PL156394B1

PL156394B1 - Sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej PL PL

Info

Publication number: PL156394B1
Application number: PL1987263575A
Authority: PL
Priority date: 1986-01-08
Filing date: 1987-01-07
Publication date: 1992-03-31
Also published as: KR870007279A; CN1039133C; JPH0795952B2; KR950008571B1; DK6487A; DK464087D0; BR8705281A; HUT43874A; HUT47972A; WO1987004181A1; HU209143B; EP0229042A3; EP0290455A4; AU6717587A; JPS63502720A; PL263575A1; CA1331156C; RU2043417C1; NZ218810A; AU611080B2

Abstract

1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej o masie czasteczkowej wynoszacej okolo 34 kilodaltonów, posiadajacej aktywnosc wlasciwa wynoszaca co najmniej 0,1 µm ola N H 3/m in u te/m g bialka wobec 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu jako subs- tratu, znam ienny tym , ze izoluje sie Klebsiella Ozaenae zawierajaca sekwencje D N A kodujaca nitrilaze, hoduje sie K. Ozaenae wytwarzajaca nitrilaze w odpowiednim srodowisku hodow la- nym, przeprowadza sie lize K. Ozaenae i wyodrebnia sie wytwarzana nitrilaze. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej.

Możliwość nadawania mikroorganizmom i komórkom pochodzącym z organizmów wyższych nowych cech genetycznych otwiera szerokie pole dla uzyskania nowych zdolności tych organizmów. Jedna z takich dziedzin dotyczy środków wykorzystywanych ze względu na właściwości cytotoksyczne. Przykładowo, w rolnictwie, stosuje się wiele związków jako środki owadobójcze, chwastobójcze lub podobne. W wielu przypadkach, związki te mają stosunkowo długi okres trwania lub przedłużoną aktywność resztkową.

W wielu sytuacjach wymagane jest działanie wybiórcze z zachowaniem określonych gatunków i niszczeniem innych. Przykładowo, często pożądane jest selektywne niszczenie chwastów przy minimalnym szkodliwym działaniu na rośliny uprawne. Jednak większość środków chwastobójczych o szerokim spektrum działania wykazuje znaczne, szkodliwe działanie na rośliny uprawne, co ogranicza ich używanie do stosowania przed wzejściem roślin lub do bardzo ostrożnego stosowania po wzejściu.

Przedmiotem dużego zainteresowania jest zatem możliwość modyfikowania zdolnych do życia komórek, nadając im oporność na stresy, takie jak środki cytotoksyczne.

156 394

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 535 060 ujawniono użycie bakteryjnego genu aroA do nadania oporności na środek „glyphosate“ komórkom wrażliwym na ten środek. Hsu i Camper (Ca. J. Microbiol, 1976, 22 537—543) opisali izolację mikroorganizmów degradujących ioksynil ze wzbogaconych hodowli z gleby. Hsu i Clenson (Dissert. Abstr. Intern. B36 /1976/, nr 8, 3708) opisali degradację mikrobiologiczną środków chwastobójczych z grupy 3,5-dwuchlorowco-4-hydroksybenzonitryli.

Ingram i Pullin (Pastic. Sci. 1974, 5, 287-291) donieśli o trwałości bromoksynilu w trzech typach gleby. Smith (Abstrp. Meeting Weed Soc. Am. 1971, str.16-17) opisał degradację bromoksynilu w ciężkiej glebie gliniastej „Regina. Smith i Flether (Hort. Res. 1964, 4, 60-62) opisali 3,5-dwuchlorowco-4-hydroksybenzonitryle i mikroorganizmy glebowe.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej o masie cząsteczkowej wynoszącej około 34 kilodaltonów, posiadającej aktywność właściwą wynoszącą co najmniej 0,1 //mola NH^/minutę/mg białka wobec 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu jako substratu, polegający na tym, że izoluje się Klebsiella Ozaenae zawierającą sekwencję DNA kodującą nitrilazę, hoduje się K. Ozaenae wytwarzającą nitrilazę w odpowiednim środowisku hodowlanym, przeprowadza się lizę K. Ozaenae i wyodrębnia się wytwarzaną nitrilazę.

Nitrylazy specyficzne dla bromoksynilu i/lub ioksynilu znajdują zastosowanie do detoksyfikacji środowiska naturalnego zawierającego bromoksynil i pokrewne środki chwastobójcze i do ochrony komórek gospodarza przed cytoksycznym działaniem tych środków. Elementy konstrukcyjne zawierające geny kodujące nitrylazę mogą być stosowane do selekcjonowania komórek gospodarza zawierających takie elementy konstrukcyjne od komórek gospodarza nie zawierających tych elementów.

Dzięki wynalazkowi uzyskano nowe sekwencje DNA, elementy konstrukcyjne, transformowane komórki, rośliny i białka związane z hydrolizą chlorowcowanych hydroksybenzonitryli, zwłaszcza 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu. Stosując wynalazek można _ wytwarzać enzym zdolny do hydrolizowania tego związku uzyskując niszczenie aktywności chwastobójczej nitrylu, ochronę komórek lub gospodarza wrażliwego na ten środek chwastobójczy lub odtruwanie środowiska naturalnego zanieczyszczonego tym środkiem chwastobójczym.

Żądany gen strukturalny uzyskuje się z jednokomórkowego mikroorganizmu, zwłaszcza z bakterii zdolnej do utylizacji benzonitrylu jako źródła azotu, zwykle zdolnej do utylizacji benzonitrylu jako jedynego źródła azotu. W niniejszym opisie, termin „benzonitryl stosuje się w odniesieniu do chlorowcowanego para-hydroksybenzonitrylu, zwłaszcza do 3,5-dwujodo-4-hydroksy benzonitrylu lub 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu a terminem „nitrylaza określa się nitrylazę zdolną do stosowania chlorowcowanego benzonitrylu jako źródła azotu, zwłaszcza jako jedynego źródła azotu. Enzym ten można otrzymać różnymi drogami, a dogodnie z bakterii występujących w stanie naturalnym w środowisku zawierającym bromoksynil lub ioksynil. Szczególnie interesujące pod tym względem są bakterie jelitowe, zwłaszcza z gatunku Klebsiella.

Można stosować Klebsiella pneumoniae, a korzystnie K. pneumoniae var. ozaenae. Zamiast izolacji z gleby, można prowadzić wzrost organizmów w glebie lub w innym środowisku przy zwiększających się stężeniach benzonitrylu i zmniejszających się ilościach alternatywnych źródeł azotu, aż do uzyskania mikroorganizmów, które przeżywają na benzonitrylu jako jedynym źródle azotu.

Niezależnie od źródła, z którego pochodzi bakteria produkująca nitrylazę, należy przeprowadzić skrining, dla upewnienia się, że nitrylaza ta wydajnie detoksyfikuje benzonitryl. Ponadto, nitrylaza ta powinna być specyficzna dla benzonitrylu a nie powinna rozkładać innych analogów nie zawierających chlorowca, posiadających inne podstawniki i podobnych. Nitrylaza otrzymana sposobem według wynalazku powinna być zatem specyficzna dla benzonitryli zdefiniowanych powyżej a nieaktywna w stosunku do analogów lub znacznie mniej aktywna w stosunku do analogów.

Pożądane jest; aby nie występowało znaczne obniżenie szybkości proliferacji, to jest, aby obniżenie szybkości proliferacji utrzymywało się w granicach poniżej 10% w stosunku do bakterii rosnących w obecności normalnego źródła azotu, na przykład amoniaku, w porównaniu do benzonitrylu jako źródła azotu, w porównywalnych stężeniach. Rezultatu takiego nie obserwuje się w przypadku innych niespecyficznych benzonitryli.

156 394

Po zidentyfikowaniu jednego lub więcej szczepów gospodarza identyfikuje się sekwencje zawierające kod dla nitrylazy stosując znane techniki. Gen taki może się znajdować w chromosomie lub w plazmidzie. Genom poddaje się fragmentacji za pomocą endonukleaz restrykcyjnych, stosując jedną lub kilka endonukleaz. Uzyskuje się fragmenty o wielkości od około 5 kilopar zasad do 50 kilopar zasad. Fragmenty te klonuje się za pomocą odpowiednich wektorów w dogodnej bakterii, na przykład w E.coli, po czym prowadzi się skrining otrzymanych transformantów na aktywność nitrylazy względem organizmu gospodarza stanowiącego negatywny organizm porównawczy.

Z jednego lub więcej klonów, w których zidentyfikowano aktywność nitrylazy izoluje się elementy pozachromosomalne zawierające żądany fragment DNA, plazmidy lub wirusy, stosując znane techniki, takie jak liza komórek gospodarza, precypitacja DNA i wyodrębnienie DNA wektora plazmidowego lub wirusowego od DNA chromosomalnego. Elementy pozachromosomalne rozszczepia się endonukłeazą restrykcyjną i żądane fragmenty izoluje się stosując różne techniki rozdziału i identyfikacji fragmentów o różnej wielkości, na przykład technikę elektroforezy, wirowanie w gradiencie gęstości i podobne.

Zależnie od wielkości fragmentu, poddaje się go dalszej obróbce dla zmniejszenia jego rozmiarów, tak, aby ściślej odpowiadały rozmiarom żądanego genu i flankujących regionów regulatorowych.

Znane są różne techniki manipulacji fragmentami zawierającymi sekwencję kodującą enzym oraz sekwencje regulatorowe flankujące tę sekwencję. W tym celu można stosować częściowe trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi w różnych mieszaninach reakcyjnych z następnym klonowaniem tych fragmentów dla określenia, który z nich zachowuje zdolność ekspresji nitrylazy.

Alternatywnym sposobem jest wyizolowanie i częściowe oznaczenie sekwencji enzymu. W oparciu o znaną sekwencję aminokwasową sporządza się sondy, które stosuje się z kolei do identyfikacji fragmentów zawierających żądany gen. Łącząc takie podejście z trawieniem enzymem restrykcyjnym, klonuje się fragmenty i prowadzi skrining na obecność żądanego genu. Ponadto, w celu usunięcia nukleotydów z jednego lub z obydwu końców fragmentu dla dalszego zmniejszenia ilości zbędnych nukleotydów, stosuje się trawienie egzonuklezazami, takimi jak Bal31.

Alternatywnie, gen klonuje się w odpowiednim gospodarzu i izoluje się informacyjny RNA skrining z sondą, prowadząc identyfikację w odpowiednim układzie translacyjnym in vitro lub in vivo, na przykład, w oocytach Xenopus lub w lizacie retikulocytów lub w podobnym układzie. Wyizolowany informacyjny RNA stosuje się do wytworzenia cDNA stosując znane techniki z użyciem odwrotnej transkryptazy i utworzeniem nici komplementarnej wobec polimerazy DNA. W tym przypadku, otrzymany gen strukturalny nie jest związany z regionami regulatorowymi związanymi z transkrypcją.

Sekwencję DNA zawierającą gen strukturalny zdolny do ekspresji nitrylazy można łączyć z wieloma różnymi innymi sekwencjami DNA w celu wprowadzenia go do odpowiedniej komórki gospodarza.

Sekwencja towarzysząca będzie zależeć od rodzaju gospodarza, sposobu wprowadzania sekwencji DNA do gospodarza i od tego, czy pożądane jest utrzymanie charakteru episomalnego czy integracja.

Dla gospodarzy prokariotycznych istnieje wiele różnych wektorów, które można stosować do wprowadzania sekwencji DNA poprzez transformację, konjugację lub transfekcję. Takie sekwencje DNA obejmują wiele różnych plazmidów, takich jak pBR322, paCYC184, pMB9, pRK290 i podobne, kosmidy, takie jak pVK100 lub wirusy, takie jak P22 i podobne.

Wprowadzenie DNA do gospodarzy eukariotycznych można prowadzić wieloma różnymi technikami, takimi jak transformacja za pomocą DNA strąconego wobec jonów wapnia, wymagająca nie podlegającej replikacji sekwencji DNA, plazmidu łub minichromosomu, transformacja za pomocą sekwencji zawierającej T-DNA w Agrobacterium, mikroinjekcja za pomocą mikropipety lub elektroporacja.

Od tego, czy w konstrukcji DNA jest obecny kompetentny układ replikujący będzie zależeć, czy DNA ten będzie podlegał replikacji jako element episomalny czy też będzie on zintegrowany z genomem gospodarza i będzie następowała ekspresja genu strukturalnego w gospodarzu. Można

156 394 stosować elementy episomalne, takie jak plazmidy wywołujące nowotwory, na przykład Ti lub Ri lub ich fragmenty albo wirusy, na przykład, CAMV, TMV, lub ich fragmenty, nie zabijające komórki gospodarza, w których to elementach episomalnych obecny jest gen strukturalny, usytuowany w sposób, który pozwala na ekspresję tego genu strukturalnego. Szczególnie przydatne są fragmenty posiadające funkcję replikacyjną a nie posiadające innych funkcji, takich jak onkogeneza, wirulencja i podobne.

Fragmenty otrzymane ze źródła wytwarzającego nitrylazę klonuje się, stosując odpowiedni wektor klonujący. Klonowanie prowadzi się w odpowiednim mikroorganiźmie jednokomórkowym, na przykład w bakterii takiej jak E.coli. Korzystne jest zastosowanie kosmidu, gdzie przez częściowe lub wyczerpujące trawienie otrzymuje się fragmenty o rozmiarach zbliżonych do żądanych. Przykładowo, kosmid pVK100 można częściowo trawić odpowiednim enzymem restrykcyjnym i poddawać ligacji z fragmentami uzyskanymi w wyniku częściowego lub wyczerpującego trawienia plazmidu, chromosomu lub ich fragmentu. Jedynie fragmenty o żądanych rozmiarach będą mogły być „upakowane i wprowadzone przez transdukcję do organizmu gospodarza.

Organizm gospodarza selekcjonuje się w oparciu o cechę oporności na benzonitryl. Szczepy przyjmujące można modyfikować, nadając im odpowiednie cechy genetyczne, pozwalające na selekcję tych komórek, które ulegały transdukcji (transduktantów).

W mikroorganizmach, transduktanty te można stosować do konjugacji z innymi mikroorganizmami, stosując ewentualnie plazmid mobilizujący. Dla dalszego zmniejszenia rozmiarów fragmentu zawierającego gen strukturalny nitrylazy można stosować wiele technik. Przykładowo, można izolować wektor kosmidowy, trawić go różnymi endonukleazami restrykcyjnymi, na przykład EcoRI, Bg 1II, Smal i podobnymi i otrzymane fragmenty klonować w odpowiednim wektorze, dogodnie, w poprzednio użytym wektorze kosmidowym. Zamiast wektorów kosmidowych można stosować różne dostępne wektory klonujące o małych rozmiarach, jak pACYC177 i pACYC184. Tak więc, można klonować fragmenty o rozmiarach poniżej 5 kilopar zasad, zwykle poniżej 4 kilopar zasad a bardziej korzystnie, poniżej 2 kilopar zasad nadając oporność na benzonitryl.

Pożądane jest, aby fragment taki miał długość około 1 kilopary zasad a mniejszą od 5 kilopar zasad, korzystnie mniej niż 4 kilopary zasad, konkretnie zaś, co najmniej 1047 par zasad, bardziej konkretnie, łącznie z regionami flankującymi, co najmniej 1100 par zasad, korzystnie poniżej 1,5 kilopar zasad. Szczególnie korzystny jest fragment BgHI-Smal pochodzący z Klebsiella ozaenae a jeszcze bardziej korzystny, fragment Pstl-HincII o długości 1210 par zasad.

Ekspresję enzymu nitrylazy można uzyskać w dowolnym dogodnym źródle prokariotycznym lub eukariotycznym, takim jak bakterie, drożdże, grzyby nitkowca, komórki roślin i podobne. Tam, gdzie enzym nie jest wydzielany przez komórkę, można stosować lizę komórek i izolować nitrylazę znanymi drogami. Do takich użytecznych sposobów izolowania należy chromatografia, elektroforeza, chromatografia powinowactwa i podobne techniki. Dogodną drogą jest konjugacja bromoksynilu poprzez odpowiednie grupy funkcyjne, na przykład, grupę karboksylową z nierozpuszczalnym nośnikiem i użycie tego połączenia jako wypełnienia do izolacji nitrylazy.

Aktywność właściwa nitrylazy powinna wynosić co najmniej około 0,1//mola amoniaku (minutę/mg białka), zwykle co najmniej około 0,5 lub więcej w warunkach opisanych przez Harpera (Biochem. J., 1977, 167, 685-692).

Oczyszczony enzym można stosować w różny sposób. Można go stosować bezpośrednio do oznaczeń bromoniksynilu, ioksynilu i innych pokrewnych benzonitryli. Enzym ten, w postaci skonjugowanej z określoną oznaczoną substancją, na przykład z haptenem, antygenem lub przeciwciałem może znaleźć zastosowanie jako środek do znakowania w próbach diagnostycznych. Próby takie są opisane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 654 090, 3 817 837 i 3 850 752. W tych opisach patentowych podane są szczegółowo sposoby konjugowania oraz oznaczania stężenia oznaczanej substancji.

Sekwencję DNA kodującą nitrylazę można stosować na wiele sposobów. Sekwencja ta może być użyta jako sonda przy izolowaniu nitrylaz typu dzikiego lub zmutowanych. Można ją również stosować do integracji z gospodarzem przez rekombinację tego gospodarza, w celu nadania mu oporności na benzonitryl.

W zastosowaniu do komórek roślinnych, gen strukturalny zawarty w elemencie konstrukcyjnym można wprowadzać do jądra komórki roślinnej metodą injekcji mikropipetą w celu jego

156 394 7 integracji przez rekombinację z genomem gospodarza. Alternatywnie, gen strukturalny wprowadza się do gospodarza roślinnego metodą elektroporacji.

Jeśli gen strukturalny uzyskuje się ze źródła posiadającego regulatorowe sekwencje sygnalne, które nie są rozpoznawane przez gospodarza roślinnego, wtedy dla uzyskania ekspresji tego genu niezbędne jest wprowadzenie odpowiednich sygnałów regulatorowych.

Przy stosowaniu wirusa lub plazmidu, na przykład plazmidu wywołującego nowotwór, po wykonaniu jego mapy restrykcyjnej wybiera się miejsce restrykcyjne w dół od promotora, przy którym ma być dokonana insercja genu strukturalnego w odpowiedniej odległości od tego promotora. Jeśli w sekwencjach DNA nie występuje odpowiednie miejsce restrykcyjne, trawi się je kilkakrotnie egzonukleazą, taką jak Bal31 i wprowadza syntetyczne miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną (linker).

Szczególnie korzystne jest zastosowanie plazmidu wywołującego nowotwór, takiego jak Ti lub Ri, za pomocą których gen nitrylazy można wprowadzać do chromosomów komórek roślinnych. Zastosowanie plazmidów Ti lub Ri jest opisane w publikacjach zgłoszeń PCT nr WO 84/02913, 02919 i 02920 oraz w publikacji zgłoszenia europejskiego EPO 116718, jak również w publikacji Matzke'go i Chiltona w J. Mol. Appl. Genetics, 1981,39-49.

Stosując prawe ramię lub obydwa ramiona T-DNA, w którym ramiona flankują kasetę ekspresyjną zawierającą gen strukturalny nitrylazy pod kontrolą transkrypcyjnych i translacyjnych sygnałów regulatorowych inicjacji i zakończenia rozpoznawanych przez gospodarza roślinnego, można zintegrować kasetę ekspresyjną z genomem gospodarza i uzyskać ekspresję enzymu nitrylazy w komórce gospodarza w różnych etapach różnicowania.

Dla uzyskania ekspresji w komórkach roślinnych można przygotowywać różne elementy konstrukcyjne. Elementy te zawierają kasetę ekspresyjną zdolną do funkcjonowania w roślinach, dając ekspresję nitrylazy w gospodarzu roślinnym.

W celu umożliwienia transkrypcji stosuje się różne regiony inicjacji transkrypcji tzw. regiony promotorowe, zarówno konstytutywne jak i indukowane.

Jeśli w niepodlegającym translacji regionie 5' brak kodonu ATG to region inicjacji transkrypcji łączy się z genem strukturalnym kodującym nitrylazę uzyskując sekwencje inicjacji transkrypcji za kodonem inicjacji, zwykle w obrębie 200 zasad od kodonu inicjacji.

Koniec 3' genu strukturalnego będzie zawierał jeden lub więcej kodonów stopu, które łączy się z regionem zakańczania transkrypcji funkcjonalnym w gospodarzu roślinnym, przy czym ten region terminatorowy może być związany z tym samym lub innym genem strukturalnym, co region inicjacji.

Kaseta ekspresyjna charakteryzuje się tym, że zawiera w kierunku przebiegu transkrypcji: region inicjacji, gen strukturalny pod kontrolą regionu inicjacji transkrypcji oraz region zakańczania kontrolujący zakańczanie transkrypcji i tworzenia informacyjnego RNA.

Jako regiony regulatorowe transkrypcji i translacji korzystnie stosuje się regiony promotorowe i terminatorowe dla związków opiniowych, pozwalające na konstytutywną ekspresję genu nitrylazy. Alternatywnie, można stosować inne promotory i/lub terminatory, zwłaszcza promotory umożliwiające w gospodarzu roślinnym ekspresję indukowaną lub regulowaną.

Do regionów promotora uzyskiwanych z plazmidu Ti należą promotory opinowe, takie jak promotor syntetazy oktopiny, promotor syntetazy nopaliny, promotor syntetazy agropiny, promotor syntetazy manopiny i podobne.

Mogą być również stosowane promotory wirusowe, takie jak promotor regionu VICAMV lub promotor o pełnej długości (358), promotory związane z genami karboksylanów ribulozo-l,5-bisfosforanowych, na przykład mała jednostka, geny związane z faseoliną, gromadzeniem białka, β-conglycyniny, tworzeniem celulozy i podobne.

Różne sekwencje można ze sobą łączyć w znany sposób. Region promotora identyfikuje się poprzez region w kierunku 5' od genu strukturalnego, przykładowo gen opinowy oraz dokonuje się jego selekcji i izolacji przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie.

Podobnie, region terminatorowy izoluje się jako region w kierunku 3' od genu strukturalnego. Otrzymane sekwencje klonuje się i łączy w takiej orientacji aby uzyskać konstytutywną ekspresję genu nitrylazy w gospodarzu roślinnym.

156 394

Modyfikując komórki roślin uprawnych przez wprowadzenie genu funkcjonalnego wyrażającego się wytwarzaniem enzymu nitrylazy, można stosować bromoksynil, ioksynil lub analogiczny środek chwastobójczy w wielu różnych hodowlach roślin uprawnych w stężeniach zapewniających całkowite niszczenie chwastów przy jednoczesnym pozostawaniu roślin uprawnych w stanie nienaruszonym.

W ten sposób uzyskuje się poprawę ekonomiki hodowli, gdyż zużytkowanie nawozów sztucznych i wody jest bardziej wydajne i unika się niepożądanych skutków obecności chwastów.

Kasetę ekspresyjną dającą ekspresję enzymu nitrylazy można wprowadzać do wielu odmian roślin, zarówno jednoliściennych jak i dwuliściennych, takich jak kukurydza, pszenica, soja, tytoń, bawełna, pomidory, ziemniaki, gatunki Brassica, ryż, orzeszki ziemne, petunia, słonecznik, burak cukrowy, trawa kwietnikowa i podobne. Gen może być obecny w komórkach lub w częściach roślin takich jak callus (twardzina), tkanka, korzenie, bulwy, odrośle, rozłogi, małe roślinki, kiełkujące nasiona, liście, sadzonki, pyłek kwiatowy i podobnych.

Przy hodowli roślin uprawnych opornych na benzonitryl można stosować wiele różnych form użytkowych środka chwastobójczego w celu ochrony tych roślin przed chwastami, zwiększając wzrost roślin uprawnych i zmniejszając zużycie środków odżywczych. Przykładowo, bromoksynil można stosować po wzejściu roślin do niszczenia chwastów w hodowlach zabezpieczonych roślin uprawnych takich jak słonecznik, soja, kukurydza, bawełny i podobne, w formie czystego związku lub w postaci złożonych form użytkowych w kombinacji z innymi produktami.

Na pola można stosować ogólnie przyjęte ilości środków chwastobójczych w formach użytkowych, tak, aby uzyskać stężenie 0,112-4,48 kg/ha, korzystnie 0,224-2,24 kg/ha bromoksynilu. Inne środki chwastobójcze stosuje się w ilości 0,112-4,48 kg/ha składnika aktywnego. Formy użytkowe powinny zawierać inne dodatki, takie jak detergenty, środki pomocnicze, środki rozpryskujące, zagęszczające, stabilizatory i podobne. Stosuje się tu mokre lub suche formy użytkowe, między innymi proszki, koncentraty tworzące emulsje, koncentraty ciekłe i inne znane w technice. Roztwory środka chwastobójczego stosuje się w znany sposób, na przykład przez rozpylenie, nawadnianie, opylanie.

Wynalazek ilustruje następujący przykład nie ograniczając jego zakresu.

Przykład . Materiały i metody.

Enzymy restrykcyjne i ligazę T4 do reakcji ligacji stosowano zgodnie z zaleceniami producenta. Klonowanie i analizę molekularną prowadzono według przepisów podanych w wydawnictwie: Maniatis i wsp. 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Analizę klonów prowadzono w sposób opisany przez Ish-Horowitza i wsp., Nuci. Acids Res., 1981,9, 2989-2998. Do wszystkich prób klonowania stosowano E.coli, szczep MM294 (Hanahan, Mol. Biol., 1983, 166, 557-80). Antybiotyki stosowano w stężeniach: chloramfenikol /Cm/: 25//g/ml; tetracyklina /Tc/: 10/zg/ml; penicylina /Ap/: 300//g/ml.

Transformacje plazmidowego DNA w E.coli prowadzono według Mandela i Higa, J. Mol.Biol., 1970, 53, 159-162.

Wyizolowano i przeprowadzono skrinig bakterii wyodrębnionych z próbek gleby zanieczyszczonej bromoksynilem. Jeden z mikroorganizmów zidentyfikowano jako Klebsiella pneumoniae, podgatunek ozaenae. Po częściowym oczyszczeniu i scharakteryzowaniu substancji specyficznych dla bromoksynilu uzyskano z tego organizmu aktywny enzym-nitryłazę, o pozornym ciężarze cząsteczkowym równym 34 kilodaltonów.

W wyniku prowadzenia wielokrotnych hodowli pochodnych K. ozaenae na stałym agarze L, wyizolowano wariant, który nie wykazywał już zdolności utylizacji bromoksynilu jako jedynego źródła azotu, jeśli jego wzrost prowadzono w ciekłej pożywce o określonym składzie, zawierającej w litrze: 1,5 g KH2PO4, 3,5 g K2HPO4,0,1 g MgSO4-7H20,50 mg ekstraktu drożdżowego, po 0,1 % cytrynianu, glicerolu i bursztynianu oraz pierwiastki śladowe. Podłoże to zostało opisane przez Barnetta i Ingrahama J. Appl. Bacteriol., 1975, 18, 131-143 i znane jest jako wielowęglowa pożywka YETE. Ta wielowęglowa pożywka YETE zawierała ponadto 0,05% bromoksynilu. Jakkolwiek omawiany organizm nie utylizuje bromoksynilu jako jedynego źródła azotu, może on rosnąć, uzyskując pełną gęstość na pożywce L zawierającej 0,05% bromoksynilu. Wyselekcjonowano kolonię wariantu K. ozaenae i prowadzono jej wzrost w 10 ml pożywki L. Ponadto, z płytek

156 394

LB zawierających bromoksynil wybrano 3 niezależne kolonie K. ozaenae i prowadzono ich wzrost w tych samych warunkach. Te same 4 kolonie K. ozaenae hodowano jednocześnie w 10 ml pożywki L z dodatkiem 0,05% bromoksynilu. Wzrost hodowli prowadzono do uzyskania pełnej gęstości przy temperaturze 30°C i z każdej hodowli wypreparowano plazmidowy DNA techniką minipreparatywną opisaną przez Ish-Horowitza i wsp., Nuci. Acids Res., 1981, 9, 2989. Nietrawione plazmidowe DNA poddano elektroforezie w 0,5% żelu agarozowym i pasma plazmidu uwidaczniano przez barwienie bromkiem etidium.

W jednym wariancie K. ozaenae, rosnącym bądź w obecności bądź w nieobecności bromoksynilu ujawniono pojedynczy plazmid o wielkości 68 kilopar zasad. W trzech koloniach K. ozaenae wykazano większe plazmidy (90 kilopar zasad) przy prowadzeniu wzrostu w obecności 0,05% bromoksynilu. W nieobecności bromoksynilu, w dwóch spośród trzech kolonii K. ozaenae były obecne obydwie formy plazmidu. Dane te wskazują na konwersję większych plazmidów w mniejsze formy z towarzyszącą utratą około 22 kilopar zasad plazmidowego DNA przy zaprzestaniu selekcji bromoksynilem.

Wszystkie cztery kolonie hodowano w 200 ml pożywki L zawierającej 0,05% bromoksynilu. Następnie niszczono komórki w prasie francuskiej, supernanty uzyskane po wirowaniu z dużą szybkością dializowano wobec buforu zawierającego 0,05M KPO4 “pH 7,5// i 2,5 mM ditiotreitolu (DTT), po czym w oddzielnych surowych ekstraktach oznaczono aktywność nitrylazy specyficzną dla bromoksynilu. Surowy ekstrakt, uzyskany z wariantu K. ozaenae nie zawierał oznaczalnych ilości aktywności nitrylazy, podczas gdy pozostałe surowe ekstrakty K. ozaenae wykazywały specyficzną aktywność nitrylazy równą odpowiednio 0,124, 0,105 i 0,143/rmoli NHa/minutę/mg białka. Prowadzono wzrost zawiesiny komórek (200 ml) w temperaturze 30°C do punktu środkowego logarytmicznej fazy wzrostu na pożywce M9 (Miller 1972), zawierającej 0,1% glukozy i 0,04% bromoksynilu. Surowe ekstrakty uzyskano przez zniszczenie komórek, ultrawirowanie i dializę supernantu w buforze zawierającym 0,05 Μ KPO4 (pH 7,5) i 2,5 mM DTT. We wszystkich próbach stężenie substratu wynosiło 3 mM bromoksynilu. Wydzielanie NH3 monitorowano metodą Harpera (Biochem. J. 1977, 888, 685-692). Zdolność wariantu K. ozaenae do wzrostu na pożywce L zawierającej bromoksynil może być wynikiem nabytej przez ten organizm nieprzepuszczalności dla tego związku. Jednak organizm ten nie może rosnąć na określonych pożywkach utylizując bromoksynil jako jedyne źródło azotu.

Reasumując, okazało się, że kod genetyczny dla nitrylazy K. ozaenae znajduje się w plazmidach. Gen (geny) kodujące ten enzym są usytuowane w segmencie plazmidowego DNA o wielkości 22 kilopar zasad odrywanym samorzutnie z plazmidu K. ozaenae przy zaprzestaniu selekcji bromoksynilem.

Ekspresja nitrylazy specyficznej dla bromoksynilu z K. ozaenae w E.coli.

Z K. ozaenae w warunkach selekcyjnych z dodatkiem 0,05% bromoksynilu preparuje się plazmidowy DNA i DNA ten transformuje się do E.coli, szczep MM294 (thi, gyrA96, endl, HsdR17). Selekcję transformantów prowadzi się na nie zawierającym'azotu (N) stałym minimalnym podłożu agarozowym (zawierającym w litrze: 1,5g KH2PO4, 3,5g K2HPO4, 0,1 g MgSO4'7H2O i 0,1% glukozy) z dodatkiem 0,05% bromoksynilu jako jedynego źródła azotu. Po 5 dniach inkubacji na płytkach selekcyjnych pojawiło się 10 kolonii. Kolonie te posiewa się ezą na płytki z agarem L zawierającym 0,05% bromoksynilu i testuje się na obecność w MM294 auksotroficznego markera tiaminy. W żadnej z kolonii rosnących na podłożu minimalnym w nieobecności tiaminy nie wykazano, że jest to szczep E.coli MM294. Wszystkie kolonie miały zdolność wzrostu na podłożu M9 wzbogaconym w tiaminę i 0,05% bromoksynilu jako jedynego źródła azotu. Nie zaobserwowano wzrostu na tym podłożu w nieobecności bromoksynilu. Do dalszej analizy wybrano dwie z tych kolonii. Analiza surowego ekstraktu z preparatów E. coli MM294 zawierających plazmid o wielkości 90 kilopar zasad na aktywność nitralizy specyficznej dla bromoksynilu wykazała aktywność właściwą równą 0,216/rmola NHa/minutę/mg. W szczepach E. coli MM294 zawierających mniejsze plazmidy aktywność nitrylazy była nieoznaczalna. Większy plazmid E.coli o wielkości 90 kilopar zasad oznaczono symbolem pBrx 1 a mniejszy plazmid o wielkości 68 kilopar zasad oznaczono symbolem pBrxlA.

Dla potwierdzenia, że szczep E. coli MM294 zawierający plazmid pBrxl wytwarza właściwy metabolit jako wynik reakcji nitrylazy specyficznej dla bromoksynilu, prowadzi się wzrost 2 ml

156 394 hodowli E. coli MM294 (pBrxl) w czasie 24 godzin w temperaturze 30°C na pożywce M9 z dodatkiem 0,05% bromoksynilu. Próbkę przesączu hodowli poddaje się chromatografii HPLC na kolumnie Cie. Cała zawartość bromoksynilu w przesączu hodowli przechodzi w nowy pik metabolitu. Ten pik metabolitu zidentyfikowano metodą analizy spektralnej jako kwas 3',5'-dwubromo-4hydroksybenzoesowy (DBHB). Tak więc, produkt ekspresji zawartego w E. coli plazmidu nitrylaza specyficzna dla bromoksynilu, jest taki sam, jaki występuje w K. ozaenae.

Klonowanie genu nitrylazy specyficznej dla bromoksynilu w E. coli.

Dla zbadania, czy segment DNA kodujący enzym specyficzny dla bromoksynilu nadaje się do klonowania w E. coli, trawi się plazmid pBrxl enzymem BamHI, otrzymując dwa pasma o wielkości 53 i 37 kilopar zasad. Fragmenty po trawieniu BamHI poddaje się ligacji do miejsca dla BamHI w wektorze plazmidowym pACYC 184zE. coli (Chang iCoen, J. Bactieriolog., 1978,134, 1141) i transformuje do szczepu E. coli MM294. Klonowanie do miejsca BamHI w pACYC 184 powoduje w wyniku insercji inaktywację genu oporności na tetracyklinę. Wyselekcjonowano 10 opornych na chloramfenikol i wrażliwych na tetracyklinę kolonii MM294, wypreparowano z nich DNA metodą minipreparatywnej analizy klonów i DNA trawiono enzymem BamHI. Cztery klony zawierały fragment BamHI o długości 37 kilopar zasad a jeden klon zawierał po trawieniu BamHI większy fragment DNA - pBrxl o długości 53 kilopar zasad. Pięć klonów zawierało klonowany fragment BamHI znaleziony również w plazmidzie pBrxlA, korespondujący z segmentem DNA pozostającym po samorzutnej delecji 22 kilopar zasad plazmidowego DNA. Wszystkie 10 klonów hodowano w 200 ml pożywki L w obecności 20 pg/ml chloramfenikolu (selekcjonując w ten sposób plazmid), sporządzono surowe ekstrakty i oznaczono w nich aktywność nitrylazy specyficznej dla bromoksynilu. Cztery klony zawierające fragment BamHI o długości 37 kilopar zasad wykazywały aktywność nitrylazy w zakresie 0,140/rmola uwalnianego NHa/minutę/mg białka, podczas gdy w pozostałych 6 klonach nie stwierdzono wykrywalnej aktywności nitrylazy. Dane te wskazują na fakt, że gen kodujący nitrylazę specyficzną dla bromoksynilu jest zlokalizowany we fragmencie BamHI o długości 37 kilopar zasad klonowanym z plazmidu pBrx 1 i że segment DNA o długości 22 kilopar zasad odszczepiony samorzutnie przy zaprzestaniu selekcji bromoksynilem jest usytuowany wewnętrznie względem fragmentu BamHI o długości 37 kilopar zasad.

Dla potwierdzenia orientacji fragmentów BamHI w odniesieniu do wektora pACYC 184, trawiono DNA z powyższych 4 klonów za pomocą EcoRI i analizowano elektroforetycznie w 0,07% żelu agarozowym. Analizowano również połączone produkty trawienia EcoRI plazmidów pBrxl i pBrxlA. Zdefiniowano zarówno orientację fragmentu BamHI o długości 37 kilopar zasad w odniesieniu do wektora pACYC 184 jak i plazmidów oznaczonych odpowiednio jako pBrx2 i pBrx3.

Zaobserwowano ponadto, że te trzy fragmenty EcoRI są usytuowane wewnętrznie w stosunku do segmentu DNA o długości 22 kilopar zasad ulegającego samorzutnej delecji z plazmidów pBrx2 i pBrx3.

Wielkości tych fragmentów EcoRI wynoszą odpowiednio 18 kilopar zasad, 3 kilopary zasad i 1,9 kilopar zasad. Gen kodujący nitrylazę specyficzną dla bromoksynilu powinien być zlokalizowany w obrębie jednego z tych trzech fragmentów EcoRI, o ile ten gen strukturalny nitrylazy nie jest rozdzielony miejscem dla endonukleazy EcoRI.

Badano lokalizację specyficznej dla bromoksynilu nitrylazy E. coli (pBrx3). Uzyskano następujące wyniki:

156 394

Tabela 1 Nitrylaza specyficzna dla bromoksynilu jest w E. coli enzymem periplazmatycznym

Warunki prowadzenia hodowli “/	Aktywność właściwa nitrylazy ^b/
Komórki traktowane toluenem
(pożywka-L)	0,829
Komórki traktowane lizozymem
(pozywka-L)	0,796
Całe komórki (pożywka-L)	0,770
Całe komórki (pożywka-L + Brx 1)	1,25
Cale komórki (M9)	0,950
Całe komórki (M9 + Brxl)	1,45
Całe komórki (pACYC184 /M9)	0

a prowadzono wzrost komórek E. coli MM294 zawierających plazmid pBrx3 do uzyskania fazy stacjonarnej w hodowlach 5 ml w temperaturze 37°C we wskazanej pożywce. Tam gdzie wskazano, hodowle zawierały 20/zg/ml chloramfenikolu i 0,04% bromoksynilu (Brxl). Z każdej hodowli pobierano próbkę 1 ml, przemywano raz buforem nitrylazy (0,1 Μ KPO4 (pH 7,5) i komórki zawieszano w 0,1 ml tego samego buforu.

W próbkach 50μ1 oznaczano aktywność nitrylazy według Harpera (Biochem. J., 1977,

167, 685-692), z dodatkiem lub bez dodatku 3 mM bromoksynilu jako substratu.

b w pmolach NHa/minutę/mg. Białko oznaczano przy OE>eoo = 1,4, to jest 10⁹komórek/ml = 150 pg.

Powyższe dane wskazują, że enzym nitrylaza zlokalizowany jest w komórce w przestrzeni periplazmatycznej. Drugą obserwacją jest fakt, że ekspresja enzymu zachodzi w nieobecności bromoksynilu w pożywce, co wskazuje, że do ekspresji tego enzymu nie jest wymagane indukowanie bromoksynilem.

Dalsze oczyszczanie nitrylazy specyficznej dla bromoksynilu.

Przeprowadzono dalsze oczyszczanie nitrylazy z K. ozaenae uzyskując następujące wyniki:

Tabela 2

Oczyszczanie z E. coli mtrylaz.y specyficznej dla bromoksynilu (materiał wyjściowy - 6 g komórek)

Frakcja	Objętość	Białko	pmoli NHa/mrnutę	S.Ab
Ekstrakt surowy ^B'	100 ml	210 mg	18,15	0,086
35-50% NH4SO4	6 ml	83 mg	26,77	0,250
DEAE Sephadex	56 ml	19 mg	15,52	0,820

^a'’ Prowadzono wzrost komórek w temperaturze 30°C do punktu środkowego logarytmicznej fazy wzrostu na pożywce M9 zawierającej 0,04% bromoksynilu i glukozę. Surowe ekstrakty preparowano przez rozbicie komórek, ultrawirowanie 1 dializę w buforze zawierającym 0,05 Μ KPO4 (pH 7,5) 1 2,5 mM DTT. We wszystkich próbach oznaczania nitrylazy, stężenie substratu wynosiło 3 mM.

b pmole NH3/min/ng.

Kolumnę o pojemności 2,5 cm² X 10 cm równoważono w buforze zawierającym 0,05 M KPOą (pH 7,5) i 2,5 mM i 1mM EDTA.

Po podaniu próbki, kolumnę rozwijano ilością 300 ml liniowego gradientu 0,02 M do 0,40 M NaCl w powyższym buforze kolumny. Po podaniu gradientu, kolumnę przemywano buforem zawierającym IM NaCl. Zbierano frakcje po 5 ml i ilości po 0,075 ml frakcji badano na zawartość nitrylazy. Przy stężeniu 0,22 M soli wymyto pojedynczy pik wykazujący aktywność enzymu. W aktywnych frakcjach odzyskano około 75% wyjściowej aktywności nitrylazy.

Frakcje zawierające pik nitrylazy z kolumny DEAE dializowano wobec 0,02 Μ KPOą (pH 7,5) i ilości po 50μ1 (6pg białka) z każdej frakcji analizowano w 11,25% denaturowanym żelu Laemmli'ego. Bogate w białko pasmo odpowiadające aktywnemu pikowi z kolumny DEAE jest polipeptydem o ciężarze cząsteczkowym 34.000. W aktywnych frakcjach z kolumny nie wykazano innych polipeptydów. Z tych danych wynika, że nitrylaza specyficzna dla bromoksynilu jest polipeptydem o ciężarze cząsteczkowym 34.000 i prawodpodobnie produktem jednego genu.

156 394

Klon pBrx2 trawiono wyczerpująco enzymem EcoRI i wyizolowano fragment o długości około 19 kilopar zasad. Dokonano insercji tego fragmentu do wektora pACYC184 trawionego uprzednio EcoRI (3,9 kilopar zasad), otrzymując plazmid pBrx5, który transformowano do E. coli w sposób opisany uprzednio. Znanymi technikami wyizolowano plazmid i trawiono go enzymem Bglll, otrzymując fragment o długości około 6,7 kilopar zasad, który pozostawał jako insert w wektorze pACYC184. Wyizolowany plazmid pBrx7 trawiono następnie enzymami SAmal i Bglll, uzyskując fragment o długości około 3,9 kilopar zasad. Dokonano insercji tego fragmentu do trawionego Smal-BamHI plazmidu pACYC177 (3,7 kilopar zasad) (Chang i Cohen, J. Bacteriolog. 1978, 134, 1141-56)). Uzyskano plazmid z cechą oporności na penicylinę. Plazmidem tym transformowano E. coli w sposób opisany powyżej i selekcjonowano transformanty na zawierającej penicylinę pożywce selekcyjnej. Otrzymano plazmid pBrx8, zawierający gen nitrylazy we fragmencie o długości 3,9 kilopar zasad.

Plazmid pBrx8 trawiono częściowo enzymem Pstl i dokonano insercji uzyskanych fragmentów do pUC18 trawionego uprzednio Pstl (Yanisch-Perron i wsp., Gene, 1985, 33, 103-119). Uzyskane plazmidy klonowano w E. coli i prowadzono skrining na aktywność nitrylazy. Jeden klon posiadał plazmid pBrx9 o wielkości 5,3 kilopar zasad. Plazmid ten wyizolowano i następnie trawiono enzymami Pstl i Hincll, otrzymując fragment o długości 1210 par zasad, posiadający w kierunku Pstl do Hincll w stosunkowo równych odstępach miejsca restrykcyjne dla Ciał, Sali, Scal i SphI. Fragment PstI-HincII sekwencjonowano metodą Sanger'a i wsp. (proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5468). Otrzymana sekwencja (z odpowiadającymi jej aminokwasami)

przedstawiona jest

wzorem:

95

125

ATG

GAC

ACC

ACT

TTC

AAA

GGA

GCC

GCT

GTT

CAG

GCC

GAA

CCG

GTA

TGG

ARG

GAT

GCC

GCT

Met

Asp

THr

Thr

Phe

Lys

Ala

Val

Gin

Ala

Glu

Pro

Val

Trp

Met

Asp

Ala

155

1Θ5

GCA

ACA

GCC

GAT

AAG

ACC

GTG

ACG

CTA

GTA

GCT

AAA

GCC

GCA

GCG

GCT

GGC

GCG

CAG

CTC

Ala

Thr

Ala

Asp

Lys

Thr

Val

Thr

Leu

Val

Ala

Lys

Ala

Gly

Ala

Gin

Leu

215

245

GTC

GCA

TTT

CCC

GAA

TTG

TGG

ATT

CCG

GGC

TAC

CCA

GGA

TTC

ATG

CTC

ACG

CAC

AAC

CAA

Val

Ala

Phe

Pro

Glu

Leu

Trp

Ile

Pro

Gly

Tyr

Pro

Gly

Phe

Het

Leu

Thr

His

Asn

Gin

275

305

ACC

GAA

ACC

CTA

CCA

TTC

ATC

ATT

AAA

TAC

CGC

AAG

CAG

GCA

ATC

GCC

GAT

GGA

CCA

Thr

Glu

Thr

Leu

Pro

Phe

Ile

Lys

Tyr

Arg

Lys

GLn

Ala

Ile

Ala

Asp

Gly

Pro

335

365

GAA

ATC

GAA

AAA

ATT

CGC

TGC

GCG

GCT

CAG

GAG

CAT

AAC

ATT

GCG

CTC

TCC

TTT

GGG

TAC

Glu

He

Glu

Lys

Ile

Arg

Cys

Ala

Gin

Glu

His

Asn

Ile

Ala

Leu

Ser

Phe

Gly

Tyr

395

425

AGC

GAA

CGG

GCT

GGC

CGT

ACG

CTC

TAC

ATG

TCA

CAA

ATG

CTT

ATC

GAT

GCC

GAT

GGC

ATC

Ser

Glu

Arg

Ala

Gly

Arg

Thr

Leu

Tyr

Met

Ser

Gin

Met

Leu

Ile

Asp

Ala

Asp

Gly

Ile

455

485

ACC

AAA

ATT

CGT

CGA

AAG

CTC

AAA

CCA

ACC

CGC

TTT

GAA

CGA

GAA

CTC

TTT

GGC

GAA

Thr

Lys

Ile

Arg

Lys

L6u

Lys

Pro

Thr

Arg

Phe

Glu

Arg

Glu

Leu

Phe

Gly

Glu

515

545

GGT

GAC

GGA

TCG

GAC

TTA

CAG

GTC

GCC

CAA

ACT

AGC

GTT

GGT

CGG

GTG

GGT

GCC

CTC

AAC

Gly

Asp

Gly

Ser

Asp

Leu

Gin

Va 1

Ala

Gin

Thr

Ser

Val

Gly

Arg

Val

Gly

Ala

Leu

Asn

575

605

TGC

GCG

GAG

AAT

TTG

CAG

TCG

CTA

AAC

AAG

TTT

GCG

CTT

GCT

GCC

GAG

GGT

GAA

CAG

ATA

Cys

Ala

Glu

Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Asn

Lys

Phe

Ala

Leu

Ala

Glu

Gly

Glu

Gin

Ile

156 394

635

665

CAT

ATC

TCC

GCC

TGG

CCA

TTC

ACG

CTT

GGA

AGC

CCT

GTG

CTC

GTC

GGA

GAC

TCC

ATC

GGC

His

He

Ser

Ala

T rp

Pro

Phe

Thr

Leu

Gly

Ser

Pro

Val

Leu

Val

Gly

Asp

Ser

Ile

Gly

695

725

GCC

ATC

AAC

CAG

GTC

TAC

GCG

GCC

GAG

ACG

GGG

ACC

TTC

GTT

CTC

ATG

TCG

ACG

CAG

GTG

Ala

Ile

Asn

Gin

Val

T yr

Ala

Glu

Thr

Gly

Thr

Phe

Val

Leu

Met

Ser

Thr

Gin

Val

755

785

GTT

GGA

CCG

ACC

GGC

ATC

GCC

TTC

GAG

ATC

GAA

GAC

AGG

TAC

ACC

CCG

AAT

CAG

TAT

Val

Gly

Pro

Thr

Gly

Ile

Ala

Phe

Glu

He

Glu

Asp

Arg

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gin

Tyr

815

845

CTT

GGT

GGG

TAC

GCG

CGG

ATC

TAC

GGG

CCT

GAC

ATG

CAG

TTG

AAG

AGC

AAG

TCG

TTG

Leu

Gly

Tyr

Ala

Arg

Ile

Tyr

Gly

Pro

Asp

Met

Gin

Leu

Lys

Ser

Lys

Ser

Leu

875

905

TCA

CCG

ACC

GAA

GAG

GGC

ATC

GTC

TAC

GCC

GAG

ATC

GAC

CTG

TCG

ATG

CTT

GAG

GCA

Ser

Pro

Thr

Glu

Gly

Ile

Val

Tyr

Ala

Glu

Ile

Asp

Leu

Ser

Met

Leu

Glu

Ala

935

965

AAG

TAC

TCG

CTC

GAT

CCC

ACG

GGC

CAC

TAT

TCG

CGC

CCT

GAT

GTG

TTC

AGC

GTG

TCG

ATT

Lys

Tyr

Ser

Leu

Asp

Pro

Thr

Gly

His

Tyr

Ser

Arg

Pro

Asp

Val

Phe

Ser

Val

Ser

Ile

995

1025

AAC

CGG

CAA

CGG

CAG

CCT

GCG

GTG

TCA

GAA

GTT

ATC

GAC

TCA

AAC

GGT

GAC

GAG

GAC

CCG

Asn

Arg

Gin

Arg

Gin

Pro

Ala

Val

Ser

Glu

Val

Ile

Asp

Ser

Asn

Gly

Asp

Glu

Asp

Pro

1055

1085

AGA

GCA

TGC

GAG

CCC

GAC

GAG

GGG

GAT

CGT

GAG

GTC

GTA

ATC

TCT

ACG

GCA

ATA

GGG

Arg

Ala

Cys

Glu

Pro

Asp

Glu

Gly

Asp

Arg

Glu

Val

Ile

Ser

Thr

Ala

Ile

Gly

GTT

CTA

CCC

CGT

TAT

TGC

GGA

CAT

TCC

Val

Leu

Pro

Arg

Tyr

Cys

Gly

His

Ser

Fragment Pstl-HincII, zasadniczo wolny od niekodujących regionów flankujących 5' i 3' można poddać ligacji z linkerem EcoRI i trawić enzymem EcoRI, otrzymując go w stanie gotowym do wprowadzenia do roślinnej kasety ekspresyjnej przez insercję w miejscu EcoRI w pCGN451.

Plazmid pCGN451 zawiera kasetę oktopinową zawierającą około 1,566 par zasad niekodującego regionu 5' połączonych poprzez linker EcoRI z końcem 3' genu i około 1,349 par zasad niekodującego DNA 3'. Zdefiniowane przez Barkera i wsp. (Plant Molecular Biology, 1983,2.335) liczby koordynacyjne pTi wynoszą 11 207-12 823 dla regionu 3' i 13 643 do 15 208 dla regionu 5'. Fragment 5' otrzymano w sposób następujący: Mały podklonowy fragment zawierający koniec 5' regionu kodującego w postaci fragmentu BamHI-EcoRI, klonowanio w pBR32, otrzymując plazmid pCGN407. Fragment BamHI-EcoRI posiada w regionie kodującym miejsce dla Xmnl, podczas gdy pBR322 ma dwa takie miejsca. Plazmid pCGN407 trawiono Xmnl, następnie nukleazą Bal31 i do uzyskanych fragmentów dołączano linkery EcoRI.

Po trawieniu enzymami EcoRI i BamHI fragmenty frakcjonowano co do wielkości, frakcje te klonowano i sekwencjonowano. W jednym przypadku usunięto cały region kodujący i 10 par zasad niepodlegających translacji sekwencji 5' pozostawiając niepodlegający transkrypcji region 5', miejsce przyłączenia mRNA i 16 par zasad intaktnego, nie podlegającego translacji regionu 5' (w kierunku miejsca dla BamHI). Ten mały fragment uzyskano przez frakcjonowanie w 7% żelu akryloamidowym i wymycie fragmentów o długości około 130 par zasad. Ten frakcjonowany pod względem wielkości DNA poddano ligacji z M13mp9; otrzymanych kilkanaście klonów sekwencjonowano i sekwencje porównano ze znaną sekwencją genu syntetazy oktopiny. Element M13 oznaczono jako pI4 i plazmidy te trawiono enzymami BamHI i EcoRI, otrzymując mały fragment, który poddano ligacji z fragmentem XhoI-BamHI zawierającym w górę, sekwencje 5' z pTiA6 (Garfinkel i Nester, J. Bacteriol., 1980,144, 732) oraz z fragmentem EcoRI-XhoI, zawierającym sekwencje 3'.

Wytworzony fragment Xhol klonowano do miejsca Xhol w pochodnej pUC8, oznaczonej jako pCGN426. Plazmid ten różni się od pUC8 tym, że posiada pojedyncze miejsce EcoRI zablokowane polimerazą DNAI i stracone miejsca dla Pstl i Hindlll przez zanieczyszczenie endonukleazą restrykcyjną HincII w wyniku insercji linkera Xhol w miejscu dla HincII w plazmidzie pUC8. Utworzony plazmid pCGN451 posiada pojedyncze miejsce dla EcoRI do insercji sekwencji kodującej białko między regionem niekodującym 5' (który zawiera 1 550 par zasad nie podlegającej transkrypcji sekwencji 5' łącznie z prawym ramieniem T-DNA. Miejscem łączenia z mRNA i 16 par zasad nie podlegającej translacji sekwencji 5') a regionem 3' (zawierającym 267 par zasad regionu kodującego, kodon stopu, 196 par zasad nie podlegającej translacji sekwencji DNA, miejsce poliadenylacji „poli A“ i 1 153 par zasad nie podlegającej transkrypcji sekwencji 3').

Do plazmidu pCGN517, zawierającego geny oporności na tetracyklinę dokonuje się insercji fragmentu Xhol zawierającego kasetę syntetazy oktopinowej (ocs.). Plazmid pCGN517 preparuje się z plazmidu pHC79 (Hohn, Gene, 1980,11,291) przez wprowadzenie do miejsca Pstl genu Kan^rpochodzącego ż pUC4K (vieira, Gene 1982,19,259). Plazmid pCGN517 trawiono enzymem Sali, po czym w miejscu Sali dokonano insercji fragmentu Xhol.

Dokonano również insercji fragmentu Xhol do drugiego plazmidu pCGN529. Plazmid pCGN529 wytwarza się z pACYC184 przez insercję genu Kan^r z Tn5 (Rothstein i wsp., 1981, Movable Genetic Elements, str. 99, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nowy Jork) oraz insercję fragmentu Bglll o długości 2,4 kilopar zasad z pRiA4 T-LDNA (White i Nester, J. Bacteriology, 1980, 144, 710) do miejsca BamHl pozostającego po podstawieniu fragmentu Hindlll-BamHI w plazmidzie pACYC184 genem Kanr z Tn5.

Fragment Xhol zawierający kasetę ocs, do której w miejscu EcoRI dokonano insercji genu nitrylazy EcoRI, wbudowuje się do pCGN517 i pCGN529, otrzymując dwa plazmidy: odpowiednio pN 1 i pN2, które stosuje się do wprowadzenia odpowiednio do A. tumefaciens lub A. rhizogenes w celu integracji z T-DNA plazmidów Ti lub Ri. Integracji do tych plazmidów można dokonać poprzez kojarzenie trzema sposobami, w sposób opisany przez Comai i wsp. (Plazmid, 1983,10, 21-30). Prowadzi się wzrost jednodobowych hodowli gospodarza E.coli zawierających plazmidy pRK2073, pNl lub N2 oraz A. tumefaciens A722 (Garfinkel, J. Bacteriol., 1980, 144, 732) lub A. rhizogenes (White, ibid. 1980,144, 710) przez dobę i odpowiednie hodowle miesza się i nanosi na płytki AB zawierające 150/rg/ml kanamycyny. Pojedyncze kolonie powtórnie posiewa się eazą jeszcze dwa razy. Prawidłową integrację sprawdza się wykonując analizę Southerna całkowitego DNA Agrobacterium. DNA trawiony endonukleazą sonduje się z poddanym translacji typu „nick“ pBrx8.

Transformacja i regeneracja skrawków liści tytoniowych hodowanych łącznie z A. rhizogenes.

Sadzonki tytoniu hoduje się aksenikalnie (temperatura 25°C, białe światło /16 godzin/. MS/1 mg/litr IA A, 0,15 mg/litr kinetyny). T rzytygodniowe rośliny utrzymywane przez przesadzanie głównego pędu stosuje się jako donory tkanki. Młode liście (od góry ku dołowi do czwartego liścia) selekcjonuje się, wycina krążki liści o średnicy 2 mm i umieszcza w płytkach Petriego (3 cm średnicy) w 1 ml podłoża MS z dodatkiem 1 mg/litr IAA. Po dobowym utrzymywaniu krążków w całkowitej ciemności, do tych hodowli dodaje się komórki Agrobacterium (A772-xpNl lub pN2) w stężeniu 10⁸-10⁹ komórek/ml w pożywce hodowli roślinnej. Wspólną hodowlę prowadzi się przez 18-24 godziny w ciemności. Następnie skrawki liści uwalnia się od Agrobacterium przez przemycie 3 razy pożywką MS bez hormonów, zawierającą 350 mg/litr cefotaksyny (Boehringer-Mannheim). Skrawki liści umieszcza się w płytkach Petriego o średnicy 9 cm w 10 ml pożywki MS bez hormonów. Płytki „Phytagar (Gibco, 0,6%, cefotaksyna, 350 mg/litr) zamyka się szczelnie parafilmem i utrzymuje w tych samych warunkach co rośliny będące donorem tkanki. W czasie 2-4 tygodni pojawiają się korzenie, które wycina się i umieszcza w tych samych warunkach i w tej samej pożywce, z dodatkiem 2 mg/litr IAA i 2 mg/litr kinetyny. W ciągu następnych 2-5 tygodni są widoczne pędy regeneracyjne.

W stadium wzrostu szóstego liścia rośliny opryskuje się roztworem bromoksynilu, kierując strumień na roślinę w naczyniu. Każde naczynie o średnicy 10,8 mm zawierające jedną roślinę otrzymuje 2,5 ml spray'u. Następnie prowadzi się wzrost roślin w komorze w temperaturze 25°C, przy 70% wilgotności względnej, w czasie 60 godzin naświetlania. Po 9 dniach od oprysku dokonuje się obserwacji wzrostu przez liczenie nowych liści dłuższych niż 0,5 cm.

Postępując według powyższego przepisu uzyskuje się rośliny oporne na bromoksynil, mające zdolność wzrostu w uprawach polowych w obecności bromoksynilu bez widocznego szkodliwego wpływu na ich wzrost.

Przy zastosowaniu sposobu według wynalazku można uzyskać ulepszenie roślin uprawnych, nadając im oporność na środki chwastobójcze, zwłaszcza na benzonitrylowy środek chwastobójczy.

Tak więc, do gospodarza roślinnego można wprowadzać gen kodujący nitrylazę, uzyskując ekspresję tego genu, co nadaje roślinie oporność na bromoksynil. Ponadto enzym ten można wytwarzać przez klonowanie tego genu w dogodnym gospodarzu bakteryjnym, w którym następuje ekspresja enzymu. Enzymy, posiadające aktywność, która może być oznaczana, znajdują szerokie zastosowanie do oznaczania wielu substancji lub benzonitrylu jako substratu. Ponadto, enzymy i bakterie, w których zachodzi ekspresja tych enzymów mogą być stosowane w celu usuwania benzonitrylowych środków chwastobójczych z zanieczyszczonego nimi środowiska.

Jakkolwiek wynalazek opisano szczegółowo w przykładzie dla lepszego jego zrozumienia, to oczywiste jest, że w obrębie jego zakresu i załączonych zastrzeżeń mogą być wprowadzane pewne zmiany i modyfikacje.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 5000 zł.

Claims

Zastrzeżenia patento we

1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej o masie cząsteczkowej wynoszącej około 34 kilodaltonów, posiadającej aktywność właściwą wynoszącą co najmniej 0,1 //mola NHa/minutę/mg białka wobec 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu jako substratu, znamienny tym, że izoluje się Klebsiella Ozaenae zawierającą sekwencję DNA kodującą nitrilazę, hoduje się K. Ozaenae wytwarzającą nitrilazę w odpowiednim środowisku hodowlanym, przeprowadza się lizę K. Ozaenae i wyodrębnia się wytwarzaną nitrilazę.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gen nitrylazy wprowadza się do organizmu gospodarza w formie kasety ekspresyjnej zawierającej gen strukturalny nitrylazy kodujący nitrylazę specyficzną dla 3,5-dwubromo-4-hydrok.sybenzonitrylu pod kontrolą regionów regulatorowych transkrypcji i translacji, funkcjonalnych w komórce roślinnej.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako kasetę ekspresyjną stosuje się kasetę zawierającą co najmniej jedno ramię T-DNA.

4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że jako kasetę ekspresyjną stosuje się kasetę, w której region inicjacji transkrypcji pochodzi z genu kodującego syntetazę opinową.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że gen nitrylazy wprowadza się do organizmu gospodarza w formie kasety ekspresyjnej zawartej w wektorze plazmidowym zdolnym do replikacji w E.coli lub A.Tumefaciens lub w obydwu tych bakteriach.

6. Sposób we dług zastr z. 1, znami ienny tym, że ja ko ge n niti rylaz; y stos uje si ię sek wenc ję DNA: 95 125 ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ARG GAT GCC GCT Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gin Ala Glu Pro Val T rp Met Asp Ala Ala 155 185 GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GFA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTC Ala Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gin Leu 215 245 GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAA Val ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile Pro Gly T yr Pro Gly Phe Met Leu Thr His Asn Gin 275 305 ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA Thr Glu Thr Leu Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gin Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro 355 365 GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC Glu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gin Glu His Asn Il^e Ala Leu Ser Phe Gly Tyr 395 425 AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC Ser Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gin Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile 455 485 ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA Thr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu 515 545 GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC Gly Asp Gly Ser Asp Leu Gin Val Ala Gin Thr Ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn 575 605 TGC GCG GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA Cys Ala Glu Asn Leu Gin Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu Gly Glu Gin Ile

156 394 3

635 665 CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC GGC His Ile Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly 695 725 GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTG Ala Ile Asn Gin Val Tyr Ala Ala Glu Thr Gly Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gin Val 755 785 GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC' ACC CCG AAT CAG TAT Val Gly Pro Thr Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gin Tyr 815 845 CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg He Tyr Gly Pro Asp Met Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu 875 905 TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA Ser Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Iie Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala 935 965 AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile 995 1025 AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG Asn Arg Gin Arg Gin Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro 1055 1085 AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG Arg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser Thr Ala Ile Gly GTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCC Val Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser

połączoną z regionem regulatorowym transkrypcji i znajdującą się pod kontrolą tego regionu, przy czym region ten jest inny niż region inicjacji transkrypcji typu dzikiego dla specyficznej dla bromoksynilu nitrylazy bakteryjnej znajdujący się w Klebsiella.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję, w której region regulatorowy transkrypcji jest funkcjonalny w roślinach.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję, w której region regulatorowy transkrypcji jest funkcjonalny w bakteriach.

9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję posiadającą otwartą ramę odczytu dla nitrylazy specyficznej dla 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu, a na końcu 5' posiada region inicjacji transkrypcji inny niż region typu dzikiego.

10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję zasadniczo homologiczną z sekwencją DNA z Klebsiella.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako organizm gospodarza, w którym zachodzi ekspresja genu nitrylazy stosuje się komórki roślinne.