을 함유하는 L-브로쓰에서 충분한 밀도로 자란다. 케이. 오자에나에 빈종 콜로니를 선택하여 10ml의 L-브로쓰에서 배양하였다. 브로모크시닐을 함유하는 LB 판으로부터 세개의 독자적인 케이. 오자에나에 콜로니를 선택하여 동일한 조건하에서 배양하였다. 이들과 동일한 네개의 케이. 오자에나에 콜로니를 0.05% 브로모크시릴을 보강한 L-브로쓰(10ml)에서 동시에 배양하였다. 배양물을 30℃에서 충분한 밀도로 증식시키고 이시-호로비츠 등의 방법[ish-Horowitz et al., Nucl. Acids Res, (1981) 9:2989]에 따라 각 배양물로부터 소형-표본 플라스미드 DNA를 제조하였다. 소화되지 않은 플라스미드 DNA를 0.5% 아가로스겔에서 전기영동하고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 플라스미드 밴드를 가시화하였다.
케이. 오자에나에 변종은 브로모크시닐 존재하 또는 부재하에 증식시켰을때 단일 플라스미드 종(68Kb의크기)을 나타내었다. 세개의 케이. 오자에나에 콜로니는 0.05% 브로모크시닐 존재하에 증식시켰을때 보다 큰 플라스미드 종(90Kb)을 나타내엇다. 브로모크시닐의 부재하에서는, 세가지 케이. 오자에나에 콜로니중 두개에 두 플라스미드 형태 모두가 존재하였다. 이 데이타는 브로모크시닐 선택을 경감시키면 약 22Kb 의 플라스미드 DNA 가 손실되면서 큰 플라스미드 종이 작은 플라스미드 형태로 전환됨을 시사한다.
네개의 모든 콜로니를 0.05% 브로모크시닐-함유 L-브로쓰(200ml)에서 증식시켰다. 프렌치 프레스로 세포를 파쇄하고, 고속 상충액을 0.05M KPO4(pH7.5) ; 2.5mM 디티오트레이톨(DTT) 함유 완충액에 대해 투석하고 개객의 조 추출액에 대하여 브로모크시닐 특이적 니트릴라제 활성을 분석하였다. 다른 케이. 오자에나에 조 추출물은 각각 0.124, 0.105 및 0.143μmole NH3/분/mg 단백질의 니트릴라제 빈활성을 갖는 반면 케이. 오자에나에 변종으로부터 제조한 조 추출물에서 니트릴라제 활성이 검출되지 않았다. 0.1%글루코스 및 0.04% 브로모크시닐을 함유하는 M9 배지[Miller (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory]내에서 세포(200ml)를 30℃에서 중간 로그기까지 증식시켰다.
세포 파쇄, 초원심분리 및 0.05M KPO4(pH7.5)및 2.5mM DTT-함유 완충액내에서의 상충액 투석에 의해 조 추출물을 제조하였다. 모든 분석에서 기질 농도는 3mM 브로모크시닐이었다. 하퍼의 방법[Harper, Biochem.J. (1977) 167: 685~692]에 따라 NH3의 방출을 모니터하였다. 브로모크시닐-함유 L-배지에서 증식할 수 있는 케이. 오자에나에 변종의 능력은 생명체가 화합물에 대하여 불투과성을 갖도록 한다. 그러나, 브로모크시닐은 단독 질소원으로 사용하는 한정 배지에서는 증식하지 못한다.
결론적으로, 케이. 오자에나에 니트릴라제는 플라스미드에 코딩된 것으로 밝혀졌다. 효소를 코딩하는 유전자(들)은, 브로모크시닐 선택을 실시하지 않을때에, 케이. 오자에나에 플라스미드로부터 자발적으로 손실되는 22Kb 플라스미드 DNA 부위에 존재하는 것을 밝혀졌다. 케이 오자에나에 브로크시닐 특이적 니트릴라제를 이. 콜리 내에서 형질 발현시킨다.
0.05% 브로모크시닐 선택하에서 생장시킨 케이. 오자에나에로부터 플라스미드 DNA를 제조하고 DNA를 이. 콜리 균주 MM294(thi. gyrA96, endI -,hsdR17) 내로 형질 전환시켰다. 단독 질소원으로서 0.05% 브로모크시닐을 가한 질소 결핍(N-) 고체 아가로스 최소 배지[1ℓ당 KH2PO4(1.5g), K2HPO4(3.5g), MgSO4.7H2O(0.1g) 및 0.1% 글루코스 함유]에서 형질 전환체를 선택하였다. 5일간 배양한후에, 선택판에 10콜로니가 나타났다. 이들 콜로니를 0.05% 브로모크시닐-함유 L-한천 배지위에 다시 화선(streak)배양하고 MM264내에서 티아민 영양요구성 표식자가 존재하는지를 시험하였다. 티아민 부재시에 어떤 콜로니도 최소배지에서 증식하지 못했다는 것은 그 균주가 이 콜리 MM294임을 시사하는 것이다. 모든 콜로니는 티아민 및 단독 질소원인 0.05% 브로모크시닐을 보강한 M9 배지내에서 증식할수 있었다. 브로모크시닐이 존재하지 않는 배지내에서는 증식하지 않았다. 더 분석하기 위하여 두 콜로니를 선택하였다. 90Kb플라스미드를 포함하는 이. 콜리 MM294의 조 추출제제의 브로모코시닐 특이적 니트릴라제 활성을 분석한 결과, 그 비활성은 0.215μmole NH3방출/분/mg 이었다. 보다 작은 플라스미드를 함유하는 이. 콜리MM294에서는 니트릴라제 활성이 검출되지 않았다. 이. 콜리 내의 작은 플라스미드(68Kb)를 pBrx1△라 명명하는 한편, 큰 90Kb 플라스미드는 pBrx1으로 명명하였다.
플라스미드 pBrx1-함유 이.콜리 균주 MM294가 브로모크시닐 특이적 니트릴라제 반응의 결과로서 적절한 대사물을 생산한다는 것을 확인하기 위하여,0.05% 브로모크시닐을 보강한 M9 배지내에서 MM294(pBrx1)의 배양물 2ml를 30℃에서 24시간 동안 증식시켰다. 배양물 여액 시료를 C18HPLC에서 크로마토그래피하였다. 배양물내의 모든 첨가된 브로모크시닐은 새로운 대사물 피크로 전환되었다. 스펙트럼분석에 따르면 대사물 피크가 3',5'-디브로모-4-히드록시벤조산(DBHB)인 것으로 확인되었다. 따라서,이 콜리내에서 형질 발현된 니트릴라제-코팅 브로모크시닐 특이적 플라스미의 생성물은 케이. 오자에나에에서 관찰되는 것과 동일하다. 브로모크시닐 특이적 니트릴제 유전자를 이. 콜리내에서 클로닝시킨다. 브로모크시닐 특이적 효소를 코딩하는 DNA부분을 이 콜리내에서 클로닝할 수 있는지 또는 없는지를 결정하기 위하여, 플라스미드 pBrx1을 BamH I 으로 소화시켜 각각 53Kb와 37Kb의 두 밴드를 생성시켰다. BamH I 단편을, 이. 콜리 플라스미드 벡터 pACYC184[Chang and Cohen, J. Bacteriol. (1978) 134 : 1141]의 BamH I 부위에 결착시키고, 이. 콜리 균주 MM294에 형징 전환시킨다. pACYC184의 BamH I 부위에 클로닝시키면 테트라사이클린내성 유전자가 삽입성 불활성화(insertional inactivation)된다. 클로람페니콜 내성, 테트라사이클린 민감성 MM294 콜로니 열개를 선택하고, 소형-표본 클론 분석 DNA를 제조하고, DNA를 BamH I으로 소화시켰다. 한개의 클론이 pBrx1의 큰 53Kb DNA 단편을 함유하는 한편 네개의 클로는 37Kb BamH I 단편을 포함하였다. 다섯개의 클론은 pBrx1으로부터 22Kb의 플라스미드 DNA가 자발적으로 삭제되면서 생성되는 DNA 부위에 해당하는 플라스미드 pBrx1Δ에서도 발견되는 클로닝된 BamH I 단편을 함유하였다. 10클론 모두를 20μg/ml의 클로람페닐콜 존재하에 20ml L-브로쓰에서 증식시켜 플라스미드를 선택하고, 조추출 제제를 수득하고 브로모크시닐 특이적 니트릴라제 활성을 분석하였다. 37Kb BamH I 단면을 포함하는 네 클론이 0.140μmole NH3방출/분/mg 단백질 범위의 니트릴라제 비활성을 나타내는 반면 다른 여섯클론에서는 니트릴라제 활성이 검출되지 않았다. 이 데이타는 브로모크시닐 특이적 니트릴라제 활성을 코딩하는 유전자가 플라스미드 pBrx1으로부터 클로닝된 37Kb BamH II 단편의 위치하고 있으며, 브로모크시닐 선택의 부재시에 자발적으로 상실되는 22Kb DNA 부위가 37Kb BamH I 단편의 내부에 있음을 시사하는 것이다.
벡터 pACYC184에 대한 BamH I 단편의 정위를 확인하기 위하여, 상기 네 클론의 DNA를 EcoR I 소화시키고, 0.07% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 플라스미드 pBrx1 및 pBrx1△의 배합 EcoR I 소화 도 분석하였다.
벡터 pACYC184에 대한 37Kb Bal II 단편의 두 정위를 모두 정의하고 각각 플라스미드 pBrx2및 pBrx3로 명명하였다. 세개의 EcoR I 단편이 플라스미드 pBrx2 및 pBrx3로부터 자발적으로 삭제된 22Kb DNA 부위의 내부에 있는 것이 관찰된다.
이 세 EcoR I 단편의 크기는 각각 18Kb, 3Kb 및 1.9Kb 이다. 브로모크시닐 특이적 니트릴라제를 코딩하는 유전자는, 니트릴라제 구조 유전자가 EcoR I 제한 부위에 의해 양분되지 않는다면, 상기 EcoR I 세 단편중 하나안에 위치 하여야만 한다.
이. 콜리(pBrx3)의 브로모크시닐 특이적 니트릴라제의 위치를 조사하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
[표 1]
Figure kpo00002
a. 플라스미드 pBrx3를 함유하는 이. 콜리(MM294) 세포를 표에 지시한 베지(5ml 배양물) 내에서 37℃에서 정체기까지 증식시켰다. 배양물은 20μg/ml 의 클로람페니콜 및 (지시된 경우에) 0.04 %의 브르모크시닐(Brx1)을 함유한다. 각 배양물로부터 1ml를 취하여 니트릴라제 완충액(0.1M KPO4, pH7.5)으로 1회 세척하고, 세포를 동일항 완충액 0.1ml에 재현탁시켰다. 하퍼[Harper, Biochem.j. (1977) 167; 685 ~692]에 따라. 3mM의 브로모크시닐을 기질로 이용하여 또는 브로모크시닐 없이 50μl의 시료의 니트릴라제 활성을 분석하였다.
b. μmole NH3/분/mg 단백질은 1.4 0. D0600=109세포/ml=150μg 으로 결정하였다.
이들 데이타는 니트릴라제 효소의 세포 위치가 페리플라즘 간극임음 시사하는 것이다. 두번째 관찰은, 효소가 배진에 브로모크시닐이 없을때 발현된다는 것은 효소 발현에 브로모크시닐 유도가 필요하지 않다는 것을 제시한다는 점이다.
케이. 오자에나에 니트릴라제를 더 정제하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
[표 2]
Figure kpo00003
a. 세포를 0.04% 브로모크시닐 및 글루코스-함유 M9배지내에서 30℃에서 중간로그기까지 증식시켰다. 세포를 파쇄 및 초원심 분리하고 0.05M KPO4(pH7.5) 및 2.5mM DTT를 함유하는 완충액에서 투석하여 조 추출물을 제조하였다. 모든 니트릴라제 분석에서의 기질 농도는 3mM 이었다.
b. μmole NH3/분/ng.
2.5cm2×10cm 컬럼 0.05M KPO4(pH7.5), 2.5mM DTT 및 1mM EDTA-함유 완충액으로 평형화하였다. 시료를 공급하고, 상기 컬럼 완충액 300ml를 이용하여 0.02M ~0.40M NaCl의 직선 균배로 컬럼을 전개시켰다. 균배전개의 마지막에 1M NaCl-함유 완충액을 공급하였다. 5ml 분획을 수집하고, 0.075ml씩의 분획을 하나씩 걸러 니트릴라제 활성에 대하여 분석하였다. 효소 활성의 단일 피크는 0.22M 염에서 용출되었다. 공급된 니트릴라제 활성중에서 약 75%가 유효 분획에서 회수되었다.
DEAE 컬럼으로부터 얻은, 니트릴라제 피크를 나타내는 분힉을 0.02M KPO4(pH 7.5)에 대하여 투석하고, 50μl(6μg 단백질)씩의 각 분획은 11.25% 변성 라엠리겔에 공급하였다. DEAE 컬럼의 유효 피크에 해당하는 강화 단백질 밴드는 분자량 34,000의 폴리펩티드이다. 다른 폴리펩티드는 컬럼의 유효 분획에 의해 강화되지 않았다. 이 데이타는 브로모크시닐 특이적 니트릴라제가 약 34,000의 분자량을 갖는 폴리펩티드이며 아마도 단일 유전자의 생성물일거라는 것을 저지한다.
물론 pBrx2를 EcoR I으로 완전 소화시키고 약 19Kb 단편을 분리하였다. 단편을 EcoR I-소화 pACYC184 벡타(3.9Kb)에 삽입하여 플라스미드 pBrx5를 수득하고 상술한대로 이. 콜리 내에 형질 전환시켰다. 공지의 방법으로 플라스미드를 분리하고 BalII 로 소화시켜 pACYC184 벡터내에 삽입된 채로 남아있는 약 6.7Kb의 단편을 수득하였다. 분리된 플라스미드 pBrx7을 Sma I 및 Bal II로 소화시켜 약 3.9Kb의 단편을 수득하고 이를 Sma I-BamH I 소화 pACYC177(3.7Kb)[Chang and Cohen, J. Bacteriol. (1978) 134 : 1141~1156]에 삽입시켰다. 페니실린 내성을 갖는 생성된 플라스미드를 상술한 대로 이. 콜리 내에 형질 전환시키고, 페니실린 선택 배지위에 형질 전환체를 선택함으로서 3.9Kb 단편에 니트릴라제 유전자를 갖는 플라스미드 pBrx8을 수득하였다.
pBrx8을 Pst I 으로 부분 소화시키고, 단편을 Pst I 소화 pUC18[Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103~119]에 삽입시켰다. 생성된 플라스미드를 이. 콜리 내에서 클로닝하고 니트릴라제 활성을 스크리닝하였다. 5.3Kb 플라스미드 pBrx9를 갖는한 클론을 분리하고 Pst I 및 Hinc II로 더 소화시킴으로써 Pst I 에서 Hinc II의 방향으로 Cla I, Sal II, Sca I 및 Sph I 제한 부위를 상당히 고른 간격으로 함유하는 1210bp 단편을 생성시켰다. 생거 등의 방법[Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463~5468]에 따라 Pst I - Hinc II 단편을 시퀸싱하였다. 그로부터 얻은 서열과 그에 코딩된 적절한 아미노산을 다음에 나타내었다.
Figure kpo00004
Figure kpo00005
실질적으로 5'- 및 3'- 비코딩 측면 구역을 함유하지 않는 Pst I-Hinc II 단편을 EcoR I 링커와 결합시키고, EcoR I 으로 소화시키면, pCGN451의 EcoR I 부위에 삽입함으로써 식물 형질 발현 카세트에 도입시킬 수 있다.
pCGN451은 EcoR I 링커를 통하여 유전자의 3'-말단과 융합된 5'-비코딩 구역의 약 1,566bp 및 3'-비코딩 DNA의 약 1,349bp를 함유하는 옥토핀 카세트를 포함한다. pTi 코오디네이트는 바커 등[Barker et al., plant Molecular Biology (1983) 2:335]에 의해 정의된 바에 따르면 3'-구역에서는 11,027~12,823이고, 5'-구역에서는 13,643~15,208이다. 5' 단편은 다음과 같은 방법으로 얻었다 : BamH I -EcoR I 단편같이, 코딩 구역의 5'-말단을 함유하는 조그만 서브클로닝된 단편을 플라스미드 pCGN407같은 pBR322322에 클로닝 시켰다. pBR322가 두개의 Xmn I 부위를 갖는 반면에 BamH I-EcoR I 단편은 코딩 구역에 한개의 Xmn I 부위를 갖는다. pCGN407을 Xmn I로 소화시키고, Ba131 누클레아제와 반응시키고 EcoR I 링커를 단편에 가하였다. EcoR I 및 BamH I 소화후에, 단편을 크기에 따라 분획화하고, 분획을 클로닝하고 시퀸싱하였다.
전체 코딩구역과 5'-비번역 서열의 10bp을 제거하면 5'-비전사 구역, mRNA 캡 (cap) 부위 및 5-비번역 구역(BamH I 부위에 대하여)의 16bp가 그대로 남는다. 이 조그만 단편은 7% 아크릴아미드 겔 위에서의 사이즈(size) 분획화에 의해 얻어지며 약 13bp의 단편이 용출된다. 이렇게 하여 사이즈 분획화된 DNA를 M13mp9에 결찰시키고, 몇몇 클론을 시퀸싱하고, 이 서열을 공지의 옥토핀 신타제 효소 서열과 비교하였다. M13 구조물을 pI4로 명명하고, 이 플라스미드를 BamH I 및 EcoR I 으로 소화시켜 작은 단편을 수득하고, 이를 pTiA6(Garfinkel and Nester, J Bacteriol. (1980) 144: 732)으로부터 상류의 5'-서열을함유하는 Xho I~BamH I 단편 및 3'-서열을 함유하는 EcoR I~Xho I 단편에 결찰시켰다. 생성된 Xho I 단편을 pCGN426이라 명명된 pUC8 유도체의 Xho I 부위에 클로닝시켰다. 이 플라스미드는, 단 하나의 EcoR I 부위가 DNA 폴리머라제 I으로 가득찼으며, pUC8의 유니크 Hind II 부위에 Xho I 링커를 삽입할때 Hinc II 제한 엔도누클레아제의 누클레아제 오염에 의해 Pst I 및 Hinc II 부위를 상실했다는 점에서 pUC8과는 다르다. 생성된 플라스미드 pCGN451은 5'-비코딩 구역(T-DNA의 오른쪽 가장자리, mRNA 캡 부위 및 5'-비번역 서열의 16bp를 포함하여 5'-비전사 서열의 1,550bp를 포함함)과 3'-구역 (26bp의 코딩 구역, 정지 코돈, 196bp의 3'-비번역 DNA, 폴리 A 부위 및 1,153bp의 3'-비전사 서열을 포함함) 사이에 단백질 코딩 서열의 삽입을 위한 하나의 EcoR I 부위를 갖는다.
옥토핀 신테타제(ocs) 카세트를 포함하는 Xho I 단편을 테트라사이클린 내성 및 카나마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pCGN517에 삽입하였다. 유니크 Pst I 부위에 pUC4K[Vieira, Gene (1982) 19: 259]의 Kanr를 삽입함으로써 pHC79 [Hohn, Gene (1980) 11:291]로부터 pCGN517을 수득하였다. pCGN517을 Sal I 으로 소화시키고, Xho I 단편을 유니크 Sal I 부위에 삽입시켰다.
Xho I 단편을 두번째 플라스미드 pCGN529에도 삽입시켰다. pCGN529는 Tn5[Rothstein et al., 1981, Movable Genetic Elements, p99, cold spring Harbor Laboratories, codl spring Harboor, NY]의 Kanr를 삽입시킴으로써 pACYC184로부터 제조하고, pACYC184의 HindIII-BamH I 단편을 Tn5의 Kanr로 대치한 후에 남아 있는 BamH I 부위에 pRiA4T-LDNA[white and Nester, j. Bacteriol. (1980) 144:710]의 Bgl II 단편(2.4kb)을 삽입시켰다.
ocs 카세트의 유니트 EcoR I 에 EcoR I 니트릴라제 유전자를 삽입시킨 ocs 카세트를 함유하는 Xho I 단편을 pCGN517및 pCGN529에 삽입시켜 각각 플라스미드 PN1 및 PN2를 수득하고, 이를 Ti 또는 Ri-플라스미드의 T-DNA에로의 통합을 위하여 각각 에이. 투메파시엔스 또는 에이. 리조게네스에 도입시키는데 사용한다. 각각의 플라스미드에로의 통합은 코마이등[Comai et al., plasmid (1983) 10 : 21~30]에 의해 설명된 3-웨이 메이팅(3-way mating)에 의해 수행할 수 있다. 플라스미드 pRK2073, PN1 또는 PN2를 함유하는 이. 콜리 숙주 및 에이. 투메파시엔스 A722[Garfinkel, J. Bacteriol. (1980) 144 : 732]또는 에이. 리조게네스 A4T [white, 상동 (1980) 144 : 710]를 밤새 배양시킨 배양물을 밤새 배양하고 적절한 배양물을 혼합하고 150μg/ml의 카나마이신을 포함하는 AB판에 도포하였다. 단일 클론들을 2회 화선배양하였다. 총 아그로박테리움 DNA의 서던(Southern)분석에 의해 통합이 올바르게 이루어졌는지를 확인한다. 니크(nick)-번역 pBrx8를 이용하여 엔도누클레아제-소화된 DNA를 탐사하였다.
브로모크시닐 특이적 니트릴가제 유전자를 충영(gall)조직내에서 형질발현시킨다.
2.6kb의 단편상에 니트릴라제 유전자를 포함하는 플라스미드 pBrx9를 BamH I로 소화시키고 Ba131로 처리하여 약간의 5' 측면 구역을 제거한다. BamH I 링커를 가하고 재폐쇄시킨다. 암피실린 내성을 갖게된 생성된 플라스미를 상술한대로 이. 콜리내로 형질전환시키고 암피실린 선택성 배지상에서 형질 전환체를 선택하여 2.6kb 단편상에 니트릴라제 유전자를 함유하는 5.2kb 플라스미드 pBrx16 및 pBrx17을 수득한다. BamH I 으로 pBrx16을 소화시키고 HincII로 부분 소화시켜 1.2kb 니트릴라제 유전자 단편을 생성시킨다.
BamH I -Hinc II 단편을 BamH I-SamH I으로 소화시킨 pCGN46에 삽입시켜 니트릴라제 유전자 단편을 함유하는 6.6kb 플라스미드 pBrx22를 수득한다.
pCGN46(Comai er al., Nature (1985), 317, 741~744)는 만노핀 신타제(MAS)형질 발현 카세트이며 MAS 프로모토 및 ocs 3'-구역을 포함한다. 다음과 같은 방법으로 pCGN46을 제조한다. 만노핀 신타제 프로모터 구역(PMAS)을 포함하는 T-R DNA (Barker et al., Plant Mol. Biol.) (1983) 2 : 325)의 일부를 함유하는 약 5.5kbp의 EcoR I 단편 (Eco13 또는 EcoC )을 pVK232라 명명된 백터내에서 클로닝시킨다. pVK232을 EcoR I으로 소화시킨 후에, Eco13을 pACYC184의 EcoR I 부위에 삽입하여, 플라스미드 pCGN14를 수득한다. pCGN14를 Sph I 및 Cla I 으로 소화시켜 (각각 Barker등의 위치 21562 및 20128에 작용, 서열은 상기 참조). 미리 Sph I 및 Acc I 으로 소화시킨 pUC19(pharmacia, Inc)에 삽입된 PMAS구역을 제거하여 pCGN40을 수득한다. PMAS구역에는 메틸화된 Cla I 인지 구역이 내부적으로 포함되어 있어 소화에 저항성을 갖는다.
EcoRV 부위가 T-DNA안에 있고, EcoR I 부위가 pUC19의 폴리링커내에 있는 pCGN40을 EcoRV 및 EcoR I 으로 소화시킴으로써 PMAS 구역을 갖는 단편을 수득한다. 옥토핀 신타제 카세트를 함유하는 pCGN451을 Sma I 및 EcoR I 으로 소화시킴으로써 옥토핀 신타제 5' 구역이 제거된 큰 단편을 분리한다. EcoRV-EcoR I PMAS구역을, 전사 개시 및 종결 구역이 폴리 링커에 의해 분리되어 있는 옥토핀 신타제 5' 구역의 pCGN451에 치환시킨다.
1.2kb 니트릴라제 유전자 단편을 포함하는 플라스미드 pBrx22을 상술한대로 이. 콜리내로 형질 전환시킨다. 플라스미드를 공지의 방법으로 분리하고 Xho I으로 소화시켜 MAS 프로모터, 세균성 5'-비번역 서열의 25염기쌍을 함유하는 브로모크시닐 유전자 및 ocs 3'-구역을 포함하는 4.1kb 단편을 수득한다. 4.1Kb 단편을 Sal I-소화된 플라스미드 pCGN783에 삽입시켜 약 31Kb의 플라스미드 pBrx28을 수득한다.
pCGN783의 제조
pCGN167의 제조
pCGN167을 제조하기 위하여, CaMV의 Alu I 단편(bp7144~7735)(Gardner et al., Nucl. Acids Res. (1981) 9: 2871~2883)을 Alu I 을 이용한 소화에 의해 수득하고 M13mp7의(Vieira Gene (1982) 19:259)의 Hinc II 부위에 클로닝시켜 C614를 창조한다. C614를 EcoR I 으로 소화시켜 35S 프로모터를 함유하는 C614로부터 EcoR I 단편을 수득하고 이를 pUC8(Vierra et al., Gene (1982) 19:259)의 EcoR I 부위에 클로닝시켜 pCGN146을 생산한다.
프로모터 구역을 트림(trim)하기 위하여, BalII 부위(bp7670)를 Bal II 및 Ba131로 처리하고, 그 다음에 Bal II 링커를 Ba131 처리된 DNA에 결합시켜 pCGN147을 수득한다.
이 구조물 pCGN528에 이용되는 셔틀 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조한다. 카나마이신 유전자를 포함하는 Tn5를 함유하는 플라스미드(Jorgenson et al., Mol. Gen. (1979) 177:65)를 HindI II-BamH I으로 소화시키고 카나마이신 유전자를 함유하는 HindIII-BamH I 단편을 pACYC184(Charg & Cohen, J. Bacteriol. (1978)134, 1141~1156)의 테트라사이클린 유전자의 HindIII-BamH I 부위에 삽입시킴으로써 pCGN525를 수득한다. pTiA6(Thomashow et al., Cell (1980) 19 : 729~739)의 BamH I 단편 19를 pCGN525의 BamH I 부위에 삽입시켜 pCGN526을 수득한다. pCGN526을 Xho I 으로 소화시켜 pCGN526으로부터 작은 pCGN 단편을 제거하고 재결찰시킴으로써 pCGN528을 수득한다.
pMB9KanXXI로부터 유래된 BamH I 카나마이신 유전자 단편을 pCGN148a의 BamH I 부위에 클로닝시켜 pCGN149a를 수득한다.
pMB9KanXXI 은 아그로박테리움 내에서의 선택을 효과적으로 하기 위해서 Xho I 을 함유하지 않고 Tn903의 작용성 카나마이신 유전자를 포함하는 pUC4K 변이종 (Vieira & Messing, Gene (1982) 19 : 259~268)이다.
pCGN149a를 Bal II 및 Sph I 으로 소화시킨다. 이 pCGN149a의 조그만 Bgl II-Sph I 단편을, BamH I 및 Sph I 으로 소화시켜 분리한 Ml(아래 참고)의 BamH I-Sph I 단편과 대치한다. 이것에 의해서, 풀랭쓰 CaMV 프로모터, 1ATG-카나마이신 유전자, 3'-말단 및 세균성 Tn903-형 카나마이신 유전자를 함유하는 구조물인 pCGN 167이 생성된다. M1은 pCGN550(참고, pCGN587의 구조물)으로부터 유래된 EcoR I 단편이며, 이것을 1ATG-카나마이신 유전자의 Pst I 부위가 M13mp9의 폴리링커 구역에 인접하도록 M13mp9의 EcoR I 클로닝 부위에 클로닝시킨다.
709(1ATG_카나마이신-3' 구역)의 제조
pCGN566을 pUC13-cm(K. Backley, ph D. thesis, UC-San Diego, 1985)의 EcoR I-Hind III 부위에 삽입된 pUC18(Yanisch-Perron, 상동)의 EcoR I-Hind III 링커를 포함한다. ORF1 및 2(Barker et al. (1983), 상기 참조)를 함유하는 pNW 31c-8, 29-1(Thomashow et al. (1980). Cell 19:729)의 Hind III-Bgl II 단편을 pCGN566의 Hind III-BamH I 부위에 서브클로닝시켜 pCGN703을 수득한다.
pTiA6[pT115955(Barker et al. (1983). 상기 참고)의 염기 2396~2920에 해당]의 전사물 7의 3'-구역을 포함하는 pCGN703의 Sau3A 단편을 pUC18(Yanisch-Perron et al. (1985), 상기 참고)의 BamH I 부위에 서브클로닝시켜 pCGN709를 수득한다.
pCGN766c(35S 프로모터-3'-구역)의 제조
CaMV-35S 프로모터, 1ATG-카나마이신 유전자 및 pTiA6의 BamH I 단편 19를 함유하는 pCGN167(제법은 하기 참고)의 HindIII-BamH I 단편을 pUC19 (Narran-der et al. (1983), 상기 참고 ; Yanisch-Perron et al. (1985), 상기 참고)의 BamH I-Hind III 부위에 클로닝시켜 pCGN976을 창조한다.
pCGN976의 0.7kb Hind III-EcoR I 단편 및(35S 프로모터) 및 pCGN709의 0.5kb EcoR I-Sal I 단편(전사물 7:3', 제법은 상기 참고)을 pCGN566의 Hind III-Sal I 부위에 삽입시켜 35S 프로모터 및 전사물 7의 3' 구역을 발전시킴으로써 pCGN766c를 창조한다.
pCGN783의 최종 제조
pCGN766의 0.7kb HindIII-EcoR I 단편 pUC119(J. Vieira, Rutgers University, N.J.)의 HindIII-Sal I 부위의 pCGN726c의 1.5kb EcoR I-Sal I 단편(1-ATG-KAN-3' 구역)에 결찰시켜 pCGN778을 수득한다.
pCGN778의 2.2kb 구역, CaMV 35S 프로모터를 함유하는 단편(1-ATG-KAN-3' 구역)으로 pCGN739의 HindIII-Sal I 폴리링커 구역을 대체시켜 pCGN783을 수득한다.
pBrx17을 BamH I 으로 소화시키고 Hinc II 로 부분 소화시켜 1.2kb 니트릴라제 유전자 단편을 수득한다.
BamH I-Hinc II 단편을 BamH I-Sma I 소화된 pCGN566에 삽입시켜 니트릴라제 유전자 단편을 함유하는 3.7kb 플라스미드 pBrx25를 수득한다.
pCGN566을 다음과 같은 방법으로 제조한다.
pUC13(CmR)(Ken Buckley ph. D. thesis, U.C., San diego)을 EcoR I 및 HindIII으로 소화시키고 pUC18 및 pUC19로부터 얻은 폴리링커를 각각 직선화된 pUC13에 삽입시킴으로써 클로람 페니콜 내성 표식체(marker)를 갖는 1.2kb 니트릴라제 유전자 단편을 포함하는 플라스미드 pBrx25를 전술한 방법에 따라 이. 콜리내에 형질 전환시킨다. 플라스미드를 공지의 방법으로 분리하고 BamH I 및 EcoR I 으로 소화시켜 다시 1.2kb 니트릴라제 유전자 단편을 수득한다. BamH I 및 EcoR I 단편을 BamH I 및 EcoR I로 소화시켜 pCGN46에 삽입시킴으로써 니트릴라제 유전자 단편을 포함하는 6.6kb 플라스미드 pVrx27을 수득한다.
pBrx27을 상술한 방법에 따라 이. 콜리내에 형질 전환시킨다. 플라스미드를 통사의 방법으로 분리하고 Xho I으로 소화시킴으로써, MAS 프로모터, 번역된 서열내에 세균성 5'의 11염기쌍을 포함하는 브로모크시닐 유전자 및 ocs 3' 구역을 포함하는 4.1kb 단편을 수득한다. 4.1kb 단편을 SAl I-소화된 pCGN783에 삽입시켜 약 31kb 플라스미드 pBrx29를 수득한다.
니트릴라제 형질 발현의 검출
플라스미드 pBrx28 및 pBrx29를 아그로박테리움 투메파시엔스종 K12(Nester, Ann. Rev. Micro. (1981) 35:531, Hoekema et al., Nature (1983) 303:179)에 형질 전환시키고, K12(pBrx28) 및 (pBrx29)를 이용하여 칼란쇠에(Kalanchoe, Garfinkel, J.Bacteriol. (1980) 144:732)에 충영을 형성시킨다.
약 1gm(생중량)의 충영 조직을 0.1M 트리스(pH 7.5), 10mM EDTA, 0,15M NaCl, 0.05% NP-40, 25mg/ml BSA, 1mM DTT 및 0.3μg/ml 류펩틴을 포함하는 완충액내에서 액체 질소하에 분쇄한다. 0.05g의 폴리비닐피롤리돈(시그마)을 가한후에 시료를 균등분쇄하고, 4℃에서 15,000g로 15분간 원심분리한다. 정제된 니트릴라제를 토끼에 주사하여 제조한 항혈청 25μl 및 에스. 아우레우스(칼바이오켐)의 10%(w/v)현탁액 250μl를 각각의 상충액에 가하고 4℃에서 16시간동안 보온한다. 시료를 원심분리하고 펠릿을 20mM 트리스(pH 7.5), 1mM EDTA, 150mM NaCl 및 0.05% NP-40으로 2회 세척한다. 펠릿을 100ul의 0.125M 트리스(pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤 및 10% BMe에 재현탁시키고 90℃로 2분간 가열한다.
전체 시료를 10% 아크릴아미드 겔(Laemmli, U.K. Nature 227 : 1680~685(1970) 상에서 전기영동한다. 분할된 폴리펩티드를 버네트[Burntte, Anal. Biochem. 112195~203(1981)]에 의해 설명된 니트로셀롤로스필터(슐라이커 및 슈엘)에 옮긴다. 니트로셀룰로스 필터(슐라이커 및 슈엘)를 블로토(BLOTTO, Johnson et al. Gen. Anal. Technol. 1, 238~42(1983)내에서 42℃로 1~3시간 동안 보온하고, 항-니트릴라제 혈청의 1:50용액을 포함하는 블로토내에서 실온에서 밤새 보온한다. 필터를 20mM 트리스(pH 7.5), 150mM NaCl 내에서 10분간 세척하고; 0.05% 트윈-20을 포함하는 동일 완충액내에서 20분간 세척하고; 트윈-20을 함유하지 않는 완충액내에서 10분간 더 세척한다.
125I-표지화된 단백질 A(9uCi/mg: NEN) 106cpm/ml를 함유하는 블로토를 필터에 가하고 실온에서 2시간 동안 보온한다. 필터를 50mM 트리스(pH 7.5), 1M NaCl 및 0.4% 사르코실내에서 밤새 세척한다. 헹구고 건조시킨후에, 듀퐁 크로넥스 강화 혈청을 이용하여 필름을 -70℃에서 코닥 AR X-선 필름에 노출시킨다.
에이. 리조게네스와 공생 배양시킨 담배 잎 조각의 형질 전환 및 자기 재생
담배를 무균적으로 배양한다.[25℃ 백색상(16시간) ; MS(1mg/L IAA, 0.15mg/L 키네린)]. 주 발아 이식을 통하여 유지시킨 3주일된 식물을 조직 공여체로 사용한다. 꼭대기로부터 네번째 있는 어린 잎을 선택하여 직경 2mm의 잎 원판을 잘라내고 그것을 1mg/L IAA를 포함하는 MS 배지(1ml)가 들어있는 페트리쉬(직경 3cm)에 놓는다. 잎 원판을 완전히 깜깜한데서 밤새보존한 후에 아그로박테리움(A722×PN1 또는 PN2) 세포(식물 배양 배지 내, 108-109/ml)를 상기 배양물에 가한다. 어둠속에서 18~24시간 동안 공생 배양을 실시한다. 잎 조각을 호르몬을 포함하지 않고 350mg/L 세포탁신(Cefotaxine, 뵈링거-만하임)을 포함하는 MS 배지로 3회 세척하여 아그로박테리움을 제거한다. 잎 조각을 9cm 페트리디쉬내의 호르몬을 함유하지 않는 MS 배지(10ml)내에 옮긴다.
식물성 한천(기브코, 0.6%; 세포탁신, 350mg/L) 페트리디쉬를 파라 필름으로 밀봉하고, 조직 공여체식물과 동일한 조건하에 보관한다. 2~4주일내에 나타나는 뿌리를 절단하고, 2mg/L의 IAA 및 2mg/L의 키네틴을 가한 동일 배지내에 동일 조건하에서 놓아둔다. 자기 재생된 뿌리는 다음 2~5주일내에 볼 수 있다.
6-잎 단계에 화분에 심어진 식물에 대하여 브로모크시닐 용액을 분무한다. 각각의 4" 화분은 식물을 포함하고 있으며, 2.5ml의 분무액을 분무받게 된다. 식물을 25℃, 70%의 상대습도 및 60시간의 조사 기간의 조건하에 생잘실에서 생장시킨다. 분무후 9일에, 0.5cm보다 긴 새로운 잎을 셈으로써 성장을 기록한다.
상기 공정을 실시함으로써, 브로모크시닐 내성을 갖는 식물을 얻을 수 있으며, 이 식물은 브로모크시닐이 존재하는 밭에서도 그 생장에 심각한 악영향을 받지 않으면서 자랄 수 있다.
본 발명의 목적은 식물로 하여금 제초제 내성, 특히 벤조니트릴 제초제에 대한 내성을 갖게함으로써 식물을 개선하는 것이다. 따라서, 니트릴라제를 코딩하는 유전자를 식물 숙주에 도입시킬 수 있고, 그럼으로써 유전자가 형질 발현되고 식물에게 벤조니트릴 내성을 부여할 수 있다. 덧붙여, 유전자를 공지의 세균 숙주내에서 클로닝하여 효소를 형질 발현시킴으로써 효소를 생산할 수 있다. 감시 가능한 활성을 갖는 효소는 각종 용도, 각종 분식물의 분석 및 벤조니트릴 기질의 분석등에 이용된다. 덧붙여, 효소 및 효소를 형질 발현시키는 세균은 오염된 환경으로 부터 벤조니트릴 제초제를 제거하는데 사용할 수 있다.
지금까지 이해를 확실하게 하기 위하여 설명과 예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하였지만, 첨부된 특허 청구의 범위내에서 본 발명을 변화시키고 조작하는 것도 가능하다.

Claims (2)

  1. 3,5-디할로겐화-p-히드록시벤조니트릴에 특이적인 니트릴라제를 생산하는 케이. 호자에나에를 분리하고; 케이. 오자에나에를 적절한 영양 배지에서 생장시키고; 상기 케이. 오자에나에를 분해시키고 상기 니트릴라제를 분리함을 특징으로 하는 3,5-디할로겐화-p-히드록시벤조니트릴에 특이적인 니트릴라제를 제조하는 방법.
  2. 3,5-디할로겐화-p-히드록시벤조니트릴에 특이적으로 작용하는 특성에 대해 세균을 스크리닝하고 이러한 특성을 가진 세균을 선택하고; 선택된 세균의 게놈을 절단하여 원하는 크기 범위의 단편들을 수득하고; 세균내에서 적절한 벡터에 상기 수득된 단편들을 클로닝시키고, 3,5-디할로겐화-p-히드록시벤조니트릴에 특이적인 특성을 갖는 니트릴라제에 대한 단편을 선택하고; 상기 특성을 갖는 니트릴라제를 형질 발현하는 구조 유전자를 가진 DNA 서열을 분리하고, 분리된 DNA를 적절한 숙주세포에서 형질 발현시킴을 특징으로 하는 3,5-디할로겐화-P-히드록시벤조니트릴에 특이적인 특성을 갖는 니트릴라제의 수득방법.
KR1019870700813A 1986-01-08 1987-01-05 할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포 KR950008571B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US81722686A 1986-01-08 1986-01-08
US817226 1986-01-08
US84566286A 1986-03-28 1986-03-28
US845662 1986-03-28
PCT/US1987/000044 WO1987004181A1 (en) 1986-01-08 1987-01-05 Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR880701050A KR880701050A (ko) 1988-04-22
KR950008571B1 true KR950008571B1 (ko) 1995-08-03

Family

ID=27124151

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019870700813A KR950008571B1 (ko) 1986-01-08 1987-01-05 할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포
KR870000095A KR870007279A (ko) 1986-01-08 1987-01-08 할로아릴니트릴분해 유전자, 그의 용도 및 그 유전자를 함유하는 세포

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR870000095A KR870007279A (ko) 1986-01-08 1987-01-08 할로아릴니트릴분해 유전자, 그의 용도 및 그 유전자를 함유하는 세포

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP0290455A4 (ko)
JP (2) JPH0795952B2 (ko)
KR (2) KR950008571B1 (ko)
CN (1) CN1039133C (ko)
AU (2) AU611080B2 (ko)
BR (2) BR8705281A (ko)
CA (1) CA1331156C (ko)
DK (2) DK6487A (ko)
HU (2) HU209143B (ko)
IL (1) IL81168A0 (ko)
NZ (1) NZ218810A (ko)
PL (1) PL156394B1 (ko)
RU (1) RU2043417C1 (ko)
WO (1) WO1987004181A1 (ko)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR950008571B1 (ko) * 1986-01-08 1995-08-03 롱쁠랑 아그로시미 할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포
US4810648A (en) * 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
FR2629098B1 (fr) * 1988-03-23 1990-08-10 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimerique de resistance herbicide
US5258300A (en) * 1988-06-09 1993-11-02 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Method of inducing lysine overproduction in plants
CA2018884A1 (en) * 1989-06-22 1990-12-22 Irving Gordon Plant transformation construct
US5484956A (en) * 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5545545A (en) * 1993-04-27 1996-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
JPH11505417A (ja) * 1995-05-05 1999-05-21 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド ヒトケモカインベータ−８、ケモカインベータ−１、およびマクロファージ炎症性タンパク質−４
ATE526818T1 (de) 1997-08-12 2011-10-15 Univ North Carolina State Gentechnisch hergestellte wasserlinse
US6322792B1 (en) 1998-11-19 2001-11-27 Elliott D. Kieff Rhadino virus LANA acts in trans on a unit of rhadino virus DNA to mediate efficient episome persistance
CN1452660A (zh) 2000-08-11 2003-10-29 辛根塔参与股份公司 植物稳定转化的方法
JP4584242B2 (ja) * 2003-02-27 2010-11-17 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 改変されたニトリラーゼおよびカルボン酸の製造方法におけるその使用
US8993846B2 (en) 2005-09-06 2015-03-31 Monsanto Technology Llc Vectors and methods for improved plant transformation efficiency
EP3339441A1 (en) 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Methods for producing hybrid seed
US7622573B2 (en) 2006-01-17 2009-11-24 Biolex, Inc. Expression control elements from the lemnaceae family
EP2803728B1 (en) 2006-05-16 2018-11-21 Monsanto Technology LLC Use of non-agrobacterium bacterial species for plant transformation
US7939721B2 (en) 2006-10-25 2011-05-10 Monsanto Technology Llc Cropping systems for managing weeds
AU2008226443B2 (en) 2007-03-09 2013-07-11 Monsanto Technology Llc Preparation and use of plant embryo explants for transformation
EP3023499A1 (en) 2008-07-16 2016-05-25 Monsanto Technology LLC Methods and vectors for producing transgenic plants
US8394384B2 (en) 2008-11-28 2013-03-12 Merial Limited Recombinant avian influenza vaccine and uses thereof
US20120220015A1 (en) 2009-05-26 2012-08-30 Biolex Therapeutics Compositions and methods for production of aglycosylated plasminogen
MX351643B (es) 2009-12-28 2017-10-23 Merial Ltd Antigeno ndv recombinante y usos del mismo.
US9345759B2 (en) 2010-03-12 2016-05-24 Merial, Inc. Bluetongue virus recombinant vaccines and uses thereof
EP2721160A2 (en) 2011-06-14 2014-04-23 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for making and biocontaining auxotrophic transgenic plants
CA2865677C (en) 2012-02-02 2021-08-10 Conicet Hahb11 provides improved plant yield and tolerance to abiotic stress
US20150218578A1 (en) 2012-03-13 2015-08-06 University Of Guelph Methods of increasing tolerance to heat stress and amino acid content of plants
US20150203864A1 (en) 2012-03-13 2015-07-23 University Of Guelph Myb55 promoter and use thereof
CA2875055A1 (en) 2012-06-07 2013-12-12 Dow Agrosciences Llc Construct and method for expressing transgenes using a brassica bidirectional constitutive promoter
CA2882143A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Dow Agrosciences Llc High-throughput dna fragment assembly
CA3116898C (en) 2012-08-17 2022-09-27 Dow Agrosciences Llc Use of a maize untranslated region for transgene expression in plants
CN102936590B (zh) * 2012-11-05 2014-04-16 江南大学 一种腈水解酶及其基因序列与应用方法
US10253325B2 (en) 2012-12-19 2019-04-09 Boston Medical Center Corporation Methods for elevating fat/oil content in plants
US20140203176A1 (en) 2013-01-23 2014-07-24 Dow Agrosciences Llc Systems and methods for real-time sampling and analysis of biomolecules beneath the surface of biological tissue
CN103275992B (zh) * 2013-01-24 2014-11-12 南京农业大学 溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2 及其应用
US11236347B2 (en) 2015-08-28 2022-02-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
US11732269B2 (en) 2015-10-02 2023-08-22 Monsanto Technology Llc Recombinant maize B chromosome sequence and uses thereof
CN108292328B (zh) 2015-11-10 2022-04-19 美国陶氏益农公司 用于预测转基因沉默风险的方法和系统
WO2018005491A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for use in genome modification in plants
RU2020111575A (ru) 2017-08-22 2021-09-23 Напиджен, Инк. Модификация генома органелл с использованием направляемой полинуклеотидом эндонуклеазы

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0131620B1 (en) * 1983-01-17 1991-08-21 Monsanto Company Genetically transformed plants
KR950008571B1 (ko) * 1986-01-08 1995-08-03 롱쁠랑 아그로시미 할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포

Also Published As

Publication number Publication date
RU2043417C1 (ru) 1995-09-10
CA1331156C (en) 1994-08-02
DK464087A (da) 1987-09-07
AU611080B2 (en) 1991-06-06
JP2580499B2 (ja) 1997-02-12
IL81168A0 (en) 1987-08-31
AU6898487A (en) 1987-07-28
DK6487A (da) 1987-09-18
WO1987004181A1 (en) 1987-07-16
EP0290455A1 (en) 1988-11-17
EP0229042A2 (en) 1987-07-15
PL156394B1 (pl) 1992-03-31
HUT43874A (en) 1987-12-28
BR8705281A (pt) 1987-12-22
JPH07194377A (ja) 1995-08-01
JPH0795952B2 (ja) 1995-10-18
KR880701050A (ko) 1988-04-22
HU209143B (en) 1994-03-28
CN87100135A (zh) 1987-09-02
PL263575A1 (en) 1987-11-02
NZ218810A (en) 1990-05-28
DK464087D0 (da) 1987-09-07
AU6717587A (en) 1988-02-04
BR8700045A (pt) 1987-12-01
KR870007279A (ko) 1987-08-18
DK6487D0 (da) 1987-01-07
EP0290455A4 (en) 1989-01-18
JPS63502720A (ja) 1988-10-13
CN1039133C (zh) 1998-07-15
HUT47972A (en) 1989-04-28
EP0229042A3 (en) 1989-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR950008571B1 (ko) 할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포
US4810648A (en) Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US5689056A (en) HMG2 promoter expression system
JPH10507913A (ja) ジャガイモ由来のプロモーター配列
JPH07500970A (ja) 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法
EP2697363A1 (en) Synthetic genes
JPH06500237A (ja) β―１，３―グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質をコードする組換えＤＮＡ、このＤＮＡを含む細菌、形質転換植物細胞および植物
US5610044A (en) Microorganisms with mannopine catabolizing ability
US6025544A (en) Processes for modifying plant flowering behavior
RU2198219C2 (ru) ФРАГМЕНТ ДНК, ПОЛУЧАЕМЫЙ ИЗ Arabidopsis thaliana, ЕГО СУБФРАГМЕНТ ИЛИ КОМБИНАЦИЯ СУБФРАГМЕНТОВ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ХИМЕРНОЙ ДНК И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ, РЕПЛИКОН (ВАРИАНТЫ)
KR101161276B1 (ko) 도관 특이적 발현 유도용 프로모터 및 이를 포함하는 발현 벡터
KR20020069340A (ko) 자스몬산 메칠화 효소 유전자의 프로모터 및 상기프로모터를 이용하여 식물체 내에서 목적 단백질을생산하는 방법
WO2010055837A1 (ja) 植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法
CN115704035B (zh) 一种烟草NtDSR2基因及其应用
JP2004535774A (ja) 遺伝子発現における使用に適した制御要素
JPH07274974A (ja) ビベンジル合成酵素遺伝子
AU769546B2 (en) Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by Agrobacterium rhizogenes
JP3089282B2 (ja) 高性能遺伝子コントロール配列
JPH05506358A (ja) 植物組織のエチレンレベルを変更する方法及び組成物
KR20130033080A (ko) 식물 조직 특이적인 ＢｒＬＲＰ1 프로모터
JPS62201578A (ja) ハロアリ−ルニトリル分解遺伝子、その使用および該遺伝子を含有する細胞
JPH03505663A (ja) ハロアリールニトリル分解性遺伝子、その使用および該遺伝子を含有する細胞
KR20130033076A (ko) 화탁 특이적인 ＢｒＣＹＳ7 프로모터

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
G160 Decision to publish patent application
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20040723

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee