JP2580499B2

JP2580499B2 - ハロアリ―ルニトリル特異性細菌ニトリラ―ゼおよびその製法

Info

Publication number: JP2580499B2
Application number: JP7015388A
Authority: JP
Inventors: デイビツド・エム・ストーカー
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-01-08
Filing date: 1995-02-01
Publication date: 1997-02-12
Anticipated expiration: 2012-02-12
Also published as: RU2043417C1; CA1331156C; DK464087A; AU611080B2; IL81168A0; AU6898487A; DK6487A; WO1987004181A1; EP0290455A1; EP0229042A2; PL156394B1; HUT43874A; BR8705281A; JPH07194377A; JPH0795952B2; KR880701050A; HU209143B; CN87100135A; PL263575A1; NZ218810A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はハロアリールニトリル特
異性細菌ニトリラーゼ、その製法、およびそれを含む組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物および高等生物細胞に新規な遺伝
子能力を付与することが可能となったので、新たな可能
性の大道が開かれてきた。１つの分野で、細胞毒の影響
を及ぼす種々の作用的物質が関心をもたれている。例え
ば、農業で使用される多くの化合物は、害虫、雑草など
の駆除に使用される。多くの場合、これらの化合物の滞
留時間は比較的長く、また長く引き延ばされる。

【０００３】保存すべき種と抹殺すべき種とを区別する
ことが望ましい場合が少なくない。例えば、雑草を選択
的に駆除して作物に与える悪影響を最少限に止めること
が望ましい場合がしばしばある。大抵の場合、広範囲に
亘る除草剤の多くは作物に顕著な悪影響を及ぼすため、
それらの使用は基本的に発芽前に限られているか、そう
でなくても発芽後の適用には充分な注意を払わなければ
ならない。

【０００４】したがって、細胞毒作用物質のような抑圧
に抵抗性をもつよう成育細胞を改良することには大いに
興味があるところである。

【０００５】米国特許第4,535,060 号明細書は、細菌 a
roＡ遺伝子の利用を記載しており、グリホゼート感受性
細胞にグリホゼート耐性を与えている。Ｈsu及びＣampe
r のＣan. Ｊ. Ｍicrobiol. （1976）22： 537〜 543
は、土壌を多く含む培養物からイオキシニル分解物を単
離することを記載しているＨsuおよびＣlemsonのＤisse
rt. Ａbstr. Ｉtrn.Ｂ36（1976）Ｎo. 8，3708は、 3,5
−ジハロゲノ− 4−ヒドロキシベンゾニトリル系除草剤
の微生物分解を記載している。Ｉngran およびＰullin
のＰestic ．Ｓci. （1974） 5： 287〜 291は、３種の
土壌中におけるブロモキシニルの永続性を記載してい
る。ＳmithのＡbstrp.Ｍeeting Ｗeed Ｓoc. Ａm.（19
71）pp.16 〜17は、リジャイナ（Ｒegina ：カナダの州
都）重質クレー中でのブロモキシニルの分解を記載して
いる。ＳmithおよびＦletcher のＨort.Ｒes. （1964）
4：60〜62は、 3,5−ジハロゲノ− 4−ヒドロキシベン
ゾニトリル類および土壌微生物について報告している。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明においては、ニ
トリラーゼ（nitrilase ）、該ニトリラーゼをコードす
る核酸配列、ニトリラーゼ遺伝子が外来となっている所
望の宿主によって認識される調節遺伝子の転写および翻
訳調節下にあって該ニトリラーゼをコードする遺伝子を
含有する構築物、該構築物を含有する宿主細胞、該構築
物を含有する生物、生物の一部もしくは調製物が提供さ
れる。ブロモキシニル（bromoxynil）及び／又はイオキ
シニル（ioxynil ）特異性ニトリラーゼは、ブロモキシ
ニル含有地域および関連除草剤から毒性を除去し、その
ような除草剤の細胞毒から宿主を保護する上で有用であ
る。前記構築物は、該構築物含有宿主細胞と非含有宿主
細胞とを区別する上で有用である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ハロゲン化ヒ
ドロキシベンゾニトリル特に 3,5−ジブロモ− 4−ヒド
ロキシベンゾニトリル又は 3,5−ジヨード− 4−ヒドロ
キシベンゾニトリルの加水分解に関連して、新規なＤＮ
Ａ配列、新規な構築物、形質転換細胞、形質転換植物、
ペプチドを提供する。本発明は、前記ニトリルを加水分
解し得る酵素の生成に係り、これによって前記ニトリル
の除草活性を解毒し、且つ該除草剤に感受性の細胞もし
くは宿主を保護し、該除草剤で汚染された環境から毒素
を排除せんとするものである。

【０００８】関心のある構造遺伝子は、単細胞微生物、
特にベンゾニトリルを窒素源とし得ることが判っている
細菌、ベンゾニトリルを唯一の窒素源とし得る細菌から
得ることができる。以下の記述においてベンゾニトリル
又はニトリラーゼという場合、ベンゾニトリルとはハロ
ゲン化 p−ヒドロキシベンゾニトリル特に 3,5−ジヨー
ド− 4−ヒドロキシベンゾニトリル又は 3,5−ジブロモ
− 4−ヒドロキシベンゾニトリルを指し、ニトリラーゼ
とはこのようなハロゲン化ベンゾニトリルを窒素源とし
て特に唯一の窒素源として使用することのできるニトリ
ラーゼを指す。

【０００９】本発明酵素は種々の方法で得ることができ
るが、有利にはブロモキシニル又はイオキシニルを含有
する環境で天然に存在する細菌から得ることができる。
なかでも腸内細菌、とくにクレブシエラ（Ｋlebsiella)
属の種がよい。クレブシエラ・ニューモーニア（Ｋl ebs
iella pneumoniae）特に変種オゼネ（ozaenae)を利用
することができる。土壌から分離するよりもむしろ、生
物体を土壌中又は増加する高濃度のベンゾニトリルと減
少量の他の窒素源とを含む他の培地で成長せると、ベン
ゾニトリルを唯一の窒素源として利用しながら生存し続
ける生物体が得られる。

【００１０】ニトリラーゼ含有細菌の源にかかわらず、
ニトリラーゼがベンゾニトリルの解毒に有効であるよう
にするため、スクリーニングはしなければならない。更
に、ニトリラーゼは、ベンゾニトリル類似物すなわちハ
ロゲンを欠いているもの、他の置換基を有してるもの等
々よりも、ベンゾニトリルそのものに特異的でなければ
ならない。したがって、本発明のニトリラーゼは本明細
書にいうベンゾニトリルに特異的であり、前記類似物に
対しては比較的不活性であるか又は実質的に活性でな
い。窒素源としてのベンゾニトルと対比して、比較濃度
の通常の窒素源例えばアンモニアの存在下では細菌の増
殖速度が顕著に低下しないこと、すなわち細菌の増殖が
約10％以下低減しないことが望ましい。そして非特異的
なベンゾニトリルが認められない方がよい。

【００１１】１つ又はそれ以上の宿主菌株が決まったな
ら、ニトリラーゼのコード配列を同定する技術を用い
る。遺伝子は染色体又はプラスミド上に存在する。ゲノ
ムは断片化することができ、特に制限エンドヌクレアー
ゼを用いてそのようにすることができ、この場合１つ又
は複数のエンドヌクレアーゼを用いて約 5ｋb から50ｋ
b に亘る断片が形成される。これらの断片を都合の良い
細菌例えば大腸菌中で適当なベクターにクローン化し、
得られる形質転換体をニトリラーゼ活性についてスクリ
ーニングする。宿主生物はネガティブなバックグランド
となる。

【００１２】１つ又はそれ以上のクローンがニトリラー
ゼ活性を有するものと同定された場合、所望のＤＮＡ断
片を含有する染色体外要素すなわちプラスミド又はウィ
ルスを、宿主の溶解、ＤＮＡの沈殿、染色体ＤＮＡから
のベクターＤＮＡすなわちプラスミドＤＮＡ又はウィル
スＤＮＡの分離等々の常套手段によって単離する。

【００１３】次いで、染色体外要素をエンドヌクレーゼ
制限によって開裂し、種々のサイズの断片を分離、同定
する種々の技術たとえば電気泳動、密度勾配遠心法等々
によって所望の断片を単離する。

【００１４】断片の大きさに応じて、遺伝子およびその
両側の調節領域のサイズにもっと近づくよう断片のサイ
ズを小さくするように操作することができる。酵素をコ
ードする配列およびその調節両側配列を含有する断片の
操作には種々の技術が存在する。種々の反応混合物中で
種々の制限酵素を使用する部分開裂を使用し、各断片を
クローン化してどの断片がニトリラーゼ発現能力を有し
ているかを決定する。

【００１５】あるいはまた、酵素を単離し、部分的に配
列させる。アミノ酸配列に基づき、プローブを調製し
て、遺伝子を有する断片を同定するものに使用する。こ
の技術を制限酵素開裂と組み合せることにより、所望の
遺伝子を存在させるよう断片をクローン化しスクリーニ
ングすることができる。更に、Ｂal31のようなエキソヌ
クレアーゼを使用して断片の片方又は両方端からヌクレ
オチドを除去し、余分のヌクレオチドの数を更に減じる
ことができる。

【００１６】あるいはまた、遺伝子を適当な宿主中でク
ローン化し、プローブを用いるスクリーニングによって
メッセンジャーＲＮＡを単離し、適当なin vitro又はin
vivo 翻訳系例えばアフリカツメガエル（Ｘenopus）卵
母細胞もしくは網状赤血球等々において同定する。単離
したメッセンジャーを次いで、逆転写酵素およびＤＮＡ
ポリメラーゼを用いる相補鎖の形成などの常套手段を用
いて、 cＤＮＡ調製に利用する。この場合、得られる構
造遺伝子は、転写に関連する調節領域を欠失している。

【００１７】ニトリラーゼ発現構造遺伝子を有するＤＮ
Ａ配列を、適当な宿主細胞に導入するため、広範囲の他
のＤＮＡ配列に結合させる。コンパニオン配列は、宿主
の性質、ＤＡＮ配列の宿主の導入方法、およびエピソー
ム維持もしくは組込みが所望かどうかに依存している。

【００１８】原核生物宿主について、ＤＮＡ配列の形質
転換、結合、形質導入又はトランスフェクションによる
原核生物宿主への導入に種々のベクターを使用すること
ができる。ＤＮＡ配列は種々のプラスミド例えば pＢＲ
322 ， pＡＣＹＣ184 ， pＭＢ9 ， pＲＫ290 等、種々
のコスミド例えば pＶＫ100 、種々のウィルス例えばＰ
22等を含む。

【００１９】真核生物について、ＤＮＡの宿主への導入
に種々の技術を用いることができる。例えば非複製ＤＮ
Ａ配列、プラスミドもしくはミニクロモソームを含むＣ
ａ⁺⁺−沈降ＤＮＡの利用する形質転換、Ａgrobacterium
におけるＴ−ＤＮＡ含有配列を利用する形質転換，マイ
クロピペットもしくはエレクトロポレーションを利用す
る微量注入法などである。競合的複製システムがＤＮＡ
構成中に存在するか否かに応じて、ＤＮＡがエピソーム
要素として複製されるか否か、ＤＮＡが宿主ゲノムに組
込まれるか否か、構造遺伝子が宿主中で発現されるか否
かを決定する。エピソーム要素を使用し得る。例えば、
Ｔi あるいはＲi のような腫瘍誘発プラスミドもしくは
その断片、Ｃa ＭＶ，ＴＭＶのようなウィルスもしくは
その断片などである。これらは宿主に致命的なものでは
なく、構造遺伝子は、その発現が可能となるような状態
で前記エピソード要素中に存在する。特に関心がもたれ
るものは、複製機能を有するが他の機能例えば発癌性、
有毒性などを欠く断片である。

【００２０】ニトリラーゼ源から得た断片は適当なクロ
ーニングベクターを用いてクローン化する。クローニン
グは適当な単細胞微生物たとえば大腸菌のような細菌中
で行うことができる。望ましくはコスミドを使用する。
ここでは部分的又は完全な消化により、ほぼ所望サイズ
の断片が得られる。例えばコスミド pＶＫ100 は適当な
制限酵素の作用を受けて部分的に消化され、プラスミ
ド、染色体もしくはそれらの断片の部分的又は完全消化
のいずれかにより得られた断片に連結する。パッキング
をすれば、所望サイズの断片のみを宿主生物にパック
し、形質導入することが確保される。

【００２１】宿主生物としてはベンゾニトリル耐性のも
のが選択される。感受性菌株は変異させて、形質導入体
の選択基準となる適当な遺伝特徴を持たせることができ
る。微生物において、形質導入体は他の微生物への接合
に用いられる。この場合、必要に応じ移動可能なプラス
ミドを用いる。ニトリラーゼに対する構造遺伝子を含有
する断片のサイズを更に小さくするのに種々の技術を利
用することができる。例えば、コスミドベクターを単離
し、種々の制限酵素たとえばＥcoＲＩ，ＢglII，ＳmaＩ
等々で開裂し、得られた断片を適当なベクター、有利に
は先に使用したコスミドべクター中にクローン化する。
コスミドベクターの代わりに、他の種々のクローニング
ベクター、なかでも小さいサイズのもの例えば pＡＣＹ
Ｃ177 、pＡＣＹＣ184 などを使用することができる。
このように、好ましくは約 5Ｋb以下、一般に約 4Ｋb
以下、最も好ましくは約 2Ｋb 以下の断片をクローン化
して、ベンゾニトリル耐性とする。

【００２２】望ましくは、断片は約 1Ｋb であり、約 5
Ｋb 以下であり、好ましくは約 4Ｋb 以下であり、特に
少なくとも約1047bpであって、更に少なくとも約1100bp
の両側領域を含有していてもよく、好ましくは約 1.5Ｋ
b 以下である。特に関心があるのは、クレブシエラ・オ
ゼネからのＢglII−ＳmaＩ断片であり、特に約1210bpの
ＰstＩ−Ｈin cII断片である。

【００２３】ニトリラーゼ酵素は、任意の都合の良い
源、原核生物か又は真核生物のいずれかによって発現さ
れる。このような源としては、例えば、細菌、イース
ト、糸状菌、植物細胞などがある。分泌物が得られない
場合、細胞を溶解して酵素単離し、公知方法を利用して
ニトリラーゼを単離する。有用な方法としては、クロマ
トグラフィー、電気泳動法、アフィニティクロマトグラ
フィーなどがある。有利には、ブロモキシニルを、適当
な官能基たとえばカルボキシル基を介して不溶性支持体
に接合させ、ニトリラーゼ単離用のパッキングとして利
用することができる。

【００２４】ニトリラーゼ比活性は、Ｈarper のＢioch
em．Ｊ．（1977） 167： 685〜692に記載の条件下で、
少なくとも約 0.1マイクロモルアンモニア／min ／mg蛋
白質であり、一般には少なくとも約 0.5マイクロモルア
ンモニア／min ／mg蛋白質又はそれよりも高い。

【００２５】精製酵素をいろいろの方法で使用すること
ができる。ブロモキシニル、イオキシニル又は他の関連
ベンゾニトリルのアッセイに直接使用することができ
る。あるいはまた、この酵素は、ハプテンもしくは抗原
のような関心のある分析対象物に又は抗体に接合させ
て、診断アッセイの標識として使用することができる。
このようなアッセイは米国特許第 3,654,090号明細書、
同第 3,817,837号明細書、同第 3,850,752号明細書に記
載されている。接合方法および分析対象物の濃度測定は
これらの米国特許明細書に詳しく記載されているので、
これら明細書の至適開示部分を参照により本明細書中に
含めるものとする。

【００２６】ニトリラーゼをコードするＤＮＡ配列の利
用方法もいろいろある。ＤＮＡ配列は野生型又は変異型
ニトリラーゼ単離用のプローブとして利用できる。ある
いはまた、ＤＮＡ配列は、組換えによる宿主への組込み
に利用でき、宿主をベンゾニトリル耐性とすることがで
きる。

【００２７】植物細胞を用いる場合、構築の一部として
の構造遺伝子を、組換えによる宿主ゲノムの組込みのた
めマイクロピペット注入により、植物細胞核に導入する
ことができる。あるいはまた、エレクトロポレーション
を利用して、植物宿主へ導入するため構造遺伝子をその
中へ導入することができる。植物宿主によって認識され
ない調節シグナルを有する源から構造遺伝子を得る場
合、発現のため適当な調節シグナルを導入することが必
要な場合がある。ウィルス又はプラスミド例えば腫瘍誘
発プラスミドを使用してマップ化する場合、プロモータ
ーの下流側に制限部位を選択し、その中にプロモーター
から適当な距離をおいて構造遺伝子を挿入する。ＤＮＡ
配列が適当な制限部位を提供しない場合、Ｂal31のよう
なエキソヌクレアーゼを用いて何回も消化し、合成制限
エクドヌクレアーゼ部位（リンカー）を挿入することが
できる。

【００２８】腫瘍誘発プラスミド例えばＴi 又はＲｉの
使用はとくに関心がもたれるものであって、ニトリラー
ゼ遺伝子は植物細胞染色体に組込まれる。Ｔi −プラス
ミドとＲi −プラスミドの使用は、ＰＣＴ国際公開ｗｏ
84／02913 ，同ｗｏ84／02919 ，同ｗｏ84／02920 ，及
びＥＰＯ出願 0116718、並びＭatzke とＣhiltonのＪ．
Ｍol．Ａpp．Ｇenetics （1981） 1：39〜49に記載され
ている。

【００２９】Ｔ−ＤＮＡの右ボーダー（border）又は両
方のボーダーを使用する場合であって、このボーダー
が、植物宿主によって認識される開始と終結用の転写お
よび翻訳調節シグナル下に、ニトリラーゼ構築遺伝子を
有する発現カセットを配置しているとき、発現カセット
が植物ゲノムに組み込まれて、植物細胞中その種々の分
化段階においてニトリラーゼ酵素の発現が行なわれる。

【００３０】種々の構築物が調製できて、植物細胞内で
の発現がなされる。構築物は、植物宿主中でのニトリラ
ーゼ発現のため植物中で機能する発現カセットを提供す
る。

【００３１】転写するため、構成性又は誘発性の種々の
転写開始領域（プロモータ領域）を使用する。

【００３２】ニトリラーゼをコードする構造遺伝子に転
写開始領域を結合させて、開始コドンの上流、通常は開
始コドンから約 200塩基以内のところで転写を開始す
る。ここで非翻訳 5′−領域はＡＴＧを欠いている。

【００３３】構造遺伝子の 3′−末端は１つ又はそれ以
上のストップコドンを有しており、これは植物宿主中で
機能する転写終結領域に結合する。この終結領域は開始
領域と同じか又は異なる構造遺伝子と関連させてもよ
い。

【００３４】発現カセットは、転写方向に、開始領域、
開始領域の転写コントロール下での構造遺伝子、転写の
終結と適当にはメッセンジャーＲＮＡのプロセッシング
を指令する終結領域を有することで特徴づけられる。

【００３５】転写および翻訳調節領域として、有利には
オピン(opine) プロモーター及びターミネーター領域を
使用する。これらはニトリラーゼ遺伝子の構成発現を可
能にする。あるいはまた、他のプロモーター及び／又は
ターミネーターを使用することも可能であり、特に植物
宿主中で誘発発現又は調節発現を可能にするプロモータ
ーを使用することができる。Ｔi −プラスミドから利用
できるプロモーター領域は、オピンプロモーター例えば
オクトピンシンテターゼプロモーター、ノパリンシンテ
ターゼプロモーター、アグロピンシンテターゼプロモー
ター、マンノピンシンテターゼプロモーター等々を有し
ている。その他のプロモーターとしては、ウィルスプロ
モーター例えばＣa ＭＶ領域VIプロモーター又は完全長
（35Ｓ）プロモーター、リブロース− 1,5−ビスホスフ
ェートカルボキシレート遺伝子に関連するプロモーター
例えば小さいサブユニット、ファセオリン，蛋白質貯
蔵，β−コングリシニン，セルロース形成等に関連する
遺伝子を挙げることができる。

【００３６】種々の配列を常法に従い一緒に結合しても
よい。プロモーター領域は、構造遺伝たとえばオピン遺
伝子の 5′領域から制限マッピング、配列決定により同
定され、選択され、単離され得る。同様にターミネータ
ー領域は構造遺伝子から領域3′として単離される。配
列は適当な配向にクローン化されて結合され、植物宿主
中がニトリラーゼ遺伝子の構成発現が付与される。

【００３７】ニトリラーゼ酵素を発現する機能遺伝子を
作物植物細胞に導入すると、広範囲の作物に対して、雑
草のほぼ完全または完全な除去を達成できる濃度でブロ
モキシニル、イオキシニル又は類似の除草剤を使用する
ことができ、該作物に比較的悪影響を与えることはな
い。このため、化学肥料、水などを充分に活用すること
ができ、雑草がもたらす有害効果を排除することができ
るので、実質的な経済効果をあげることができる。

【００３８】ニトリラーゼ酵素を発現する発現カセット
は、広範囲の植物、単子葉および双子葉植物、例えばト
ウモロコシ、麦、大豆、タバコ、綿、トマト、ポテト、
Ｂrassica 種、ライス、ピーナッツ、ペチュニア、ヒマ
ワリ、サトウダイコン、芝草などに導入することができ
る。遺伝子は、癒合組織（仮皮）組織、根、管状部、胎
芽、苗木、種、葉、若木、花粉などの植物部分又は細胞
に存在し得る。

【００３９】植物をベンゾニトリル耐性とすれば、作物
成長を助長し、栄養物の競合体を抑圧するなどして作物
を雑草から保護するのに種々の調合剤、方法を採り得
る。例えば、ブロモキシニルをヒマワリ、大豆、コー
ン、綿などの作物に害を与えないで雑草の発芽後駆除に
使用でき、あるいはまた他の薬剤と併用することもでき
る。

【００４０】殺虫剤の有用量を調合剤の形態でフィール
ドに散布し、ブロモキシニルを約 0.1〜4 ｌb/acre好ま
しくは 0.2〜2 ｌb/acre散布し、他の除草剤をその活性
成分として約 0.1〜4 ｌb/acreの量散布する。調合剤に
他の添加物、例えば洗剤、助剤、拡散剤、粘着剤、安定
剤などを混入してもよい。調合剤は湿式調合物でも乾式
調合物でもよく、流動可能な粉末状、乳化可能な濃縮
物、液体濃度などこの分野で知られている形態にするこ
とができる。

【００４１】除草溶液は、通常の方法たとえばスプレ
イ、潅水、散布などにより適用できる。

【００４２】

【実施例】下記の実施例は本発明の説明のためのもので
あって、本発明を限定するものではない。

【００４３】材料と方法連結反応に制限酵素とＴ4 リガーゼを、それらの製造業
者の使用説明に従って、使用した。クローニングと分子
分析の標準方法は、Ｍaniatis 等の(1982 ）Ｍolecular
Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual ，Ｃold Ｓprin
g Ｈarbor Ｌaboratory, Ｎer Ｙork に準じた。

【００４４】クローン分析はＩsh−Ｈorowitz 等のＮuc
l.Ａcids Ｒes. （1981） 9：2989〜2998に記載されて
いる方法で行なった。

【００４５】Ｅ．coli株ＭＭ294 をすべてのクローニグ
実験に用いた（Ｈanahan，Ｍol．Ｂiol ．(1983) 166：
557〜80）。

【００４６】抗生物質の量（使用した場合）は、cm（ク
ロラムフェニコール）25μｇ／μｌ、Ｔc （テトラサイ
クリン）10μｇ／ｍｌ，Ａp （ペニシリン)300μｇ／ｍ
ｌであった。

【００４７】Ｅ．coliにおけるプラスミドＤＮＡの形質
転換は、Ｍandel およびＨiga のＪ．Ｍol．Ｂiol.（19
70）53： 159〜162 に従った。

【００４８】ブロモキシニル汚染土壌サンプルからの細
菌分離物を単離し、スクリーニングした。このような微
生物はクレブシェラ・ニューモーニア（Ｋlebsiella
pneum oniae) の亜種オゼネ（ozaenae)であった。

【００４９】前記微生物のブロモキシニル特異体とニト
リラーゼを部分精製して特徴付けしたものは、見掛け分
子量 34kＤalの活性酵素を生産した。

【００５０】固体Ｌ−アガー上でＫ．オゼネを繰り返し
継代培養したところ、ＢarnettとＩngraham のＪ．Ａpp
l ．Ｂacteriol．（1975）18： 131〜143 に記載されて
いるように、１リットルあたりＫＨ₂ＰＯ₄（ 1.5
ｇ）、Ｋ₂ＨＰＯ₄（ 3.5ｇ）、Ｍg ＳＯ₄・ 7Ｈ₂Ｏ
（ 0.1ｇ）、イースト抽出物（50mg）、クエン酸塩、グ
リセロール、コハク酸塩 0.1％及び微量元素を含む所定
の液体培地中での成育により、ブロモキシニルを唯一の
窒素源とすることのできない変異体が分離された。前記
ば培地は以下ＹＥＴＥ多炭素培地（ＹＥＴＥ multi−ca
rbonmedium）という。ＹＥＴＥ多炭素培地は0.05％のブ
ロモキシニルを含んでいた。この微生物はブロモキシニ
ルを唯一の窒素源とするものではないが、0.05％のブロ
モキシニルを含有するＬ−ブロス中で最高密度まで増殖
する。Ｋ．オゼネ変異体コロニーを選択し、10mlのＬ−
ブロス中で成育させた。また、３つの独立したＫ．オゼ
ネのコロニーをブロモキシニル含有ＬＢプレートから選
択し、同一条件下で成育させた。これらの同じ４つの
Ｋ．オゼネコロニーを、0.05％ブロモキシニル供給Ｌ−
ブロス10ml中で同時に成育した。30℃で最高密度になる
まで培養を続け、ミニプレップ（mini-prep)プラスミド
ＤＮＡがＩsh−Ｈorowitz 等のＮucl.Ａcids Ｒes．
（1981） 9：2989の方法により各培養物から調製され
た。未消化プラスミドＤＮＡを 0.5％アガロースゲル上
で電気泳動すると、プラスミドバンドがエチジウムブロ
ミド染色で可視化された。

【００５１】Ｋ．オゼネ変異体微生物は、ブロモキシニ
ルの存否に拘らず成長する単一プラスミド種（68Ｋb の
サイズ）であることが判った。３つのＫ．オゼネコロニ
ーは、0.05％のブロモキシニル存在下での成育により、
より大きなプラスミド種（90Ｋb ）を示した。ブロモキ
シニルが存在しない場合には、３つのＫ．オゼネコロニ
ーのうち２つに両プラスミド型が存在する。このこと
は、ブロモキシニル選択が緩和された場合、約22Ｋb の
プラスミドＤＮＡの附随的損失を伴なってより大きなプ
ラスミド種からより小さいものへ変換することを示して
いる。

【００５２】４つのすべてのコロニーを、0.05％のブロ
モキシニル含有Ｌ−ブロス 200ml中で増殖させた。細胞
をフレンチプレスで破壊し、0.05ＭのＫＰＯ（ pＨ 7.
5）と2.5 mＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）とを含む
バッファーを用いて高速上清透析を行ない各粗製抽出物
のブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性について分析
した。Ｋ．オゼネ変異体の粗製抽出物は検出可能なニト
リラーゼ活性を示さなかったが、他のＫ．オゼネ粗製抽
出物はそれぞれ 0.124， 0.105および 0.143マイクロモ
ルＮＨ₃／min ／mg蛋白質のニトリラーゼ特異活性を示
した。 0.1％グルコースと0.04％ブロモキシニルを含有
するＭ9 培地（Ｍiller （1972）のＥxperiments in
Ｍolecular Ｇenetics ，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌab
oratory）中で、細胞（ 200ml）を30℃で対数増殖期ま
で成育させた。細胞を破壊し、超遠心し、0.05ＭＫＰＯ
₄ pＨ 7.5と 2.5 mＭＤＴＴを含むバッファー中上清を
透析することで、粗製抽出物を得た。基質濃度はすべて
のアッセイにおいて3mＭブロモキシニルであった。ＮＨ
₃の放出はＨarper のＢiochem．Ｊ．（1977） 1 67： 6
85〜692 に従ってモニターした。Ｋ．オゼネ変異体がブ
ロモキシニル含有Ｌ−ブロス中で成育するということ
は、同微生物がこの化合物に対して非透過性を獲得した
ということである。しかしながら、この微生物は唯一窒
素源としてブロモキシニルを利用する所定培地中で成育
することができない。

【００５３】以上より、Ｋ．オゼネニトリラーゼはコー
ドされたプラスミドであるように思われる。この酵素を
コードする遺伝子は、ブロモキシニル選択が存在しない
ときにＫ．オゼネプラスミドから自然損失した22Ｋb プ
ラスミドＤＮＡセグメントに存在するものと思われる。

【００５４】Ｋ．オゼネブロモキシニル特異性ニトリラ
ーゼのＥ．coli中での発現 0.05％ブロモキシニル選択下で成育するＫ．オゼネから
プラスミドＤＮＡを調製し、該ＤＮＡをＥ．coli株ＭＭ
294 （thi ， gyrＡ96， endＩ^-， hsdＲ17）に形質転
換した。窒素欠損（Ｎ^-）固体アガロース最少培地（１
リットルあたりＫＨ₂ＰＯ₄（ 1.5ｇ）、Ｋ₂ＨＰＯ₄
（ 3.5ｇ）、Ｍg ＳＯ₄・ 7Ｈ₂Ｏ（ 0.1ｇ）と 0.1％
グルコース含有）に唯一窒素源として0.05％ブロモキシ
ニルを添加して、形質転換体を選択した。５日間のイン
キューベーション後、10のコロニーが選択プレート上に
現われた。これらのコロニーを0.05％ブロモキシニル含
有Ｌ−アガープレート上で再び画線培養し、ＭＭ294 中
チアミン栄養要求性マーカーの存在をテストした。チア
ミンが存在しない最少培地中で成育したコロニーはいず
れもＥ．col iＭＭ294 菌株を示さなかった。すべてのコ
ロニーは、チアミンと唯一窒素源としての0.05％ブロモ
キシニル供給Ｍ9 培地で成長することができる。ブロモ
キシニルを存在させないこの培地では成長は望めない。
コロニーのうち２つを更に分析するため選択した。90Ｋ
b プラスミドを含むＥ．coliＭＭ294の粗製抽出調製物
をブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性について分析
したところ、 0.216マイクロモルＮＨ₃放出／min ／mg
の比活性が認められた。より小さいプラスミド種を含む
Ｅ．coliＭＭ294 は検出可能なニトリラーゼ活性体を生
産しなかった。Ｅ．coliのより大きな90Ｋb プラスミド
を pＢrx1 と記載し、より小さいプラスミド（68Ｋb ）
を pＢrx1 △と記載する。

【００５５】プラスミド pＢrx1 を含むＥ．coli株ＭＭ
294 がブロモキシニル特異性ニトリラーゼ反応の結果と
しての適当な代謝産物を生産していることを確認するた
め、0.05％ブロモキシニル供給Ｍ9 培地で30℃24時間、
ＭＭ294 （ pＢrxl)の 2ml培養物を成育させた。培養物
の濾液サンプルをＣ₁₈ＨＰＬＣカラムを用いてクロマト
グラフィーにかけた。培養物濾液中のすべての導入ブロ
モキシニルは、新しい代謝産物ピークに換わっていた。
代謝産物ピークの同定は、スペクトル分析によったとこ
ろ、 3′ 5′−ジブロモー 4−ヒドロキシ安息香酸（Ｄ
ＢＨＢ）であった。このように、Ｅ．coli中ニトリラー
ゼ発現をコードするブロモキシニル特異性プラスミドの
生成はＫ．オゼネにみられたものと同じである。

【００５６】ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ遺伝子
のＥ．coli中でのクローン化ブロモキシニル特異性酵素をコードするＤＮＡセグメン
トがＥ．co li中にクローン化できるか否かを調べるた
め、プラスミド pＢrx1 をＢamＨＩで消化したところ、
２つのバンド53Ｋb と37Ｋb とが得られた。ＢamＨＩフ
ラグメントをＥ．coliプラスミドベクター pＡＣＹＣ18
4 （ＣhangとＣohen，Ｊ．Ｂacteriol．（1978） 134：
1141）のＢamＨＩ部位に連結させ、Ｅ．coli株ＭＭ294
に形質転換した。 pＡＣＹＣ184 のＢamＨＩ部位へクロ
ーニングすると、ラトラサイクリン耐性遺伝子の挿入失
活が起こる。クロラムフェニコール耐性テトラサイクリ
ン感受性ＭＭ294 コロニーを選択し、ミニプレップクロ
ーン分析ＤＮＡ（mini−prepclone analysis ＤＮＡ）
を調製し、該ＤＮＡをＢamＨＩで消化した。４つのクロ
ーンは37Ｋb ＢamＨＩフラグメントを有していたが、１
つのクローンは pＢrx1 のより大きい53Ｋb ＢamＨＩＤ
ＮＡフラグメントを収容していた。クローン化ＢamＨＩ
フラグメントを有する５つのクローンはまた、 pＢrx1
から22Ｋb のプラスミドＤＮＡを自然欠失した後のＤＮ
Ａセグメントに対応するプラスミド pＢrx1 △にもみら
れる。すべての10のクローンを 200μｇ／ｍｌのクロラ
ムフェニコールの存在下（プラスミドを選択するため）
200ｍｌのＬ−ブロス中で増殖させ、粗製抽出調製物を
得、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性について分
析した。37Ｋb ＢamＨＩフラグメントを有する４つのク
ローンは 0.140マイクロモルＮＨ₃放出／min ／mg蛋白
質程度のニトリラーゼ特異活性を示したが、他の６つの
クローンには検出可能なニトリラーゼ活性は認められな
かった。このデータは、ブロモキシニル特異性ニトリラ
ーゼ活性をコードする遺伝子がプラスミド pＢrx1 から
クローン化された37Ｋb ＢamＨＩフラグメント上に存在
すること、ブロモキシニル選択の非存在下自発損失した
22Ｋb ＤＮＡセグメントが37Ｋb ＢamＨＩフラグメント
の内部に存在することを示している。

【００５７】ベクター pＡＣＹＣ184 に対するＢamＨＩ
フラグメントの配向を調べるため、上記４つのクローン
のＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、0.07％アガロースゲル上
で電気泳動にかけた。プラスミド pＢrx1 と pＢrx1 △
のＥcoＲＩ消化物を集め、これからも分析した。

【００５８】ベクター pＡＣＹＣ184 に対する37Ｋb Ｂ
amＨ7 フラグメントの両配向を求め、それぞれプラスミ
ド pＢrx2 ， pＢrx3 とした。３つのＥcoＲＩフラグメ
ントが、プラスミド pＢrx2 と pＢrx3 から自然欠失し
た22Ｋb ＤＮＡセグメトの内部に存在することがまた観
察された。これらＥcoＲＩフラグメントのサイズはそれ
ぞれ18Ｋb ， 3Ｋb および 1.9Ｋb である。ブロモキシ
ニル特異性ニトリラーゼをコードする遺伝子は、ニトリ
ラーゼ構造遺伝子がＥcoＲＩ制限部位によって二分され
ない限り、これら３つのＥcoＲＩフラグメントの１つの
中に位置している。Ｅ．coli(pＢrx3)のブロモキシニ
ル特異性ニトリラーゼの位置を調べた。その結果を次に
示す。

【００５９】

【表１】

【００６０】(a) プラスミド pＢrx3 を含むＥ．coli
（ＭＭ294 ）細胞を例示の培地中37℃で定常増殖期まで
成育させ、５ml培養物とした。培養物は、その旨記載し
てある場合には、20μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
と0.04％のブロモキシニル（Ｂrx1 ）を含んでいた。各
培地から１ｍｌを採取し、ニトリラーゼバッファー（
0.1ＭＫＰＯ₄， pＨ 7.5）を用いて一度洗浄し、同じ
バッファー液 0.1mlに細胞を再懸濁させた。Ｈarper の
Ｂiochem．Ｊ．（1977） 167： 685〜692 に準拠して、
3mＭブロモキシニルを基質として使用するか又は使用し
ないで、50μｌサンプルのニリラーゼ活性を分析した。

【００６１】(b) 単位：μmoleＮＨ₃／min ／mg。

【００６２】蛋白質は 1.4Ｏ．Ｄ．₆₀₀＝10⁹細胞／ｍ
ｌ＝ 150μｇとして求めた。

【００６３】これらのデータは、ニトリラーゼ酵素の細
胞位置が細胞周辺腔にあることを示している。酵素が培
地中ブロモキシニル非存在下で発現されるという第２の
観察結果は、ブロモキシニル誘導に酵素発現が必要でな
いことを表わしている。

【００６４】ブロモキシニル特異性ニトリラーゼの精製Ｋ．オゼネニトリラーゼを更に精製すると、次の結果が
得られた。

【００６５】

【表２】

【００６６】(a)0.04 ％ブロモキシニルとグルコースを
含有するＭ9 培地中30℃で対数増殖期まで細胞を成育さ
せた。粗製抽出物は、細胞破壊、超遠心、および0.05Ｍ
ＫＰＯ₄ pＨ 7.5と 2.5 mＭＤＴＴを含むバッファー中
での透析により調製した。基質濃度はすべてのニトリラ
ーゼアッセイにおいて3mＭであった。

【００６７】(b) 単位：μmoleＮＨ₃／min ／ng。

【００６８】0.05 ％ＫＰＯ₄ pＨ 7.5、 2.5 mＭＤＴ
Ｔおよび1mＭＥＤＴＡ含有バッファーで 2.5cm²×10cm
カラムを平衡化させた。サンプルを入れ、前記カラムバ
ッファー中0.02Ｍ〜0.40Ｍ線状勾配の 300ｍｌＮa Ｃｌ
で展開した。１ＭＮａＣｌ含有バッファーを前記勾配の
最後に入れた。５ｍｌ画分を集め、各フラクションの0.
075ｍｌアリコットをニトリラーゼ活性について分析し
た。酵素活性の単一ピークが0.22Ｍ塩で溶出した。

【００６９】最初のニトリラーゼ活性の約75％が活性画
分で回収された。

【００７０】ＤＥＡＥカラムからのニトリラーゼピーク
を有する画分を、0.02ＭＫＰＯ₄ pＨ 7.5と、11.25 ％
の変性Ｌaemmliゲルに適用された各画分50μｌ（ 6μｇ
の蛋白質）とを用いて透析した。ＤＥＡＥカラムからの
活性ピークに対応する蛋白質主バンドは分子量34,000の
ポリペプチドである。その他のポリペプチドは活性カラ
ム分画によって顕現化できなかった。これらのデータ
は、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼが分子量約34,0
00のポリペプチドで、単一遺伝子の生産物である可能性
が高いことを示している。

【００７１】クローン pＢrx2 をＥcoＲＩで完全に消化
し、約19Ｋb のフラグメントを分離した。このフラグメ
ントをＥcoＲＩ消化 pＡＣＹＣ184 ベクター（ 3.9Ｋb)
に挿入し、前記したように、Ｅ．coliに形質転換される
プラスミド pＢrx5 を得た。このプラスミドを情報に従
い単離し、ＢglIIで消化して、p ＡＣＹＣ184 ベクター
に挿入されたままの約 6.7Ｋb フラグメントを得た。こ
の単離されたプラスミド pＢrx7 を次いでＳmaＩおよび
ＢglIIで消化し、ＳmaＩ−ＢamＨＩ消化 pＡＣＹＣ 177
（ 3.7Ｋb)（ＣhangとＣohenのＪ．Ｂacteriol．（197
8） 134：1141〜1156）に挿入される約 3.9Ｋb のフラ
グメントを得た。ペニシリン耐性の形成されたプラスミ
ドを前記したようにＥ．coliに形質転換し、ペニシリン
選択培地上で形質転換体を選択し、プラスミド pＢrx8
を得た。これは 3.9Ｋb フラグメントにニトリラーゼ遺
伝子を担持している。

【００７２】pＢrx8 をＰstＩで部分的に消化し、その
フラグメントをＰstＩ消化 pＵＣ18（Ｙanisch−Ｐerro
n 等のＧene （1985）33： 103〜119 ）に挿入した。得
られたプラスミドをＥ．co liにクローン化し、ニトリラ
ーゼ活性についてスクリーニングした。１つのクローン
は 5.3Ｋb のプラスミド pＢrx9 を有していたが、これ
を単離し更にＰstＩおよびＨinc IIで消化すると、Ｐst
Ｉ〜Ｈinc II方向に、比較的等間隔をあけてＣlaＩ，Ｓ
alＩ，ＳcaＩおよびＳphＩ制限部位を有する1210bpのフ
ラグメントが得られた。ＰstＩ−Ｈinc IIフラグメント
をＳanger 等のＰroc.Ｎatl ．Ａcad ．Ｓci. ＵＳＡ
（1977）74：5463〜5468の方法に準じて配列決定した。
この配列を（コードされた適当なアミノ酸と共に）次に
示す。

【００７３】

【表３】

【００７４】

【表４】

【００７５】側方の 5'-及び 3'-非コーディング領域を
実質的に持たないPst I-Hin cII フラグメントはEco RI
リンカーと連結してEco RIで消化し得、その状態でpCGN
451のEco RI部位への挿入により植物発現カセットに導
入できる。

【００７６】pCGN451 は、前記遺伝子の 3′末端にEco
RIリンカーを介して融合された約1,566bp の5'非コーデ
ィング領域と約1,349bp の 3′非コーディングDNA とを
含むオクトピンカセットを含む。pTi 配位(coordinate)
は、Barker他、Plant Mole-cular Biolog y (1983) 2:33
5で規定されているように、 3′領域の場合が11,207〜1
2,823、5'領域の場合が13,643〜15,208である。5'フラ
グメントは下記の方法で得た。

【００７７】Bam HI-EcoR フラグメントとしてコーディ
ング領域の 5′末端を含むサブクローニング処理した小
さいフラグメントをプラスミドpCGN407 としてpBR322内
でクローニングした。Bam HI-EcoRIフラグメントはコー
ディング領域にXmn I 部位を１つ有し、pBR322はXmn I
部位を２つ有する。pCGN407 をXmn I で消化し、Bal 31
ヌクレアーゼで切除し、Eco RIリンカーをこれらのフラ
グメントに付加した。Eco RI及びBam HI消化の後前記フ
ラグメントをサイズ分画(size fractionation)し、得ら
れたフラクションをクローニング処理して配列した。一
例として、コーディング領域全体及び10bpの 5′非翻訳
配列を除去し、 5′非転写領域と、mRNAキャップ部位
と、16bpの 5′非翻訳領域(BamHI部位への) はそのまま
残した。この小さいフラグメントは７％アクリルアミド
ゲルでのサイズ分画によって得、約130bp の長さのフラ
グメントを溶離した。このサイズ分画したDNA をM13mp9
内に連結し、幾つかのクローンを配列して、その配列を
オクトピンシンターゼ遺伝子の既知の配列と比較した。
M13 構築体はP14 と称し、このプラスミドをBam HI及び
Eco RIで消化して小フラグメントを得、これをpTiA6(Ga
rfinkel 及びNester, J.Bacte riol. (1980) 144:732)
からの上流 5′配列を含むXho I 〜Bam HIフラグメント
と、 3′配列を含むEco RI〜Xho I フラグメントとに連
結した。得られたXho I フラグメントをpCGN426 と称す
るpUC8誘導体のXho I 部位内にクローニングした。この
プラスミドはDNA ポリメラーゼI で補充された単一EcoR
I 部位を有し、且つXho I リンカーをpUC8の唯一のHin
cII 部位に挿入した時にHin cII 制限エンドヌクレアー
ゼのヌクレアーゼ感染によってPstI及びHin d III 部位
を失ったという点でpUC8と異なる。このようにして得ら
れるプラスミドpCGN451 は、タンパク質コーディング配
列を 5′非コーディング領域(T-DNAの右端を含む1,5550
bpの 5′非転写配列と、mRNAキャップ部位と、16bpの
5′非翻訳配列とを含む) と、 3′領域(267bpのコーデ
ィング領域と、ストップコドン(stop codon)と、196bp
の 3′非転写配列とを含む) との間に挿入するための単
一のEco RI部位を有する。

【００７８】オクトピンシンテターゼ(ocs) カセットを
含むXho I フラグメントをプラスミドpCGN517 内に挿入
した。このプラスミドはテトラサイクリン耐性遺伝子及
びカナマイシン耐性遺伝子を有する。pCGN517 は、pUC4
K からの Kan^r遺伝子(Vieira, Gene (1982) 19 :259)
を唯一のPstI部位に導入することによって、pHC79(Hoh
n，Gene (1980) 11 :291)から形成した。このpCGN517
を、唯一のSal I 部位に挿入したS alI及びXho I フラグ
メントで消化した。

【００７９】Xho I フラグメントは第２のプラスミドpC
GN529 内にも挿入した。このpCGN529 は、Tn5(Rothstei
n 他,1981,Movable G enetic Elements,p.99 ，Cold Spr
ingHarbor Laborato-ries，Cold Spring Harbor，NY)
からの Kan^r遺伝子の挿入によってpACYC184から形成す
る。Bam HI部位に挿入したpRiA4T-LDNA(White 及びNest
er, J.Bacteriol. (1980) 144 : 710)からの2.4kb のBg
l IIフラグメントは、pACYC184のHin dIII-BamHIフラグ
メントをTn5 の Kan^r遺伝子で置換した後でそのまま残
る。

【００８０】Eco RIニトリラーゼ遺伝子がocs カセット
の唯一のEco RIに挿入されたo cs カセットを含むXho I
フラグメントをpCGN517 及びpCGN529 に挿入して２つの
プラスミドpN1 及びpN2 を得る。これらのプラスミド
は、T-DNA にTi- 又はRi- プラスミドを組込むべく、夫
々A .tum efaciens又はA .r hizogenes への導入に使用さ
れる。夫々のプラスミドへの組込みは、Comai 他, Plas
mid (1983) 10 :21〜30に記述されているように、3-ウ
エイメイティング(3-way mating)によって実施し得る。
プラスミドpRK2073 、pN1 もしくはpN2 及びA .tumefac
ie ns A722(Garfinkel, J.Bac eriol .(1980) 144 :732)
もしくはA .rhizoge nes A4T(White, 同上(1980)) 144
: 710)を含むE .coli 宿主を一晩培養したものを一晩
培養し、適当な培養体を混合して、150 μg/ml カナマ
イシンを含むABプレート上に伸ばす。独立コロニーを２
回画線培養する。 AgrobacteriumDNA 全体のサザン分析
によって正確な組込みを確認する。エンドヌクレアーゼ
で消化したDNA をニックトランスレーション処理したpB
rx8 でプローブした。

【００８１】ブロモキシニル特異的ニトリラーゼ遺伝子
を胆汁組織中に発現させる 2.6kb フラグメント上にニトリラーゼ遺伝子を担持する
プラスミドpBrx9 をBam HIで消化し、Bal 31で処理して
5′側方領域の一部分を除去した。BamHI リンカーを付
加して再閉鎖を完了した。その結果得られたプラスミド
はアンピシリン耐性を与えた。このプラスミドを前述の
ごとくE .coli に形質転換し、これらの形質転換体をア
ンピシリン選択媒質で選択処理して5.2kb プラスミドpB
rx16及びpBrx17を得た。これらのプラスミドは2.6kb フ
ラグメント上にニトリラーゼ遺伝子を有する。pBrx16を
Bam HIで消化し、且つHin cII で部分的に消化すると1.
2kb ニトリラーゼ遺伝子フラグメントが得られた。

【００８２】Bam HI-SmaI で消化したpCGN46にBam HI-
Hin cII フラグメントを挿入して、ニトリラーゼ遺伝子
フラグメントを含む6.6kb プラスミドpBrx22を得た。

【００８３】PCGN46（Comai 他, Nature (1985) 317 :7
41〜744)はマンノピンシンターゼ(MAS) 発現カセットで
あり、MAS プロモータ及び ocs 3 ′領域を含む。pCGN
46の構築は下記の方法で達成した。マンノピンシンター
ゼプロモータ領域(P_MAS) を含むT-R DNA(Barker他,Pla
nt Mol.Biol .(1983) 2 :325) の一部分を担持するほぼ
5.5kbpのE .c oli フラグメント(Eco13又はEco C)をpVK2
32と称するベクター内でクローニングした。pVK232をEc
o RIで消化した後、Eco13 をpACYC184のEco RI部位に挿
入してプラスミドpCGN14を得た。pCGN14をSph I 及びCl
a I により消化（夫々前述のBarker他の配列の部位2156
2 及び20128 で）して P_MAS領域を除去し、pCGN40を得
るべくSph I 及びA cc I で消化しておいたpUC19(Pharma
cia,Inc.) に前記 P_MAS領域を挿入した。この P_MAS領
域は内部にCla I 認識部位を含み、この部位は消化に耐
えるようにメチル化される。

【００８４】pCGN40をEco RV及びEc o RIで消化した。Ec
o RV部位はT-DNA 内にあり、Eco RI部位はpUC19 のポリ
リンカー内にある。その結果 P_MAS領域を持つフラグメ
ントが得られた。オクトピンシンターゼカセットを含む
pCGN451 をSma I 及びEco RIで消化し、オクトピンシン
ターゼ 5′領域を除去しておいたより大きい大フラグメ
ントを分離した。オクトピンシンターゼ 5′領域に代え
てEco RV-EcoRI P_MA _S領域をpCGN451 に導入し、転写開
始及び終了領域をポリリンカーで分離してpCGN46を得
た。

【００８５】1.2kb ニトリラーゼ遺伝子フラグメントを
含むプラスミドpBrx22を前述のごとくE .Coli に形質転
換した。このプラスミドを従来の方法で分離し、Xho I
で消化して、MAS プロモータと、25塩基対分のバクテリ
ア 5′非翻訳配列を含むブロモキシニル遺伝子と、 ocs
3 ′領域とを含む4.1kb フラグメントを得た。この4.
1kb フラグメントをSal I で消化したプラスミドpCGN78
3 に挿入してほぼ31kbのプラスミドpBrx28を得た。

【００８６】pCGN783 の構築 pCGN167 の構築 pCGN167 を構築すべく、Alu I での消化によりCaMVのAl
u I フラグメント(bp7144〜7735)(Gardner 他, Nucl.Ac
ids Res. (1981)9 : 2871〜2888) を得、M13mp7のHin c
II 部位にクローニングして（Vieira Gene (1982) 19:
259）C614を形成した。C614をEco RIで消化して、35S
プロモータを含むEco RIフラグメントをC614から形成
し、これをPUC8(Vierra 他, Gene (1982) 19 :259)のEc
o RI部位にクローニングしてpCGN146 を形成した。

【００８７】前記プロモータ領域をトリミングすべく、
Bgl II部位(bp7670)をBgl II及びBal 31で処理し、次い
でBgl IIリンカーをBal 31処理したDNA に結合してpCGN
147を形成した。

【００８８】pCGN528(後述) をBgl IIで消化し且つpCGN
147 からのBam HI- Bgl IIプロモータフラグメントを挿
入することによって、プロモータ領域と選択可能なマー
カー(ATG′ 2つのKAN)と 3′領域とを含むpCGN148aを形
成した。前記フラグメントをpCGN528 のBgl II部位にク
ローニングして、Bgl II部位がpCGN528 のカナマイシン
遺伝子の近くになるようにした。

【００８９】この構築体pCGN528 に使用されるシャトル
ベクターは下記の方法で形成した。カナマイシン遺伝子
(Jorgenson他，Mol .Gen.(1979) 177:65)を有するTn5 を
含むプラスミドをHin dIII-B amHIで消化し、且つカナマ
イシン遺伝子を含むHin dIII-BamHIフラグメントをpACY
C184のテトラサイクリン遺伝子(Chang & Cohen, J.Bact
eriol .(1978) 134 , 1141〜1156) 内のHin dIII- Bam
HI部位に挿入することによっpCGN525 を形成した。pTiA
6(Thomashow 他, Cell (1980) 19 : 729〜739)のBam HI
フラグメント19をpCGN525 のBam HI部位に挿入すること
によってpCGN526 を形成した。Xho I での消化及び再連
結によってpCGN526 から小さいXho I フラグメントを欠
失させることによりpCGN528 を得た。

【００９０】pMB9KanXXIからのBam HIカナマイシン遺伝
子フラグメントをpCGN148aのBam HI部位にクローニング
することによってpCGN149aを形成した。

【００９１】pMB9KanXXIはXho I 部位の無い、但しAgro
bacteriu m 内での効果的選択が可能であるようにTn903
からの機能カナマイシン遺伝子を含むpUC4K 変種である
（Vieira & Messing, Gene (1982) 19:259:268）。

【００９２】pCGN149aをBgl II及びSph I で消化した。
pCGN149aのこのBgl II-SphI 小フラグメントをBam HI及
びSph I での消化により分離した M1(後述) のBam HI-S
phIフラグメントにより置換した。その結果pCGN167 が
得られる。これは、全長に及ぶCaMVプロモータと、1ATG
- カナマイシン遺伝子と、 3′末端とバクテリアTn903
型カナマイシン遺伝子とを含む構築体である。M1はpCGN
550 からのEco RIフラグメント(pCGN587の構築参照) で
あり、これをM13mp9のEco RIクローニング部位にクロー
ニングして、1ATG- カナマイシン遺伝子のPst I 部位が
M13mp9のポリリンカー領域に近くなるようにした。

【００９３】709(1ATG-3′領域) の構築 pCGN566 はpUC13-cm(K.Buckley,Ph.D.論文,UC-San Dieg
o,1985年) のEco RI-Hin dIII部位に挿入されたpUC18(Y
anisch-Perron，同上) のE co RI- Hin dIIIリンカーを
含む。ORF1及び2(Barker他(1983), 同上) を含むpNW31c
-8, 29-1(Thomashow他 (1980),Cell 19:729)のHin dIII
- B gl IIフラグメントをpCGN566 のHin dIII-BglII部位
にサブクローニングしてpCGN703 を形成した。

【００９４】pTiA6(pT115955の塩基2365〜2920に対応す
る(Baraker他,1983,同上) からの転写体７の 3′領域を
含むpCGN703 のSau 3AフラグメントをpUC18(Yanisch-Pe
r ron他(1985), 同上) のBam HI部位にサブクローニング
してpCGN709 を形成した。

【００９５】pCGN766cの構成(35sプロモーター - 3′領
域) CaMV-35Sプロモーターと、1ATG- カナマイシン遺伝子
と、pTiA6 のBam HIフラグメント19とを含むpCGN167(構
成については後段参照) のHin dIII- Bam HIフラグメン
トを、pUC19(上記Norrander et al.(1983)；上記Yanisc
h-Perron et al.(1985)) のBam HI-HindIII部位にクロ
ーニングし、pCGN976 を作製した。

【００９６】pCGN976 の0.7kb Hin dIII-EcoRIフラグメ
ント(35Sプロモーター) 並びにpCGN709 の0.5kb Eco RI
- Sa l I フラグメント (転写体 7： 3′、pCGN709 の構
成については上段参照) をpCGN566 のHin dIII-SalI 部
位に挿入することによって35S プロモーター並びに転写
体7 からの 3′領域を発生させ、pCGN766cを作製した。

【００９７】最終的なpCGN783 の構成 pCGN766cの0.7kb Hin dIII-E coRIフラグメント(CaMV-35
S プロモーター) とpCGN726cの1.5kb Eco RI-SalI フラ
グメント(1-ATG-KAN-3′領域) とを、pUC119（J. Vieir
a, Rutgers University, N.J. ）のHin dIII- Sal I 部
位へと連結して、pCGN778 を生成した。

【００９８】pCGN778 の2.2kb 領域の、CaMV-35Sプロモ
ーター(1-ATG-KAN-3′領域) を含むHin dIII-SalI フラ
グメントでpCGN739 のH indIII-SalI ポリリンカー領域
を置換して、pCGN783 を生成した。

【００９９】pBrx17をBam H1で消化し、かつ一部Hin cI
I で消化して1.2kb ニトリラーゼ遺伝子フラグメントを
得た。Bam H1-HincII フラグメントをBam H1-SmaI で消
化したpCGN566 に挿入して、ニトリラーゼ遺伝子フラグ
メントを含む3.7kb プラスミドpBrx25を作製した。

【０１００】pCGN566 は次のように構成した。pUC13(Cm
^R)(Ken Buck- ley 博士論文, U.C., San Diego)をEco
RI及びHin dIIIで消化し、pUC18 及びpUC19 から得たポ
リリンカーを線状化したpUC13 にそれぞれ挿入して、ク
ロラムフェニコール耐性標識を有するpCGN566 を得た。

【０１０１】1.2kb ニトリラーゼ遺伝子フラグメントを
含むプラスミド pBrx25 を、先に述べたようにE. coli
に形質転換した。プラスミドを通常方法で単離し、かつ
BamH1及びEco RIで消化して、再び1.2kb ニトリラーゼ
遺伝子フラグメントを得た。Bam H1及びEco RIフラグメ
ントをBam H1及びEco RIで消化したpCGN46に挿入して、
ニトリラーゼ遺伝子フラグメントを含む6.6kb プラスミ
ドpBrx27を作製した。

【０１０２】pBrx27を、先に述べたようにE. co li に形
質転換した。このプラスミドを通常方法で単離し、かつ
Xho I で消化して、MAS プロモーターと、翻訳された配
列中に細菌の 5′位の11塩基対を含むブロムオキシニル
遺伝子と、ocs 3′領域とを含む4.1kb フラグメントを
得た。4.1kb フラグメントをSAl I で消化したpCGN783
に挿入して、約31kbのプラスミドpBrx29を得た。

【０１０３】ニトリラーゼ発現の検出プラスミドpBrx28及びpBrx29を用いて形質転換して、Ag
robacterium t umefaciens 株K12 にした。(Nester, Ann.
Rev. Mi-cro. (1981) 35: 531; Hoekema etal.,Natur
e (1983) 303 :179) K12(pBrx28) 及びK12(pBrx29) を
用いて、リュウキュウベンケイ属植物(Kalanchoe) にえ
い瘤(galls) を形成した(Garfinkel, J.Bacteriol. (19
80) 144 : 732) 。

【０１０４】約１gm( 新鮮重量) のえい瘤組織を、0.1M
のpH7.5 トリスと、10mMのEDTAと、0.15M のNaClと、0.
05％のNP-40 と、25mg/ml のBSA と、1 mMのDTT と、0.
13μｇ/ml のロイペプチンとを含有する緩衝液中の液体
窒素中で擦り砕いた。複数の試料を、ポリビニルピロリ
ドン(Sigma)0.05 ｇの添加後に均質化し、次いで 4℃で
15分間、15,000ｇで遠心分離した。精製ニトリラーゼを
ウサギに注射することによって調製した抗血清25mg/ml
、並びにS. aureus (Calbiochem)の10％(w/v)懸濁液 2
50μｌを上澄みに添加し、4 ℃で16時間培養した。次に
試料を遠心分離し、ペレットを20⊆MのpH7.5 トリス、1
mMのEDTA、150 mMのNaCl並びに0.05％のNP-40 で2 回
洗浄した。ペレットを、0.125MのpH6.8 トリス、 4％の
SDS 、20％のグリセロール並びに10％のBMe を含有する
全量100ul 中に再び懸濁させ、90℃で2 分間加熱した。
試料全体を10％アクリルアミドゲルにおいて電気泳動に
掛けた（Laemmli, V. K., Na- ture 227: 680-685 (197
0)）。分解したポリペプチドを、Burnetteが述べている
（Anal. Biochem. 112: 195-203 (1981)）ようにしてニ
トロセルロースフィルター(Schlei-cher及びSchuell)に
移した。その後ニトロセルロースフィルター(Schleiche
r 及びSchuell)をBLOTTO(Johnson et al.,Gen. Anal. T
echn ol. 1, 38-42 (1983))において42℃で 1〜3 時間培
養し、続いて抗ニトリラーゼ血清の 1：50溶液を含むBL
OTTOにおいて室温で一晩培養した。フィルターを、20mM
のpH7.5 トリス並びに150 ⊆MのNaCl中で10分間、0.05
％のTween −20を含有する同上緩衝液中で20分間、及び
Tween−20を含有しない同上緩衝液中で更に10分間洗浄
した。次に、10⁶cpm/mlの¹²⁵I 標識蛋白質A(9u Ci/m
g; NEN)を含むBLOTTOをフィルターに付加して、室温で2
時間の培養を行なった。フィルターを、50mMのpH7.5
トリス、1MのNaCl並びに 0.4％のサルコシル中で一晩洗
浄した。濯いで乾燥した後フィルターを、Dupont Crone
x 増感血清の使用下に−70℃でKodak AR X線フィルムに
対し露出した。

【０１０５】A. rhizogen es と共培養(co-cultivate)し
たタバコ葉片の形質転換及び再生タバコを、異種植物を交えずに栽培する (25℃、白色光
(16 時間) ；MS(IAA 1mg/L、キネチン 0.15 mg/L))。主
新芽移植(main shoot transplant) によって維持した3
週齢の上記植物を、組織提供体として用いる。 (頂から
4 番目までの)若葉を選択し、これらの若葉から直径2 m
mの葉ディスクを打ち抜き、打ち抜いたディスクをペト
リ皿 (直径3 cm) 内の、IAA 1 mg/Lを伴ったMS培地1 ml
中に置く。ディスクを一晩完全な闇中に保持した後、こ
れらの培養物に、Agrobacteri um(A772xpN1 あるいはpN
2)の細胞 (植物培養基1 ml当たり10⁸〜10⁹個) を付加
する。共培養を、闇中で18〜24時間実施する。ホルモン
が欠如しており、かつcefotaxine(Boehringer-Mannhei
m)350mg/Lを含有するMS培地で3 回洗浄することによっ
て、葉片からAgr obacterium を除去する。葉片を9 cmペ
トリ皿内の、ホルモンを伴わないMS培地10ml中に移す。
Phytagar(Gibco 0.6％；cefotaxine 350mg/L)ペトリ皿
をパラフィルム(parafilm)で密閉し、組織提供体植物と
同一条件下に保持する。 2〜4 週間後までに根が現れ、
この根を切除して、上記と同じ培地にIAA 2 mg/L及びキ
ネチン2 mg/Lを加えたものの中に上記同一条件下に置
く。更に 2〜5 週間後に、再生する新芽が目視できる。

【０１０６】6 葉段階の植物にブロモキシニル溶液を、
ポットに植えた植物へ向けての噴霧により付与する。植
物を1 本ずつ植えられた各４″ポットは、2.5 mlの噴霧
液を受容する。植物を栽培ケース内で、温度25℃、相対
湿度70％、及び光照射期間60時間で成長させる。0.5 cm
より長い新葉を計数することによって、噴霧後9 日間の
成長を記録する。

【０１０７】上述のような手続きを辿ることによってブ
ロモキシニル耐性の植物が取得可能であり、この植物は
ブロモキシニルが存在する畑に、該植物自体の成長に重
大な悪影響を及ぼさずに適用することができる。

【０１０８】本発明は、植物を除草剤に耐性に、特にベ
ンゾニトリル除草剤に特異的に耐性にすることによって
該植物の改良をもたらす。即ち、ニトリラーゼに関して
コードする遺伝子を植物ホストに導入し得、その結果上
記遺伝子は発現して、植物にベンゾニトリル耐性を付与
する。そのうえ、遺伝子を適当な細菌ホスト中でクロー
ニングし、それによって酵素を発現させることによって
酵素を生成し得る。モニター可能な活性を有する酵素
は、様々な分析対象(analytes)あるいはベンゾニトリル
基質についてのアッセイにおいて幅広く用いることがで
きる。また、酵素並びに酵素を発現する細菌は、ベンゾ
ニトリル除草剤を汚染環境から除去するのに用いること
も可能である。

【０１０９】本明細書では本発明を、明確に理解される
ように具体的説明及び実施例に即して詳述したが、特許
請求の範囲内で幾つかの変更及び変形を実施し得ること
は明らかであろう。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:22）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列を有し、ブロモキシ
ニルを基質として少なくとも約0.1 マイクロモルNH₃/m
in./mg蛋白質の比活性を有する純度で、約34kdの実質的
に純粋な細菌ニトリラーゼ。 Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gln Ala Glu Pro Val Trp ¹ ⁵ ¹⁰ ¹⁵ Met Asp Ala Ala Ala Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys ²⁰ ²⁵ ³⁰ Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gln Leu Val Ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile ³⁵ ⁴⁰ ⁴⁵ Pro Gly Try Pro Gly Phe Met Leu Thr His Asn Gln Thr Glu Thr Leu ⁵⁰ ⁵⁵ ⁶⁰ Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gln Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro ⁶⁵ ⁷⁰ ⁷⁵ ⁸⁰ Glu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gln Glu His Asn Ile Ala Leu ⁸⁵ ⁹⁰ ⁹⁵ Ser Phe Gly Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gln 100 ¹⁰⁵ ¹¹⁰ Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile Thr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu ¹¹⁵ ¹²⁰ ¹²⁵ Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu Gly Asp Gly Ser ¹³⁰ ¹³⁵ ¹⁴⁰ Asp Leu Gln Val Ala Gln Thr Ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn ¹⁴⁵ ¹⁵⁰ ¹⁵⁵ ¹⁶⁰ Cys Ala Glu Asn Leu Gln Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu ¹⁶⁵ ¹⁷⁰ ¹⁷⁵ Gly Glu Gln Ile His Ile Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro ¹⁸⁰ ¹⁸⁵ ¹⁹⁰ Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly Ala Ile Asn Gln Val Tyr Ala Ala ¹⁹⁵ ²⁰⁰ ²⁰⁵ Glu Thr Gly Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gln Val Val Gly Pro Thr ²¹⁰ ²¹⁵ ²²⁰ Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gln Tyr ²²⁵ ²³⁰ ²³⁵ ²⁴⁰ Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gln Leu Lys ²⁴⁵ ²⁵⁰ ²⁵⁵ Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Ile ²⁶⁰ ²⁶⁵ ²⁷⁰ Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly ²⁷⁵ ²⁸⁰ ²⁸⁵ His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile Asn Arg Gln Arg ²⁹⁰ ²⁹⁵ ³⁰⁰ Gln Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro ³⁰⁵ ³¹⁰ ³¹⁵ ³²⁰ Arg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser ³²⁵ ³³⁰ ³³⁵ Thr Ala Ile Gly Val Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser ³⁴⁰ ³⁴⁵
【請求項２】前記細菌ニトリラーゼがクレブシエラ由
来のニトリラーゼである請求項１に記載の細菌ニトリラ
ーゼ。
【請求項３】少なくとも約0.5 マイクロモルNH₃/mi
n./mg蛋白質の比活性を有する請求項１に記載の細菌ニ
トリラーゼ。
【請求項４】３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシ
ベンゾニトリル特異性ニトリラーゼを産生するクレブシ
エラ・オゼネを単離し、適当な栄養培地中で該クレブシ
エラ・オゼネを増殖させ、そして、該クレブシエラ・オ
ゼネを溶菌し該ニトリラーゼを単離することから成る、
下記のアミノ酸配列を有し、ブロモキシニルを基質とし
て少なくとも約0.1 マイクロモルNH₃/min./mg蛋白質の
比活性を有する純度で、約34kdの実質的に純粋な細菌ニ
トリラーゼの製造方法。 Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gln Ala Glu Pro Val Trp ¹ ⁵ ¹⁰ ¹⁵ Met Asp Ala Ala Ala Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys ²⁰ ²⁵ ³⁰ Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gln Leu Val Ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile ³⁵ ⁴⁰ ⁴⁵ Pro Gly Try Pro Gly Phe Met Leu Thr His Asn Gln Thr Glu Thr Leu ⁵⁰ ⁵⁵ ⁶⁰ Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gln Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro ⁶⁵ ⁷⁰ ⁷⁵ ⁸⁰ Glu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gln Glu His Asn Ile Ala Leu ⁸⁵ ⁹⁰ ⁹⁵ Ser Phe Gly Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gln 100 ¹⁰⁵ ¹¹⁰ Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile Thr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu ¹¹⁵ ¹²⁰ ¹²⁵ Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu Gly Asp Gly Ser ¹³⁰ ¹³⁵ ¹⁴⁰ Asp Leu Gln Val Ala Gln Thr Ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn ¹⁴⁵ ¹⁵⁰ ¹⁵⁵ ¹⁶⁰ Cys Ala Glu Asn Leu Gln Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu ¹⁶⁵ ¹⁷⁰ ¹⁷⁵ Gly Glu Gln Ile His Ile Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro ¹⁸⁰ ¹⁸⁵ ¹⁹⁰ Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly Ala Ile Asn Gln Val Tyr Ala Ala ¹⁹⁵ ²⁰⁰ ²⁰⁵ Glu Thr Gly Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gln Val Val Gly Pro Thr ²¹⁰ ²¹⁵ ²²⁰ Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gln Tyr ²²⁵ ²³⁰ ²³⁵ ²⁴⁰ Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gln Leu Lys ²⁴⁵ ²⁵⁰ ²⁵⁵ Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Ile ²⁶⁰ ²⁶⁵ ²⁷⁰ Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly ²⁷⁵ ²⁸⁰ ²⁸⁵ His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile Asn Arg Gln Arg ²⁹⁰ ²⁹⁵ ³⁰⁰ Gln Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro ³⁰⁵ ³¹⁰ ³¹⁵ ³²⁰ Arg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser ³²⁵ ³³⁰ ³³⁵ Thr Ala Ile Gly Val Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser ³⁴⁰ ³⁴⁵
【請求項５】少なくとも約０．５マイクロモルＮＨ₃
／min.／mg蛋白質の比活性を有する請求項４に記載の方
法。
【請求項６】ニトリラーゼ活性に関して細菌をスクリ
ーニングし該ニトリラーゼ活性を有する該細菌を選択
し、該細菌のゲノムを切断し所望の大きさの範囲を有す
る断片を産生し、該断片を細菌内の適当なベクター上で
クローニングし該ニトリラーゼ活性を有する酵素を選択
し、そして、該ニトリラーゼ活性を有する該酵素を発現
する構造遺伝子を有するＤＮＡ配列を単離することを含
む、下記のアミノ酸配列を有し、ブロモキシニルを基質
として少なくとも約0.1 マイクロモルNH₃/min./mg蛋白
質の比活性を有する純度で、約34kdの実質的に純粋な細
菌ニトリラーゼの製造方法。 Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gln Ala Glu Pro Val Trp ¹ ⁵ ¹⁰ ¹⁵ Met Asp Ala Ala Ala Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys ²⁰ ²⁵ ³⁰ Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gln Leu Val Ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile ³⁵ ⁴⁰ ⁴⁵ Pro Gly Try Pro Gly Phe Met Leu Thr His Asn Gln Thr Glu Thr Leu ⁵⁰ ⁵⁵ ⁶⁰ Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gln Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro ⁶⁵ ⁷⁰ ⁷⁵ ⁸⁰ Glu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gln Glu His Asn Ile Ala Leu ⁸⁵ ⁹⁰ ⁹⁵ Ser Phe Gly Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gln 100 ¹⁰⁵ ¹¹⁰ Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile Thr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu ¹¹⁵ ¹²⁰ ¹²⁵ Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu Gly Asp Gly Ser ¹³⁰ ¹³⁵ ¹⁴⁰ Asp Leu Gln Val Ala Gln Thr Ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn ¹⁴⁵ ¹⁵⁰ ¹⁵⁵ ¹⁶⁰ Cys Ala Glu Asn Leu Gln Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu ¹⁶⁵ ¹⁷⁰ ¹⁷⁵ Gly Glu Gln Ile His Ile Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro ¹⁸⁰ ¹⁸⁵ ¹⁹⁰ Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly Ala Ile Asn Gln Val Tyr Ala Ala ¹⁹⁵ ²⁰⁰ ²⁰⁵ Glu Thr Gly Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gln Val Val Gly Pro Thr ²¹⁰ ²¹⁵ ²²⁰ Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gln Tyr ²²⁵ ²³⁰ ²³⁵ ²⁴⁰ Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gln Leu Lys ²⁴⁵ ²⁵⁰ ²⁵⁵ Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Ile ²⁶⁰ ²⁶⁵ ²⁷⁰ Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly ²⁷⁵ ²⁸⁰ ²⁸⁵ His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile Asn Arg Gln Arg ²⁹⁰ ²⁹⁵ ³⁰⁰ Gln Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro ³⁰⁵ ³¹⁰ ³¹⁵ ³²⁰ Arg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser ³²⁵ ³³⁰ ³³⁵ Thr Ala Ile Gly Val Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser ³⁴⁰ ³⁴⁵
【請求項７】酵素がクレブシエラ由来のニトリラーゼ
である請求項６に記載の方法。
【請求項８】下記のアミノ酸配列を有し、ブロモキシ
ニルを基質として少なくとも約0.1 マイクロモルNH₃/m
in./mg蛋白質の比活性を有する純度で、約34kdの実質的
に純粋な細菌ニトリラーゼを含有してなる組成物。 Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gln Ala Glu Pro Val Trp ¹ ⁵ ¹⁰ ¹⁵ Met Asp Ala Ala Ala Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys ²⁰ ²⁵ ³⁰ Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gln Leu Val Ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile ³⁵ ⁴⁰ ⁴⁵ Pro Gly Try Pro Gly Phe Met Leu Thr His Asn Gln Thr Glu Thr Leu ⁵⁰ ⁵⁵ ⁶⁰ Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gln Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro ⁶⁵ ⁷⁰ ⁷⁵ ⁸⁰ Glu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gln Glu His Asn Ile Ala Leu ⁸⁵ ⁹⁰ ⁹⁵ Ser Phe Gly Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gln 100 ¹⁰⁵ ¹¹⁰ Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile Thr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu ¹¹⁵ ¹²⁰ ¹²⁵ Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu Gly Asp Gly Ser ¹³⁰ ¹³⁵ ¹⁴⁰ Asp Leu Gln Val Ala Gln Thr Ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn ¹⁴⁵ ¹⁵⁰ ¹⁵⁵ ¹⁶⁰ Cys Ala Glu Asn Leu Gln Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu ¹⁶⁵ ¹⁷⁰ ¹⁷⁵ Gly Glu Gln Ile His Ile Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro ¹⁸⁰ ¹⁸⁵ ¹⁹⁰ Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly Ala Ile Asn Gln Val Tyr Ala Ala ¹⁹⁵ ²⁰⁰ ²⁰⁵ Glu Thr Gly Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gln Val Val Gly Pro Thr ²¹⁰ ²¹⁵ ²²⁰ Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gln Tyr ²²⁵ ²³⁰ ²³⁵ ²⁴⁰ Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gln Leu Lys ²⁴⁵ ²⁵⁰ ²⁵⁵ Ser Lys Ser Leu Ser Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Ile ²⁶⁰ ²⁶⁵ ²⁷⁰ Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly ²⁷⁵ ²⁸⁰ ²⁸⁵ His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile Asn Arg Gln Arg ²⁹⁰ ²⁹⁵ ³⁰⁰ Gln Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro ³⁰⁵ ³¹⁰ ³¹⁵ ³²⁰ Arg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser ³²⁵ ³³⁰ ³³⁵ Thr Ala Ile Gly Val Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser ³⁴⁰ ³⁴⁵
【請求項９】前記細菌ニトリラーゼがクレブシエラ由
来のニトリラーゼである請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】前記細菌ニトリラーゼが少なくとも約
0.5 マイクロモルNH₃/min./mg蛋白質の比活性を有する
請求項８に記載の組成物。