CN102936590B - 一种腈水解酶及其基因序列与应用方法 - Google Patents
一种腈水解酶及其基因序列与应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种新型腈水解酶及其基因的克隆和表达。从恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（编号CGMCC 3830）的总DNA获得腈水解酶基因SEQIDNO:1，该基因全长1113个核苷酸，编码370个氨基酸SEQIDNO:2。本发明还公开了重组腈水解酶的构建、高效表达和纯化的方法，以及纯化重组腈水解酶的最适作用温度和pH。以质粒pET28a(+)为表达载体，以E.coli Rosetta-gami(DE3)为表达宿主，实现腈水解酶基因的高效表达。重组腈水解酶最适作用温度为55℃，最适作用pH为7.5，能高效转化3-氰基吡啶为烟酸，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及源自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号CGMCC No.3830）的一种新型腈水解酶的基因序列，以及腈水解酶工程菌的构建、重组腈水解酶的高效表达和分离纯化，属于酶基因工程及酶工程领域。
背景技术
腈水解酶能够催化腈类化合物转化为具有广泛应用价值的羧酸类化合物，如丙烯酸、扁桃酸、烟酸、异烟酸、亚氨基二乙酸、甘氨酸等。同时该酶可以用于处理含有腈的废水和腈污染的有毒废水。腈水解酶作用底物的广泛性及优良的化学、区域、立体选择性使其在羧酸合成中表现出巨大应用潜力，在制药、饲料、食品、环保等领域具有良好的应用前景。
烟酸，又称为3-吡啶甲酸，是人体必需的13种维生素之一，广泛应用于食品和饲料添加剂。烟酸作为药物除了能够治疗糙皮病外，还可以用于治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、糖尿病等。另外烟酸可作为形成活性污泥的生化激素、空气和废气的除臭剂。烟酸在染料、感光材料、洗涤剂等方面也有一定的应用。烟酸的生产可采用化学方法和生物方法合成，目前在工业上，仍主要采用化学法来进行烟酸的生产，如氨氧化法、气相氧化法、电解氧化法和吡啶羟基化法等，所采用原料一般为3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。如专利CN200810058492.4公开了以吡啶为溶剂，二氧化硒为氧化剂，3-甲基吡啶为原料合成烟酸的方法，反应温度为100~150 ℃，反应选择性在98.5%以上，但产品收率仅40~50%。专利CN95191372.7公开了以3-甲基吡啶为原料，在钒、钛氧化物催化剂存在下，按氧：3-甲基吡啶摩尔比15~40，水：3-甲基吡啶摩尔比10~70条件下进行一步气相非均相催化氧化反应，烟酸收率为82~86%，但该法反应温度250-290℃，对设备要求较高，能耗较大，而且收率偏低。从这些情况可以看出，化学合成法产率较低，产品副产物较多，需采用价格昂贵的催化剂，产品的后续分离纯化困难，而且能耗偏高，污染较严重。因此，化学法应用于烟酸制备仍存在诸多不足之处。
相对于传统化学方法，生物催化法反应条件温和，环境友好，催化剂易于制备，催化效率较高，选择性强且成本较低，适合于工业化生产，为烟酸的大规模制备提供了一条行之有效的途径。自1988年，Mathew等采用能产腈水解酶的菌株Rhodococcus rhodochrous JI 催化3-氰基吡啶合成烟酸，此后陆续报道能产腈水解酶的菌株N. rhodochrous LL100-21、Rhodococcus sp、Bacillus pallidus Dac521 、Nocardia globerula NHB-2、Rhodococcus sp. NDB 1165 、Rhodobacter sphaeroides LHS-305 等微生物的游离细胞或固定化细胞被应用于催化3-氰基吡啶合成烟酸。为了进一步提高催化剂的稳定性及催化效率，同时为深入了解腈水解酶的分子机理，很多研究者对野生菌腈水解酶的基因进行克隆表达。但是应用于催化3-氰基吡啶转化为烟酸的野生菌的腈水解酶基因的克隆、表达、酶学性质报导不多。目前国内没有对恶臭假单胞菌腈水解酶基因的克隆、表达的研究。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）为本实验室筛选到的一株具有腈水解酶活性的菌株，能够催化3-氰基吡啶产烟酸。此外，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）所产的腈水解酶还能够转化4-氰基吡啶、2-氯-4氰基吡啶、亚氨基二乙腈、氰基吡嗪、甘氨腈等腈类化合物产生相应的酸。因此恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）腈水解酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达，为其实际应用及作用机理研究显得非常重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的腈水解酶及其基因的克隆方法，该腈水解酶由SEQ ID：2所示的氨基酸序列构成，由SEQ ID：1所示的基因序列编码。该腈水解酶由一株恶臭假单胞菌产生，该株恶臭假单胞菌于2010年5月11日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3830，分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4。
本发明的另一个目的是提供包含本发明基因的质粒及包含本表达质粒的宿主细胞。
为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案在于：
1、所述的腈水解酶完整基因序列的克隆方法。
（1）恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）腈水解酶基因部分序列（Nit M）的克隆：将Pseudomonas属腈水解酶氨基酸序列进行同源比对，采用CODEHOP软件进行引物设计，经DNAMAN软件进一步分析，设计一对简并引物P1和P2，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）总DNA为模板克隆Nit M序列：
P1: 5’-GGCGGAAGCTGaarccnacnca-3’
P2: 5’-ACGTCGGGCCTGswrtartgncc-3'
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为95℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55-65 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌(Escherichia coli) JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上。经37 ℃培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，以P1和P2为引物PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定。
（2）恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830） 腈水解酶基因5’端序列（Nit 5’）的克隆：根据分离纯化恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）所产腈水解酶测得的N端序列设计简并引物P3，根据上述得到的Nit M序列设计引物P4，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）总DNA为模板克隆Nit 5’端序列：
P3: 5’-ATGGTRACATAYACNAAYAA-3’
P4: 5’- TCTACATGCGTCGGCTTCAGCTT-3'
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50-60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD-19 T载体连接后转化E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上。经37 ℃培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，以P3和P4为引物PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定。
（3）恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）腈水解酶基因3’端序列（Nit 3’）的克隆：根据上述得到的Nit M序列设计三条特异性引物P5、P6和P7，用上述三条引物和Tail-PCR方法中所用的随机引物，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）总DNA为模板克隆Nit 3’端序列：
P5: 5’-CGATGGCGGCAGCCTCTACATGAG-3’
P6: 5’-GACGAAAGCTGAAACCCACTCATGTA-3’
P7: 5’-CCAGACCCCAACCAAATACGCGATGT-3’
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为Tail-PCR方法中所用的条件。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体连接后转化E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上。经37℃培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，以P7和NAP（随机引物）为引物PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定。
（4）腈水解酶基因的生物信息学分析：将Nit M序列、5’端序列和3’端序列进行拼接，拼接序列在NCBI上进行分析，获得腈水解酶的开放阅读框（OpenReading Frame），进而推导出腈水解酶的氨基酸序列。
2、所述的腈水解酶基因的工程菌的构建和表达方法。
（1）含编码腈水解酶基因的表达质粒的构建：设计含有NdeI和ECORI酶切位点的引物P8和P9，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）总DNA为模板克隆腈水解酶全长基因序列：
P8: 5’-GGATATCGGATATCCATATGGTTACGTACACGAATAAGTTC-3’
P9: 5’-CCGGAATTCTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3’
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50-60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体连接后转化E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上。经37 ℃培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，酶切验证插入目的片段的质粒进行序列测定，测序正确的命名为pMD19T-Nit。
将质粒pMD19T-Nit和pET-28a(+)分别进行双酶切后割胶回收，割胶回收片段连接后转化大肠杆菌E. coli Rosetta-gami(DE3)感受态细胞，在含卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板培养过夜，挑取单菌落接入含有卡那霉素和氯霉素抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，酶切验证插入目的片段的质粒命名为pET28a(+)-Nit。
（2）重组腈水解酶的诱导表达：将重组菌体E. coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit接入含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中37 ℃培养过夜，转接至新鲜的LB培养基中37 ℃培养至OD600达0.8-1.0，添加终浓度0.2-1.3 mM的IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）在25-30 ℃下进行产酶诱导4-24 h，重组菌株表现出腈水解酶活性。
（3）重组腈水解酶的纯化及酶学性质：将上述获得的重组菌株的发酵液离心后收集菌体，菌体洗涤后超声破碎。通过高速离心所得上清液即为无细胞抽提液。采用Akta系统纯化重组腈水解酶，Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用缓冲液A冲洗至平衡，然后上样，待完全吸附后，分别用含缓冲液A和含400 mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，收集各阶段洗脱峰，活力组分在50 mM 磷酸缓冲液（pH7.4）中透析过夜后，得到纯化的腈水解酶。通过SDS-PAGE分析纯化后的腈水解酶的纯度和分子量大小，并测定纯化酶的酶活及反应最适pH和最适温度。
本发明提供了一种新的腈水解酶基因完整DNA序列的克隆及其序列，腈水解酶工程菌E. coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit的构建及重组腈水解酶的高效表达和纯化。本发明所涉及的腈水解酶为目前国内P．putida 腈水解酶的首例报道。经Blast比对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）与已报道P．putida MTCC5100 腈水解酶氨基酸的同源性仅为40%，与目前所报道的所有腈水解酶同源性最高的仅达62.1%，说明源于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）的腈水解酶为一种新型腈水解酶。重组菌株E. coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit表现出较高腈水解酶活性，纯化腈水解酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为7.5，该酶能有效地将底物3-氰基吡啶转化为烟酸。此外，重组菌株发酵周期短，催化效率高，适合于工业生产烟酸的需要。
附图说明
图1：重组腈水解酶分离纯化SDS-PAGE图谱。
泳道1：无细胞抽提液上清；泳道2：为纯化后的腈水解酶；泳道3：标准蛋白分子量Marker
图2：重组腈水解酶的最适反应温度（以3-氰基吡啶为底物反应）。
图3：重组腈水解酶的最适反应pH（以3-氰基吡啶为底物反应）。
pH6-7.5为柠檬酸钠缓冲液，pH7-8为磷酸钠缓冲液，pH7.5-8.5为Tris-HCl缓冲液，pH8.0-9.5为氯化铵缓冲液。
具体实施方式
实施实例1
本实施例说明腈水解酶基因部分序列（Nit M）的克隆方法。
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）Nit M序列的克隆：将Pseudomonas属腈水解酶氨基酸序列进行同源比对，采用CODEHOP软件进行引物设计，经DNAMAN软件进一步分析，设计一对简并引物P1和P2，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830） 总DNA为模板克隆Nit M序列：
P1: 5’-GGCGGAAGCTGaarccnacnca-3’
P2: 5’-ACGTCGGGCCTGswrtartgncc-3’
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体用T4连接酶在16 ℃连接12 h，连接产物42 ℃热击90 s转化E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性（100 mg/L）的LB平板上。经37 ℃培养过夜，挑取3个菌落接入含氨苄抗性（100 mg/L）LB液体培养基，培养10 h后提取质粒，以P1和P2为引物经PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定。
实施实例2
本实施例说明腈水解酶基因5’端序列（Nit 5’）的克隆方法。
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）的Nit 5’ 序列的克隆：根据分离纯化恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）所产腈水解酶测得的N端序列设计简并引物P3，根据上述得到的Nit M序列设计引物P4，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）总DNA为模板克隆Nit 5’端序列：
P3: 5’-ATGGTRACATAYACNAAYAA-3’
P4: 5’- TCTACATGCGTCGGCTTCAGCTT -3'
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体用T4连接酶在16℃连接12 h，连接产物42 ℃热击90 s转化E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性（100 mg/L）的LB平板上。经37℃培养过夜，挑取3个菌落接入含有氨苄抗性（100 mg/L）LB液体培养基，培养10 h后提取质粒，以P3和P4为引物经PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定。
实施实例3
本实例说明腈水解酶基因3’端序列的克隆方法。
根据上述得到的Nit M序列设计三条特异性引物P5、P6和P7，用上述三条引物和Tail-PCR方法中所用的随机引物，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830）总DNA为模板克隆Nit 3’端序列：
P5: 5’-CGATGGCGGCAGCCTCTACATGAG-3’
P6: 5’- GACGAAAGCTGAAACCCACTCATGTA-3’
P7: 5’-CCAGACCCCAACCAAATACGCGATGT-3’
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为Tail-PCR方法中所用的条件。以P5与非特异性引物AP1、AP2、AP3、AP4分别进行第一轮PCR。选取P5与AP2扩增的PCR产物为模板，P6和NAP为引物进行第二轮扩增。以第二轮PCR产物为模板，P7和NAP为引物进行第三轮PCR。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体用T4连接酶在16 ℃连接12 h，连接产物42 ℃热击90 s转化E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性（100 mg/L）的LB平板上。经37 ℃培养过夜，挑取3个菌落接入含有氨苄抗性（100 mg/L）的LB液体培养基，培养10 h后提取质粒，以P7和NAP为引物经PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定。
实施实例4
本实例说明腈水解酶完整基因序列的克隆方法。
将腈水解酶M序列、5’端序列和3’端序列进行拼接，拼接序列在NCBI进行分析获得开放阅读框 （OpenReading Frame），基因全长1113bp，编码 370个氨基酸。设计一对含有NdeI和ECORI酶切位点的 引物P8和P9，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4（保藏编号 CGMCC No.3830） 总DNA为模板克隆腈水解酶基因全长序列：
P8: 5’-GGATATCGGATATCCATATGGTTACGTACACGAATAAGTTC-3’
P9: 5’-CCGGAATTCTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3’
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为在95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1min 30s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体用T4连接酶在16 ℃连接12 h，连接产物42 ℃热击90 s转化E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性（100 mg/L）的LB平板上。经37 ℃培养过夜，挑取3个菌落接入含氨苄抗性（100 mg/L）LB液体培养基，培养10 h后提取质粒，用NdeI和ECORI双酶切质粒，验证插入目的片段的质粒进行序列测定，测序正确的命名为pMD19T-Nit。
实施实例5
本实施例说明重组质粒的构建程序。
本研究所采用的表达质粒是pET-28a(+)，带有T7启动子和His-tag标记，将质粒pET-28a(+)和pMD19T-Nit分别用NdeI和ECORI进行双酶切后割胶回收，回收片段用T4连接酶在16 ℃连接12 h，连接产物42 ℃热击90 s转化E. coli Rosetta-gami(DE3)感受态细胞，在含卡那霉素（10 mg/L）和氯霉素（35 mg/L）的LB平板培养12 h，挑取3个菌落接入含卡那霉素（10 mg/L）和氯霉素（35 mg/L）的LB液体培养基，培养10 h后提取质粒，用NdeI和ECORI双酶切验证插入目的片段的重组质粒命名为pET28a(+)-Nit，含有重组质粒的重组菌体命名为E. coliRosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit。
实施实例6
本实施例说明重组腈水解酶的诱导表达。
将重组菌体E. coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit接入含卡那霉素（10 mg/L）和氯霉素（35 mg/L）LB液体培养基中37 ℃培养12 h，转接至新鲜的LB培养基中37 ℃培养至OD600达0.1，添加终浓度0.2 mM的IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）在30 ℃下进行产酶诱导4.5 h，重组菌株表现出最高腈水解酶活性。
实施实例7
本实施例说明重组腈水解酶的分离纯化与酶学特征。
将重组菌体的发酵液于4℃，5000 rpm离心5 min，去除上清。离心收集的细胞悬浮于缓冲液A（50 mM磷酸钠、500 mM氯化钠，pH7.4）中，制备成菌悬液。菌悬液在冰浴中用超声破碎仪破碎，200 W功率下工作30min，每个循环工作2 s停4s。样品用结晶紫进行染色，在显微镜下进行观察，直到显示细胞完全裂解为止。细胞破碎液4 ℃下20,000 rpm离心10 min，所得上清液即为无细胞抽提液。无细胞抽提液用0.45 μm滤膜过滤制备成上样样品，采用Akta系统纯化重组腈水解酶。先将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用缓冲液A冲洗至平衡，冲柱流速2 mL/min，而后上样，上样流速为1 mL/min，待完全吸附后，用缓冲液A、含400mM 咪唑的缓冲液梯度洗脱，洗脱流速2 mL/min，收集各阶段洗脱峰，活力组分在50 mM 磷酸缓冲液（pH7.4）透析过夜后，得到纯化的腈水解酶。纯化后重组腈水解酶达到电泳纯（图1），表观分子量为42000道尔顿。
以3-氰基吡啶为底物时，腈水解酶的最适反应温度为55°C（图2），最适反应pH为7.5（图3）。在最适反应条件下，纯化重组腈水解酶能在20 min内将50mM 3-氰基吡啶全部转化为烟酸，酶活为157.55 μmol /(mg·min)。
SEQ ID NO:1
<110>江南大学；江西省德兴市百勤异VC钠有限公司
<120>一种腈水解酶及其基因序列与应用方法
<160>2
<210>1
<220>1113
<212>DNA
<213>恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）
<400>1
1 ATGGTTACGT ACACGAATAA GTTCAAAGCG GCTACGGTTC AAGCTGAACC CGTCTGGTTT
61 GATGCCGCGG CTACTGTCGA GAAAACTATC GGCCTAATAA AAGAAGCAGC CGACAACAAT
121 GCTCAGATCA TCGCATTTCC TGAGGTTTTT ATTCCCGGAT ATCCGTATCA CATCTGGCTG
181 GATAGCCCCT TCGCGGGGAT GGGCAAGTTC GCCACACGCT ATCATGAACA ATCCCTGTCG
241 ATTGACAGCC CGTTGATCAC ACGGATTCAG GAAGCTGCCG AGAGCAATAA TATATGTGTG
301 GTGATCGGAT TCAGTGAGCG CGATGGCGGC AGCCTCTACA TGAGCCAACT GATTATTGAT
361 GAAAAAGGGA AGATCGTTGC TCACAGACGA AAGCTGAAAC CCACTCATGT AGAGCGTACC
421 GTCTATGGCG AAGGTGATGG CTCGGACATC GCAGTTCACG ACATGCCTAT TGGTAGGGTC
481 GGCGCTTTGA ACTGTTGGGA ACATTTCCAG ACCCCAACCA AATACGCGAT GTACGCGATG
541 CATGAACAGG TCCACATCGC GGCATGGCCT GGGATGTCCT TATATCAGCC TGAAGTGTTC
601 GCCTTCAGTT CCGAAGCACA GCTTGTTGCC ACCCAAATGT ACGCAATGGA AGGTCAAACC
661 TTCGTGTTGT GCTCGACTCA GGTTGTGGGA AAAGCTGCAC TTGAGTTTTT CTGCGAAAAC
721 GAAATGCACA AAAAGCTTAT CGGCTATGGC GGGGGATTCG CTCAAATATT CGGACCGGAC
781 GGTCGGCCAT TAGCCGAGCG GCTGCCTGCG GATGGAGAGG GGATCCTCTA CGCCGAGATC
841 GATCTGGCCC AAATCACGAT GGCTAAACAG GCTGCAGACC CTGTGGGCCA TTATTCCCGG
901 CCCGATGTTT TTTCATTGCA GTTCAATAAC CAGGCCCAAT CTCCCGTCAA ACGTCTGAAG
961 GATATGGGCA AACATATTGA GTCGGAGGAA GTCTTTTCCT CAATATCGCA GGGTACGGTA
1021 CCCGGCTTAA CGTATAGCTT GGAAGTCCCC GGTCCTTTCT TACAAAAGTC GCTCGCTCAA
1081 TTTGAGCCGG TTAAGGTCCA TGAAGAGAGC TGA
SEQ ID NO:2
<210>2
<221>370
<212>PRT
<213>恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）
<400>1
1 MVTYTNKFKA ATVQAEPVWF DAAATVEKTI GLIKEAADNN AQIIAFPEVF IPGYPYHIWL
61 DSPFAGMGKF ATRYHEQSLS IDSPLITRIQ EAAESNNICV VIGFSERDGG SLYMSQLIID
121 EKGKIVAHRR KLKPTHVERT VYGEGDGSDI AVHDMPIGRV GALNCWEHFQ TPTKYAMYAM
181 HEQVHIAAWP GMSLYQPEVF AFSSEAQLVA TQMYAMEGQT FVLCSTQVVG KAALEFFCEN
241 EMHKKLIGYG GGFAQIFGPD GRPLAERLPA DGEGILYAEI DLAQITMAKQ AADPVGHYSR
301 PDVFSLQFNN QAQSPVKRLK DMGKHIESEE VFSSISQGTV PGLTYSLEVP GPFLQKSLAQ
361 FEPVKVHEES
Claims (2)
1.一种来源于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4的腈水解酶，该株恶臭假单胞菌于2010年5月11日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3830，分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）,该腈水解酶完整的DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.一种权利要求1所述的腈水解酶基因的克隆方法，其特征为，采用如下步骤完成：
（1）保藏编号为CGMCC No.3830的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4腈水解酶基因Nit M序列的克隆：将Pseudomonas属腈水解酶氨基酸序列进行同源比对，采用CODEHOP软件进行引物设计，经DNAMAN软件进一步分析，设计一对简并引物P1和P2，以保藏编号为CGMCC No.3830的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4总DNA为模板克隆Nit M序列：
P1： 5’-GGCGGAAGCTGaarccnacnca-3’
P2： 5’-ACGTCGGGCCTGswrtartgncc-3'
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55-65 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上；经37℃培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，P1和P2为引物PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定；
（2）保藏编号为CGMCC No.3830的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4的腈水解酶基因5’端序列的克隆：根据分离纯化保藏编号为CGMCC No.3830的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4所产Nit酶测得的N端序列设计简并引物P3，根据上述得到的Nit M序列设计引物P4，以保藏编号为CGMCC No.3830的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4总DNA为模板克隆Nit 5’端序列：
P3： 5’-ATGGTRACATAYACNAAYAA-3’
P4： 5’-TCTACATGCGTCGGCTTCAGCTT-3'
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50-60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上；经37 ℃培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，P3和P4为引物PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定；
（3）保藏编号为CGMCC No.3830的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4腈水解酶基因3’端序列的克隆：根据上述得到的Nit M序列设计三条特异性引物P5、P6和P7，以此三条引物和Tail-PCR方法中所涉及的随机引物AP1、AP2、AP3、AP4和NAP，P. putida CGMCC3830总DNA为模板克隆Nit 3’端序列：
P5： 5’-CGATGGCGGCAGCCTCTACATGAG-3’
P6： 5’-GACGAAAGCTGAAACCCACTCATGTA-3’
P7： 5’-CCAGACCCCAACCAAATACGCGATGT-3’
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为Tail-PCR方法中所用的条件；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上；经37 ℃培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，P7和NAP（随机引物）为引物PCR验证插入目的片段的质粒进行序列测定；
（4）腈水解酶基因的生物信息学分析：将腈水解酶的M序列、5’端序列和3’端序列进行拼接，拼接序列在NCBI进行分析获得Nit酶的开放阅读框（OpenReading Frame），进而推导出腈水解酶的氨基酸序列。
3. 一种权利要求1所述的腈水解酶在工程菌中表达的方法，其特征为，具体步骤如下：
（1）含编码腈水解酶基因的表达质粒的构建：设计分别含有NdeI和ECORI酶切位点的引物P8和P9，以保藏编号为CGMCC No.3830的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）XY4总DNA为模板克隆腈水解酶Nit基因：
P8： 5’-GGATATCGGATATCCATATGGTTACGTACACGAATAAGTTC-3’
P9： 5’-CCGGAATTCTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3’
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50-60℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，回收片段与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌E. coli JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板上；经37℃培养过夜，挑取单菌落接入含有氨苄抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，酶切验证插入目的片段的质粒命名为pMD19T-Nit，对该质粒进行序列测定；将质粒pMD19T-Nit和pET-28a(+)分别用NdeI和ECORI双酶切后割胶回收，回收片段连接后转化大肠杆菌E. coli Rosetta-gami(DE3)感受态细胞，在含卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板培养过夜，挑取单菌落接入含有卡那霉素和氯霉素抗性的LB液体培养基，培养10-14 h后提取质粒，酶切验证插入目的片段的质粒命名为pET28a(+)-Nit；
（2）重组腈水解酶的诱导表达：将重组菌体E. coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit接入含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中37 ℃培养过夜，转接至新鲜的LB培养基中37 ℃培养至OD600达0.8-1.0，添加终浓度0.2-1.3 mM的IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）在25-37 ℃下进行产酶诱导4-24 h，重组菌株表现出腈水解酶活性；
（3）重组腈水解酶的纯化及酶学性质：将上述获得的重组的菌体发酵液离心后收集菌体，菌体洗涤后超声破碎，高速离心所得上清液即为无细胞抽提液；采用Akta系统纯化重组腈水解酶，Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用缓冲液A冲洗至平衡，然后上样，待完全吸附后，分别用含缓冲液A和含400 mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，分别收集各阶段洗脱峰，通过SDS-PAGE分析纯化后的腈水解酶的纯度和分子量大小，并测定纯化酶的的酶活及反应最适pH和最适温度；其中所述缓冲液A为50 mM磷酸钠、500 mM氯化钠、pH7.4的缓冲液。
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