JPS63502720A

JPS63502720A - ハロアリ−ルニトリル分解遺伝子、その使用および該遺伝子含有細胞

Info

Publication number: JPS63502720A
Application number: JP62500738A
Authority: JP
Inventors: ストーカー，デイビッド・エム
Original assignee: カルジ−ン・インコ−ポレイテツド
Priority date: 1986-01-08
Filing date: 1987-01-05
Publication date: 1988-10-13
Anticipated expiration: 2010-10-18
Also published as: CN87100135A; EP0290455A4; IL81168A0; DK6487D0; AU6717587A; KR950008571B1; AU611080B2; DK464087D0; BR8700045A; KR880701050A; HU209143B; PL156394B1; DK6487A; EP0229042A2; RU2043417C1; CN1039133C; CA1331156C; JPH0795952B2; NZ218810A; EP0229042A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ハロアリールニトリル分解遺伝子、その使用および該遺伝子含有細胞関連出願の参照本発明は、１９８６年１月８日付で出願された米国特許出願番号第８１７，２２６号の一部継続出願である１９８６年３月２８日付で出願された米国特許出願番号第８４５，６６２号を更に一部継続出願した発明に対応する。これらの各先行米国特許出願の開示内容は参照により水用１１１１１中に含めるものとする。

微生物および高等生物１Ｂ胞に新規な遺伝子能力を付与することが可能となったので、新たな可能性の大通が開かれてきた。

１つの分野で、細胞毒の影響を及ぼす種々の作用的物質が関心をもたれている。

例えば、農業で使用される多くの化合物は、害虫、雑草などの駆除に使用される。多く府の場合、これらの化合物のＲ招待間は比較的長（、また長く引き延ばされる。

保存すべき種と抹殺すべき種とを区別することが望ましい場合が少なくない。例えば、雑草を選択的に駆除して作物に与える悪影響を最少限に止めることが望ましい場合がしばしばある。

大抵の場合、広範囲に亘る除草剤の多くは作物に顕著な悪影響を及ぼすため、それらの使用は基本的に発芽前に限られているならない。

したがって、細胞毒作用物質のような抑圧に抵抗性をもっよを記載しており、グリホゼート感受性を細胞にグリホゼート耐性を与えている。ｌ−１ｓｕ及びＣａ＋５ｐｅｒのＣａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

（１９７６）　２２　：　５３７〜５４３は、土壌を斧く含む培養物からイオキシニル分解物を単離することを記載しているＨｓｕおよびＣｌｅａ＋ｓｏｎのＤｉｓｓｅｒｔ、Ａｂｓｔｒ、Ｉ　ｔｒｎ、Ｂ５６（１９７６）　Ｎｏ、８゜３７０８は、３．５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベンゾニトリル系のＰｅ５ｔｉｃ　、　ｓｃｔ、（１９７４）　５：　２８７〜２９１は、３種の土壌中におけるブロモキシニルの永続性を記載している。５ｗ１ｔｈのＡｂＳｔｒＤ、Ｍｅｅｔｉｎｌｌ　Ｗｅｅｄ　Ｓｏｃ、Ａ１．　（１９７１）　Ｄｐ、１６〜１７は、リジャイナ（Ｒｅｇｉｎａ　：ツｊナダの州都）重質クレー中でのブロモキシニルの分解を記載している。３ｍ１ｔｈおよびＦ　１ｅｔｃｈｃｒのＨｏｒｔ、Ｒｅｓ、（１９６４）　４：６０〜６２ハ、３．５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベンゾニトリル類および土壌微生物について報告している。

本発明の概要本発明においては、ニトリラーゼ（ｎｉｔｒｉｌａｓｅ　）　、該ニトリラーゼをコードする核酸配列、ニトリラーゼ遺伝子が外来となっている所望の宿主によって認識される調節遺伝子の転写および翻訳調節下にあって該ニトリラーゼをコードする遺伝子を含有する構築物、該構築物を含有する宿主ＩＩＩ胞、該構築物を含有する生物、生物の一部もしくは調製物が提供される。ブロモキシニル（ｂｒｏｌｉｏｘｙｎＮ）及び／又はイオキシニル（ｉｏｘｙｎｉｌ　＞特異性ニトリラーゼは、ブロモキシニル含有地域および関連除草剤から毒性を除去し、そのような除草剤のｍ胞毒から宿主を保護する上で有用である。前記構築物は、該構築物含有宿主細胞と非含有宿主細胞とを区別する上で有用である。

本発明の詳細な説明本発明は、ハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリル特に３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾニトリル又は３．５−ショート−４−ヒドロキシベンゾニトリルの加水分解にｌｌｌ１連して、新規なりＮＡ配列、新規な構築物、形質転換ＩＢ胞、形質転換植物、ヘブチドを提供する。本発明は、前記ニトリルを加水分解し得る酵素の生成に係り、これによって前記ニトリルの除草活性を解毒し、且つ該除草剤に感受性の細胞もしくは宿主を保護し、関心のある構造遺伝子は、Ｂ５１１１胞微生物、特にベンゾニトリルを窒素源とし得ることが判っている細菌、ベンゾニトリルを唯一の窒素源とし得る細菌から得ることができる。以下の記述においてベンゾニトリル又はニトリラーゼという場合、ベンゾニトリルとはハロゲン化ｐ−ヒトＯキシベンゾニトリル特に３．５−ショート−４−ヒドロキシベンゾニトリル又は３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾニトリルを指し、ニトリラーゼとはこのようなハロゲン化ベンゾニトリルを窒素源として特に唯一の窒素源として使用することのできるニトリラーゼを指す。

本発明酵素は種々の方法で得ることができるが、有利にはブロモキシニル又はイオキシニルを含有する環境で天然に存在する細菌から得ることができる。なかでも腸内細菌、とくにクレブシェラ（Ｋ　Ｉｅｂｓｉｅｌｌａ）ａの種がよい。クレブシェラ・ニューモーニア（Ｋ　Ｉｅｂｓｉｅｌ　ｌａｄ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）特に変種オゼネ（ｏｚａｅｎａｅ）を利用することができる。土壌から分離するよりもむしろ、生物体を土壌中又は増加する高濃度のベンゾニトリルと減少１の他の窒素源とを含む伯の培地で成長仕ると、ベンゾニトリルを唯一の窒素源として利用しながら生存し続ける生物体が得られる。

ニトリラーゼ含有細菌の源にかかわらず、ニトリラーゼがベンゾニトリルの解毒に有効であるようにするため、スクリーニングはしなければならない。更に、ニトリラーゼは、ベンゾニトリル類似物すなわちハロゲンを欠いているもの、他の置換基を有してるもの等々よりも、ベンゾニトリルそのものに特異的でなければならない。したがって、本発明のニトリラーゼは水用ＩＢ書にいうベンゾニトリルに特異的であり、前記類似物に対しては比較的不活性であるか又は実質的に活性でない。窒素源としてのペンゾニトルと対比して、比較濃度の通常の窒素源例えばアンモニアの存在トでは細菌の増殖速度が顕若に低下しないこと、すなわちＩｌｌ菌の増殖が約１０％以下低減しないことが望ましい。そして非特異的なベンゾニトリルが認められない方がよい。

１つ又はそれ以上の宿主菌株が決まったなら、ニトリラーゼのコード配列を同定する技術を用いる。遺伝子は染色体又はプラスミド上に存在する。ゲノムは断片化することができ、特に制限エンドヌクレアーゼを用いてそのようにすることができ、この場合１つ又は複数のエンドヌクレアーゼを用いて約５ｋｂから５０Ｋ　ｂに亘る断片が形成される。これらの断片を都合の良いｌ菌例えば大ｌｌＱ菌中で適当なベクターにクローンし、得られすなわちプラスミド又はウィルスを、宿主の溶解、ＤＮＡの沈降、染色体ＤＮＡからのベクターＤＮＡすなわちプラスミドＤＮＡ又゛はウィルスＤＮＡの分離等々の常套手段によって単離する。

次いで、染色体外要素をエンドヌクレアゼ制限によって開裂し、種々のサイズの断片を分離、ｌ１５１定する種々の技術たとえば電気泳動、密度勾配遠心法等々によって所望の断片を単離する。

断片の大きさに応じて、遺伝子およびその両側の調節領域のサイズにもつと近づくよう断片のサイズを小さくするように操ることができる。酵素をコードする配列およびその調節両側配列を含有する断片の操作には種々の技術が存在する。種々の反応湿合物中で種々の制限酵素を使用する部分開裂を使用し、各断片をりＯ −ンしてどの断片がニトリラーゼ発現能力を有しているかを決定する。

あるいはまた、酵素を単離し、部分的に配列させる。アミノ酸配列に基づき、ブＯ−ブを！ｌｌ製して、遺伝子を有する断片を同定するものに使用する。この技術を制限酵素開裂と組み合せることにより、所望の遺伝子を存在！させるよう断片をクローンしスクリーンすることができる。更に、３ａ１３１のようなエキソヌクレアーゼを使用して断片の片方又は両方端からヌクレオチドを除去し、余分のヌクレオチドの数を更に減じることができる。

あるいはまた、遺伝子を適当な宿主中でりＯ−ンし、ブ〇−ブを用いるスクリーンによってメツセンジャーＲＮＡを単離し、適当なｉｎ　ＶｉｔｒＯ又はｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｉ訳シテム例えばアフリカッメガエル（Ｘ　ｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞もしくは網状赤血球等々において同定する。単離したメツセンジャーを次いで、逆転者および１）ＮＡボリメｌラーゼを用いる相補鎖の形成などの常套手段を用いて、ＣＤＮＡ調製に利用する。この場合、得られる構造遺伝子は、転写に関連する調節領域を欠失している。

ニトリラーゼ発現構造遺伝子を有するＤＮＡ配列を、適当な宿主細胞に導入するため、広範囲の他のＤＮＡ配列に結合させる。コンパニオン配列は、宿主の性質、ＤＡＮ配列の宿主の尋人方法、およびエビソーム維持もしくは組込みが所望かどうかに依存している。

原核生物宿主について、ＤＮＡ配列の形質転換、複合、形質導入又はトランスフェクションによる原核生物宿主への導入に種々のベクターを使用することができる。ＤＮＡ配列は種々のプラスミド例えばｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＢ９　。

ｐＲＫ　２９０等、種々のコスミド例えばｔｌＶＫｌｏＧ、種々のウィルス例えばＰ２２等を含む。

真核生物について、ＤＮＡの宿主への導入に種々の技術を用いることができる。

例えば非複製ＤＮＡ配列、プラスミドもしくはミニクロモソームを含むＣａ＋＋ −沈降ＤＮＡの利用する形質転換、Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｎにおけるＴ−ＤＮＡ含有配列を利用する形質転換、マイクロピペットもしくはエレクトロポレーションを利用する微發注剣法などである。競合的複製システムがＤＮＡ構成中に存在するか否かに応じて、ＤＮＡがエビソーム要素として複製されるか否か、ＤＮＡが宿主ゲノムに組込まれるか否か、構造遺伝子が宿主中で発現されるか否かを決定する。

エビソーム要素を使用し得る。例えば、ＴｉあるいはＲ１のようなＩＩ！誘発プラスミドもしくはその断片、Ｃａ　ＭＶ、ＴＭＶのようなウィルスもしくはその断片などである。これらは宿主に致命的なものではなく、構造遺伝子は、その発現が可能となるような状態で前記エピソード要素中に存在する。特に関心がニトリラーゼ源から得た断片は適当なりローニゲベクターを用いてクローンする。クローニゲは適当な単細胞微生物たとえば大腸菌のような細菌中で行うことができる。望ましくはコスミドを使用する。ここでは部分的又は完全な消化により、はぼ所望サイズの断片が得られる。例えばコスミドｌ）Ｖ　Ｋ　１００は適当な制限Ｎ素の作用を受けて部分的に消化され、プラスミド、染色体もしくはそれらの断片の部分的又は完全消化のいずれかにより得られた断片に連結する。バッキングをすれば、所望サイズの断片のみを宿主生物にパックし、形質導入することが確保される。

宿主生物としてはベンゾニトリル耐性のものが選択される。

感受性菌株は変異させて、形質導入体の選択基準となる適当な遺伝特徴を持たせることができる。微生物において、形質導入体は他の微生物への接合に用いられる。この場合、必要に応じ移動可能なプラスミドを用いる。ニトリラーゼに対する構造遺伝子を含有する断片のサイズを更に小さくするのに種々の技術を利用することができる。例えば、コスミドベクターを単離し、種々の制限酵素たとえばＥ　ＣＯＲＩ　、旦」リ−Ｉ［，５ｌｌａＩ等々で開裂し、得られた断片を適当なベクター、有利には先に使用したコスミドベクター中でクローンする。コスミドベクターの代わりに、他の種々のクローニングベクター、なかでも小さいサイズのもの例えばｐＡ　ＣＹ　Ｃ１７７，１１Ａ　ＣＹ　０１８４などを使用することができる。このように、好ましくは約５ＫｂｌＸＦ、一般に約４Ｋｂ以下、最も好ましくは約２Ｋｂ以下の断片をクローンして、ベンゾニトリル耐性とする。

望ましくは、断片は約ＩＫｂであり、約５Ｋｂ以下であり、好ましくは約４Ｋｂ以下であり、特に少なくとも約１０４７ｂＤであって、更に少なくとも約１１００ｂＤの両側領域を含有していてもよく、好ましくは約１．５Ｋｂ以下である。

特に関心があるのは、クレブシェラ・オゼネからのＢＯＩＩＩ−８ｍａＩ断片であり、特に約１２１０ｂｐ（７）　Ｐ　５ｔＩ−Ｈｉｎ　ｃＩＩ断片である。

ニトリラーゼ発現素は、任意の都合の良い源、原核生物か又は真核生物のいずれかによって発現される。このような源としては、例えば、細菌、イースト、糸状菌、植物１胞などがある。

分泌物が得られない場合、細胞を溶解して酸素単離し、公知方法を利用してニトリラーゼを単離する。有用な方法としては、り０マドグラフイー、電気泳動法、アフイニテイクロマトグラフィーなどがある。有利には、ブロモキシニルを、適当な官能基たとえばカルボキシル基を介して不溶性支持体に接合させ、ニトリラーゼ単離用のバッキングとして利用することができる。

ニトリラーゼ比活性は、ＨａｒｐｅｒのＢ　ｉｏｃｈｃｍ、　Ｊ　、（１９７７）約０，５マイクロモルアンモニア／１ｎ　／ｌｏ蛋白質又はそれよりも高い。

精ｌｉｔ素をいろいろの方法で使用することができる。ブ０モギシニル、イオキシニル又は他の関連ベンゾニトリルのアッセイに直接使用することができる。あるいはまた、この１ｌｉｆＩｉは、ハブテンもしくは抗原のような関心のある分析対象物に又は抗体に接合させて、診断アッセイの標識として使用することができる。このようなアッセイは米国特許第３，６５４，０９０号明細内、同第３，８１７，８３７号明細書、同第３．８５０，７５２号明１川書に記載されている。接合方法および分析対象物の濃度測定はこれらの米国特許明細書に詳しく記載されているので、これら明細書の至適開示部分を参照により本川ｉｌｌ吉中に含めるものとする。

ニトリラーゼをコードするＤＮＡ配列の利用方法もいろいろある。ＤＮＡ配列は野生型又は変異型ニトリラーゼ単離用のプロブとして利用できる。あるいはまた、ＤＮＡ配列は、組換えによる宿主への組込みに利用でき、宿主をベンゾニトリル耐性とすることができる。

植物Ｉｌｌ胞を用いる場合、構築の一部としての構造遺伝子を、組換えによる宿主ゲノムの組込みのためマイクロピペット注射により、植物硼飽核に導入することができる。あるいはまた、■レフトロボレーションを利用して、植物宿主へ導入するため構造遺伝子をその中へ導入することができる。植物宿主によって認識されない調節ジグプルを有する源から構造遺伝子を得る場合、発現のため適当な調節シグナルを導入することが必要な場合がある。ウィルス又はプラスミド例えばｆ４ｇ誘発プラスミドを使用してマツプする場合、プロモーターのＦ流側に制限部位を選択し、その中にプロモータから適当な距離をおいてＩ造遺伝子を挿入する。ＤＮＡｌＳｉ！列が適当なυ１限部位を提供しない場合、艶旦３１のようなエキソヌクレアーゼを用いて何回も消化し、合成制限エキソヌクレアーゼ部位（リンカ−）を挿入することができる。

腫瘍誘発プラスミド例えばＴｉ又はＲｉの使用はとくに関心がもたれるものであって、ニトリラーｔ（遺伝子は植物細胞染色体に組込まれる。Ｔｉ−プラスミドとＲｉ−プラスミドの使用は、ＰＣＴ国際公開ｗ　ｏ　８４／　０２９１３　、同ｗ　ｏ　８４／　０２９１９　、同ｗ　ｏ　８４１０２９２０　、及びＥＰＯ出願０１１６７１８、並びＭ　ａｔｚｋｅとＣｈｉｌｔｏｎのＪ、ＭＯｌ、ＡＩ）ｐ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８１）　１：３９〜４９に記載されている。

Ｔ−ＤＮＡの右ボーダー（ｂｏｒｄｅｒ　）又は両方のボーダーを使用する場合であって、このボーダーが、植物宿主によって認識される開始と終結用の転写および翻訳調節シグナル下に、ニトリラーゼ構築遺伝子を有する発現カセットを配置しているとき、発現カセットが植物ゲノムに組み込まれて、植物細胞中その種々の分化段階においてニトリラーゼＭＩｇの発現が行なわれる。

種々の構築物がＸＩ！］！ＦＪできて、植物細胞内での発現がなされる。

構築物は、植物宿主中でのニトリラーゼ発現のため植物中で機能する発現カセットを提供する。

転写するため、構成性又は誘発性の種々の転写開始領１＄４（プロ′モータ領域）を使用する。

ニトリラーゼをコードする構造遺伝子に転写開始領域を結合させて、開始コドンの上流、通常は開始コドンがら約２００塩基以内のところで転写を開始するうここで非翻訳５′−領域はＡＴＧを欠いている。

構造遺伝子の３′−末端は１つ又はそれ以上のストップコド結合する。この終結領域は開始領域と同じか又は異なる構造遺伝子と関連させてもよい。

シトロール下での構造遺伝子、転写の終結と適当にはメツセンジャーＲＮＡのプロセッシングを指令する終結領域を有することで特徴づけられる。

転写および翻訳調節領域として、有利にはオビン（ｏｐｉｎｅ）プロモーター及びターミネータ−領域を使用する。これらはニトリラーゼ遺伝子の構成発現を可能にする。あるいはまた、他のプロモーター及び／又はターミネータ−を使用することも可能であり、特に植物宿主中で誘発発現又は調節発現を可能にするプロモーターを使用することができる。Ｔ１−プラスミドから利用できるプロを一ター領域は、オビンプロモーター例えばオクトビンシンテターゼプロモーター、ツバリンシンテターゼプロモーター、アグロビンシンテターゼプロモーター、マンノピンシンテターゼプロモーター等々を有している。その他のプロモーターとしては、ウィルスブロモ−ター例えばＣａＭＶ領域■領域上−ター又は完全長（３５Ｓ）プロモーター、リブロース−１，５−ビスホスフエートカルボキシレート遺伝子に関連するプロモーター例えば小さいサブユニット、フ７セオリン、蛋白質貯蔵、β−コングリシニン、セルロース形成等に関連する遺伝子を挙げることができる。

種々の配列を常法に従い一緒に結合してもよい。ブロモ−ター領域は、構造運転たとえばオビン遺伝子から５′領域により、及び制限マツピングにより同定され得、配列化が選択されて同定される。同様にターミネータ−領域は構造遺伝子から領域３′として単離される。配列は適当な配向にクローンされて結合され、植物宿主中がニトリラーゼ遺伝子の構成発現が付与される。

ニトリラーゼ酵素を発現する機能遺伝子を作物植物細胞に導入すると、広範囲の作物に対して、雑草のほぼ完全または完全な除去を達成できる濃度でブロモキシニル、イオキシニル又は類似の除草剤を使用することができ、該作物に比較的悪影響を与えることはない。このため、化学肥料、水などを充分に活用することができ、雑草がもたらす有害効果を排除することができるので、実質的な軽済効果をあげることができる。

ニトリラーゼ酵素を発現する発現カセットは、広範囲の植物、単子葉および双子葉植物、例えばトウモロコシ、麦、大豆、タバコ、綿、トマト、ポテト、Ｂ　ｒａｓｓｉｃａ種、ライス、ビーナツツ、ペチュニア、ヒマワリ、サトウダイコン、芝草などに導入することができる。遺伝子は、癒合組織（仮皮）組織、根、管状部、胎芽、苗木、優、葉、若木、花粉などの植物部分又は細胞に存在し得る。

植物をベンゾニトリル耐性とすれば、作物成長を助長し、栄養物の競合体を抑圧するなどして作物を雑草から保護するのに種々の調合剤、方法を採り得る。例えば、ブロモキシニルをヒマワリ、大豆、コーン、綿などの作物に害を与えないで雑草の発芽後駆除に使用でき、あるいはまた他の薬剤と併用することもできる。

殺虫剤の有用聞を調合剤の形態でフィールドに散布し、ブロモキシニルを約０．１〜４　ｌ　ｂ／ａｃｒｅ好ましくは０．２〜２　Ｊ！ｂ／ａｃｒｅ散布し、他の除草剤をその活性成分として約０．１〜４　ｐ　ｂ／ａｃｒｅの樋散布する。

調合剤に他の添加物、例えば洗剤、助剤、拡散剤、粘着剤、安定剤などを混入してもよい。調合剤は湿式調合物でも乾式調合物でもよく、流動可能な粉末状、乳化可能な濃縮物、液体ＩＩＩなどこの分野で知られている形態にすることができる。

除草溶液は、通常の方法たとえばスプレィ、潅水、散布などにより適用できる。

下記の実施例は本発明の説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。

連結反応に制限酵素とＴ４リガーゼを、それらの製造業者の使用説明に従って、使用した。クローニングと分子分析の標準方法は、Ｍ　Ｂｎｔａｔｉｓ等の（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｏ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ　ｅｒ　Ｙ　ｏｒｋに準じた。

クローン分析はｌ　ｓｈ　−ＨＯｒｏｗｉｔｚ等のＮ　ｕｃｌ、Ａ　ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９８１）　９　：　２９８９〜２９９８に記載されている方法で行なった。

Ｅ、ｃｏｌｉ株Ｍ　Ｍ　２９４をすべてのクローニゲ実験に用いた（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ　、（１９８３）　１６６：　５５７〜８０）。

抗生物質のｆｆ１（使用した場合）は、ｃｍ（クロラムフェニコール）２５ｘ／ −１Ｔｃ　（テトラサイクリン）　１ＯＮ／ｄ、　Ａｐ　（ペニシリン）３００埒／ｄであった。

Ｅ、ｃｏｌｉにおけるプラスミドＤＮＡの形質転換は、Ｍａｎｄｅｌブロモキシニル汚染土壌サンプルからの細菌分離物をＩＩＩｗｉシ、スクリーンした。このような微生物はクレブシェラ・ニューモー　二ｙ　（Ｋ　Ｉｅｂｓｉｅｌ　Ｉａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の亜種オゼネ（０Ｚａｅｎａｅ）であった。

前記微生物のブロモキシニル゛特異体とニトリラーゼを部分精製して特徴課したものは、見掛は分子量３４ｋ［）ａｔの活性酵素を生産した。

固体し一アガー上でに、オゼネを繰り返し継代培養したところ、Ｂ　ａｒｎｅｔｔと［ｎｇｒａｈａｒＡのＪ、　Ａｐｐｌ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９７５）１８　：　１３１〜１４３に記載されているように、１リツトルあたりＫ） −１２ＰＯ４（１，５ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（３，５ｇ）、Ｍａ　Ｓｏ　−７Ｈ２０（０，１ｇ）　、イー１１ｔｂ出物（５０ｑ）、クエンＦｌｔｍ、グリセロール、コハク酸塩０．１％及び微ω元索を含む所定の液体培ダ地中での成育により、ブロモキシニルを唯一の窒素源とすることのできない変異体が分離された。前記ば培地は以下ＹＥＴＥ多炭素環炭素培地　Ｅ　Ｔ　Ｅ　ｍｕｌｔｉ−ｃａｒｂｏｎｍｅｄｉｕｍ）という。ＹＥＴＥ多炭素培地は０．０５％のブロモキシニルを含んでいた。この微生物はブロモキシニルを唯一の窒素源とするものではないが、０．０５％のブロモキシニルを含有するし−ブロス中で最高密度まで増殖する。Ｋ、オゼネ変異体コ〇ニーを選択し、１０ｄのし一ブロス中で成育させた。

また、３つの独立したに、オゼネのコロニーをブロモキシニル含有しＢプレートから選択し、同一条件下で成育させた。これらの同じ４つのに、オゼネコロニーを、０．０５％ブロモキシニル供給し一ブロス１０ｄ中で同時に成育した。３０ ℃で最高密度になるまで培養を続け、ミニブレｙ　７　（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）プラスミドＤＮＡが■５ｈ−Ｈ０ｒＯＷｉｔＺ等のＮｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８１）　９：２９８９の方法により各培養物から調製された。未消化プラスミドＤＮＡを０．５％アガロースゲル上で電気泳動すると、プラスミドバンドがエチジウムプロミド染色で可視化された。

Ｋ、オゼネ変異体微生物は、ブロモキシニルの存否に拘らず生長する単一プラスミド種（６８Ｋｂのサイズ）であることが判った。３つのに、オゼネコロニーは、０．０５％のブロモキシニル存在下での成育により、より大きなプラスミド種（９０Ｋｂ　）を示した。ブロモキシニルが存在しない場合には、３つのに、オゼネコロニーのうち２つに両プラスミド型が存在する。このことは、ブロモキシニル選択が緩和された場合、約２２ＫｂのプラスミドＤＮＡの附随的損失を伴なってより大きなプラスミド種からより小さいものへ変換することを示している。

４つのすべてのコロニーを、０．０５％のブロモキシニル含有Ｌ−ブロス２００ｄ中で増殖させた。細胞をフレンチプレスで破壊し、０．０５ＭのＫＰＯ（ｐｌ −１７，５）と２．５１１ＩＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ＞とを含むバッファーを用いて高速上清透析を行ない各粗製抽出物のブロモキシニル特異性二イトリラーゼ活性について分析した。Ｋ、オぜネ変異体の粗製抽出物は検出可能なニトリラーゼ活性を示さなかったが、他のに、オゼネ粗製抽出物はそれぞれ０．１２４．　０．１０５および０．１４３マイクロモルＮＨ３／ｗｉｎ　／ｌｌＩ！ｉＦ蛋白質のニトリラーゼ特異活性を示した。

０．１％グルコースと０．０４％ブロモキシニルを含有するＭ９培地（Ｍ　１ｌｌｅｒ　（１９７２）のＥ　ｘｐｅｒ＋ｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒａｅｎｅｔｒｃｓ　、　ｃｏｌｄ　３　ｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　）中で、細胞（２００ｍ）を３０℃で対数増殖期まで成育させた。細胞を破壊し、超遠心し、０．０５ＭＫＰＯ４吐７．５と２．５ｍＭＤＴＴを含むバッファー中上消を透析することで、粗製抽出物を得た。基質濃度はすべてのアブレイにおいて３１１１Ｍブロモキシニルであった。ＮＨ３の放出はＨａｒｐｅｒのＢ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、（１９７７）　ｉ６７　：６８５〜６９２に従ってモニターした。Ｋ、オゼネ変異体がブロモキシニル含有し一ブロス中で成育するということは、同微生物がら、この微生物は唯一窒素源としてブロモキシニルを利用する所定培地中で成育することができない。

以上より、Ｋ、オゼネニトリラーゼはコードされたプラスミドであるように思われる。この酵素をコードする遺伝子は、ブロモキシニル選択が存在しないときにに、オゼネプラスミドがら自然損失した２２ＫｂプラスミドＤＮＡセグメントに存在するものと思われる。

０．０５％ブロモキシニル選択下で成育するに、オゼネからプラスミドＤＮＡを調製し、該ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ株ＭＭ２９４　（ｔｈｉ　。

−ハｔｌＡ９６．　ｅｎｄ　ｌ　−、囲Ｒ１７）に形質転換した。窒素欠損（Ｎ −）固体アガロース最少培地（１リツトルあたりＫＨ２ＰＯ４（１，５ｇ）、Ｋ２１−ＩＰＯ４（３，５ｇ）、ＭＵ　Ｓｏ　・　７Ｈ２０（０，１９）と０．１％グルコース含有）に唯一窒素源として０．０５％ブロモキシニルを添加して、形質転換体を選択した。５日間のインキューベーション後、１ｏのコロニーが選択プレート上に現われた。これらのコロニーを０．０５％ブロモキシニル含有し −アガープレート上で再び画線培養し、ＭＭ２９４中チアミフチアミン栄養要求性マーカーテストした。チアミンが存在しない最少培地中で成育したコロニーはいずれもＬ−並置Ｍ　Ｍ　２９４菌株を示さなかった。すべてのコロニーは、チアミンと唯一窒素源としての０．０５％ブロモキシニル供給Ｍ９培地で成長することができる。ブロモキシニルを存在させないこの培地では成長は望めない。コロニーのうち２つを更に分析するため選択した。９０Ｋｂプラスミドを含むＥ　、　ｃｏｌｉＭＭ２９４の粗製抽出調製物をブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性について分析したところ、０．２１６マイクロモルＮＨ３放出／１ｎ／Ｒｇの比活性が認められた。より小さいプラスミド種を含むＥ、　ｃｏｌｉＭＭ２９４は検出可能なニトリラーゼ活性体を生産しなかった。Ｅ、ＣＯ１＋のより大きな９０ＫｂプラスミドをｐＢｒｘｌと記載し、より小さいプラスミド（６８Ｋｂ）をｐ３　ｒｘｌΔと記載する。

プラスミドｐＢ　ｒｘｌを含む［：、ｃｏｌｉ株Ｍ　Ｍ　２９４がブロモキシニル特異性ニトリラーゼ反応の結果としての適当な代謝産物を生産していることを確認するため、０．０５％ブロモキシニル供給Ｍ９培地で３０℃２４時間、ＭＭ２９４　（１）Ｂｒｘｌ）の２ｍ培養物を成りロマトグラフィーにかけた。培養物濾液中のすべてのミ導入ブロモキシニルは、新しい代謝産物ピークに換わっていた。

代謝産物ピークの同定は、スペクトル分析によったところ、３′５′　−ジブロモ−４−とドロキシ安息香酸（ＤＢＨＢ）であった。このように、Ｅ、ｃｏｌｔ中ニト中受トリラーゼ発現ドするブロモキシニル特異性プラスミドの生成はに、オゼネにみられたものと同じである。

ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ遺伝子の［、Ｃ０１ｉ中でのクローン化ブロモキシニル特異性酵素をコードするＤＮＡセグメントがＥ、ｃｏｌｉ中でクローンできるか否かを調べるため、プラスミドｐＢｒｘｌをＢａ１ＨＩで消化したところ、２つのバンド５３Ｋｂと３７Ｋｂとが得られた。、Ｂａ１ｌＨＩフラグメントをＥ、ｃｏｌｉプラスミドベクターｐＡ　ＣＹ　Ｃ１８４（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ、　Ｊ　。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９７８）　１３４：１１４１）のＦ３ａｌ１８１部位に連結させ、Ｅ、ｃｏ＋を株Ｍ　Ｍ　２９４に形質転換した。ｐＡ　ＣＹ　Ｃ１８４の堕１」■部位ヘクローニグすると、ラトラサイクリン耐性遺伝子の挿入失活が起こる。クロラムフェニコール耐性テトラサイクリン感受性Ｍ　Ｍ　２９４コロニーを選択し、ミニブレツブクローン分析ＤＮＡ　（ａ＋１ｎｉ−ｐｒｅｐ　ｃｌｏｎｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ＤＮＡ）を調製し、該ＤＮＡを堕Ｈ１で消化した。４つのクローンは３７Ｋｂ　ＢａａＨＩフラグメントを有していたが、１つのクローンはｐＢ　ｒｘｌのより大きい５３Ｋｂ　ＢａｍＨ［ＤＮＡフラグメントを収容していた。

クローン化ＢａｎＨＩフラグメントを有する５つのクローンはまた、ｐ［３ｒｘｌから２２ＫｂのプラスミドＤＮＡを自然欠失した後のＤＮＡセグメントに対応するプラスミドｐ３　ｒｘｌΔにもみられる。すべての１０のクローンを２００埒／　ｄのクロラムフェニコールの存在下（プラスミドを選択するため）　２００ｄのし一ブロス中で増殖させ、粗製抽出調製物を得、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性について分析した。３７Ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントを有する４つのりＯ−ンは０．１４０マイクロモルＮＨ３放出／Ｗｉｎ　／ｌｔｇ蛋白質程度のニトリラーゼ特異活性を示したが、他の６つのクローンには検出可能なニトリラーゼ活性は認められなかった。このデータは、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性をコードする遺伝子がプラスミドｐＢ　ｒｘｌからクローンされた３７Ｋｂ　Ｂａｇ）−１１７ラグメント上に存在すること、ブロモキシニル運択の非存在下自発損失した２２ＫｂＤＮＡセグメントが３７Ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントの内部に存在することを示している。

化し、０．０１％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。プラスミドｐＢ　ｒｘｌとｐ３　ｒｘｌΔのＥｃｏＲＩ消化物を厚め、これからも分析した。

ベクターｐＡ　ＣＹ　Ｇ　１８４に対する３７Ｋｂ　ＢａｍＨ７フラグメントの再配向をめ、それぞれプラスミドｐＢ　ｒｘ２　、ｐ［３ｒｘ３とした。３つのＥＣ０ＲＩフラグメントが、プラスミドｐＢ　ｒｘ２と１）Ｂ　ｒｘ３から自然欠失した２２ＫｂＤＮＡセグメトの内部に存在することがまた観察された。これらＥＣ０ＲＩフラグメントのサイズはそれぞれ１８Ｋｂ　、３Ｋｂおよび１．９Ｋｂである。ブロモキシニル特異性ニトリラーゼをコードする遺伝子は、ニトリラーゼ構造遺伝子がＥＣ０ＲＩ制限部位によって二分されない限り、これら３つのＥＣ０ＲＩフラグメントの１つの中に位置している。

Ｅ　、　ｃｏｌｉ（ｐＢ　ｒｘ３）のブロモキシニル特異性ニトリラーゼの位置を調べた。その結果を次に示す。

第１表ブロモキシニル特異性ニトリラーゼはＥ、ｃｏｌｉのペリプラズム酵素である。

培　養　条　件（ａ）　ニトリラーゼ特異性（ｂ）トルエン化細胞（Ｌ−ブ【コス）　０．８２９シンザイム処理細胞（［−ブロス）　０．７９６全細胞（し− ブロス）　０．７７０全細胞（し−ブロス＋Ｂｒｘ１）　１．２５全細胞（８９）　０．９５０全ＩＢ胞（８９＋Ｂｒｘ１）　１．４５全細胞／　ｐＡＣＹＣ１８ａ　（８９）　０（ａ）プラスミドｐ３　ｒｘ３を含むＥ　、ｃｏｌｉ　（ＭＭ２９４　）細胞を例示の培地中３７℃で定常増殖期まで成育させ、５ｄ培養物とした。

培養物は、その鴇記載しである場合には、２０ｎ　／　ｇｅのクロラムフェニコールと０．０４％のブロモキシニル（ＢｒＸ１）を含んでいた。各培地から１ｄを採取し、ニトリラーゼバッファー（ｏ、１ＭＫＰＯ、ｐＨ７，５）を用いて一度洗浄し、同じバッファー液０．１Ｍ１に細胞を再！！濁させた。ＨａｒｐｅｒのＢ　ｔｏｃｈｅｍ、　Ｊ　。

（１９７７）　１６７：　６８５〜６９２に準拠して、３１１１Ｍブロモキシニルを基質として使用するか又は使用しないで、５０／Ｊ９ンブルの二すラーゼ活性を分析した。

（ｂ）単位：　ｕ　ｌｌｌ０ｌｅＮ　Ｈ３／　ｌ！ｎ　／　Ｈ０蛋白質は１．４０．　Ｄ、　−１０９細胞／ｄ＝　１５０埒としてめた。

これらのデータは、ニトリラーゼ酵素のｍ開位置がｍ胞周辺腔にあることを示している。酵素が培地中ブロモキシニル非存在下で発現されるという第２の観察結果は、ブロモキシニル誘導に酵素発現が必要でないことを表わしている。

ブロモキシニル特異性ニトリラーゼの精製に、オゼネニトリラーゼを更にｆｉ製すると、次の結果が得らブロモキシニル特異性ニトリラーゼのＥ、ｃｏｌｉからの精製（出発材料は６グラムの細胞）組成（ａ）　１００ａｉ！　２１０ｉ９１８．１５　０．０８６３５〜５０″％　６Ｉｄ　８３Ｒｇ　２６．７７　０．２５０１１１’１４５Ｏ４ＤＥＡＥ　５６ａＩ　Ｌ’ｌ＋＋ｙ　１５．５２　０．８２０セフアデツクス（ａ）０．０４％ブロモキシニルとグルコースを含有するＭ９培地中３０℃で対数増殖期まで細胞を成育させた。粗製抽出物は、細胞破壊、超遠心、および０．０５ＭＫＰＯ４吐７．５と２．５１ＭＤＴＴを含むバッファー中での透析によりＷ４製した。基質濃度はすべてのニトリラーゼアッセイにおいて３ｍＭであった。

（ｂ）単位：　ｕ　ｍｏｌｅＮ　Ｈ３／　ｌ！ｎ　／　ｎ１Ｏ１０５％ＫＰＯ４ｐＨ７，５，２，５ｓＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔおよび１ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ含有バッファーで２．５ＪＸ１０ｃＩＲカラムを平衡させた。サンプルを入れ、前記カラムバッファー中０．０２Ｍ〜０．４０Ｍ線状勾配の３００ｍ１！　Ｎ　ａ　Ｃｊ！で展開した。ＩＭＮ、ｚｃ！含有バッファーを前記勾酸の緑後に入れた。５Ｉ＋ｌｉ！両分を集め、各フラクションの０．０７５ｄアリコツトをニトリラーゼ活性について分析した。酵素活性の単一ピークが０．２２Ｍｍで溶出した。

最初のニトリラーゼ活性の約７５％が活性画分で回収された。

ＤＥＡＥカラムからのニトリラーゼピークを有するが両分を、０．０２Ｍ　Ｋ　Ｆ’　Ｏ４吐７．５と、１１．２５％の変性１−ａｅａ＋ｍｌｉゲルに適用された各画分５０成（６ｕの蛋白質）とを用いて透析した。ＤＥＡＥカラムからの活性ピークに対応する蛋白質多含有バンドは分子ｆｉ　３４．０００のポリペプチドである。その他のポリペプチドは活性カラム分画によって豊富化できなかった。これらのデータは、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼが分子母約３４，０００のポリペプチドで、単一遺伝子の生産物である可能性が高いことを示している。

クローンＤＢ　ｒｘ２をＥＣ０ＲＩで完全に消化し、約１９Ｋ　ｂのフラグメントを分離した。このフラグメントをＥＣ０ＲＩ消化ＤＡＣＹ　Ｃ１８４ベクター（３，９Ｋｂ）に挿入し、前記したように、Ｅ、ｃｏｌｉに形質転換されるプラスミドｐ３　ｒｘ５を得た。このプラスミドを情報に従い単離し、旦ＵＩＩ［で消化して、ｐ　ＡＣＹＣ１８４ベクターに挿入されたままの約６．７Ｋｂフラグメントを得た。この単離されたプラスミドｐＢｒｘ７を次いで３ｓａ工およびＷ虹■で消化し、３ｓａＩ−ＢａｌＨＩ消化ｐＡｃＹｃ　１７７（３，７Ｋ　ｂ）　（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎのＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９７８）　１３４：１１４１〜１１５６）に挿入される約３．９Ｋｂの７ラグメントを得た。べ二に形質転換し、ペニシリン選択培地上で形質転換体を選択し、プラスミドｐＢｒｘ＆を得た。これは３．９Ｋｂフラグメントにニトリラーゼ遺伝子を担持している。

ローンし、ニトリラーゼ活性についてスクリーンした。１つのクローンは５．３ＫｂのプラスミドＩ）Ｂ　ｒｘ９を有していたが、これを単離し更にＰＳｔＩおよび）−１ｉｎｃＩＩで消化すると、ＰＳｔＩ〜Ｈｉｎｃ［方向に、比較的等間隔をあけてＣ１ａＩ、望ａｌＩ。

５ＣａＩおよび５ｏｈＩｔｉＩｌ限部位を有する１２１０ｂｐのフラグメントが得られた。ＰＳｔＩ　−Ｈｉｎｃ　■フラグメントをＳ　ａｎｇｅｒ等のＰｒｏｃ、Ｎａｒｌ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　ＬＪ　Ｓ　Ａ　（１９７７）　７４：　５４Ｇ３〜５４６８の方法に準じて配列化させた。この配列を（」−ドされた適当なアミノ酸と共に）次に示す。

υ−ＬＩＩＯＥ−１＠Ｉ　υ−（コ　ロい　トΦ　＜＞　ａコ藁ｆ　８；　にｔ　藁ｆ　已ち　８；　シ＝　８ｇ　ごぎｒＪｏ＋　ベー　＜つ　くコ　ＵΦ　くコ　＜９　し１　０司＜ｔｔｒ　ＬＪ二　〇−（＋Ｉ　？＋　（＋１　＜為　く切　Ｕ−〇＜　くト　じ（Ｑじ　（Ｈじじ　＜、５　Ｑ（Ｕ＜側方の５−及び３ °−非コーディング領域を実質的に持たないＰｓｔｌ−ＨｉｎａｌｌフラグメントはＥｃｏＲＩリンカ−と連結してＥｃｏＲＩで消化し得、その状態でｐｃｃＮ４５１のＥｃｏＲ１部位への挿入により植物発現カセットに導入できる。

ｐＣ（，８４５１は、前記遺伝子の３′末端にＥｃｏＲ１リンカ−を介して融合された約１，５６６ｂｐの５”非コーディング領域と約１，３４９ｂｐの３°非コーデイング１）１４八とを含むオクトビンカセットを含む、　ｐＴｉ配位（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）は、Ｂａｒｋｅｒ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅ−幻■ａｒ　Ｂシ１」ｕ−（１９８３）　２：３３５で規定されているように、３′領域の場合が１１，２０７〜１２，８２３．５°領域の場合が１３，６４３〜１５．２０８である。５′フラグメントは下記の方法で得た。

ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲフラグメントとしてコーディング領域の５°末端を含むサブクローニング処理した小さいフラグメントをプラスミドｐｃＧＮ４０７としてｐＢＲ３２２内でクローニングした。

Ｂａｍ）ＩＴ−ＥｃｏＲ１フラグメントはコーディング領域に石１部位を１つ有し、ｐＢＲ３２２は漁すエ１部位を２つ有する。ｐｃＧＮ４０７をＸｍｎ１で消化し、回１ヌクレアーゼで切除し、上部１リンカ−をこれらのフラグメントに付加した。ＥｅｏＲＴ及びＢａｍＨＩ消化の後前記フラグメントをサイズ分別（ｓｉｚｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎａ−ｔｉｏｎ）　Ｌ、得られたフラクションをクローニング処理して配列した。−例として、コーディング領域全体及び１０ｂｐの５ ′未翻訳処理配列を除去し、５°未転写処理領域と、ｍＲＮΔキャップ部位と、１６ｂ、の５°未翻訳処理領域（Ｂａａ）１１部位への）はそのまま残した。この小さいフラグメントは７％アクリルアミドゲルでのサイズ分別によって得、約１３０ｂｐの長さのフラグメントを溶離した。このサイズ分別したＤＮＡを８１３ｍｐｅ内に連結し、幾つかのクローンを配列して、その配列をオクトピンシンターゼ遺伝子の既知の配列と比較した。

８１３構築体はＰＩ３と称し、このプラスミドをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化して小フラグメントを得、これをｐＴｉ＾６（にａｒｆ　１ｎｋｅｌ及びＮｅ５ｔｅｒ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８０）　１４４ニア３２）からの上流５′配列を含むＸｈｏｌ〜ＢａｍＨＩフラグメントと、３°配列を含むＥｅｏＲＩ〜Ｘｈｏｌフラグメントとに連結した。得られたＸｈｏｌフラグメントをｐｃｔ；８４２６と称するｐＵｃ８誘導体のＸｈｏＩ部位内にクローニングした。このプラスミドはＤＮＡポリメラーゼＩで補充された単−ＥｅｏＲ１部位を有し、且つＸｈｏｌリンカ−をｐＵｃ８の唯一のＨｉｎａｌｌ部位に挿入した時に１ｉｎｅｌＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ感染によってＰｓｔｌ及びＬ−Ｉ１１部位を失ったという点でｐｔｌｃ８と異なる。このようにして得られるプラスミドｐＣにＮ４５１は、タンパク質コーディング配列を５′非コーデイング領域（Ｔ−ＤＮＡの右端を含む１，５５５０ｂｐの５°未転写処理配列と、ａ＋ＲＮＡキャップ部位と、１６ｂｐの５“未翻訳処理配列とを含む）と、３ °領域（２６７ｂ、のコーディング領域と、ストップコドン（ｓｔｏｐ　ｅｏｄｏ、ｎ）と、１９６ｂｐの３°未転写処理配列とを含む）との間に挿入するための単一のも！オクトピンシンテターゼ（ｏｃｓ）カセットを含むＸｈｏＩフラグメントをプラスミドｐｃｉｌ；Ｎ５１７内に挿入した。このプラスミドはテトラサイクリン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を有する。ｐＣにＮ５１７は、ｐＵｃ４ＫからのＫａｎ’遺伝子（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｇｅｎｅ（１９８２）　１９：２５９）を唯一のＰｓｔＩ部位に導入することによって、ｐＨｃ７９（Ｈｏｈｎ、旺ｎｅ（１９８０）　１１：２９１）から形成した。このｐｃＧＮ５１７を、唯一の鉤±１部位に挿入した５ａｌＩ及びＸｈｏｌフラグメントで消化した。

Ｘｈｏｌフラグメントは第２のプラスミドｐｃＧＮ５２９内にも挿入した。このｐｃＧＮ５２９は、Ｔｉ５（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ他、１９８１．ＭｏｖａｂｌｅＧｅｎｅｔｉｃ　ＥＩｅｍｅｎｔｓ、ｐ、９９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）からのＫａｎ’遺伝子の挿入によってｐＡｃＹｃ１８４から形成する。　Ｂａｍｔ１１部位に挿入したｐＲｉ＾４Ｔ−ＬＤＮ＾（Ｗｈｉｔｅ及びＮｅ５ｔｅｒ、Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、（１９８０）凪ニア１０）からの２．４ｋｂのＢＬＬＩＩフラグメントは、ｐへＣＹＣｌ３４のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｂａａ−旧フラグメントをＴｉ５のにａｎ’遺伝子で置換した後でそのまま残る。

ＥｅｏＲＩニトリラーゼ遺伝子がど互カセットの唯一のＥｃｏＲＩに挿入されたＯｅＳカセットを含むＸｈｏｌフラグメントをｐｃｃＮ５１７及びｐｃＧＮ５２９に挿入して２つのプラスミドρＮ１及びｐＮ２を得る。これらのプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡにＴｉ−又はＲｉ−プラスミドを組込むべく、夫々Ａ−，ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡ、ｄ■ｌ■至Ｊ」−への導入に使用される。夫々のプラスミドへの組込みは、Ｃｏｍａ　ｉ他、Ｐｌａｓｍｉｄ（１９８３）　１０：２１〜３０に記述されているように、３−ウエイメイティング（３−ｗａｙ　ｍａｔｉｎｇ）によって実施し得る。プラスミドｐＲＫ２０７３、ｐＮｌもしくはｐＮ２及びＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　＾７２２（Ｃａｒｆｉｎｋｅｌ、Ｊ、Ｂａｃｅｒｉｏｌ、（１９８０）　１先（ニア３２）もしくはＡ、７−＾４Ｔ（１’ １ｈｉｔｅ、同上（１９８０））　１４↓ニア１０）を含むＥ、ｅｏｌｉ宿主を一晩培養したものを一晩培養し、適当な培養体を混合して、１５０ｐｇ／ｍｌカナマイシンを含むへＢプレート上に伸ばす、独立コロニーを２回画線培養する。

住ｒｏｂａｅｔｅ−ｒｉ阻ＤＮ＾全体のサザン分析によって正確な組込みを確認する。エンドヌクレアーゼで消化したＤＮＡをニックトランスレーション処理したｐＢｒｘ８でプローブした。

ブロモキシニル特　ニトリラーゼ遺　子を胆汁組織　に１ＬｔＬ２．６ｋｂフラグメント上にニトリラーゼ遺伝子を担持するプラスミドｐＢｒｘ９をシリー旧で消化し、Ｂａ１３１で処理して５°側方領域の一部分を除去した。−Ｈリンカ−を付加して再閉鎖を完了した。その結果得られたプラスミドはアンピシリン耐性を与えた。このプラスミドを前述のごと（Ｅ、ｃｏｌｉに形質転換し、これらの形質転換体をアンピシリン選択媒質で選択処理ルて５．２ｋｂプラスミドｐＢｒｘ１６及びｐＢｒｘ１７を得た。これらのプラスミドは２．６ｋｂフラグメント上にニトリラーゼ遺伝子を有する。　ｐＢｒｘ１６をＢａｍＨＩで消化し、且っＨｉｎａｌｌで部分的に消化すると１．２ｋｂニトリラーゼ遺伝子フラグメントが得られた。

ＢａｍＨＩ−Ｓｅａｌで消化したｐｃｃＮ４６にＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメントを挿入して、ニトリラーゼ遺伝子フラグメントを含む６．６ｋｂプラスミドｐＢｒｘ２２を得た。

ＰＣにＮ４６　（Ｃｏｍａｉ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）　３１ヱ：７４１〜７４４）はマンノピンシンターゼ（ＮＡＳ）発現カセットであり、ＭＡＳプロモータ及び結上３゛領域を含む、　Ｉ）ＣにＮ４６の構築は下記の方法で達成した。マンノピンシンターゼプロモータ領域（ＰＩＩＡ、）を含むＴ−ＲＤＮＡ（Ｂａｒｋｅｒ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、（１９８３）　２：３２５）の一部分を担持するほぼ５．５ｋｂｐの１．阻匡フラグメント（Ｅｅｏ１３又は旺ハ）をｐＶに２３２と称するベクター内でクローニングした。

ｐＶに２３２をＥｃｏＲＩｔ”消化Ｌ　タｆ＆、Ｅｃｏ１３ヲｐＡｃＹｃ１８４ノＥｅｏＲ１部位に挿入してプラスミドｐｃＧＮ１４を得た。　ｐｃＧＮ１４をＩＩ及びＣ１ａｌにより消化（夫々前述のＢａｒｋｅｒ他の配列の部位２１５６２及び２０１２８で）してＰ。Ａｌｌ領域を除去し、Ｉ）ＣにＮ４０を得るべく址Ｉ及びＡｃｃＴで消化しておいたｐＵｃ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、）に前記Ｐ、Ａｓ領域を挿入した。このＰＭＡ１１領域は内部にり１１認織部位を含み、この部位は消化に耐えるようにメチル化される。

ｐｃＧＮ４０を除皇ＲＶ及びむ且Ｒ１で消化した。ヒ且Ｒｖ部位はＴ−ＤＮＡ内にあり、上部１部位はｐＬｌｃ１９のポリリンカー内にある。その結果ＰＭＡＩ領域を持つフラグメントが得られた。オクトピンシンターゼカセットを含むＩ）ＣにＮ４５１をＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、オクトピンシンターゼ５°領域を除去しておいたより大きい大フラグメントを分離した。オクトピンシンターゼ５°領域に代え１’　ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩＰＭＡｓ領域ヲｐｃｃＮ４５１４１ｍ　２ｍ　入Ｌ、転写開始及び終了領域をポリリンカーで分離してｐＣＩ、８４Ｂを得た。

１．２ｋｂニトリラーゼ道伝子フラグメントを含むプラスミドｐＢｒｘ２２を前述のごと（Ｅ、Ｃｏ１１に形質転換した。このプラスミドを従来の方法で分離し、Ｘｈｏｌで消化して、Ｈ＾Ｓプロモータと、２５塩基対分のバクテリア５”未翻訳処理配列を含むブロモキシニル遺伝子と、弘３′領域とを含む４．１ｋｂフラグメントを得た。この４．１ｋｂフラグメントを５ａｌｌで消化したプラスミドｐｃＧＮ７８３に挿入してほぼ３１ｋｂのプラスミドｐＢｒ×２８を得た。

バ」Ｎ■旦９」１第一バμＵμぴ１１摩４ｐｃｃ８１６７を構築すべく、υ且Ｉでの消化によりＣａＭＶのＵ且■フラグメント（ｂｐ７１４４〜７７３５）（Ｇａｒｄｎｅｒ他、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９８１）９：２８７１〜２８８８）を得、Ｍ１３＋ａｐ７ノＨｉｎｃ１１部位４：ｌ：りＤ−ニングして（Ｖｉｅｉｒａ　にｅｎｅ（１９８２）　１９二２５９）Ｃ６１４を形成した。

Ｃ６１４をＥｃｏＲＩで消化して、３５Ｓプロモータを含むＥｃｏＲＩフラグメントをＣ６１４から形成し、これをＰＬＩＣ８（Ｖｉｅｒｒａ他、旺阻（１９８２）往：２５９）の上部１部位にクローニングしてｐｃＧＮ１４６を形成した。

前記プロモータ領域をトリミングすべく、ＬＬＬ１１部位（ｂｐ７６７０）をｈ ±ＩＩ及びｂ±３１で処理し、次いでＢＪＬＬｌ！リンカｐｃｃ８５２８（後述）をｂ±ＩＩで消化し且つｐｃＧＮ１４７からのＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　−ＬＥＬＬＩ　Ｉプロモータフラグメントを挿入することによって、プロモータ領域と選択可能なマーカー（ＡＴに’　２つのにＡＮ）と３′領域とを含むｐｃＧ８１４８ａを形成した。前記フラグメントをｐＣＧＮ５２８のｈ±１１部位にクローニングして、ｈ±１１部位がｐｃｃＮ５２８のカナマイシン遺伝子の近くになるようにした。

この構築体ｐｃＧＮ５２８に使用されるシャトルベクターは下記の方法で形成した。カナマイシン遺伝子（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ他。

Ｍｏ１．Ｃｅｎ、（１９７９）　１７ヱ：６５）を有するＴｎ５を含むプラスミドを［１ｉｎｄｌｌｌ−Ｂａ見■Ｉで消化し、且つカナマイシン遺伝子を含むＨｉｎｄｌｌｌ−Ｂａ見Ｈｌフラグメントをｐ＾ＣＹＣｌ３４のテトラサイクリン遺伝子（Ｃｈａｎｇ　＆　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、１ａｅｔｅｒｉｏ１．（１９７８）　１３４．１１４１〜１１５６）内のＨｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨ１部位に挿入することによってｐｃｔ；Ｎ５２５を形成した。ｐＴｉ＾６（Ｔｈｏｍａｓｈｏ −他、　Ｃｅｌ！（１９８０）　１９ニア２９〜７３９）の匝ＩＩＩフラグメント１９をｐｃＧＮ５２５の旺１１部位に挿入することによってｐｃｃＮ５２６を形成した。　Ｘｈｏｌでの消化及び再連結によってｐＣＧ８５２Ｂから小さいＸｈｏｒフラグメントを欠失させることによりｐｃｃ８５２Ｂを得た。

ｐＨＢ９ＫａｎＸＸＩからのＢａｍｔｌｌカナマイシン遺伝子フラグメントをｐｃｃＮ１４８ａのＢａｍＨ１部位にクローニングすることによってｐｃＧＮ１４９ａを形成した。

ｐＨＢ９ＫａｎＸＸＩはυリー１部位の無い、但し〜２旦４已ｅｒハ」１内での効果的選択が可能であるようにＴｉ２Ｏ３からの＠能カナマイシン道伝子を含むｐＵＣ４に変種である（Ｖｉｅｉｒａ　＆　Ｍｅｓｓｉｎ　。

Ｇｅｎｅ（１９８２）　１９：２５９：２６８）。

ｐＣＧ８１４９ａをｈ±ＩＩ及び油ｌで消化した。　ｐＣ（：Ｎ１４９ａのこのｈ±１１−　ＩＩ小フラグメントをｈ見Ｈ１及びＳｉｔでの消化により分離したＭｌ（後述）のｌ１ｌｌ−９工Ｉフラグメントにより置換した。その結果９Ｃに８１６フが得られる。これは、全長に及ぶＣａ１ｌ／プロモータと、１＾ＴＧ− カナマイシン遺伝子と、３°末端とバクテリアＴｎ９０３型カナマイシン遺伝子とを含む構築体である。ＭｌはｐｃＧＮ５５０からのＥｃｏＲＩフラグメント（ｐＣＧ）１５８７の構築参照）であり、これをＭ１３ｍｐ９のＥｅｏＲＩクローニング部位にクローニングして、１＾ＴＧ−カナマイシン遺伝子のｂ工■部位がＭ１ｊ＋Ｈ９のポリリンカー領域に近くなるようにした。

７０９１＾Ｔｆ；−３°−のｐｃｃＮ５６６はｐ　Ｕ　Ｃ１３−ｃ　ｖａ　（【」±±卜しＵ−、Ｐ　ｈ　、　Ｄ　、論文、ＵＣ−Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

１９８５年）のＥｃｏＲＩ４１ｉｎｄ１１１部位に挿入されたｐυＣｌ８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　、同上）のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌリンカ−を含む、　０ＲＦＩ及び２（Ｂａｒｋｅｒ他（１９８３）　、同上）を含むｐＮＷ３１ｃｍ８．２９−１’（Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ他（１９８０）　、叶Ｉ＋　１９ニア２９）のＵ工ｄｌｌｌ−８，±ＩＩフラグメントをｐＣＧＮ５６６のトユｃｌｌｌＩ−ｊｌ上１１部位にサブクローニングしてｐｃＧＮ７０３を形成した。

ｐＴｉ八６へｐＴ１１５９５５の塩基２３６５〜２９２０に対応する（Ｂａｒａｋｅｒ他。

１９８３、同上）からの転写体７の３′領域を含むｐｃＧＮ７０３の５ａｕ３＾フラグメントをｐＵｃ１８（Ｙａｎｉｓｅｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　（１９８５）、同上）のｍ１部位にサブクローニングしてｐｃＧＮ７０９を形成した。

（以下余白）己四１η澱！Φ」」或工（３５Ｓプロモーター−３′領域）ＣａＭＶ−３５Ｓプロモーターと、１＾ＴＧ−カナマイシン遺伝子と、ｐＴｉ＾６のシｔｍＨＩフラグメント１９とを含むｐｃＧＮ１６７（構成については１」参照）のＨｉｎｄｌｌＩ−ＢａｍＨＩａラグメントを、ｐＵＣ１９（１，−；１ｉＮｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　；　＋１ｊｉｌＬＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８５））の旺ｍＨＩ−Ｈｉｎｄｌ１１部位にクローニングし、ｐｃＧＮ９７６を創出した。

ｐｃＧＮ９７６ノ０．７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ７５グ、Ｉ　’ｙ　）　（３５Ｓ７ｏ　モーター）並びにｐｃＧＮ７０９の０．５ｋｂヒ邸Ｉ−針上Ｉフラグメント（トランスクリプト７：３′、ｐｃＧＮ７０９の構成についてはＬｌ参照）をｐＣに８５６６のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａ土土部部位挿入することによって３５Ｓプロモーター並びにトランスクリプト７からの３′領域を発生させ、ｐｃＧ８７６８ｃを創出した。

ｔＣＧＮ７８３のｐｃＧＮ７６６ｃの０．７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ＣａＭＶ−３５Ｓプロモーター）と−ｐｃＧＮ７２６ｅの１．５ｋｂむｏＲＩ−鉢 ±！フラグメント（１−＾Ｔに−ＫＡＮ−３’領域）とを、ｐＵｃ１１９（Ｊ、　Ｖｉｅｉｒａ、　ＲｕｔｇｅｒｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎ、Ｊ、）の旧ｎｄｌｌＩ−Ｓａ１１部位へと連結して、ｐＣＧＮ７７８を生成した。

ｐｃｃＮ７７８の２．２ｋｂ領域の、ＣａＭＶ−３５Ｓプロモーター（１−＾ＴＧ−に＾Ｎ−３′領域）を含む肛りｌｌｌ−陸土ＩフラグメントでｐｃｃＮ７３９の」１ｎｄＩ［！−５ａｌｌポリリンカー領域を置換して、ｐｃＧ８７８３を生成した。

ｐＢｒｘ１７をＢａｍＦｌｌで消化し、かつ一部）１ｉｎａｌｌで消化して１．２ｋｂニトリラーゼ遺伝子フラグメントを得た。ＢａｍＨｌ−ＨｉｎｅｌＩフラグメントをＢａｍＨｌ−Ｓｍａｒで消化したｐｃＧＮ５６６に挿入して、ニトリラーゼ遺伝子フラグメントを含む３．７ｋｂプラスミドｐＢｒｘ２５を創出した。

ｐＣ（：Ｎ５６６は次のように構成した。ｐＵｃ１３（Ｃｍ’）（Ｋｅｎ　Ｂｕｃｋ−Ｌｗ博士論文、　Ｕ、Ｃ，、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９から得たポリリンカーを線形化したｐＵｃ１３にそれぞれ挿入して、クロラムフェニコール耐性標識を有するｐＣＧ８５６６を得た。

１．２ｋｂニトリラーゼ遺伝子フラグメントを含むプラスミドｐＢｒｘ２５を、先に述べたように形質転換してＥ、　ｃｏｌｉにした。プラスミドを通常方法で単離し、かつＢａｍＨｌ及びＥｃｏＲＴで消化して、再び１．２ｋｂニトリラーゼ遺伝子フラグメントを得た。ｂ見Ｈ１及びＥｃｏＲＩフラグメントを１リ−Ｈｌ及び上部Ｉで消化したｐｃｃＮ４６に挿入して、ニトリラーゼ遺伝子フラグメントを含む６．６ｋｂプラスミドｐＢｒｘ２７を創出した。

ｐＢｒｘ２７を、先に述べたように形質転換してＥ、　ｃｏｌｉ−にした、このプラスミドを通常方法で単離し、かつＸｈｏＩで消化して、ＭＡＳプロモーターと、翻訳された配列中に細菌の５′位の１１塩基対を含むブロムオキシニル遺伝子と、姐１′領域とを含む４．１ｋｂフラグメントを得た。　４．ｌｋｂフラグメントを部上■で消化したｐＣＧＮ７８３に挿入して、約３１ｋｂのプラスミドｐＢｒｘ２９を得た。

ニド１ラーゼ　のプラスミドｐＢｒｘ２８及びｐＢｒｘ２９を形質転換して、〜■旦胎■ニーｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株に１２にした。（Ｎｅｓｔｅｒ、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉ−ｅｒｏ、　（１９８１）　３５：　５３１　；　Ｈｏｅｋｅｍａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８３）３０３：　１７９）Ｋ１２（ｐＢｒｘ２８）及びに１２（ｐＢｒｘ２９）を用いて、リュウキュウベンケイ属植物（Ｋａｌａｎｃｈｉ５ｅ）にえい瘤（ｇａｌｌｓ）を形成した（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９８０）　１４４＋　７３２）。

約１ｇＭ（新鮮重量）のえい瘤組織を、０．１ＨのｐＨ７，５）リスと、１０ｉ＋ＭのＥＤＴ＾と、０．１５８のＮａＣｌと、０．０５％のＮＰ−４０と、２５ｙｆＩ／１１のＢＳ八と、１３１８のＤＴＴと、０．１ａｕｇ／ｉ１のロイペプチンとを含有する緩衝液中の液体窒素中で擦り砕いた。複数の試料を、ポリビニルピロリドン（Ｓｉｇｗ＋ａ）０．０５２の添加後に均質化し、次いで４℃で１５分間、１５，０００ｇで遠心分離した。精製ニトリラーゼをウサギに注射することによって調製した抗血清２５ｕｌ、並びにＳ、　ａｕｒｅｕｓ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の１０％（、／Ｖ）懸濁液２５０ｕ１を各上澄みに添加し、４℃で１６時間培養した０次に試料を遠心分離し、ペレットを２０ｚＨのｐＨ７，５）リス、１ｍＨのＥＤＴ＾、１５０ｇＭのＮａＣＩ並びに０．０５％のＮＰ−４０で２回洗浄した。ベレットを、０．１２５８のｐｌ＋６．８　）リス、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロ−ル並びに１０％のＢＭｅを含有する全量１００ｕ１中に再び懸濁させ、９０℃で２分間加熱した。試料全体を１０％アクリルアミドゲルにおいて電気泳動に掛けた（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｖ、　Ｋ、、　Ｎａ−匡１世：　６８０−６８５　（１９７０））、分解したポリペプチドを、Ｂｕｒｎｅｔｔｅが述べている（八ｎａ１．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１１２：　１９５−２０３（１９８１））ようにしてニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉ−ｅｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌｌ）に移した。その後ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｂｅｒ及び５ｃｈｕｅｌｌ）をＢＬＯＴＴＯ（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｇｅｎ、＾ｎａ１．　Ｔｅｅｈｎｏｌ、　１．３８−４２　（１９８３））において４２℃で１〜３時間培養し、続いて抗ニトリラーゼ血清の１：５０溶液を含むＢＬＯＴＴＯにおいて室温で一晩培養した。フィルターを、２０ｚＨのｐＨ７，５）リス並びに１５０１ＭのＮａＣｌ中で１０分間、０．０５％のＴｗｅｅｎ　−２０を含有する同上緩衝液中で２０分間、及びＴｗｅｅｎ−２０を含有しない同上［ｊ液中で更に１０分間洗浄した１次に、１０’ｅｐｍ／ｚ１の目ｓ■標識蛋白質＾（９ｕ　Ｃ１／ａｙ；　ＮＥＮ）を含むＢＬＯＴＴＯをフィルターに付加して、室温で２時間の培養を行なった。フィルターを、５０ｙＭのｐＨ７，５）リス、ＩＮのＮａＣｌ並びに０．４％のサルコシル中で一晩洗浄した。濯いで乾燥した後フィルターを、Ｄｕｐｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ増感血清の使用下に一７０℃でＫｏｄａｋ　ＡＲＸ線フィルムに対し露出した。

＾、ｒｈｉｚＯｅｎｅＳと丑培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｅ　したタバコ葉　の５びタバコを、異種植物を交えずに栽培する（２５℃、白色光（１６時間）　：　ＭＳ（ＩＡ＾ｌｚｙ／Ｌ、キネチン０．１５ｘｙ／Ｌ））、主新芽移植（鴎ａｉｎ　５ｈｏｏｔ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）によって維持した３週齢の上記植物を、組織提供体として用いる。（頂がら４番目までの）若葉を選択し、これらの若葉から直径２ｘｚの葉ディスクを打ち抜き、打ち抜いたディスクをペトリ皿（直径３０１）内の、Ｉ＾＾１ｘｇ／Ｌを伴ったＭＳ培地１ｘｌ中に置く、ディスクを一晩完全な間中に保持した後、これらの培養物に、〜■且狛鷺１見ｒｉ−Ｖ（＾７７２ｘｐＮ１あるいはｐＨ２）の細胞（植物培養基１ｚｌ当たり１０”〜１０９個）を付加する。共培養を、間中で１８〜２４時間実施する。ホルモンが欠如しており、がっｅｅｆｏｔａｘｉｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎ−ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）３５０ｚｇ／Ｌを含有するＭＳ培地で３回洗浄することによって、葉片からむ工ｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｍ−を除去する０葉片を９ｃｘベトリ皿内の、ホルモンを伴わないＭＳ培地１０１１中に移す。

Ｐｈｙｔａｇａｒ（（＋１ｂｃｏ　Ｏ，６％；　ｃｅｆｏｔａｘｉｎｅ　３５０Ｂ／Ｌ）ペトリ皿をパラフィルム（ｐａｒａｆ　ｉ　１ｍ）で密閉し、組織提供体植物と同一条件下に保持する。２〜４週間後までに根が現れ、この根を切除して、上記と同じ培地に■＾＾２ｘｇ／Ｌ及びキネチン２ｚｇ／Ｌを加えたものの中に上記同一条件下に置く、更に２〜５週間後に、再生する新芽が目視できる。

６葉段階の植物にブロムオキシニル溶液を、ポットに植えた植物へ向けての噴霧により付与する。植物を１本ずっ植えられた各４″ポツトは、２．５ｖｌの噴霧液を受容する。植物を栽培ケース内で、温度２５℃、相対湿度７０％、及び光照射期間６０時間で成長させる。０．５ｃｍより長い新葉を計数することによって、噴霧後９日間の成長を記録する。

上述のような手続きを辿ることによってブロムオキシニル耐性のｍ物が取得可能であり、この植物はブロムオキシニルが存在する畑に、該植物自体の成長に重大な悪影響を及ぼさずに適用することができる。

本発明は、植物を除草剤に耐性に、特に生乙Ａ三り去Ｅ除草剤に特異的に耐性にすることによって該植物の改良をもたらす。即ち、ニトリラーゼに関してコードする遺伝子を植物ホストに導入し得、その結果上記遺伝子は発現して、植物に生乙ｆ二り九劇耐性を付与する。そのうえ、遺伝子を適当な細菌ホスト中でクローニングし、それによって酵素を発現させることによって酵素を生成し得る。モニター可能な活性を有する酵素は、様々な分析対象（ａｎａｌｙｔｅｓ）あるいはベンゾニトリル基質についてのアッセイにおいて幅広く用いることができる６また、酵素並びに酵素を発現する細菌は、５３ζゾＳ１上！ルー除草剤を汚染環境から除去するのに用いることも可能である。

本明細書では本発明を、明確に理解されるように図解及び実施例に即して詳述したが、請求の範囲各項の範囲内で幾つかの変更及び変形を実施し得ることは明らかであろう。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロモキシニルを基質として少なくとも約０．１マイクロモルＮＨ３／ｍｉｎ．／ｍｇ蛋白質の比活性を有する純度で、約３４ｋｄの実質的に純粋な細菌ニトリラーゼ。
２．３，５−ジハロゲン化−Ｐ−ヒドロキシベンゾニトリル特異性ニトリラーゼを発現する外来遺伝子を有する細菌宿主。
３．約３４ｋｄのニトリラーゼを含有し、プロモキシニルを基質として少なくとも約０．１マイクロモルＮＨ３／ｍｉｎ．／ｍｇ蛋白質の比活性を有する組成物。
４．前記ニトリラーゼが細菌ニトリラーゼである請求の範囲第３項に記載の組成物。
５．前記細菌ニトリラーゼがクレプシエラ由来のニトリラーゼである請求の範囲第４項に記載の組成物。
６．少なくとも約０．５マイクロモルＮＨ３／ｍｉｎ．／ｍｇ蛋白質の比活性を有する請求の範囲第３項に記載の組成物。
７．３．５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリル特異性ニトリラーゼを発現する外来遺伝子を有する細菌宿主。
８．細菌宿主が大腸菌である請求の範囲第７項に記載の細菌宿主。
９．植物細胞内で機能する調節領域の転写及び翻訳調節下にあって、プロモキシニル及び／又はイオキシニル特異性ニトリラーゼをコードする構造遺伝子を有する発現カセット。
１０．前記ニトリラーゼが細菌ニトリラーゼである請求の範囲第９項に記載の発現カセット。
１１．前記カセットが少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ端を有する請求の範囲第９項又は第１０項に記載の発現カセット。
１２．前記転写開始領域がオピンをコードする遺伝子由来である請求の範囲第９項，第１０項又は第１１項のいずれかに記載の発現カセット。
１３．請求の範囲第９項に記載の発現カセットを有し、大腸菌及びアグロバクテリウム・ツメフアシエンスのうち少なくとも一方で複製可能なプラスミド。
１４．前記発現カセットが少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ端を有する請求の範囲第１３項に記載のプラスミド。
１５．明細書中に実質的に記載されており、クレプシエラ内に見出だされるプロモキシニル及び／又はイオキシニル特異性細菌ニトリラーゼに対する野生型転写開始領域以外の転写調節領域の調節下にあるＤＮＡ配列。
１６．前記転写調節領域が植物内で機能する請求の範囲第１５項に記載のＤＮＡ配列。
１７．前記転写調節領域が細菌内で機能する請求の範囲第１５項に記載のＤＮＡ配列。
１８．３，５−ジハロゲン化−Ｐ−ヒドロキシベンゾニトリル特異性ニトリラーゼ酵素をコードする読取り枠を有し、その５′末端に野生型転写開始領域以外のものを有するＤＮＡ配列。
１９．前記ニトリラーゼ酵素が細菌ニトリラーゼ酵素である請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡ配列。
２０．クレプシエラ由来ＤＮＡ配列と実質的に相同な請求の範囲第１９項に記載のＤＮＡ配列。
２１．請求の範囲第９項乃至第１２項のいずれか１つに記載の発現カセットを含有する植物細胞。
２２．請求の範囲第２１項に記載の植物細胞を含む植物。
２３．３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリル特異性ニトリラーゼを産生するクレプシエラ・オゼネを単離し、適当な栄養培地中で該クレプシエラ・オゼネを増殖させ、そして、該クレプシエラ・オゼネを溶歯し該ニトリラーゼを単離することから成る、３，５−ジハロゲン化−Ｐ−ヒドロキシベンシエトリル特異性ニトリラーゼの製造方法。
２４．選択特性に関して細菌をスクリーニングし該選択特性を有する該細菌を選択し、該細菌のゲノムを切断し所望の大きさの範囲を有する断片を産生し、該断片を細菌内の適当なベクター上でクローニングし該選択特性を有する酵素を選択し、そして、該選択特性を有する該酵素を発現する構造遺伝子を有するＤＮＡ配列を単離することから成る、前記選択特性を有する酵素の獲得方法。